Øvelsesvejledning til Almen velsesvejledning... · PDF file2. år Blok 1 Øvelsesvejledning til Almen Mikrobiologi Lars H. Hansen, Bo Jensen, Anders Priemé, Sten Struwe, Søren

2. år Blok 1

Øvelsesvejledning

til Almen Mikrobiologi

Lars H. Hansen, Bo Jensen,

Anders Priemé, Sten Struwe, Søren J. Sørensen

Afdeling for Mikrobiologi

Biologisk Institut

Københavns Universitet

2007

Almen Mikrobiologi 2007 Indholdsfortegnelse

INDHOLDSFORTEGNELSE

OVERSIGT OVER ØVELSER OG KOLLOKVIER ............................................................................ 4 GENERELLE SIKKERHEDSREGLER FOR DE STUDERENDES LABORATORIEARBEJDE........ 5

Første gang du er i et nyt laboratorium ..........................................................................................................5 Inden du begynder på et arbejde ...................................................................................................................5 Under laboratoriearbejdet...............................................................................................................................6 Efter endt laboratoriearbejde ..........................................................................................................................6 Uheld ved laboratoriearbejde .........................................................................................................................7 Generelle kommentarer..................................................................................................................................7

1. INTRODUKTION........................................................................................................................... 8 1.1. Substratfremstilling ..................................................................................................................................8 1.2. Inkubering og opbevaring af kulturer.......................................................................................................8 1.3. Steriliseringsmetoder...............................................................................................................................9

Tørsterilisering..........................................................................................................................................10 Autoklavering ............................................................................................................................................10 Dampsterilisering......................................................................................................................................10 Flambering og glødning............................................................................................................................11 Sterilfiltrering.............................................................................................................................................11

1.4. Basale teknikker ....................................................................................................................................12 Podning.....................................................................................................................................................12 Podning med podenål...............................................................................................................................12 Podning med pipette.................................................................................................................................12 Podning med sprøjte ................................................................................................................................13 Fortyndinger..............................................................................................................................................13

Fraktioneret udstrygning...............................................................................................................................13 Tælling af mikroorganismer ......................................................................................................................14 Pladespredning på agar ...........................................................................................................................14 Indstøbning i agar .....................................................................................................................................15 Tælling i tællekammer ..............................................................................................................................16

2. VÆKST AF MIKROORGANISMER ............................................................................................ 17 2.1 Vækst i væskekultur ...............................................................................................................................17

Øvelse 1: Vækstkurve ..............................................................................................................................17 2.2 Vækst på overflade.................................................................................................................................19

2

Almen Mikrobiologi 2007 Indholdsfortegnelse

Øvelse 2: Radiær udbredelse...................................................................................................................19 Selektive medier: ......................................................................................................................................19 Atamons indvirkning på svampevækst (Geotrichum candidum): .............................................................20

Øvelse 3: Bakterie-kimtal i hakket oksekød .................................................................................................22 Øvelse 4: Indvirkning af bakteriehæmmende behandlinger af hakket oksekød ..........................................23

3. IDENTIFIKATION AF MIKROORGANISMER............................................................................. 25 Øvelse 5: Identifikation af bakterier ..............................................................................................................25

Gram-farvning...........................................................................................................................................27 Katalase....................................................................................................................................................28 Cytochrom c oxidase ................................................................................................................................29 Oxidativ eller fermenterende glukoseomsætning.....................................................................................29

API identifikations kits...............................................................................................................................33 Identifikation af mikrosvampe.......................................................................................................................33

Skimmelsvampe .......................................................................................................................................34 Gærsvampe ..............................................................................................................................................35 Mugsvampe ..............................................................................................................................................35

Fremstilling af præparater af skimmelsvampe .........................................................................................35 Øvelse 6: Identifikation af mikrosvampe.......................................................................................................36

4. KVANTITATIVE BESKRIVELSER AF BAKTERIEPOPULATIONER I SPILDEVAND................ 37 Brug af indikatorbakterier .........................................................................................................................38 Decimal fortyndingsrække af spildevandet til alle øvelserne fra 7 til 12 ..................................................39

Øvelse 7: Antal koloniformende enheder (CFU) .........................................................................................39 Øvelse 8: Bestemmelse af totalt bakterietal ................................................................................................40 Øvelse 9: Påvisning af Clostridium perfringens (C. welchii).........................................................................41 Øvelse 10: Påvisning af fækale enterokokker ..............................................................................................43 Øvelse 11: Kvantitativ bestemmelse af coliforme bakterier .........................................................................44 Øvelse 12: Antibiotikaresistente bakterier i spildevand................................................................................48 Isolering af antibiotikaresistente bakterier fra spildevand ............................................................................48 Forekomst af multiresistens..........................................................................................................................50

SUBSTRATOPSKRIFTER.............................................................................................................. 52

3

Almen Mikrobiologi 2007 Oversigt over øvelser og kollokvier

OVERSIGT OVER ØVELSER OG KOLLOKVIER

Se særskilt dokument: "Øvelsesoversigt 2007"

4

Almen Mikrobiologi 2007 Generelle sikkerhedsregler

Generelle sikkerhedsregler for de studerendes laboratoriearbejde

Første gang du er i et nyt laboratorium

Orienter dig om, hvor sikkerhedsudstyr findes, og hvordan det anvendes.

Orienter dig om, hvilke flugtveje der er, og hvor de fører hen.

Inden du begynder på et arbejde

Overtøj må ikke medbringes i laboratorierne.

Er det nødvendigt at medbringe tasker, skal de placeres, så de ikke

generer nogen.

Der skal altid bæres kittel ved alt laboratoriearbejde. Kitlen bruges ikke

blot for at skåne dit almindelige tøj, men også for at beskytte dig mod

skadelige stoffer.

Kitlen skal være knappet foran og bør vaskes ofte, samt når man har

mistanke om, at der er kommet sundhedsskadelige stoffer på.

Du bør ikke gå til frokost i kittel.

Du skal bære briller ved alt farligt laboratoriearbejde, helst

laboratoriesikkerhedsbriller.

Anden ansigtsbeskyttelse kan være påkrævet.

Handsker bør kun bruges ved arbejde med

ætsende/sundhedsskadelige/smittefarlige stoffer. Handskerne tages af

ved endt arbejde og bør kun bruges så kort tid som muligt. Hvis der

spildes på handskerne kasseres disse straks.

Hvis du har langt hår: bind det op, så det ikke kan komme i roterende

maskiner eller antændes af en åben flamme, f.eks. en bunsenbrænder

(langt løsthængende hår er også uhensigtsmæssigt ved biologisk

laboratoriearbejde).

5


Sørg for at få en ordentlig instruktion i brug af apparatur, inden du

begynder på arbejdet (læs øvelsesvejledningen grundigt).

Under laboratoriearbejdet

Du må ikke løbe/jage hverken i laboratoriet eller på gangene ved

laboratoriet. Mange ulykker kan undgås, hvis man tager det lidt med ro.

Al indtagelse af mad eller drikke samt tobaksrygning er forbudt i

laboratoriet. Slik i lommerne er således også uacceptabelt. Arbejde hvor

farlige flygtige stoffer kan dannes eller forekommer skal foregå i

stinkskab; der skal altid arbejdes med mindst mulig lugeåbning under

hensyntagen til det arbejde, der skal udføres. Det er især fordelagtigt, at

lugekanten er under ansigtshøjde, hvilket også beskytter mod stænk.

Ved afpipettering skal der anvendes gummibold eller anden forsvarlig

sugeanordning.

Hæld aldrig kemikalier tilbage i beholderen.

Tages kemikalier ud af stinkskabene, skal de opbevares i lukkede

beholdere, f.eks. tilproppede reagensglas.

Kemikalierester skal, hvad enten det er små eller store mængder,

opsamles efter de gældende forskrifter, der er ophængt i lokalet.

Kemikalieaffald må normalt ikke hældes i vasken, da afløbene i

stinkskabene såvel som fra andre vaske i laboratoriet er direkte forbundet

med det almindelige kloaksystem.

Efter endt laboratoriearbejde

Vis omtanke ved rengøring af glasapparatur; kan eventuelt foregå i

stinkskabene med sprit og vand for at undgå farlige dampe og lugtgener.

Den enkelte skal sørge for forsvarlig oprydning og rengøring af

arbejdspladsen, før laboratoriet forlades (kemikaliespild m.v. tørres op).

Før laboratoriet forlades, bør man vaske hænder, og kitlen skal tages af.

6


Uheld ved laboratoriearbejde

Ved uheld tilkaldes hjælp så hurtigt som muligt. Brug din sunde fornuft.

Uheld, uanset størrelse og omfang, skal anmeldes (specielle blanketter) til

det pågældende instituts sikkerhedsgruppe.

Blanketter udleveres hos øvelsesvejlederen.

Generelle kommentarer

Vis samme hensyn over for andre, som du selv ønsker at blive genstand

for.

Stinkskabe er primært beregnet til at bortskaffe luftforurening ved

processer, der foregår inde i skabene - selv om de også medvirker til den

generelle fornyelse af laboratorieluften.

7

Almen Mikrobiologi 2007 Introduktion

1. INTRODUKTION

1.1. Substratfremstilling

Et næringsmedium til mikroorganismer skal indeholde alle de stoffer,

mikroorganismerne kræver for at kunne vokse. Foruden vand skal mediet

indeholde uorganiske mineralsalte, suppleret med kulstof-, energi- og

kvælstofkilde samt eventuelle vækststoffer. De fleste mikroorganismer

man dyrker med henblik på økologiske eller kliniske undersøgelser, er

heterotrofe og er i stand til at vokse på sammensatte (komplekse)

substrater. Der tilsættes som regel kødekstrakt, gærekstrakt, pepton

(oligo- og polypeptider), jordekstrakt eller vitaminopløsning.

Ved substratfremstillingen blandes ingredienserne, og pH indstilles på

den ønskede værdi, lettest med et pH-meter. pH justeres med 0,1 M

NaOH eller 0,1 M HCl. Mængden, der skal tilsættes, kan beregnes ved

først at indstille på 10 ml af substratet, eller justering foretages ved direkte

tildrypning til mediet under omrøring og kontinuert pH-måling.

De fleste substrater autoklaveres ved 121°C i 20 minutter og kan, hvis de

er tilstrækkeligt beskyttede mod fordampning og kontaminering,

opbevares lang tid – eventuelt i køleskab.

Substrater, der stivnes med agar, skal køles til ca. 45°C inden

ophældning i sterile plast-petriskåle. Rørglas med agarsubstrat kan efter

autoklavering anbringes skråt for at give en stor agaroverflade

(skråstivning).

1.2. Inkubering og opbevaring af kulturer

Inkubering af kulturer sker i thermostat indstillet på den ønskede

temperatur. Inkubationstiden er afhængig af mikroorganismens

væksthastighed og formålet med forsøget. Ved inkubering af petriskåle

ved temperaturer over 25°C skal disse anbringes med bunden opad, og

hvis inkubationen er langvarig, i plastikposer for ikke at tørre ud.

