Upload
duongkhanh
View
217
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Základy hmotnostníspektrometrie
Lenka Hernychováe-mail: [email protected]
Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové
HistorieKoichi TanakaKoichi Tanaka vyvinul MALDI technikuTanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., YoshidaT.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151
JB JB FennFenn vyvinul ionizaci elektrosprejemFenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64
Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie
Tanaka K.
Fenn J.B.
PrincipHmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, kteráurčuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty.
Přístroj se nazývá hmotnostníspektrometr.
PrincipMS vypovídá o primární struktuře analyzované
látky
Neposkytuje informace o sekundární či terciálnístruktuře proteinu
Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace….) a může určit i místo modifikace
Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13C/12C, 34S/32S, 18O/16O - kvantifikace
Princip
Umožňuje analýzu komplexních směsí
Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality
Identifikaci proteinů
Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby
Možnost analýzy nekovalentních komplexů
Popis přístroje
1. Iontový zdroj
2. Hmotnostní analyzátor
3. Detektor
4. Řídící počítač
Experimentální uspořádání
Vacuum Vacuum SystemSystem
Sample Sample InletInlet DetectorDetector Data Data
SystemSystemMass Mass
AnalyserAnalyserIonisationIonisationMethodMethod
Atmosphere
SouSouččáásti MS syststi MS systéémumu
MALDI-TOF hmotnostní spektrometry
Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)
4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems)
MALDI-TOF Voyager
(Applied Biosystems)
PrincipIonizace1.Měkké techniky ionizaceEnergetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá.
2. Tvrdé techniky ionizaceDodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.
Typy ionizace
- nárazem elektronů (EI)- působením elektrostatického pole (FI, FD)- chemickou ionizací (CI)- nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB)- ionizací fotony- ionizací 252Cf- elektrosprejem, termosprejem (ESI)- ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)
Hmotnostní analyzátoryUmožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech.
Typy analyzátorůKvadrupolový analyzátor (jednoduché, trojnásobné)
Iontová pastPrůletový analyzátor (TOF)Hybridní (Q-TOF, Q-trap, TOF-TOF, trap-TOF, trap-ICR, …)
FT-MS (ICR-MS)
DetektorPoskytuje analogový signál úměrný počtu
dopadajících iontů.
Dělí se do dvou skupin1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud
vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů(měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin)
2. Násobičové detektory využívají efekt násobeníelektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)
MALDIMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization
Metoda využívá ionizace laserempulsní technika -------- UV (N2)
IR (CO2) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns)
dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých)
jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)
MALDI-TOF MS - ionizace
1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) a usušen (vykrystalizován) na MALDI destičce
2. Laserový výstřel ionizujemolekuly matrice.
3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonuz matrice:
MH+ + A M + AH+
+
MALDI destička
Laser
AH+
+20 kV Ground Variable Grid Grid
Proces MALDI ionizace
Měkká ionizaceMalá nebo žádná fragmentaceJednou nabité ionty [M+H]+; [M-H]-
Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery …Analýza komplexních sloučeninRychlá příprava vzorku & analýzaTolerantní k detergentům a solímJednoduchá interpretace datSpojený s TOF analyzátorem
Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu majírychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z
Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t
Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu
t = k ( m1/z - m2/z)
TOF analyzátor
TOF analyzátor
Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovéma PSD módu
Lineární mód – měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m)Reflektronový mód – měření peptidů (dráha letuje prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m)Post-Source Decay (PSD) – kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)
Letová trubice
Detektor
Zdrojiontů
Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.
15-25 kV
Průletový analyzátor (TOF)
Charakteristika – reflektronový mód
Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm)
Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol)
Teoreticky neomezené rozmezí m/z
Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra v jednom ionizačním pulsu
Příprava vzorků pro MSPředseparační techniky
rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, capLC, MudPIT HPLC ….)
Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí
+ _-
++ +- -
-+ + + --
++-
-
-
++ - -
- -
-
-- + +
-
-++
-
-pI 3 pI 10+ + +- -
-+
+
+-
-
++---
+
+- -- - -
--
++-
-
++--
PolyaPolyakkrylamidrylamidovýový gelgel
+ +
- -
+
+
-
-
+
- -
--
++
-++
-
První dimenzeDruhá
dimenze
2-Dimensionální PolyAkrylamidováGelová Elektroforéza 2D-PAGE
Chromatogram separace acetonitrilového extraktu(proteiny) Brucella melitensis získaný z HPLC Alliance.
ACN extrakt Brucella melitensis
Modrými šipkami je označena oblast, ve které byly jímány frakce, a šipky zelenéoznačují konkrétně najímané frakce.
Iontový záznam v podobě BPI (base peak intensity) tryptického digestuacetonitrilového extraktu Francisella tularensis LVS separovaný na CapLC a detekovaný na hmotnostním spektrometru Q-TOF Ultima API.
