Variasi Metode dan Alat Pemeriksaan SARS CoV-2

Septyana Cahyaningsih, S.Tr.TLMRSUD dr. Kanujoso Djatiwibowo Balikpapan

COVID-19• Caused by SARS-CoV-2

(Betacoronavirus) (formerly known as nCoV-2019)

• Genome: positive-sense RNA virus

• Attach to Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) receptor

Pathogens 2020, 9(3), 231; https://doi.org/10.3390/pathogens9030231

The genomic

organization of SARS-

CoV-2

Alanagreh et al, Pathogens 2020, 9, 331; doi:10.3390/pathogens9050331

Bagaimana mendeteksi virus SARS-CoV-2?

Serologi

Antibodi IgM anti-SARS-CoV-2.

Antibodi IgG anti-SARS-CoV-2.

Metode molekuler

Real-time quantitative PCR standar baku emas

Sequencing untuk kepentingan riset.

Kultur virus (di fasilitas laboratorium khusus BSL3, tidak dilakukan rutin).

Pemeriksaan mikrobiologi berbasis molekuler

Untuk mendeteksi RNA virus ,yaitu dengan

metode RT-PCR (dengan atau tanpa

sequencing)

Metode Molekuler :

1. RT-PCR Open System ekstraksi

manual,RT-PCR Konvensional

2. RT-PCR Close System TCM

(Rapid Close System)

MS Hakim et al. (under review)

Pemeriksaan RT-PCR untuk deteksi Covid-19

Open System Close System

RT-PCR konvensional

Ekstraksi, purifikasi, dan amplifikasi materi genetik dilakukan manual. Melibatkan banyak proses “buka-tutup” tabung PCR, sehingga beresiko kontaminasi

Ekstraksi, purifikasi, dan amplifikasi materi genetik dilakukan otomatis, sehingga proses “buka-tutup” tabung terjadi sangat minimal.

Ekstraksi otomatis, mixing,, TCM

Test Molecular Targets

Scope Limit of Blanks

WHO

E gene First-line screening 3.9 copies × reactionRdRp gene Confirmatory testing 3.6 copies × reaction

N gene Additional confirmatory testing N/A

CDC

N1 and N2 genes

Combined assay 1.0–3.2 copies/μL

RNase P gene Control assay N/A

E gene, envelop gene; N gene, nucleocapside gene; RdRp gene, RNA-dependent RNA polymerase gene; RNase P gene, human RNase P gene.

Lippi et al, Clin Chem Lab Med 2020; aop

Pre- analytic

Intra- Analytic

Post- analytic

Specimen management (collection, preservation, transportation)

RNA extraction

Real time PCR mix

Real time PCR

Result analysis

Reporting results

Specimen acceptance and rejection

RT-PCR

Staffs’ skill or competence

Potential preanalytical vulnerabilities in the laboratory diagnosis of coronavirus disease 2019 (COVID-19) using (real time) reverse

transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR).

Preanalytic

Lack of identification/mis identification

Inadequate procedures for

specimen (e.g. swab) collection, handling,

transport and storage

Collection of inappropriate or

inadequate material for

quality or volume

Presence of interfering substances

Manual(pipetting)errors

Modified from Lippi et al, Clin Chem Lab Med 2020; aop

Reagen RT-PCR SARS CoV 2• Menggunakan minimal 2 target gen spesifik untuk SARS CoV 2

yang berbeda (multiplex) + kontrol + reagen ekstraksi (manual)

Target GenE (Envelope) EN (Nucleocapsid) N, N1,N2Orf (open reading frame)

Orf1, orf1ab, orf1a, orf1b, RdRp

Gen E umumnya digunakan untuk skrining sedangkan gen N dan orf untuk konfirmasi.

KontrolPositifNegatifKontrol ekstraksi

Reagen harus diujikan terlebih

dahulu

Interpretasi

• Atau sesuai petunjuk Kit• Beberapa Kit: 1 target terdeteksi (kecuali gen E saja) : Positif

Hasil InterpretasiSeluruh target gen terdeteksi Positif SARS CoV 2

Seluruh target gen tidak terdeteksi Negatif SARS CoV 2

Tidak semua target gen terdeteksi, contoh: Dari 2 target hanya 1 gen yang terdeteksiDari 3 target hanya 1 atau 2 gen yang terdeteksi

Probable/Inconclusive

Cut off untuk seluruh target:

Saat interpretasi pastikan untuk melihat grafik PCR dan riwayat pasien

InterpretasiInterpretasi Ket

Positif SARS CoV 2 Sertakan nilai CT, dapat menjadi panduan saat follow upwaktu pengambilan sampel follow up 7-10 hari, setelah hasil negatif dapat diulang segera setelah hasil keluar.

