Download pdf - Animacije i Zadaci

7/29/2019 Animacije i Zadaci

1/23

GMGM20052005

Kolegij Genetiko inenjerstvo

Animacije i zadaci

doc. dr. sc. Gordana Maravi

Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju

Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta


2/23

GMGM20052005

Bioloke animacije

http://www.rvc.ac.uk/review/DNA_1/Index.cfm

http://bcs.whfreeman.com/lodish5e/ http://www.dnalc.org/cloning.html

http://en.science-generation.com/biotkit.php?biokit_id=1&i=1# http://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderhuman

6/student/olc/vrl_animation-quizzes.html http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/T

ransgenicCrops/animation.html
http://www.rvc.ac.uk/review/DNA_1/Index.cfmhttp://bcs.whfreeman.com/lodish5e/http://www.dnalc.org/cloning.htmlhttp://en.science-generation.com/biotkit.php?biokit_id=1&i=1http://en.science-generation.com/biotkit.php?biokit_id=1&i=1http://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderhuman6/student/olc/vrl_animation-quizzes.htmlhttp://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderhuman6/student/olc/vrl_animation-quizzes.htmlhttp://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/animation.htmlhttp://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/animation.htmlhttp://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/animation.htmlhttp://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/animation.htmlhttp://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderhuman6/student/olc/vrl_animation-quizzes.htmlhttp://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderhuman6/student/olc/vrl_animation-quizzes.htmlhttp://en.science-generation.com/biotkit.php?biokit_id=1&i=1http://en.science-generation.com/biotkit.php?biokit_id=1&i=1http://www.dnalc.org/cloning.htmlhttp://bcs.whfreeman.com/lodish5e/http://www.rvc.ac.uk/review/DNA_1/Index.cfm


3/23

GMGM20052005

Zadatak 1

Razgradnja fragmenta DNA veliine 15 kb trima

restrikcijskim enzimima daje fragmente veliinanavedenih u tablici. Odredite poloaj restrikcijskihmjesta u fragmentu DNA!

BamHI EcoRI PstIBamHIEcoRI

BamHIPstI

EcoRIPstI

BamHI

EcoRI

PstI14 12 8 11 8 7 6

1 3 7 3 6 5 5

1 1 3 3

1


4/23GMGM20052005

Rjeenje zadatka 1

0 3 6 9 12 15 kb

14 kb 1 kb

BamHI

3 kb 12 kb

12 kb 3 kb

EcoRI

BamHIEcoRI

3 kb 11 kb 1 kb

EcoRI + BamHI

BamHIEcoRI

3 kb 5 kb 6kb 1 kb

EcoRI + BamHI + PstI

PstI


5/23GMGM20052005

Zadatak 2

Linearni fragment DNA veliine 100 kb obraen jepolinukleotid-kinazom uz dodatak radioaktivnog ATP.

Razgradnja s EcoRI daje fragmente veliina: 8*, 10, 15, 23i 44* kb. Razgradnja s BamHI daje fragmente veliina: 11*,14, 16, 24.5 i 34.5* kb. Razgradnja istovjetnogneradioaktivnog fragmenta s oba enzima daje fragmente

veliina 3, 4.5, 5.5, 7, 8, 9.5, 10.5, 17.5 i 34.5 kb.Odredite poloaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!

EcoRI

23108 15 448 7 4.510.55.517.53 9.5 34.5

16 34.524.511 14

BamHI


6/23GMGM20052005

Zadatak 3:

Koliko je pojedinanih klonova potrebno zaizradu genomske knjinice ljudskoggenoma u razliitim vektorima ako jevjerojatnost pojavljivanja svakog gena u

knjinici 99%? N = ln (1-P) / ln (1-f) Za ljudski genom i standardni

plazmidni vektor: P 99% ili 0.99 f 5 kb/4,400,000 kb =

1.14 x 10-6N = [ln 0.01]/[ln 0.99999886]

= -4.6/-1.14 x 10-7

= 40 350 877 pojedinanihklonovaPlazmidni vektoristabilni inserti do 5 kb


7/23

GMGM20052005

Za ljudski genom i standardnikozmid:

P 99% ili 0.99 f 35 kb/4,400,000 kb = 7.95

x 10-6

N = [ln 0.01]/[ln 0.99999205]= -4.6/-7.95 x 10-6

= 578 616 pojedinanih klonova

Inserti 20 35 kb


8/23

GMGM20052005

Za ljudski genom i standardni YAC:

P 99% ili 0.99

f 500 kb/4,400,000 kb = 1.4 x 10-4

N = [ln 0.01]/[ln 0.999886]

= -4.6/-1.4 x 10-4

= 40 350 pojedinanih klonova


9/23

GMGM20052005

Zadatak 4

elite prouavati izozim piruvat-kinaze specifian

za jetru. Enzim je proien (Mw 62 000) idobiven je peptidni slijed amino-kraja proteina.Razgradnjom kimotripsinom dobiven je krai oblik

enzima vrlo sline veliine (Mw 60 000), kao islijed jo jednog oligopeptida. Koristei navedeneinformacije predloite sondu koja bi se mogla

koristiti za pretraivanje knjinice i nalaenjegena za piruvat-kinazu. Objasnite va izbor. Peptid 1 : Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-Val

Peptid 2: Glu-Ser-Arg-Trp


10/23

GMGM20052005

Rjeenje zadatka 4

Peptid 1 : Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-ValBr. kodona: 1 4 2 4 6 6 4 4 4

Peptid 2: Glu-Ser-Arg-TrpBr. kodona: 2 4 6 1

Dio peptida 1 - manji broj moguih kombinacija zaodabir oligonukleotida


11/23

GMGM20052005

Zadatak 5

Koimunoprecipitacijom elite istraiti koji

dio molekule imunoglobulina (Ig) stupa uinterakciju s ciljnim proteinom te ste stoga

izradili nekoliko delecijskih mutanatamolekule Ig uz dodatak Flag epitopa na N-kraj proteina. Koja je svrha dodavanja Flag

epitopa? Zato ne koristiti samo anti-Igprotutijela za koimunoprecipitaciju?


12/23

GMGM20052005

Rjeenje zadatka 5

Flag epitop omoguava specifino prepoznavanje

rekombinantnih mutantnih oblika molekule Ig Anti-Ig protutijela bi se mogla vezati na epitope

koji stupaju u interakciju s ciljnim proteinom te

tako onemoguiti stvaranje kompleksa laninegativni rezultat

Delecijom pojedinih dijelova molekule Ig gube sepojedini epitopi pa postoji mogunost da anti-Igprotutijela ne prepoznaju neki od mutanata


13/23

GMGM20052005

Zadatak 6

Nedavno ste klonirali Idhgen iz laboratorijskog takora ipokuavate identificirati isti gen u vrsti divljeg glodavca

iz june Amerike. Kojim ete redoslijedom provestisljedee postupke?

A. Odabrati klon koji hibridizira sa sondom koja se temelji nanukleotidnom slijedu takorskog gena Idh

B. Uzgojiti transformirane stanice na selektivnom medijuC. Povezati genomsku i vektorsku DNA uporabom DNA ligazeD. Pokidati genomsku i vektorsku DNA restrikcijskim enzimom

E. Hibridizirati klonove obiljeenom sondom koja se temelji nanukleotidnom slijedu tskorskog gena IdhF. transformirati bakterijske stanice rekombinantnim

plazmidima

Odgovor:D - C - F - B - E - A


14/23

GMGM20052005

Zadatak 7

Plazmid pBR322 esto se koristi kao vektor za kloniranje.Sadri gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin kaoselektivne biljege. U jednom je pokusu gen ubaen urestrikcijsko mjesto unutar gena za rezistenciju naampicilin i stanice E. coli su transformiranerekombinantnim vektorom. Da bi se odredilo koje stanicesadre vektor s kloniranim genom kolonije su uzgajane namediju sa i bez antibiotika. Dobiveni su sljedei rezultati:

+ tetraciklin + tetraciklin+ampicilinbez antibiotika


15/23

GMGM20052005

Zadatak 7

Koje kolonije ne sadre ni prazni niti plazmid sugraenim genom? Zato?

Kolonije 3, 5 i 7 jer rastu iskljuivo na podlozi bezantibiotika to ukazuje na nedostatak gena za rezistencijuna antibiotike, a time i na nedostatak plazmida.