14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00Time0
100
%
ACN_FT_101204_2MS TOF MS ES+ BPI
3.28e334.78
23.76
22.0918.82
18.65
18.40
13.86
19.89
18.99
21.58
21.28
20.31
23.43
22.47
26.16
25.21
24.17
28.95
28.08
27.57
27.33
30.92
34.07
Separovaný
Protein
Proteolytické
peptidy
MALDI-TOFMS spektrum
proteolyt. peptidů
Proteasa
Postup přípravy vzorků
2D-PAGE a MALDI-TOF
Enzymatické štěpení vzorku
Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidovévazby u kladně nabitých zbytků.
Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin.
- Phe - Trp - Met - Gly - Ala - Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys -
TrypsinTrypsin
Matrice
Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum
Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpacírychlostí vakuového systému)
Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly
U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, kterézajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH3CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci
MALDI-TOF MS Výběr matrice
Sinapinic Acid Proteiny > 10kDa
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (CHCA)
Peptidy < 10kDa
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)
Neutrální karbohydráty,Syntetické polymery
“Super DHB”Proteiny,Glycosylované proteinyOligonukleotidy
HABA Proteiny,Oligosaccharidy
3-Hydroxypicolinic acid
Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce
Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensisBrucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensis
Interpretace spekter
Metoda peptidového mapování (PMF)
700 1260 1820 2380 2940 3500Mass (m/z)
0
4.0E+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593]
1112.57
1508.83
1337.66
1806.97
721.401032.59
1718.911278.702299.222007.11
874.52 1204.641381.70 1851.911530.83 2310.251095.54
1025.0 1028.8 1032.6 1036.4 1040.2 1044.0Mass (m/z)
0
1.0E+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593]
1032.59
1033.59
1034.59
Selekce monoizotopického píkuPro přesnost měření je důležitá kalibrace přístroje
1025.0 1028.8 1032.6 1036.4 1040.2 1044.0Mass (m/z)
0
7.7E
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100%
Inte
nsity
Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717]
1032.59
699.0 1359.2 2019.4 2679.6 3339.8 4000.0Mass (m/z)
0
3.3E+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717]
1112.57
1508.83
1806.97
1337.66
1718.91 2298.252006.111032.59 1702.91721.40
1278.701154.53 1851.911381.70 2211.111134.56 1530.831707.80 1979.99
721.4041251032.5903461112.5702701113.0455971134.5595991154.5338961204.6393201278.6989381337.6588941381.7014981507.8229941635.9078881702.9114391718.9152571806.9685921829.9027191851.9158471869.0375222006.1106772298.2439162301.201154
MALDI-TOFhttp://prospector.ucsf.edu/
Hodnocení spekter pomocí databáze- identifikace proteinu
Primární struktura proteinu
Štěpící místa proteinu (Arg, Lys)
Teoreticky vypočtené m/zproteolytických peptidů
Primární struktura DNA
Spektrum z MS
Experimentálně zjištěné m/zproteolytických peptidů vs.
Metoda Metoda peptidovpeptidovééhoho mapovmapováánníí -- Peptide Peptide MassMass FingerprintingFingerprinting
Anotace 2D-PAGE proteinové mapy
http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/menu_frame.cgi
699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 4001.0Mass (m/z)
0
1.7E
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100%
Inte
nsityVoyager Spec #1[BP = 1298.0, 17155]
1298.0050
1047.6398
1674.5700
2096.0804
2468.4231
1771.68092112.08081312.04791069.6449 1678.6340 2482.4645
699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 4001.0Mass (m/z)
0
1.7E
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100%
Inte
nsity
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 1298.0, 16995]
1298.0050
1047.6397
1674.5696
2096.0800
2468.4233
1771.6816
2112.06991302.00031069.6447 1678.6244 2482.4588
699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 4001.0Mass (m/z)
0
1.7E
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100%
Inte
nsity
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>MC[BP = 1296.7, 16
1296.6862
1046.5400
1672.9278
2094.0833
2466.1173
1769.9575
2110.05981300.67801068.5256 1676.9791 2480.1411
Angiotensin IAngiotensin IINeurotensinACTH (1-17)ACTH (18-39)
NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO2HR4R1 R2 R3
y1
b3
N-terminus C-terminus
b2b1
y3 y2
Schéma fragmentace
Hledání y-iontové sérieJr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 [email protected] [ 150.00-1200.00]
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
968.2
584.9
969.2
653.2
766.2218.8
654.1 881.2190.9
534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2
859.0748.1635.1552.1
F
∆71
A
∆87
S
∆115
D
∆113
X
∆101
T
∆113
X
∆129
E
Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 [email protected] [ 150.00-1200.00]
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
968.2
584.9
969.2
653.2
766.2218.8
654.1 881.2190.9
534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2
859.0748.1635.1552.1
FASDXTXEK, Y
Hledání y-iontové série
Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 [email protected] [ 150.00-1200.00]
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
968.2
584.9
969.2
653.2
766.2218.8
654.1 881.2190.9
534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2
859.0748.1635.1552.1
FASDXTXEK, Y
F A S D X T X E Y K
Hledání b-iontové série
Kontrola hmotnosti prekurzorového píku(součet hmotností všech aminokyselin)
Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 [email protected] [ 150.00-1200.00]
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
968.2
584.9
969.2
653.2
766.2218.8
654.1 881.2190.9
534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2
859.0748.1635.1552.1
FASDXTXEK, Y
F A S D X T X E Y K
1186.61186.6