Negatif SARS CoV 2 Ulang bila perlu sesuai status pasien

Probable/Inconclusive

-Pasien baru: Ulang dengan sampel baru-Pada pasien FU menunjukkan load virus sedikit(tetap dianggap positif) ulang dengan sampel baru sampai dua kali negatif.Penyebab inconclusive: Load virus sedikit, masalah di reaksi PCR (contoh:Penguapan), mutasi.

CT value

CT (Cycle Threshold) akumulasi sinyal fluorescens (jumlah siklus yang diperlukan agar sinyal fluorescens dpt melewati ambang

Nilai CT berbanding terbalik dengan load virusDengan cut off 40 siklus: Semakin mendekati 40 semakin rendah load kuman

Development of viral load during Infection of SARSCoV- 2, clinical course and positivity of rRT-PCR assays

Lippi et al.: Vulnerabilities in the diagnosis of COVID-19 Clin Chem Lab Med 2020; aop

% Positif SarsCov-2 pada berbagai spesimen RT-PCR

No. Jenis Spesimen PersentasePositif

1 Cairan Bronchoalveolar lavage (BAL)

93%

2 Biopsi Fibrobronchoscope brush 46%

3 Sputum 72%

4 Swab nasal (nasofaring) 63%

5 Swab faring (orofaring) 32%

6 Feses 29%

7 Darah 1%

8 Urin 0%Wang, W. et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Spesimens. JAMA. 2020.

Tes Cepat Molekuler (TCM)

• Alat diagnostik otomatis dengan prinsip kerja Tes amplifikasi asam nukleat (NAAT)

• Real-time PCR• Menggunakan kartrid sekali pakai

yang digunakan pada alat GeneXpert

• Diimplementasikan di Indonesia sebagai alat diagnosis TB/TB RO sejak 2012 sesuai rekomendasi WHO.

• Selain TB, alat TCM dapat dipergunakan sebagai alat diagnosis HIV, HepC, dll.

LATAR BELAKANG• Salah satu alat diagnosis covid -19 yaitu menggunakan

mesin Test Cepat Molekuler yang dimiliki oleh program TB.

• Pemeriksaan menggunakan cartridge Xpert Express SARS-Cov-2

• Hasil pemeriksaan dapat diperoleh dalam 45 menit• Akuntabilitas hasil pemeriksaan dan pengelolaan logistik

Sebaran Alat TCM Covid-19

8Sebaran 421 alat TCM di 34 provinsi

(per April 2020)

Sebaran Lab TCM Covid-19 di 341 KabkotaSumatera 91 Kabkota Jawa 106 KabkotaBali & Nusa Tenggara 31 KabkotaKalimantan 27 KabkotaSulawesi 51 KabkotaMaluku & Maluku Utara 17 KabkotaPapua & Papua Barat 18 Kabkota

421 Fasyankes

413 Rumah Sakit

7 B/BLK, BTKL

1 RSDC Wisma Atlit

Cartridge GeneXpert

Xpert Xpress SARS-CoV-2

Penyimpanan 2-280CLid hanya dibuka bila uji sudah siap dilakukan Jangan gunakan cartridge yang basah atau bocor

Cartridge Xpert

Xpress SARS-CoV-

2

self-contained, kontaminasi silang antar spesimen <<

Kontrol terdiri dari: Sample Processing Control (SPC):

Spesimen diproses dengan adekuat Monitor adanya inhibitor reaksi RT-PCR Memastikan bahwa kondisi reaksi RT-PCR (temperature

dan waktu) sesuai untuk reaksi amplifikasi Reagen RT-PCR berfungsi

Probe Check Control (PCC): memastikan reagent rehydration Pengisian tabung untuk reaksi PCR Konfirmasi bahwa semua komponen terdapat

dalam cartridge Monitor integritas probe dan stabilitas zat warna

Prosedur Pemeriksaan

Pengambilan Spesimen

PENGEPAKAN/PENGIRIMAN

1. Masukkan cryo tube berisi swab dan serum ke dalam plastik klip per Spesimen. (per pasien/spesimen)

2. Jika tidak ada plastik klip, dapat digunakan wadah lainnya (Antibocor)

24

PENGEPAKAN/PENGIRIMAN

3. Masukkan seluruh spesimen dimasukkan ke dalam cool box yang berisi Ice pack yang terlebih dahulu dibekukan. Suhu pengiriman dijaga 2-8°C

4. Ice packs sebaiknya ditempatkan pada sisi kiri-kanan (ditambahkan juga bagian atas-bawah jika memungkinkan).

5. Harus dapat dipastikan bahwa spesimen tetap terjaga kondisi suhunya tetap dingin saat diterima di laboratorium

26

Alur Pemeriksaan dengan TCM

GeneXpert Xpert Xpress SARS-CoV-2

Proses pengolahan specimen dilakukan di dalam BSC : 1. Pastikan tutup VTM rapat.