8


Langtidsopbevaring af bakterie- og svampekulturer kan ske ved lav

temperatur (ca. 4°C), bedst på rørglas, overhældt med steril paraffinolie.

Andre langtidsopbevaringsmetoder er frysetørring, frysning i flydende

kvælstof eller opbevaring i 20% glycerol ved -80°C.

1.3. Steriliseringsmetoder

Et effektivt drab af mikroorganismer er paradoksalt nok en forudsætning

for et vellykket arbejde med renkulturer af mikroorganismer. I stedet for

"drab" og "udryddelse" anvendes det mindre dramatiske "sterilisation",

hvorved forstås en proces, hvor et givet materiale befris for levende

mikroorganismer eller deres hvilestadier. Når et sterilt materiale eller et

medie podet med definerede kulturer inficeres af andre mikroorganismer,

siger man, at det er blevet kontamineret. Begreberne "desinficeret",

"aseptisk" og "infektion" anvendes hovedsageligt i forbindelse med

medicin og hygiejne.

Mikroorganismer varierer stærkt i deres følsomhed overfor forskellige

sterilisationsmetoder. Udover artsforskelle har faktorer såsom

vandindhold, mediets pH, alderen af cellerne og tilstedeværelsen af

sporer betydning for følsomheden. Den decimale reduktionstid (D10)

nødvendig for at reducere en given mikrobiel population 90% under givne

omstændigheder anvendes hyppigt som mål for effektiviteten af en

behandling (se tabel).

Sporer fra Decimal reduktionstid (D10) i sekunder

ved våd varme

105° 120° 130° 140° 150° 160°

Bacillus cereus 12,1 4,2 2,6 1,3 1,0 0,7

Bacillus subtilis 27,8 4,5 3,1 2,1 1,1 0,5

Bacillus stearothermophilus 2857 38,6 8,8 3,9 2,4 1,4

Sterilisation kan opnås ved tør varme, våd varme, filtrering, kemiske

metoder eller bestråling.

9


Tørsterilisering Alle tørre glasvarer (pipetter, kolber, etc.) steriliseres i en varmeovn ved

160°C i 2-3 timer. Den lange opholdstid er nødvendig for at sikre, at alle

bakteriesporer er dræbt. Til mikrobiologisk brug er det nødvendigt, at

sætte en lille tot vandskyende vat i enden af pipetterne. De steriliseres

enten indpakket i brunt papir, glas- eller metalrør. Kolber forsynes med

vat i mundingen og overbindes med papir eller staniol.

Autoklavering De fleste medier og substrater kan tåle autoklavering ved et overtryk på 1

atm., dvs. 121°C i 20 minutter. Autoklavering finder sted i en autoklave,

der kan være tilsluttet enten gas eller elektricitet. Der skal være destilleret

vand i bunden af autoklaven, og det er vigtigt, at dampen har drevet al

atmosfærisk luft ud, inden autoklaveringen begynder, fordi der ellers ikke

opnås en tilstrækkelig høj temperatur. Medier og substrater autoklaveres

som regel i rørglas, kolber eller infusionsflasker, der er forsynet med

vandskyende vat overbundet med papir eller løstsiddende skruelåg. Hvis

substratet er tilsat agar, må kolben højst være 3/4 fyldt, da substratet

ellers stødkoger (koger over).

Autoklavering kan også benyttes til at sterilisere glasvarer og instrumenter

samt til at sterilisere kontamineret materiale før opvask.

Sukkerholdige substrater skal autoklaveres ved temperaturer under

110°C for at hindre karamellisering, evt. tilsættes sukker sterilt efter

autoklavering.

Dampsterilisering Hvis mediet eller substratet ikke kan tåle mere end 100°C, kan der

foretages en dampsterilisation i autoklaven (åben ventil) i 90 minutter,

eller hvis absolut sterilisation er påkrævet gentages processen 3 dage i

træk i 30 minutter (kochning). Dette skulle sikre, at alle bakteriesporer er

spiret og dernæst dræbt.

10


Flambering og glødning Podenåle og andre metalinstrumenter, der kan tåle høje temperaturer,

skal glødes i en bunsenbrænder inden brug. Skalpeller, spatler o.a., der

ikke kan tåle at blive glødet, skal dyppes i alkohol (96%) og flamberes.

Sterilfiltrering Membranfiltrering benyttes til sterilisering af væsker, men også til

opsamling af bakterier i vand- og jordprøver med henblik på tælling, især

hvis antallet af kim er ringe, og en koncentrering er nødvendig.

Et membranfilter er en tynd polymér-membran, der fås med porestørrelser

fra 0,025 μm til 15 μm, og de mest anvendte typer er af celluloseacetat og

cellulosenitrat fra Sartorius, Millipore og Gelman.

Filterholderen og sugeflasken skal være steriliserede inden brugen

(autoklaveret i indpakket stand). Det sterile filter anbringes, tragten

monteres ovenpå, og suget tilsluttes. Prøven hældes i, suges igennem

filtret, og der skylles efter med vand (eller PBS-opløsning).

11

Almen Mikrobiologi 2007 Basale teknikker

1.4. Basale teknikker

Podning Podning af bakterier og svampe foretages almindeligvis med podenål,

pipette eller sprøjte.

Podning med podenål Stregkultur: Podenålen køles efter udglødning i randen af agaren eller i en

flydende kultur. Med en glødet podenål (med øje eller vinkelbøjet) ridses

forsigtigt i overfladen af agar i en skål eller skråstivnet agar i et rør.

Stikkultur: Med en glødet podenål (lige) podes i et rør med agar fra

toppen til bunden.

Podenål kan også benyttes til at overføre podemateriale til både faste og

flydende substrater.

Podning med pipette Pipetter benyttes til overførsel af mikroorganismer fra flydende medier

eller vandprøver til faste substrater eller medier. Hvis mængden, der skal

overføres, blot er nogle dråber eller et ubestemt kvantum, benyttes

finpipetter. Til afmåling af bestemte mængder, f.eks. ved fortynding og

pladespredning, anvendes graduerede stangpipetter eller finpipetter.

Fuldpipetter kan anvendes (1-50 ml), hvis man ikke har brug for

graduering.

Podning skal foregå i så sterile omgivelser som muligt, helst i poderum

eller sterilbænk. Mundinger på rør og kolber flamberes i en gasflamme,

efter at vatproppen er taget af. Glasvarerne holdes med den ene hånd,

mens vatproppen tages ud og holdes med den anden hånds lillefinger,

således at podenål eller pipette kan bruges af de frie fingre. Før

påsætning af proppen flamberes mundingen af glasset igen.

12


Podning med sprøjte Anaerobe bakteriekulturer, er som oftest ekstremt følsomme overfor ilt,

podes mest hensigtsmæssigt med sterile éngangssprøjter forsynet med

en tynd kanyle. Før podningen gasses sprøjten omhyggeligt med steril

kvælstof for at sikre anaerobitet.

Fortyndinger Det vil som regel være nødvendigt at fortynde den vandprøve eller

jordsuspension, der skal undersøges for mikroorganismer, inden podning

foretages. Dette foregår ved, at der laves en serie decimale fortyndinger

efter følgende procedure:

Fortyndingerne udføres med sterile 1 ml pipetter og pipetteskift eller med

finpipetter og skift af pipettespids, og blanding af prøven for hver

fortynding. Som fortyndingsmedium benyttes PBS-opløsning.

Fraktioneret udstrygning

Denne teknik benyttes, når man ønsker en separation af

mikroorganismerne i en blandet prøve eller forskellige stammer i en

renkultur.

Udstrygningen foretages med en podenål på en agaroverflade, der skal

være helt tør. Dette opnås ved at tørre skålen uden låg i en sterilbænk.

Først podes nær kanten af skålen, dernæst steriliseres podenålen i en

flamme, køles, og der udstryges fra podematerialet. Således fortsættes

13


flere gange skålen rundt, som ovenstående tegning angiver. Der skulle

derved blive mulighed for at opnå enkeltliggende kolonier, hvorfra der kan

isoleres videre.

Tælling af mikroorganismer

Pladespredning på agar Pladespredningsmetoden kan benyttes til svampe- og bakterietællinger.

Det er en indirekte metode, hvor man tæller de "kim", der kan vokse frem

til kolonier på det benyttede substrat.

Inden pladespredningen skal der normalt laves decimale fortyndinger af

prøven. Fra passende fortyndinger af udgangsmaterialet afpipetteres 0,1

ml på skåle med substrat. Dråben spredes på agaroverfladen med en

drigalskispatel. Skålene inkuberes ved ønsket temperatur, indtil

kolonierne er vokset frem.

Optælling foregår nemmest på bagsiden af skålene ved at markere hver

talt koloni med en speedmarker. Tælles svampekolonier, må der højst

være 25; tælles bakterier må der højst være 50-200 kolonier på hver skål.

Hvis en svampe- eller bakteriekoloni dækker mere end en fjerdedel af

skålen, skal denne kasseres. Antal CFU (colony forming units) pr. g eller

ml prøve beregnes ved at gange antallet af kolonier på skålene med

14


fortyndingen og yderligere x 10, da der kun er spredt 0,1 ml på hver

plade.

Indstøbning i agar Indstøbningsmetoden benyttes hovedsageligt til bakterie-tællinger. På en

pladespredningsskål kan kolonierne undertiden være svære at adskille

ved tælling. Endvidere kan mange mikroorganismers selvbevægelighed

medføre, at kolonier breder sig hurtigt over en fugtig agaroverflade. En

bedre adskillelse opnås derfor ofte ved at indstøbe prøven i agar.

Substratet autoklaveres i rør med 20 ml i hver og nedkøles i vandbad til

45-50°C inden podningen. Fra decimale fortyndinger podes 0,1 ml i rør af

15


hver fortynding. Rørene rulles mellem hænderne, og indholdet hældes i

skåle med et tyndt lag agar i bunden. Blanding kan også ske ved, at 0,1-1

ml af fortyndingerne afpipetteres i bunden af tomme skåle eller skåle med

et tyndt lag agar, og det smeltede, nedkølede substrat hældes over.

Dernæst roteres pladerne for at sikre fuldstændig opblanding.

Optælling som ved pladespredning.

Tælling i tællekammer Der findes forskellige typer tællekamre. Alle har imidlertid det til fælles, at

de har et kvadratnet indridset i glasset. Længden af siderne i dette net og

dybden af kammeret er kendt.

Inden brugen skal tællekammeret renses i alkohol og tørres. En dråbe af

den suspension, der skal undersøges, anbringes på kvadratnettet og

dækglasset lægges på eller klemmes fast afhængigt af typen. Under

mikroskop tælles 10 tilfældige felter. Tællingen gentages med en ny dråbe

efter at tællekammeret er renset. Middeltallet pr. kvadrat udregnes (celler

på selve linierne tælles kun på de to af siderne).

Følgende er et regneeksempel med en bestemt type cellekammer: Hvert

lille felt har et areal på 0,0025 mm2. Dybden i kammeret er 0,1 mm. Hvis

man antager, at hvert lille kvadrat i gennemsnit indeholder 8 celler, dvs. 8

celler i et volumen på 0,0025 mm2 x 0,1 mm. (1 ml udgør 1000 mm3).