Koje kolonije sadre samo prazni plazmid? Objasnite!Kolonije 2, 4, 8 i 9 jer im gen za ampicilin nije inaktiviranugradnjom strane DNA pa mogu rasti na podlozi s oba

antibiotika. Koje kolonije sadre plazmid s ugraenim genom? Zato?

Kolonije 1 i 6 jer rastu na podlozi s tetraciklinom dok na

podlozi s oba antibiotika ne mogu rasti jer im je gen zarezistenciju na ampicilin inaktiviran ugradnjom strane DNA.


16/23

GMGM20052005

Zadatak 8

Plazmid je razgraen restrikcijskim enzimima EcoRI

i HindIII. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veli

ine30, 15 i 5 kb, razgradnja s HindIII daje fragmentveliine 50 kb, a razgradnja s oba enzima dajefragmente veliine 20, 15, 10 i 5 kb. Odreditepoloaj restrikcijskih mjesta na plazmidu.

2 mogunosti:


17/23

GMGM20052005

Zadatak 9

Na slici je prikazana restrikcijska mapa

za EcoRI gena X:0.7 kb1 kb 2 kb

Nacrtajte obrazac dobiven elektroforezom uagaroznom gelu za mutantni gen kojem nedostaje EcoRI mjesto

koje daje fragmente veliine 1 i 0.7 kb (mutA) Za mutantni gen koji sadri novo EcoRI mjesto

unutar fragmenta od 2 kb kao to je oznaeno naslici (mut B)

1.7 kb 0.3 kb mutB


18/23

GMGM20052005

Rjeenje zadatka 9

2.0

1.0

0.7

1.7

0.3

gen X mutA mutB

MutA ima samo

jedno EcoRImjesto i daje dvafragmentaveliine 2 i 1.7kb

MutB daje 4

fragmentaveliine 1.7, 1,0.7 i 0.3 kb zbogdodatnog EcoRimjesta

Z d t k


19/23

GMGM20052005

Koje od restrikcijskihendonukleazanavedenih u tablicikreiraju tupe krajeve?

Koje su od njih

izoshizomeri (enzimikoji imaju isto mjestoprepoznavanja, ali nekidaju nuno na istommjestu)?

koje su od njihizokaudameri (kreirajuidentine krajeve)?

Zadatak

10


20/23

GMGM20052005

Rjeenje zadatka 10

Tupe krajeve kreiraju: AluI, EcoRV, HaeIII, MspI, PvuII

Izoshizomeri:

HpaII i MspI Izokaudameri:

BamHi i BglII HpaII i TaqI

SalI i XhoI


21/23

GMGM20052005

Zadatak 11

Fragment DNA dobiven razgradnjom genomskeDNA restrikcijskim enzimom EcoRI zdruen je s

plazmidnim vektorom lineariziranim istim RE takoda moe doi do spajanja ljepljivih krajeva.Smjesi je dodana T4 DNA ligaza. Navedite sve

mogue produkte ligacijske reakcije! Odgovor:

Linearne molekule DNA nastale povezivanjem iskljuivo

fragmenta, iskljuivo vektora te kombinacijom vektorai fragmenta svaka u dvije mogue orijentacije

Krune molekule DNA nastale povezivanjem iskljuivo

fragmenta, iskljuivo vektora te kombinacijom vektorai fragmenta svaka u dvije mogue orijentacije


22/23

GMGM20052005

Zadatak 12

Slijed nukleotida u viestrukom mjestu za

kloniranje sadri mjesta prepoznavanja REBamHI, EcoRI, PstI i SalI. Oznaite poloajovih mjesta na nukleotidnom slijedu:

-GAATTCGGATCCGTCGACCTGCAG-EcoRI BamHI SalI PstI


23/23

GMGM20052005

Zadatak 13

Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae

velik je 13.5x106 pb. Ako je genomskaknjinica izraena u fagu koji moe primitiinserte veliine 16 kb, koliko individualnihklonova je potrebno pretraiti da bi se sasigurnou od 99% naao odreeni fragment?

Odgovor: N=ln(1-P)/ln(1-f); P=0.99; f=16 kb/13.5x103kb

N=3838-3883