Homogenisasi dengan memipet perlahan VTM (+ 5 kali).

2. Transfer sampel dengan menggunakan pipet yang telah disediakan masukkan ke dalam catridge.

3. Tutup catridge dengan rapat.4. Swab catridge dengan alkohol swab

(kecuali bagian segitiga dibelakang), sebelum keluar dari BSC.

Algoritme Deteksi

Interpretasi Hasil

Materi genetik target (SARS-CoV-2) terdeteksi

•Sinyal pada kedua target (N2 dan E) atau hanya N2 terdeteksi.

•SPC: NA. SPC (kontrol internal) dapat diabaikan pada hasil positif karena target (SARS-CoV-2) terdeteksi.

•PCC (kontrol probe): PASS.

SARS-CoV-2 POSITIVE

Materi genetik target (SARS-CoV-2) kemungkinan terdeteksi

• Sinyal pada target E terdeteksi.

• SPC: NA. SPC (kontrol internal) dapat diabaikan pada hasil positif karena target (SARS-CoV-2) terdeteksi.

• PCC (kontrol probe): PASS.

• Selama pandemi, hasil presumptive positif dianggap positif sehingga tidak perlu diulang

SARS-CoV-2 PRESUMPTIVE POSITIVE

• Materi genetik target (SARS-CoV-2) tidak terdeteksi

• Tidak ada sinyal probe yang terdeteksi.

• SPC (kontrol internal): PASS.

• PCC (kontrol pobe): PASS.

SARS-CoV-2 NEGATIVE

• SPC (kontrol internal): FAIL

• PCC (control probe): PASS

• Penyebab : o Cara pengumpulan dan

penyimpanan spesimen tidak sesuai prosedur.

o Kualitas spesimen yang buruk

INVALID

SARS-CoV-2: NO RESULT

SPC (kontrol internal): NO RESULT

PCC (kontrol probe) – FAIL

Penyebab : Kendala teknis pada katrid atau mesin TCM

ERROR

SARS-CoV-2: NO RESULT

SPC (kontrol internal): NO RESULT

PCC (control probe): NA (not applicable)

Penyebab : Gangguan koneksi atau listrikPemeriksaan dihentikan secara manual oleh operator

NO RESULT

Pengulangan Test

SARS-CoV-2 Presumptive positive

INVALID: SPC negative menandakan spesimen tidak diproses dengan sempurna, karena adanya inhibitor reaksi

ERROR: pemeriksaan dibatalkan (aborted), karena: PCR tube tidak terisi dengan baik Terdapat masalah reagent probe integrity Terlampauinya batas ekanan maksimum

didalam cartridge

NO RESULT: data yang dikumpulkan tidak cukup, misalnya operator menghentikan running atau software terttutup

Keterbatasan

Penggunaan pada spesimen lain belum pernah diuji

Penggunaan pada swab nasal dan mid-turbinate “dianggap” dapat digunakan hanya untuk pasien gejala spesifik COVID-19

Hasil negative palsu: pengambilan dan penanganan spesimen tidak sesuai atau jumlah virus yang tidak adekuat

Seperti halnya metode molekuler lain: bila terdapat mutasi pada gen target

Uji ini tidak dapat menyatakan bahwa tidak terdapat infeksi oleh virus lain atau bakteri

Uji Kualitas

Limit of Detection (LoD) Xpress SARS-C0V-2 dibandingkan AccuPlex SARS-CoV2 Reference material

Limit of Detection (LoD) Xpress SARS-C0V-2 dibandingkan Live SARS-CoV2

Alat Pelindung Diri

Pemeriksaan spesimen

Masker N95

Sarung tangan tidak bertepung (non-powdered gloves)

Jas lab bukaan belakang (gown)

Pengaman mata (goggles) atau pelindung muka (face shield)

Penutup kepala (cover head)

Penutup sepatu (cover shoes)Contoh APD di layanan kesehatan untuk COVID-19.