Pr. ml suspension findes:

1000 x 8/0,00025 = 3,2 x 107 celler /ml

16

Almen Mikrobiologi 2007 2. Vækst af mikroorganismer

2. VÆKST AF MIKROORGANISMER

Øvelserne skal vise, hvorledes mikroorganismer vokser i væskekultur og

på overflader. Forskelle på vækst af encellede og flercellede

mikroorganismer belyses og de generelle vækstbegreber gennemgås.

2.1 Vækst i væskekultur

Øvelse 1: Vækstkurve

Vækst i væskekulturer kan for de fleste mikroorganismer simpelt måles ved at følge stigningen i populationens optiske densitet (O.D.) ved en given bølgelængde. Formålet med øvelsen er at bestemme den specifikke væksthastighed af en mikroorganisme, der vokser under omrøring i en kolbe, samt at iagttage de forskellige vækstfaser i denne dyrkning.

Fremgangsmåde

Som testorganisme anvendes bakterien Pseudomonas putida (uwc 1), og væksten måles ved optisk densitet (O.D.) på et spektrofotometer. Vandbadene er indstillet til forskellige temperaturer. Vælg et vandbad til hele øvelsen og noter temperaturen. En Erlenmeyerkolbe med sterilt vækstmedium podes fra forkulturer med

steril pipette (1 ml). Kolben mærkes med holdnummer. Podetidspunktet

17


noteres, kolben omrøres, og der udtages en prøve (1 ml) med steril

pipette. Kolben anbringes straks i det valgte rystevandbad, og prøven

overføres til en kuvette. Prøvens O.D. aflæses umiddelbart i

spektrofotometer ved 450 nm overfor vand (alle hold) samt overfor en af

følgende bølgelængder 350, 550 eller 650 nm (husk at bruge de samme

to bølgelængder hver gang samt i begge tilfælde at nulstille overfor

vand).

Efter 15 minutter udtages den næste prøve, som aflæses i spektrofotometer. Derefter udtages prøverne hvert 15 minut på samme måde. I rapporten afsættes O.D. som funktion af tiden på semilogaritmisk papir (husk at notere bølgelængderne).

Bakterie: Pseudomonas putida (uwc 1),

OD 450 nm

Valgfri bølgelængde

OD nm

18


2.2 Vækst på overflade

Øvelse 2: Radiær udbredelse Formålet med denne øvelse er at demonstrere, hvorledes bakterier og

skimmelsvampe vokser på et fast substrat med/uden antibiotika (både

nystatin eller penicillin+ streptomycin) samt at teste effekten af

svampehæmningsmidlet atamon i forskellige koncentrationer og ved

forskellig pH. Den anvendte metodik bruges ofte til biologisk bestemmelse

af visse stoffers koncentration.

Fremgangsmåde

Selektive medier: Der anvendes en svamp Geotrichum candidum og en bakterie

Pseudomonas putida.

Arbejdet foregår så sterilt som muligt. Pladerne (hhv. svampe og bakterie)

podes vha. en podenål. Lågene på petriskålene må kun lettes lidt, ikke

fjernes helt, når der podes; podenålen glødes inden og mellem hver

podning. Hvert hold poder 2 kontrolplader (uden hæmmer), en for hver af

de to mikroorganismer, samt 4 plader, en af henholdsvis nystatin og

penicillin+streptomycin for hver organisme. Podningen foregår ved med

podenålen at afsætte en lille "prik" midt i petriskålene.

Skålene inkuberes ved 30ºC. Den følgende laboratoriedag måles

diameteren af hver koloni med en lineal.

19


Sammenligning af vækst på plader: Skimmelsvamp: Geotrichum candidum..................

Tid (i timer) Kr

Radius af koloni (μm) kontrol

+ nystatin

+penicillin+streptomycin

Bakterie: Pseudomonas putida

Tid (i timer) Kr

Radius af koloni (μm) kontrol

+nystatin

+penicillin+streptomycin

Koloniens radiære væksthastighed (Kr) er defineret som:

Kr = ΔR/ΔT

hvor ΔR er ændringen i koloniens radius i tidsrummet ΔT. Beregn den radiære væksthastighed i μm/time for kontrollerne. Bakteriekoloni .................. μm/time Svampekoloni .................... μm/time

Atamons indvirkning på svampevækst (Geotrichum candidum):

Arbejdet foregår så sterilt som muligt. Pladerne med atamon podes vha.

en podenål. Lågene på petriskålene må kun lettes lidt, ikke fjernes helt,

når der podes; podenålen glødes inden og mellem hver podning. Podning

foregår ved med podenålen at afsætte en lille “prik” midt i petriskålene.

20


Der podes 6 plader, en af hver af følgende atamon-koncentrationer: 0%,

0.05%, 0.1%, 0,2%, 0.4%, 0.8% (vægt/volumen) og med ukendt

koncentration. pH i disse plader er indstillet til 5,5. Ved atamon-

koncentrationerne 0 og 0,05% skal der endvidere podes plader med pH

4,5 og med pH 6,5.

Alle skålene inkuberes ved 30°C. De følgende laboratoriedage måles

diameteren af hver koloni med en lineal. Idet forsøget skal foregå ved

konstant temperatur, må pladerne ikke anbringes på laboratoriebordet i

længere tid.

Atamon konc. kontrol 0.05% 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% ukendt

Måledag 1

koloniradius (μm)

Måledag 2

koloniradius (μm)

Atamon konc. kontrol 0.05% 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% ukendt

Kr (μm/time)

pH 4.5

atamon

pH 6.5

atamon

med(0.05%) uden med(0.05%) uden

Måledag 1

Måledag 2

radiær væksthastighed

PH i plader 4.5

med

4.5

uden

5.5

med

5.5

uden

6.5

med

6.5

uden

Kr

(μm/ time)

Atamon koncentration i den ukendte plade: ………….%

21


2.3 Bestemmelse af bakterie-kimtal i hakket oksekød

Formålet med denne øvelse er at introducere sterile arbejdsteknikker

samt at undersøge udviklingen i bakterieantallet i hakket oksekød

opbevaret ved køleskabstemperatur og stuetemperatur.

Øvelse 3: Bakterie-kimtal i hakket oksekød

Protokollen til bestemmelse af bakterieantallet i hakket oksekød følger

principperne i Dansk Standard for bestemmelse af kimtal i hakket

oksekød.

Ved forsøgets start er 500 g hakket oksekød blevet blandet ved at ælte

kødet grundigt i to minutter. Kødet deles i to halvdele, som pakkes i

plastikfolie. Den ene halvdel placeres i køleskab ved 4 °C, mens den

anden halvdel placeres ved stuetemperatur.

Umiddelbart før øvelsens start har lærerstaben udtaget en prøve fra det

opbevarede kød og har homogeniseret 10 g hakket oksekød i 100 ml PBS

i 10 minutter på rystebord ved maksimal hasighed.

Hvert småhold får udleveret en homogeniseret portion hakket oksekød,

som har været opbevaret i enten 0, 1, 2 eller 4 dage ved en af de to

temperaturer og laver en fortyndingsrække i PBS:

Dag 0: til 10-5

Dag 1, 2 og 4: til 10-7

Husk at den udleverede prøve repræsenterer en 10-1 fortynding!

Fra følgende fortyndinger:

Dag 0: 10-4 til 10-5

Dag 1, 2 og 4: 10-6 til 10-7

pladespredes 0,1 ml på en petriskål med Plate Count Agar (PCA) med

cycloheximid (cycloheximid hæmmer svampevækst). Lav tre replikater af

hver pladespredning.

Podematerialet fordeles med en steril Drigalski spatel.

22


Pladerne mærkes med tusch på låget og stilles til inkubation ved 25 °C i

to døgn inden tælling af kolonier (Dansk Standard foreskriver fem døgns

inkubation, men det harmonerer ikke med dette øvelsesforløb, så vi nøjes

med inkubation i to døgn – vores erfaring er, at stort set alle CFU er

synlige efter to døgn).

Ved afslutningen af det praktiske arbejde, og når I forlader laboratoriet

skal I altid vaske hænder. Brug sæbe og vask grundigt. Husk at vaske

håndleddene.

Test af effekten af håndvask: Hver person inddeler en petriskål med Plate Count Agar i fire lige store

dele med en tusch:

Område 1) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger INDEN

håndvask.

Område 2) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER

håndvask, men INDEN tørring i håndklæde.

Område 3) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER tørring i

håndklæde.

Område 4) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER vask

med 70% etanol og afdampning af denne, men INDEN tørring i

håndklæde.

Pladen mærkes med navn og holdnummer med tusch på låget og stilles til

inkubation ved 25 °C i to døgn inden tælling af kolonier.

Øvelse 4: Indvirkning af bakteriehæmmende behandlinger af hakket oksekød

Til denne øvelse benytter samtlige småhold hakket oksekød opbevaret

ved 4 °C i fire døgn.

23


10 g hakket oksekød i 100 ml PBS, A) autoklaveres i 20 minutter; B)

pasteuriseres under omrøring, så kødet opnår 71 °C i 15 sek; eller C)

koges i 2 minutter.

Hver gruppe får udleveret en af ovenstående prøver og laver følgende

fortyndingsrække ud fra den udleverede prøve ( som er10-1):

A) Autoklavering: til 10-1 (anvendes ufortyndet)

B) Pasteurisering: til 10-2 (fortyndes 10 gange)

C) Kogning: til 10-2 (fortyndes ti gange)

hvorfra der pladespredes 0,1 ml på en petriskål med PCA med

cycloheximid. Lav en plade af hver fortynding. Podematerialet fordeles

med en steril Drigalski spatel.

Pladerne mærkes med tusch på låget og stilles til inkubation ved 25 °C i

to døgn inden tælling af kolonier.

Test af steril teknik Hvert småhold får udleveret en prøve med sterilt vand og laver

fortyndingsrække til 10-4 i PBS. Der pladespredes 0,1 ml af 10-4

fortyndingen på en petriskål med PCA med cycloheximid (der laves kun

en plade).

Efter 7 dage checkes for vækst på pladen.

24

Almen Mikrobiologi 2007 3. Identifikation af mikroorganismer

3. IDENTIFIKATION AF MIKROORGANISMER

Øvelse 5: Identifikation af bakterier

Der er mange grunde til at beskæftige sig med identifikation af bakterier

f.eks. i klinikken, i levnedsmiddelkontrol, i vandhygiejne og i økologiske

undersøgelser. I de fleste forsøg på identifikation indsnævrer man

overvejelserne til kun at omfatte et begrænset udvalg af samtlige

forekommende bakterier, og praksis viser, at det til mange formål er

tilstrækkeligt. Hvis man derimod begynder helt forfra med en ukendt

bakterie (svarende til brug af identifikationsnøgler for andre organismer) er

begyndelsen på identifikationsprocessen vanskelig.

Der findes mange måder at indlede en identifikation på, og på grund af

den store praktiske interesse er der også udviklet flere kommercielle

identifikationssystemer f.eks. API systemet (www.biomerieux.com) og

BIOLOG (www.biolog.com). Disse identifikationssystemer bygger på

bakteriernes fysiologiske egenskaber, og enten skal bakterierne vokse i

substraterne og omsætte dem, eller også skal allerede dannede enzymer

reagere med substraterne. Mange af de benyttede substrater er stærkt

selektive og tillader kun visse bakteriers vækst. Dette princip benyttes især

til påvisning af bestemte bakterier i blandede prøver (se 1.3 & 1.4).

Udover bakteriernes forskellige fysiologiske egenskaber benyttes også

enkelte morfologiske karakterer til at "adskille" bakterier. I det nedenfor

beskrevne enkle system, der bygger på Cowan et al. (1993) Cowan &

Steel´s Manual for the Identification of Medical Bacteria, indgår celleform,

sporedannelse og bevægelighed således som overordnede kriterier

sammen med cellens omsætning af glucose og vækst under aerobe og

anaerobe forhold.

Hvis man ikke kan identificere en bakterie, kan man mod behørig betaling

få den identificeret hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen (www.dsmz.de), som har stor ekspertise i

bakterieidentifikation og besidder det nødvendige appatur.

25

http://www.biomerieux.com/

http://www.dsmz.de/


Isolering og rendyrkning Det er meget vigtigt, at de bakterieisolater, man vil identificere, er rene og

altså ikke blandinger af forskellige bakteriestammer. Det kan være svært

at sikre sig dette, men gentagen udstrygning på forskellige substrater med

efterfølgende opformering fra enkeltkolonier er en nødvendig

sikkerhedsforanstaltning.

Den mest benyttede metode til at isolere bakterier fra blandede prøver er

brug af agarsubstrater med forskellige kulstofkilder - og inkubering under

aerobe forhold. Allerede herved har man afskåret sig fra at isolere en

række bakterier, hvoraf mange er hyppigt forekommende og vigtige i

naturen.

De anaerobe og fototrofe bakterier er udelukkede, de kemolithoautotrofe

vokser ikke, og selv heterotrofe bakterier med lav væksthastighed vokser

ikke frem på de sædvanlige medier. Det vil derfor kun være et udvalg af

hurtigtvoksende, heterotrofe bakterier der normalt isoleres, og det er disse

bakterier, der bliver lagt vægt på i det følgende.

Primær karakterisering Til den primære karakterisering af bakterier med henblik på identifikation

benyttes følgende egenskaber i Cowan et al.´s skemaer:

Cellemorfologi: Gramfarvningsreaktion

Celleform og arrangement

Bevægelighed

Sporedannelse

Fysiologi: Katalase

Cytochrom-oxidase

Oxidation-fermentation

26


Med disse oplysninger er det muligt at identificere en lang række

almindelige bakterier til gruppe eller slægt efter de indledende skemaer for

Gram-positive og Gram-negative bakterier.

I denne øvelse skal hvert småhold identificere to ukendte isolater på

grundlag af ovennævnte morfologiske og fysiologiske karakteristika.

Bakteriekulturerne udleveres på agarplader mærket med en kode.

Første trin i identifikationsprocessen er at fremstille friske præparater til

vurdering af bakteriernes eventuelle bevægelighed og sporedannelse.

Gram-farvning og testene til bestemmelse af fysiologiske egenskaber

udføres som beskrevet i de efterfølgende afsnit. Resultaterne indføres i

skemaet, hvorefter det skulle være muligt at bestemme de to ukendte

isolaters slægt.

Gram-farvning Gram-farvning er den klassiske indledende test, som benyttes til inddeling

af bakterier i to hovedgrupper af vidt forskellig fysiologisk karakter.

Cellevæggen hos Gram-positive bakterier består af flere murein-lag, og

det formodes, at der under farvningen sker en dehydrering, så

farvekomplekset bindes i cellevæggen. De Gram-negative bakterier

indeholder derimod kun ét murein-lag, men en stor del lipider. Under

farvningen opløses lipiderne i alkohol, cellevæggen bliver porøs og

farvekomplekset udvaskes. For tydeligere at kunne se de nu farveløse

Gram-negative celler, foretages til sidst en farvning med en kontrastfarve -

erythrosin. Ved undersøgelse i mikroskopet vil de Gram-positive bakterier

være mørkviolette (blå), mens de Gram-negative bakterier på grund af

kontrastfarvningen er lys pink (rød).

Gram-reaktionen kan ændres med cellens fysiologiske tilstand. Kun unge

bakteriekulturer bør derfor benyttes til Gram-farvning. Metoden kræver en

vis standardisering, det er derfor vigtigt at overholde tidsangivelserne.

27


Fremgangsmåde 1. En dråbe frisk bakteriekultur udstryges på et affedtet objektglas (sørg

for at udstryge nok bakterier på glasset). Objektglasset mærkes med

blyant, idet den senere affarvning i etanol fjerner tusch.

2. Objektglasset lufttørres under lampe og flammefikseres. Objektglasset

skal være helt tørt inden flammefikseringen.

3. Objektglasset nedsænkes i krystalviolet-opløsning (opl. 1) i 1 min.

4. Præparatet skylles herefter med vand i 3-4 sekunder.

5. Præparatet henstår i jodopløsningen (opl. 2) i 1 min.

6. Affarvning med 96% etanol (opl. 3) (der skylles med flere hold, indtil

der ikke fjernes mere farve).

7. Afskylning med vand.

8. Kontrastfarvning med erythrosin-opløsning i 2 min. (opl. 4).

9. Præparatet skylles i vand, afdryppes og tørres. Det er herefter klar til

mikroskopering.

Gram-præparaterne undersøges i mikroskop og både celleform og

resultatet af Gram-farvningsreaktionen noteres.

Katalase Katalase er et enzym, der dannes af obligat aerobe og fakultativt

anaerobe bakterier, mens det ikke dannes af mikroaerofile og obligat

anaerobe bakterier. Katalase omsætter brintoverilte (H2O2), der dannes

ved flavoproteiners elektronoverførsel til O2, til H2O og O2. Mikroaerofile

bakterier har i stedet en peroxidase, der oxiderer organiske forbindelser

med H2O2.

Blandt aerobt voksende bakterier er mælkesyrebakterierne den eneste

katalase-negative gruppe.

Som eksempler kan nævnes:

K+ : Micrococcus, Staphylococcus, Propionibacterium, enterobakterier,

Bacillus.

K- : Mælkesyrebakterier (f.eks. Streptococcus), Clostridium.

28


Fremgangsmåde Katalase-testen udføres ved direkte på kolonier på agarpladen at tilsætte

en dråbe 3% H2O2-opløsning. Ved positiv reaktion ses luftudvikling (O2) i

form af bobler eller skum. Selv svage bobler registreres som positiv

reaktion.

Cytochrom c oxidase

Alle obligat aerobe og fakultativt anaerobe bakterier er i besiddelse af

cytochrom-oxidaser og -reduktaser. Visse af disse bakterier har cytochrom

c oxidase, som også er i stand til at oxidere den kunstige elektrondonor

N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylen-diamin-dihydrochlorid, der ved oxidation

skifter fra farveløs til blå. Da de fleste aerobe Gram-positive bakterier

mangler cytochrom c oxidase, har testen kun praktisk betydning ved

identifikation af aerobe Gram-negative bakterier.

Som eksempler kan nævnes:

O+ : Pseudomonas, Aeromonas, Acetobacter, Vibrio.

O- : Enterobakterier, f.eks. Escherichia coli.

Fremgangsmåde Med en podenål udstryges en koloni på en strip med N,N,N,N-tetramethyl-

p-phenyl-diamin-dihydrochlorid. Ved positiv reaktion ses en blåfarvning i

løbet af 10 sek. Sværtning efter 30 sekunder eller mere regnes for negativ

reaktion.

Oxidativ eller fermenterende glukoseomsætning

Bakteriernes kulhydratomsætning foregår enten respiratorisk (aerobt) eller

fermenterende (anaerobt). Denne forskel kan undersøges ved at pode

bakterien i Hugh & Leifsons medium, hvor glukose (i høj koncentration) er

kulstofkilden. Peptonindholdet skal derimod være lavt for at modvirke, at

basiske produkter (NH3) fra peptonnedbrydningen neutraliserer den

29


dannede syre fra kulhydratnedbrydningen (specielt den svage

syredannelse ved den oxidative omsætning). Substratet er halvflydende

(0,3% agar) med det formål at undgå væskestrømninger, hvorved den

oxidativt dannede svage syre, der produceres øverst i glasset, ikke

opblandes i det øvrige substrat og neutraliseres.

Bakterier, der viser fermentativ nedbrydning af glukose, er enten obligat

eller fakultativt anaerobe. Bakterier, der ikke kan nedbryde glukose, kan

eventuelt udnytte substratets pepton og derfor alligevel vokse i substratet

uden at danne syre.

Testen er af mindre betydning for Gram-positive bakterier (kun

Micrococcus, Nocardia og nogle Bacillus-arter er rent oxidative), men er

vigtig ved identifikationen af Gram-negative bakterier, idet alle

enterobakterier (vigtige slægter som Escherichia, Salmonella, Shigella,

Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Erwina, Serratia, Yersinia, Vibrio og

Aeromonas) nedbryder glukose fermentativt. Blandt de Gram-negative

bakterier er Pseudomonas den vigtigste oxidative slægt.

Fremgangsmåde Til undersøgelsen anvendes to rør med H & L medium, der begge podes

som stikkultur. Det ene rør påhældes 1/2-1 cm tykt lag smeltet vaseline

(for at holde kulturen anaerob). Kulturerne inkuberes ved 37 °C. Aflæsning

efter 24-96 timer.

NB: H & L medium vil være podede inden øvelserne, så disse blot skal

aflæses. Ved aflæsning undersøges dels for bakteriel vækst, dels for

farvereaktion med indikatorfarve i mediet (se nedenstående skema), hvor

gul indikerer aktivitet.

30


Tilsmeltede rør Åbne rør _________________________________________________________

Aerob vækst - + Anaerob vækst + - Fakultativ anaerob vækst + + Fermentativ nedbrydning, F gul gul eller grøn Oxidativ nedbrydning, O grøn gul Ingen nedbrydning grøn grøn eller blå

Identifikation af vigtige Gram-positive slægter (Skemaer frit efter Cowan et al. (1993))

Form Bevægelighed

Aerob vækst

Anaerob vækst

Kat Ox Sy OF

Micrococcus Kugler - + - + - (+) O

Staphylococcus Kugler - + + + - + F

Streptococcus Kugler - + + - - + F

Leuconostoc Kugler - - + - - + F

Corynebacterium Stave - + + + - (+) (F)

Lactobacillus Stave - + + - - + F

Bacillus Stave m. sporer

(+) + (+) + (+) (+) O/F

Clostridium Stave m. sporer

(+) - + - - (+) F

Nocardia Stave - + - + - + O

Kat, Katalase test; Ox, Cytochrom c oxidase; Sy, Syredannelse fra glukose; OF, Oxidation - Fermentation

31


Identifikation af vigtige Gram-negative slægter

Form Bevæge-lighed

Aerob vækst

Anaerobvækst

Kat Ox Sy OF

Neisseria Kugler - + - + + + O

Acinetobacter K/S - + - + - + O

Bacteroides Stave - - + (-) - (+) F

Alcaligenes Stave (+) + - + +/- - -

Flavobacterium Stave - + - + + + O

Pseudomonas Stave + + (-) + + (+) O

Vibrio Stave krumme

+ + + + + + O/F

Serratia* Stave (+) + + + - + F

Campylobacter Stave + ** - (+) + - -

*) gælder også andre Enterobakterier; **) i 5% O2

Samlede resultater for bakterie-identifikation

Nr Form Gram Endo-sporer

Bevæge- lighed

Aerob vækst

Anaerobvækst

Kat Ox Sy OF Slægt

Sekundær karakterisering De primære tests identificerer højst den ukendte bakterie til slægt. Det er

derfor ofte nødvendigt at benytte sekundære tests til yderligere

identifikation. Valget af sekundære tests er forskellige fra gruppe til

gruppe. Tabel 24.3 i Brock Biology of Microorganisms giver en oversigt

over en række vigtige diagnostiske tests for klinisk vigtige bakteriegrupper.