Sumber: Presentasi pencegahan dan pengendalian infeksi (PPI) untuk Novel Coronavirus (COVID-19), Hindra Irawan Satari, Pokjanas

Pencegahan dan Pengendalian Infeksi, Kemkes RI

BSL

2

www.CDC.Gov/24-7WHO. Laboratory biosafety manual. 2004

Ventilation system• Mechanical ventilation

systems that provide an inward flow of air without recirculation to spaces outside the laboratory

Sarana yg perlu diperhatikan terkait SARS CoV 2:• BSC : Minimal Class II A• Autoclave : pengolahan

limbah• Untuk pengaturan udara

Portable Hepafilter

risk assessment

Sarana yg perlu diperhatikan

Portable Hepafilter/plasma ion generator Untuk pengaturan udara bila diperlukan

BSC : Minimal Class II A Autoclave : pengolahan limbah

Semua harus terpelihara dan terkalibrasi

• Selesai bekerja, segel materi yang terkontaminasi (seperti pot dahak bekas, pipet dan cartridge bekas) ke dalam kantong bertanda biohazard, dan otoklaf atau insenerasi atau kubur dengan segera.– Perhatian: membakar plastik

dapat melepaskan toksin yang berbahaya bagi pernafasan.

• Dekontaminasi pipet transfer menggunakan disinfektan yang sesuai sebelum dibuang.

Pembuangan Limbah

Semua materi yang telah digunakan, dianggap telah terkontaminasi!

Setelah selesai diautoklaf , limbah di Incenerator / Pihak ke 3

Bila menggunakan Pihak Ke 3 • Pastikan Pengangkut teregistrasi di Kemen LH• Memiliki perizinan pengangkutan limbah

berupa dokumen manifest • Lakukan evaluasi pengangkut limbah

apakah benar limbah terkirim telah di musnahkan tanggung jawab si pembuang dan pengangkut

Pembuangan Limbah

• Pra analisis: 1. SPO pengumpulan spesimen2. SPO pengelolaan spesimen3. SPO pemeriksaan TCM4. SPO penyimpanan reagensia dan katrid5. SPO Keamanan dan Keselamatan Kerja6. SPO Pengelolaan Limbah7. SPO Pencatatan dan Pelaporan

• Analisis : Internal Quality Control (SPC, PCC)

• Pasca Analisis : Pencatatan, pelaporan, dokumentasi

Pemantapan Mutu Internal (PMI)

• PME untuk pemeriksaan COVID-19 menggunakan TCM dilakukan dengan mengirimkan sisa VTM dari:– 5 spesimen positif pertama DAN

– 10 spesimen negatif pertama Dikirim ke Puslitbangkes

Pemantapan Mutu Eksternal (PME)

Pemanfaatan TCM untuk pemeriksaan COVID-19

Prioritas:a. ODP, PDP, Follow upb. OTG : 1) OTG Nakes yang merawat pasien COVID-192) OTG dengan hasil rapid test positif (+)3) OTG kontak dekat dengan pasien COVID-19

konfirmasi positif (+)

Alur Pemeriksaan TCM untuk Terduga COVID-19 (PDP/ODP)

Invalid, Error, No Result

Pemeriksaan ulang TCM

Positif

Terduga (PDP/ODP)

48

Hasil pemeriksaan TCM berupa Presumtive Positive digolongkan sebagai hasil Positif.

Pengulangan untuk hasil Invalid, Error, dan No Result Hanya diperbolehkan satu kali.dengan sampel yang baru

Apabila hasil pengulangan tetap tidak berupa hasil positif atau negatif, maka tetap laporkan hasil pemeriksaan TCM untuk tindak lanjut oleh dokter pengirim

Pemeriksaan TCM

Negatif

Positif

Bukan COVID-19 Kasus konfirmasi

Negatif

Alur Pemeriksaan TCM untuk kasus konfirmasi

Kasus konfirmasi

BergejalaTidak Bergejala

dengan hasil RT-PCR Positif

Pemeriksaan TCM FU 2 kali pada hari Ke-14 dengan selang waktu > 24 jam

Pemeriksaan TCM FU 2 kali dengan selang waktu > 24 jam setelah

klinis membaik

Paling cepat hari ke-7 dan 9 setelah tes positif terakhir

Semua Negatif Pemeriksaan TCM pertama Positif

Pemeriksaan TCM ulang setelah 7 hari (hari ke-21

dan 22)

Pemeriksaan TCM ulang setiap 2 hari sekali

Sembuh dari COVID-19

Pemeriksaan TCM pertama Positif

Sembuh dari COVID-19

Semua Negatif

Semua Negatif Semua Negatif

TAMPILAN MODUL COVID DI SITB

TERIMA KASIHSemoga Bermanfaat