Udover de klassiske undersøgelser for vækst på specifikke medier og

enzym-assays anvendes idag en række molekylære teknikker til yderligere

identifikation af bakterieisolater. Disse metoder omfatter en række

typninger baseret på restriktionsenzym-analyse af plasmid- og

kromosomalt DNA. Sekventering af DNA kodende for 16S RNA er den

mest anvendte metode til fylogenetiske studier, mens reaktioner med

specifikke antistoffer er meget anvendt inden for klinisk mikrobiologisk

identifikation.

32


Api identifikations kits

Der findes en række testkits til identifikation af bakterieisolater. API

systemet er et eksempel på et sådant system. Testkittet består at en

række brønde der indeholder specifikke vækstmedier og nogle enkelte

enzymsubstrater. Brøndene podes med en bekteriesuspension og efter

en vis inkubationstid (24-48 timer, afhængig af hvilket system man

anvender) kan testene aflæses. Aflæsningen af API testkit omsættes til

en talkode. Bakteriens navn fås ved opslag af talkoden i APIs

identifikationskatalog.

Identifikation af mikrosvampe

Mikrosvampe omfatter skimmelsvampe (Fungi Imperfecti eller

Deuteromycetes), mugsvampe (Murorales) og gærsvampe

(Ascomyceter).

Svampe findes vidt udbredt i naturen og har en vigtig økologisk rolle som

nedbrydere af organisk materiale, især komplekse molekyler som lignin.

Forskellige slægter er i stand til at producere enzymer til omsætning i

naturen af plantekomponenter som f. eks. stivelse, pektin, cellulose og

lignin. Visse mikrosvampe kan producere antibiotika, hvorfor

mikrosvampe har stor industriel interesse. Andre svampe udskiller

toksiske metabolitter, der kan gøre foder og levnedsmidler giftige for dyr

og mennesker. Skimmelsvampe finder man også i stigende grad i

fugtplagede boliger, hvor de er årsag til det såkaldte "sick building

syndrome". Både i økologiske studier og ved kommercielle screeninger er

identifikation af isolerede svampe en nødvendighed.

Isolering af mikrosvampe er traditionelt foregået ved pladespredning. På

pladerne vil kolonier vokse frem ved spiring af de spredte konidier. For at

få et indblik i om der også findes levedygtige hyfer i undersøgelses-

materialet, kan jordvaskemetoden benyttes. Vaskede jordpartikler

(mineralkorn, organiske rester) placeres på agarplader, hvorefter levende

hyfer kan vokse frem til kolonier. Ved begge metoder er det nødvendigt at

33


rendyrke de enkelte isolater for at få renkulturer af de forskellige svampe

inden en identifikation.

Skimmelsvampe Identifikation af mikrosvampe er helt afhængig af genkendelsen af

morfologiske strukturer. Makroskopisk iagttages koloniernes form,

struktur, farve, sporulering og luftmyceliedannelse. Dette sker på

standardmedier for visse slægters vedkommende (f.eks. Penicillium,

Aspergillus og Fusarium), men i øvrigt på et komplekst medium, f.eks. V-8

agar.

Mikroskopisk benyttes en lang række karakterer som adskillelses-

grundlag mellem slægter og mellem arter. Dette gælder f.eks. konidiernes

størrelse, form, pigmentering, overfladestruktur og opdeling i celler.

Konidierne kan dannes ved simpel septering af en hyfe, hvor

enkeltcellerne kan fungere som konidier, eller konidierne dannes på

kondiebærere ved knopskyding eller fra phialider eller annelider.

Konidierne sidder enkeltvis, i kæder eller i hoveder, hvor mange konidier

er holdt sammen af slim. Konidiebærerne kan være placeret direkte på

hyferne eller være samlet mange sammen i koremier eller pyknider.

Terminologi til bestemmelse af skimmelsvampe Pyknide: oftest kugleformet beholder til konidier, apikal åbning.

Koremier: mange kondiebærere samlet i en stilk.

Perithecier: oftest kugleformet beholder til ascosporer.

Basipetal: kædedannelse, den yngste konidie dannes ved basis.

Acropetal: kædedannelse, den yngste konidie dannes i toppen, dvs. at

hver ny konidie dannes oven på den forrige.

Thallisk: kædedannelse, hyferne fragmenteres og der dannes

arthrosporer.

Blastosporer: konidier dannes som knopskydning på konidiofor eller hyfe.

Phialide: celler hvorfra konidier dannes i basipetale kæder eller

slimhoveder, ofte flaskeformede celler, runde-ovale

konidier.

Kolarette: en krave øverst på en phialide.

34


Annelider: celler hvorfra konidier dannes i basipetale kæder, mens den

øverste del af konidioforen vokser med ringdannelse til

følge. Konidier med lige afskåret basis.

Gærsvampe Gærsvampe er encellede og identificeres dels på grundlag af deres

morfologi og dels ved hjælp af fysiologiske tests ligesom bakterier med

hovedvægten på forgæring af kulhydrater. Vegetativt deler de sig ved

knopskydning, og de har kønnet formering ved dannelse af ascosporer.

Mugsvampe Mugsvampe identificeres på grundlag af luftmyceliets vækst på agar, dets

farve, højde, sporangie- og zygosporedannelse. Mikroskopisk benyttes

sporangiesporernes størrelse, form, farve, overfladestruktur,

sporangiestørrelse og form samt zygosporekarakteristika.

Terminologi til bestemmelse af mugsvampe Sporangier: er oftest kugleformede. De vegetative sporer dannes i

sporangier og frigives, når ydervæggen brister.

Kolumella: er en central, steril del af sporangiet.

Apofyse: er en opsvulmning lige under sporangiet.

Zygospore: kønnet spore, oftest tykvæggede og piggede.

Fremstilling af præparater af skimmelsvampe

Dækglaskulturer Denne metode er velegnet til fremstilling af mikroskopiske præparater af

skimmelsvampe. Hyferne klæbes eller adhæderes til et dækglas, og

konidiedannelsen kan følges ved mikroskopering. Ved fremstilling af et

væskepræparat fra en koloni på en agarplade går konidieopbygningen let

i stykker.

I en petriskål med agar udskæres sterilt fire agarblokke med et propbor

(en skalpel eller en flad podenål kan også benyttes). Dernæst løftes disse

blokke op på agarfladen med en steril podenål. Hver blok podes med

35


svampen, der skal undersøges, og et flamberet (og dernæst afkølet)

dækglas lægges ovenpå hver blok. Mellem blokkene kan der fremstilles

en stregkultur. Inkubationen sker ved passende temperatur, indtil

svampen er vokset frem.

Ved mikroskopering anbringes dækglasset med kultursiden nedad i en

dråbe vand eller et svampefarvestof (f.eks. cotton-blue). Stregkulturen i

petriskålen iagttages ved direkte mikroskopering med 10× objektiv.

Tapepræparat Præparater til mikroskopering kan også fremstilles ved at fange hyfer med

konidier på et stykke tape. Herefter afsættes en dråbe cotton-blue, på et

objektglas, og tapen klæbes til glasset med kultursiden nedad i dråben.

Gemmepræparat Dækglasset anbringes i et urglas med Farmers fikseringsvæske i 5 min.

Dernæst dyppes det i 96% alkohol og lægges med den bevoksede side

opad på et stykke filtrerpapir. Når alkoholen er fordampet, anbringes

dækglasset på et objektglas i en dråbe lactophenol tilsat cotton-blue. Efter

en uges forløb lakkes dækglassets rand til med neglelak.

Øvelse 6: Identifikation af mikrosvampe

Fremgangsmåde Hvert småhold skal identificere de udleverede præparater af mikrosvampe

ved hjælp af de udleverede identifikationspapirer.

Derudover skal hvert småhold undersøge mikrosvampe opvokset på

forskellige fødevarer eller agarplader.

36

Almen Mikrobiologi 2007 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand

4. KVANTITATIVE BESKRIVELSER AF BAKTERIEPOPULATIONER I SPILDEVAND

Vi har valgt at bruge spildevand som prøvemateriale i denne øvelse. Dels

er bakterieindholdet i spildevand forholdsvis højt, og dels kan en sådan

undersøgelse relateres til en række sundhedsmæssige problemstillinger.

Et af hovedformålene med denne øvelse er at demonstrere nogle

forskellige metoder til at bestemme antallet af bakterier i en prøve. Dette

gøres dels ved en direkte tælling i mikroskop og dels ved tælling af

kolonier på generelle vækstmedier. Endvidere anslås antallet statistisk på

baggrund af positiv farvereaktion i en række flydende vækstmedier.

Et andet hovedformål er at undersøge forekomst af forskellige fækale

indikatororganismer i hhv. renset og urenset (råt) spildevand. Dette gælder

bl.a. de coliforme bakterier, fækale enterococcer og Clostridium

perfringens. En eller flere af disse bakterier benyttes normalt som

indikatorbakterier i vand.

Endelig undersøges udbredelsen af antibiotika resistens blandt coliforme

bakterier. Dette belyses dels ved at bestemme antallet af tetracyklin- og

ampicillin-resistente bakterier, dels ved en analyse for forekomsten af

multiresistens.

Dansk Standard har lavet en række procedurer for mikrobiologiske

vandundersøgelser. Disse forskrifter bruges af alle offentlige kontrol-

myndigheder. De fleste af procedurerne i denne øvelse er tilpasset Dansk

Standards forskrifter.

Spildevand og i mindre omfang ferskvand og havvand indeholder en

række bakterier, som normalt optræder i tarmen på pattedyr. På grund af

fækal forurening af vandmiljøet spredes disse bakterier i spildevandet og

derfra videre til recipientmiljøet.

Visse sygdomsfremkaldende bakterier (patogener) spredes også ofte ved

en fækal forurening. Fækalt forurenet drikke- og/eller badevand udgør

derfor en potentiel sundhedsfare.

For at karakterisere vands hygiejniske tilstand undersøges almindeligvis

antallet af en eller flere normalt forekommende tarmbakterier. En direkte

37


bestemmelse af indholdet af patogene bakterier er i dag mulig for de fleste

organismers vedkommende. De kan dog ikke danne baggrund for den

rutinemæssige undersøgelse af vandkvaliteten, idet de patogene bakterier

kun optræder sporadisk og ofte i et lille antal. Desuden er disse analyser

dyre og besværlige. Man vælger derfor ofte at teste for tilstedeværelsen af

en eller flere indikatororganismer.

Brug af indikatorbakterier Det er alment accepteret at følgende punkter skal være opfyldt i rimeligt

omfang, hvis en bakterie skal kunne bruges som indikatororganisme:

1. Den skal være til stede, når de patogene organismer er der.

2. Den skal på den anden side kun optræde, når der er sandsynlighed

for, at de patogene også er der.

3. Den skal være til stede i meget større antal end patogenerne.

4. Den skal være mere resistent overfor en desinfektion end

patogenerne.

5. Den skal være hurtigt voksende på et relativt simpelt medie.

6. Den skal indgå i simple og karakteristiske reaktioner, som med

lethed identificerer gruppen eller arten.

7. Den skal være tilfældigt fordelt i den udtagne prøve.

8. Dens vækst skal kunne ske uafhængigt af andre organismer (der

skal ikke kunne optræde en hæmning af indikatoren).

Sammenfattende kan man fastslå, at der ikke eksisterer nogen bakterier,

som kan betegnes som perfekte indikatorer under alle forhold. Således

har flere undersøgelser vist, at det er muligt at finde patogener på steder,

hvor det ikke var muligt at påvise forekomst af indikatororganismer som

f.eks. coliforme bakterier. Normalt vil tilstedeværelse af indikatorbakterier

kunne bruges til at indicere forekomsten af en fækal forurening, mens man

ikke vil kunne slutte omvendt, at manglen på samme angiver

omgivelsernes renhed.

38


Decimal fortyndingsrække af spildevandet til alle øvelserne fra 7 til 12 Af vandprøven laves decimale fortyndinger i PBS-opløsning. Pipettespids

skiftes, og røret whirles grundigt mellem hver fortyndning. Der laves

følgende fortyndinger:

Renset spildevand 10 0 - 10-5

Urenset spildevand 10-1 - 10-7

NB! Hvert hold arbejder enten med renset eller råt spildevand.

Øvelse 7: Antal koloniformende enheder (CFU)

Formålet med denne øvelse er, at bestemme det totale antal aerobe

heterotrofe bakterier i spildevandet før og efter rensning. Man vil, ud fra

disse tal, få et indtryk af hvor meget bakterietallet falder ved rensning af

39


spildevand. Selv om fjernelse af det bakterielle indhold i spildevandet ikke

indgår som en selvstændig del af spildevandsrensningen i

rensningsanlæg, vil totaltallet af bakterier i spildevandet falde drastisk

under rensningsprocessen. Dette skyldes først og fremmest at bakterierne

overvejende er knyttet til partikulært organisk materiale i spildevandet, og

et af hovedformålene med spildevandsrensningen er netop at fjerne det

organiske materiale.

Til kvantificering af det totale antal bakterier i spildevand benyttes et

komplekst medium, Plate Count Agar (PCA), som en lang række af de

almindelige bakterier kan vokse på.

0,1 ml fra hver fortynding pladespredes på PCA-plader. Renset spildevand 10 0 - 10-3


Alle plader inkuberes med bunden opad ved stuetemperatur i mindst 48

timer.

Efter inkubation ved stuetemperatur tælles antallet af kolonier på pladerne.

Antal CFU (colony forming units) pr. plade omregnes til CFU pr. ml prøve.

Fortyndinger med mellem 50 og 200 kolonier pr. plade tælles.

Øvelse 8: Bestemmelse af totalt bakterietal

En stor del af de naturligt forekommende bakterier vil ikke danne kolonier

på en agarplade. Det kan skyldes at de fysisk/kemiske forhold eller

næringsforholdene på vækstmediet ikke tillader vækst af disse bakterier.

En indlysende måde at komme uden om dette problem er at tælle

bakterierne direkte i prøven.

Direkte tælling af bakterier er imidlertid ikke så simpelt som det kunne

lyde, og tælling foregår derfor på et udleveret billede.

For det første må tællingerne foregå i mikroskop. For det andet skal

bakterierne fikseres så de ikke bevæger sig under tællingen. For det tredie

40


vil der i naturlige prøver være en mængde små partikler som i mikroskopet

vil ligne bakterier. Man bliver derfor nødt til at farve bakterierne så man

kan kende dem. Et fjerde problem er, at man ikke umiddelbart kan skelne

døde og levende bakterieceller.

I denne øvelse skal en enkelt farvemetode, den såkaldte Acridinorange

(AO) -metode anvendes.

AO fluorescerer når det binder sig til nukleinsyrer. Når AO binder sig til

RNA, giver AO-RNA komplekser anledning til fluorescens i det røde

område mens AO-DNA komplekser fluorescerer med grønt lys.

Ved farvning med AO opnår man en fiksering af bakterierne (de dør ved

farvningen). Man opnår endvidere at kunne skelne mellem levende

bakterier (grønne eller røde) og diverse partikler (gul-orange).

Farvningen med AO kan kun ses i UV-lys, så tællingerne må foregå i

epifluorescens-mikroskop.

Beregning

Det udleverede billed viser et udsnit af filtret på 7,5 x 10-3 mm2.

Arealet af hele det nedfiltrerede område: 339 mm2

Beregn antal bakterier pr. ml prøve.

Øvelse 9: Påvisning af Clostridium perfringens (C. welchii)

Denne sporedannende bakterie er knyttet til tarmen. Det vigtigste

tvivlsspørgsmål i forbindelse med brugen af denne organisme som

indikator, vedrører den usikkerhed som hersker omkring

størrelsesordenen af sporernes normale udbredelse i naturen. Det har dog

aldrig været muligt at påvise Clostridium perfringens i vand, som ud fra

hygiejniske kriterier er blevet betegnet som værende af tilfredsstillende

kvalitet. Fordelene ved brugen af denne bakterie er, at den som følge af

sin sporedannende egenskab vil være mere resistent overfor ydre

påvirkninger end de andre nævnte indikatororganismer, hvorfor den bedre

vil opfylde punkterne 1 og 4 (side 38). Ved undersøgelse af vand, hvor den

41


tilledte forurening har indeholdt toxiske stoffer, kan Clostridium perfringens

foretrækkes fremfor E. coli.

I meget forurenet vand findes 104 - 105 kim (celler eller evt. sporer) af

Clostridium perfringens pr. ml eller g, mens områder med ringe forurening

har under 100.

I Dansk Standard defineres Clostridium perfringens som obligat anaerobe,

sporedannende Gram-positive stave, der ved 48°C reducerer sulfit til sulfid

inden for 24 timer.

Til påvisning af Clostridium benyttes hyppigst et særligt differential-

medium med tilsætning af sulfit og en jern-forbindelse (se evt. opskrift)

samt evt. antibiotika. Den sværtning af mediet som ses, skyldes

udfældning af sulfider.

Den høje dyrkningstemperatur og det ret høje sulfitindhold i substratet

bortselekterer andre sulfitreducerende bakterier fra Clostridium

perfringens.

Lige inden podning af flaskerne smeltes substratet og sættes i vandbad

ved 50°C. Til hver flaske tilsættes 1 ml 1% natrium-sulfit; Na2SO3 og 2

dråber 5% ammoniumferrosulfat; (NH4)2 Fe(SO4)2 med sterile

injektionssprøjter og kanyler (begge opløsninger er sterilfiltrerede).

Fra hver af nedenstående fortyndinger podes 1 ml over i flasker med

smeltet jernsulfit-agar. Der laves 2 glas fra hver fortynding. Prøven

blandes med substratet ved at rulle flaskerne mellem håndfladerne.

Flaskerne stilles til afkøling på bordet. Når agaren er stivnet inkuberes

flaskerne ved 48°C i 24 timer.

Urenset spildevand 10-2 & 10-3

Renset spildevand 100 & 10-1

Efter 48 timer Optælling sker ved at tælle alle sorte kolonier, der er over 2 mm i

diameter.

Antal Clostridier pr. ml spildevand udregnes under hensyntagen til de

anvendte fortyndinger.

42


Øvelse 10: Påvisning af fækale enterokokker

Fækalier indeholder flere forskellige Enterococcus-arter, hvor

Enterococcus faecalis vil være den hyppigste. Som hos E. coli vil brugen

af denne bakterie som indikator være knyttet til en påvisning af en nylig

tilledt forurening. Fordelene ved brug af denne bakterie hænger sammen

med dens større resistens overfor en række parametre, som f.eks. pH,

end E. coli.

Til isolering af Enterococcus faecalis benyttes et medium, der er så

selektivt, at ingen af de øvrige almindeligt forekommende bakterier i

spildevandet (f.eks. E. coli og Enterobacter aerogenes) kan vokse.

I forurenet vand forekommer enterokokker i betydeligt ringere antal end

coli-bakterierne og man kan derfor opkoncentrere bakterierne ved at

filtrere vandprøven på et membranfilter (0,2 µm) i stedet for at benytte

MPN-metoden (4.5).

Membranfiltret overføres til Natriumazid-agar (NaN3) som hæmmer alle

respirerende bakteriers vækst. Der opstår en rødfarvning af kolonierne,

når mediets indhold af triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) reduceres til

formazan.

Vandprøvens størrelse vælges således, at der højst kommer 50 kolonier

pr. filter, hvilket formodentlig svarer til 1 - 5 ml moderat forurenet vand.

Filtertragten skylles efter med ca. 30 ml vand for at få alle bakterier med

og for at opnå en god fordeling af bakterierne på filtret.

Renset spildevand 1 & 5 ml (ufortyndet)

Urenset spildevand 1 & 5 ml (NB. 10-1 fortyndning)

Filtrene anbringes på Natriumazid-agar og inkuberes i 48 timer ved 37°C.

NB! Disse plader må ikke inkuberes med bunden opad.

43


Efter 48 timer: Enterokokker vil vise sig som rosa, røde eller purpurfarvede 0,5 - 2,0 mm

store kolonier. Antallet af enterokok-kolonier på filtret tælles. Hvis der er

mere end 200 kolonier pr. filter tælles kun 1/4 filterareal.

Antal enterokokker pr. ml prøve udregnes under hensyntagen til de

anvendte volumener og fortyndinger.

Øvelse 11: Kvantitativ bestemmelse af coliforme bakterier

Coliforme bakterier er en fællesbetegnelse for en gruppe af forskellige

gram-negative stavformede bakterier, som har den egenskab tilfælles, at

de kan forgære laktose under dannelse af syre og gas.

De coliforme bakterier vil under normale omstændigheder optræde i

naturen og er således ikke udelukkende bundet til en fækal forurening.

Gruppen kan derfor ikke alene bruges som en indikator for de hygiejniske

forhold i det pågældende vand, (punkt 2, side 38 vil ikke være opfyldt i

tilstrækkelig grad). Idet en stor del af de coliforme bakterier dog som oftest

vil være af fækal oprindelse, vil en bestemmelse af antallet altid kunne

give et fingerpeg om vandkvalitet - særlig i forbindelse med en for E. coli

ufavorabel tilstand, hvor flere af de andre coliforme bakterier vil være mere

hårdføre end E. coli.

E. coli har den fordel, at den er direkte knyttet til tarmen, og da E. coli

type I samtidig let kan bestemmes (idet den kan forgære laktose ved 44°C

i modsætning til resten af den coliforme gruppe) vil denne bakterie

gennemgående være en velegnet indikatororganisme. Dette forhold ses

tydeligt afspejlet i den aktuelle udformning af Dansk Standard for

vandundersøgelser. Brugen af E. coli som det eneste mål for den

hygiejniske tilstand i det pågældende vand vil dog have sine

begrænsninger. Således har undersøgelser vist, at denne bakterie i

havvand vil være genstand for en større reduktion i antallet end det kunne

forventes ud fra den normale fortynding i det vandige miljø. Dette forhold

skyldes hovedsagelig sedimentation samt det faktum, at bakterien ikke er

tilpasset forholdene i havmiljøet. E. coli vil derfor kun være velegnet til at

44


spore en nylig fækal forurening inden for en vis afstand fra

forureningskilden.

Ideen med denne øvelse er at bestemme den hygiejniske tilstand i to

forskellige vandprøver: Urenset spildevand og renset spildevand.

Metoden der benyttes er den samme metode som angives i Dansk

Standard til bestemmelse af coliforme bakterier.

Ved denne metode anvendes Most Probable Number (MPN) princippet til

at estimere antallet af levende bakterier i prøven. Afhængigt af det

selektive dyrkningsmedium, som benyttes, kan der foretages opgørelser

over antal bakterier med en bestemt egenskab. Metoden giver ikke som

pladespredningsmetoden et konkret antal, men et sandsynligt antal

bakterier. Bakterierne forekommer Poisson-fordelte og man kan derfor ud

fra antallet af "positive" glas i forskellige fortyndinger beregne det sand-

synlige antal bakterier i udgangsmaterialet.

E. coli samt nærtstående bakterier kan forgære laktose under udvikling af

gas (H2, CO2) og syre. Disse forhold undersøges ved at pode

vandprøverne i MacConkey-bouillon (McC) ophældt på reagensglas

indeholdende et mini-reagensglas (Durham-rør), som er vendt på hovedet

for at kunne opsamle evt. gasser. I glas med forgærende bakterier vil

indikatoren bromcreosol-purpur slå om til sur reaktion (gul) og der vil

opsamles gas i Durham-røret (undertiden først ved bankning på glassets

kant). Bakterier, der kan vokse i dette medie, hvor der er tilsat galdesalt,

vil her blive betragtet som coliforme bakterier.

Ved anvendelse af en sandsynlighedstabel fås "most probable number" af

bakterier i vandprøven.

Fra hver fortynding podes 5 McC-rør med 1 ml i hvert, altså 25 rør i alt.

McC-rørene må ikke rystes efter podning idet dette kan forårsage “falske”

luftbobler i Durham-rørene

Renset spildevand 10-1 - 10-5


Efter podning inkuberes glassene ved 37°C i 48 timer.

45


46

Ved positiv reaktion farves mediet gult og der ses en luftboble i Durham-

røret.

Ved aflæsningen vælges tre på hinanden følgende fortyndinger, hvor der

så vidt muligt både er positive og negative glas. Antallet af rør, hvori der

ses farveomslag og luftboble (positiv reaktion) tælles for hver af de tre

fortyndinger, og man får herved en 3-cifret tal-kode (f.eks. 5-4-1) som ved

opslag i sandsynligheds-tabellen danner grundlag for MPN-tallet. Det

fundne MPN-tal skal derefter ganges med fortyndingsgraden i den mindst

fortyndede af de tre valgte fortyndinger.

Efter aflæsning af MPN-testen podes der fra to af de positive glas 10 μl

over i nye MacConkey rør, samt i rør med peptonvand for at undersøge for

forekomst af E. coli type I.

Begge podninger inkuberes herefter ved 44°C i 24 timer.

Der testes for tilstedeværelsen af indol i peptonvandskulturen ved at

tilsætte 6-10 dråber Kovac’s reagens, hvorefter kulturen rystes kraftigt. En

positiv reaktion viser sig ved en kraftig rød farve i den øverste fase i

glasset.

Er der syredannelse, gasproduktion og positiv indolreaktion med Kovac’s

reagens betragtes E. coli type I som påvist.


Tabel for MPN/g(ml) results MPN category confidence limits 1 2 99% 95% 0 0 1 0.2 x <0.1 1.3 <0.1 1.0 0 1 0 0.2 x <0.1 1.4 <0.1 1.0 1 0 0 0.2 x <0.1 1.5 <0.1 1.1 1 0 1 0.4 x 0.1 1.9 0.1 1.5 1 1 0 0.4 x 0.1 1.9 0.1 1.5 1 2 0 0.6 x 0.1 2.3 0.2 1.8 2 0 0 0.4 x 0.1 2.2 0.1 1.7 2 0 1 0.7 x 0.1 2.6 0.2 2.1 2 1 0 0.7 x 0.1 2.6 0.2 2.1 2 1 1 0.9 x 0.2 3.1 0.3 2.5 2 2 0 0.9 x 0.2 3.1 0.3 2.5 3 0 0 0.8 x 0.1 3.1 0.3 2.5 3 0 1 1.1 x 0.2 3.7 0.4 2.9 3 1 0 1.1 x 0.2 3.7 0.4 3.0 3 1 1 1.4 x 0.4 4.3 0.6 3.5 3 2 0 1.4 x 0.4 4.3 0.6 3.5 3 2 1 1.7 x 0.5 4.9 0.8 4.1 3 3 0 1.7 x 0.5 5.0 0.8 4.1 4 0 0 1.3 x 0.3 4.9 0.5 3.9 4 0 1 1.7 x 0.5 5.8 0.7 4.6 4 1 0 1.7 x 0.5 5.9 0.7 4.7 4 1 1 2.1 x 0.6 6.8 0.9 5.5 4 2 0 2.2 x 0.7 7.1 0.9 5.7 4 2 1 2.6 x 0.8 8.1 1.2 6.6 4 3 0 2.7 x 0.9 8.3 1.3 6.8 4 3 1 3.3 x 1.1 9.5 1.5 7.7 4 4 0 3.4 x 1.2 9.8 1.5 8.1 5 0 0 2.3 x 0.6 11.6 0.9 8.7 5 0 1 3.1 x 0.9 14.5 1.4 11.2 5 1 0 3 x 1 16 1 12 5 1 1 5 x 1 20 2 15 5 1 2 6 x 2 23 3 19 5 2 0 5 x 1 22 2 17 5 2 1 7 x 2 27 3 21 5 2 2 9 x 3 31 4 25 5 3 0 8 x 2 32 3 25 5 3 1 11 x 3 38 4 30 5 3 2 14 x 4 44 6 36 5 4 0 13 x 3 50 5 39 5 4 1 17 x 5 61 7 48 5 4 2 22 x 7 73 9 59 5 4 3 28 x 9 87 13 70 5 4 4 35 x 12 101 16 83 5 5 0 24 x 6 127 10 95 5 5 1 30 x 10 180 10 130 5 5 2 50 x 10 250 20 200 5 5 3 90 x 20 380 30 300 5 5 4 160 x 40 700 60 530

Category 1: Normal results, obtained in 95% of cases. Category 2: Less likely results, obtained only in 4% of cases. These are not to be used for important

decisions. Results that are even less likely than those of category 2 are not mentioned in the table and are always unacceptable.

Fra: J.C. De Man 1975. European Journal of Applied Microbiology. Vol. 1 nr. 1 1975

47


Resultater fra øvelse 4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand

Øvelse 7 8 9 10 11 11

Spildevand PCA

CFU pr. ml

Total tælling

Celler pr. ml

Clostridier

CFU pr. ml

Enterococcer

CFU pr. ml

MacConkey

MPN pr. ml

E.coli type I

Ja/Nej

Egne

resultater

Urenset

middel)

Renset

(middel)

Øvelse 12: Antibiotikaresistente bakterier i spildevand

Forekomsten af resistens hos bakterier kan skyldes kromosomale eller

plasmidbårne resistensgener, eller forhold som f.eks. membran-

impermeabilitet, der gør, at de bakteriedræbende/hæmmende stoffer

aldrig når ind i cellen. Hver bakterieart kan være mere eller mindre følsom

over for et givet antibiotikum og det er derfor vigtigt i enhver

resistensundersøgelse at inddrage en bedømmelse af, hvilke

organismegrupper, der rent faktisk undersøges (Gram-type, antibiotiku-

mets spektrum, "naturlige" resistenser).

Gennem de seneste årtier har man kunnet spore en stigning i forekomsten

af antibiotikaresistente bakterier - specielt i de miljøer som omgiver

mennesker og husdyr. Årsagerne hertil kan f.eks. være et forhøjet

antibiotikaforbrug, spredning af plasmidbårne resistensgener i miljøer med

høj bakterietæthed, kemisk stress som følge af en generel

forureningstilstand eller den direkte forekomst af små mængder

antibiotiske stoffer i miljøet.

Isolering af antibiotikaresistente bakterier fra spildevand

Som udgangspunkt for isoleringen af antibiotikaresistente bakterier kan

benyttes agarplader, som udover vækstmediet også indeholder antibiotika

i den ønskede koncentration. Eftersom de allerfleste antibiotika

ødelægges ved høje temperaturer, fremstilles antibiotikapladerne ved at

48


tilsætte en antibiotikaopløsning til agarmedie, der er blevet autoklaveret og

derefter afkølet til ca. 50°C. Antibiotikapladerne har begrænset holdbarhed

og det er derfor vigtigt at anvende frisklavede plader til

resistensundersøgelsen.

Der eksisterer utallige metoder til bestemmelse af bakteriel resistens og til

fastsættelsen af, hvor meget antibiotika det enkelte isolat kan tåle. Dette

har specielt stor betydning ved behandlingen af bakterieinfektioner hos

mennesker. Som et udtryk for, hvor meget antibiotika der skal til at

forhindre vækst af en bakterie, anvendes minimum hæmmende

koncentration, MIC (minimum inhibitory concentration), der angives som

regel i µg/ml.

I resistensundersøgelser af f.eks. spildevand er det vigtigt at anvende

antibiotikakoncentrationer, der erfaringsmæssigt vil forhindre vækst af alle

de bakterier, som ikke er i besiddelse af resistensmekanismer. På den

anden side må antibiotikakoncentrationen i mediet ikke blive så høj, at den

overskrider selv de resistente bakteriers MIC-værdi.

Af spildevandsprøven laves decimale fortyndinger i PBS-buffer. Fra

passende fortynding pladespredes 0,1 ml på EMB plader. Hvis der

forventes et lavt antal bakterier, kan en opkoncentrering på filtre være

nødvendig. Dette foregår som foreskrevet i øvelse 10, dog anvendes der

10 ml prøve:

EMB plader:

Renset Spildevand: 100 og 10-2

Urenset spildevand: 10-2 og 10-4

EMB + 10 µg/ml tetracyklin plader:

Renset Spildevand: Filtrer 10 ml af 100 og 100

Urenset spildevand: 100 og 10-2

EMB + 50 µg/ml ampicillin plader:

Renset Spildevand: Filtrer 10 ml af 100 og 100

Urenset spildevand: 100 og 10-2

Pladerne inkuberes ved 37°C i 24 timer.

49


Kolonierne tælles på EMB plader med og uden tilsætning af antibiotika, og

antallet pr. ml spildevand udregnes under hensyntagen til de anvendte

fortyndinger. Beregn desuden på basis af EMB-pladetællinger

spildevandets procentuelle indhold af tetracyklin- og ampicillinresistente

bakterier.

Bemærk: E. coli vil ses som flade, sorte kolonier med metalskær i

påfaldende lys.

NB. Pladerne skal også bruges i Forekomst af multiresistens.

EMB EMB +AP ampicillin EMB + TC tetracyklin

CFU pr. ml CFU pr. ml % CFU pr.ml %

Forekomst af multiresistens

Den enkelte bakterie kan være resistent overfor flere forskellige

antibiotika. Multiresistens er blevet defineret som resistens overfor 3 eller

flere antibiotika samtidigt. Ved (egentlig) multiresistens forstås oftest

resistens overfor flere antibiotika af forskellig type, som involverer helt

forskellige resistensgener.

Replikateknikker anvendes for let at kunne teste bakterieisolaters vækst

på flere forskellige medietyper. Der findes i handlen særlige replikablokke

til anvendelse med velour eller filterpapir, men ved øvelserne her

anvendes sterile tandstikker til at overføre bakteriematerialet til forskellige

antibiotikaplader. Ved undersøgelse for multiresistens er det vigtigt at

arbejde med enkeltisolater. I princippet bør bakteriekolonier derfor være

renstrøget adskillige gange for at sikre, at der arbejdes med renkulturer.

Der udvælges 24 enkelt-liggende antibiotikaresistente kolonier fra både

ampicillin- og tetracyklinpladerne, som nummereres med spritpen på

bagsiden af petriskålen. En steril tandstik dyppes i en koloni og der

afsættes små streger med tandstikken på en serie af nye antibiotikaplader.

50


Stregerne sættes i samme position på alle fem nye antibiotikaplader. Til

sidst sættes en streg med tandstikken på en EMB-plade uden antibiotika.

Denne plade fungerer som kontrol for vækst og danner desuden

sammenligningsgrundlag, når antibiotikapladerne skal aflæses.

I denne undersøgelse anvendes EMB-plader med følgende antibiotika:

tetracyklin 10 µg/ml, streptomycin 50 µg/ml, ampicillin 50 µg/ml,

chloramphenicol 20 µg/ml, cefalexin 50 µg/ml.

Undersøg for vækst af antibiotika-resistente bakterier på EMB plader med

de forskellige antibiotika. En resistent bakterie vokser lige så godt på

antibiotikapladen som på kontrolpladen. Er væksten hæmmet, har isolatet

en MIC-værdi, der ligger under den i pladen anvendte

antibiotikakoncentration. Lav en opgørelse over hvor mange isolater der

havde 1, 2, 3 osv. resistenser.

Hvor mange % af de undersøgte kolonier var multiresistente (havde tre

eller flere resistenser)?

EMB +TC

CFU pr. ml

streptomycin

%

chloramphenicol

%

cefalexin

%

ampicillin

%

tetracyklin %

multiresistente

%

EMB +AP

CFU pr. ml

streptomycin

%

chloramphenicol

%

cefalexin

%

tetracyklin

%

ampicillin %

multiresistente

%

51

Almen Mikrobiologi 2007 Substratopskrifter

SUBSTRATOPSKRIFTER

Clostridium-agar (jern-sulfit agar)

Ingredienser:

Kødekstrakt 10 g Pepton 10 g Agar 15 g Dest. vand 1000 ml

Substratet hældes på 20 ml hætteglas, 10 ml i hvert glas og autoklaveres ved 121°C i 20 min. Lige inden podning af glassene smeltes substratet og sættes i vandbad ved 50°C. Til hvert glas sættes 1 ml 1% natrium-sulfit, Na2SO3 og 2 dråber 5% ammoniumferrosulfat, (NH4)2Fe(SO4)2. (Begge opløsninger skal være sterilfiltrerede).

Eosin-methylenblåt agar (EMB-agar)

Ingredienser:

Kaliumfosfat, sek. K2HPO4 2 g Pepton 10 g Laktose 10 g Eosin 0,4 g Methylenblåt 0,1 g Agar 15 g Dest. vand 1000 ml

Ingredienserne blandes. Autoklaveres ved 121°C i 20 min. Hældes på skåle.

Gram-farvning

opl.1 Krystalviolet-opløsning

Krystalviolet 10 g Ammoniumoxalat 4 g 96% Alkohol 100 ml Ionbyttet vand 400 ml

opl.2 Efterfarvning

Jod 4 g Kaliumjodid 8 g 96% Alkohol 100 ml Ionbyttet vand 400 ml

opl.3 Differentiering

Opløsning 2. 25 ml 96% Alkohol 475 ml

opl.4 Kontrastfarvning

Erythrosin 5 g Phenol 25 g Ionbyttet vand 500 ml

52


Hugh & Leifsons medium (H & L)

Ingredienser:

Pepton 2,0 g NatriumkloridNaCl 5,0 g Sek. Kaliumfosfat K2HPO4 0,3 g Bromthymolblåt (vandopl.) 0,03g Glucose 10,0 g Agar 3,0 g Destilleret vand 1000 ml

Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7,2. Agar tilsættes. Autoklaveres 20 min. ved 121°C.

LB medium

Ingredienser:

Gærekstrakt 5,0 g Bacto-Tryptone 10,0 g Natriumklorid 10,0 g (Agar) 15,0 g Dest. vand 1000 ml

Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7,0 (agar kan tilsættes, hvis mediet skal bruges som agarplader) og autoklaveres.

MacConkey bouillon

Ingredienser:

Natriumtaurocholat (Galdesalt) 5 g Laktose 10 g Pepton 20 g Natriumklorid 5 g Bromkresolpurpur (1% alk.) 2 ml Dest. vand 1000 ml

Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7,4 og der tilsættes bromkresolpurpur. Substratet fyldes på glas, ca. 5-7 ml og der anbringes dværgreagensglas med bunden opad i hvert glas. Autoklaveres ved 110°C i 15 min.

Natriumazid agar

Ingredienser:

Tryptone 20 g Gærekstrakt 5 g Glucose 2 g Kaliumfosfat sek. K2HPO4 4 g Natriumazid 0,4 g Triphenyltetrazoliumklorid (TTC) 0,1 g Agar 10 g Dest. vand 1000 ml

53


Ingredienserne (undtagen TTC og agar) opløses. pH indstilles på 7,2. Dernæst tilsættes agar og substratet autoklaveres. Efter nedkøing til 50°C tilsættes TTC opløst i lidt sterilt vand. Ophældes i petriskåle.

PBS-opløsning (Phosphate Buffered Saline)

Ingredienser:

Na2HPO4 14,4 g KH2PO4 2,4 g NaCl 80 g KCl 2,0 g Dest. vand 1000 ml

pH justeres til 7,2-7,4. Autoklaveres ved 121°C i 20 min.

Peptonvand

Ingredienser:

Tryptone 10 g Natriumklorid NaCl 5 g Dest. vand 1000 ml

Tryptonen fugtes i en kolbe med en ringe mængde koldt vand, dernæst tilsættes NaCl og resten af vandet. pH indstilles til 7,4. Mediet autoklaveres ved 121°C i 15 min.

Plate Count Agar (PCA)

Ingredienser:

Tryptone-pepton 5 g Gærekstrakt 2,5 g Glucose 1 g Agar 15 g Dest. vand 990 ml

Ingredienserne blandes uden agar og pH indstillestil 7,0. Agaren tilsættes og der autoklaveres ved 121°C i 20 min.

Efter afkøling tilsættes 50 mg cycloheximid opløst I 10 ml sterilt vand

Simmons citratagar

Ingredienser:

Magnesiumsulfat MgSO4,7H2O 0,2 g Ammoniumdihydrogenfosfat NH4H2PO4 1,0 g Kaliumdihydrogenfosfat KH2PO4 0,75 g Dikaliumhydrogenfosfat K2HPO4 0,25 g Natriumcitrat (triNa-citrat 2,72 g) 2,0 g Natriumklorid NaCl 5,0 g Agar 10,0 g Bromthymolblåt 0,08 g Dest. vand 1000 ml

54


Ingredienserne blandes. pH indstilles på 7.0 - 7.2. Efter autoklavering ved 121°C i 15 min. justeres pH til 7.2. Efter afkøling til 45-50°C ophældes substratet (godt blandet) i skåle.

V 8 Agar

Ingredienser:

V-8 juice 200 ml

Calciumcarbonat (slæmmet) CaCO3 3.0 g

Agar 20,0 g

Dest. vand. 800 ml

Ingredienserne minus agar blandes og koges. Filtreres gennem ostelærred og fyldes op til 1000 ml, hvorefter agaren tilsættes. Der autoklaveres i 20 min. ved 121°C.

Forkulturmedium for Geotrichum candidum

Pr Liter

glucose autoklaveres for sig som 27 g/l

mediet laves dobbeltkoncentreret.

Hver forkulturkolbe

225 ml dobbeltkoncentreret medium

15 ml destilleret vand

10 ml glucose (27g/l) tilsættes efter aautoklavering

NH4Cl 1

KH2PO4 6.23

NaHPO4, 2H2O 3.72

MgSO4, 7 H2O 0.24

pH 6.5

Geotrichum podes 48 mindst 48 timer før start af øvelse

Til vækst på overflade anvendes

(pr. liter)

Glucose 15 g Gærekstrakt 4 MgSO4, 7 H2O 0,5 K2HPO4, 3 H2O 1,3 agar 15 g Atamon tilsættes og pH er indstillet til 5,5

Glucose autoklaveres for sig og tilsættes efter autoklaveringen ved 121ºC i 20 min.

55


Vækstmedium for Pseudomonas putida

Til øvelsen med dyrkning i væskekultur anvendes

(pr. liter)

Glucose 0,25 g gærekstrakt 0,25 g NH4Cl 1 g K2HPO4, 3 H2O 6,23 g Na2HPO4, 2 H2O 3,72 g MgSO4, 7 H2O 0,25 g

pH indstilles til 6,5

Glucose autoklaveres for sig og tilsættes efter autoklaveringen ved 121C i 20 min.

Endelig medievolumen pr. kolbe er 50 ml.

56

Documents

Øvelsesvejledning til Almen velsesvejledning... · PDF file2. år Blok 1 Øvelsesvejledning til Almen Mikrobiologi Lars H. Hansen, Bo Jensen, Anders Priemé, Sten Struwe, Søren