UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Aleksandra Z. Ristić

“Efekti različitih regulatora rastenja na regeneraciju

Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro”

Master rad

Niš, 2013

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

“Efekti različitih regulatora rastenja na regeneraciju

Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro”

Master rad

Student: Mentor:

Aleksandra Z. Ristić Dr Dragana D. Stojičić, vanredni profesor

Br. indeksa 17

Niš, 2013

UNIVERSITY OF NIS

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

“The effect of different growth regulators on the regeneration

Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro”

Master thesis

Student: Mentor:

Aleksandra Z. Ristić Dr Dragana D. Stojičić

No. of index: 17 Associate professor

Niš, 2013

Zahvaljujem se mojoj mentorki Dragani Stojičić na ukazanoj pomoći i

strpljenju tokom izrade mog master rada.

Iskreno se zahvaljujem i asistentkinji Svetlani Tošić na pruženoj pomoći pri

izradi eksperimentalnog dela master rada. Ovaj master rad je deo doktorske

disertacije asistentkinje Svetlane Tošić i sadrži još uvek nepublikovane

rezultate. Za analizu je korišćen materijal sakupljan za potrebe izrade

disertacije.

Najveću zahvalnost dugujem mojim roditeljima i sestri koji su sve vreme mog

školovanja bili uz mene i pružali mi podršku, ljubav i verovali u mene.

Hvala svima što ste verovali i bili uz mene…

APSTRAKT

Micromeria croatica (Pers.) je endemična vrsta Dinarida, planinskog masiva u južnoj Evropi.

Na teritoriji Srbije zabeležena je na Mokroj Gori. Takođe rasprostranjena je u Hrvatskoj,

Bosni i Hercegovini i Crnoj Gori. Micromeria croatica je ugrožena vrsta na Crvenoj listi

vaskularne flore Srbije i Crne Gore. Prema dostupnoj literaturi ova biljna vrsta do sada nije

uvedena kulturu in vitro. Korišćenjem različitih regulatora rastenja ispitivana je mogućnost

regeneracije biljaka M. croatica putem indukcije aksilarnih pupoljaka na nodalnim

eksplantatima. Prema našim rezultatima najefikasnije kombinacije regulatora rastenja bile su:

1 μM Kin i 0,57 μM IAA, i 30 μM Kin i 0,57 μM IAA. Dobijeni aksilarni pupoljci su

izduživani na podlozi bez hormona a zatim i ožiljeni delovanjem auksina 0,1 μM NAA. Na

ovaj način je uspešno regenerisana Micromeria croatica u uslovima in vitro.

Ključne reči: Micromeria croatica, kinetin, aksilarni pupoljci.

ABSTRAKT

Micromeria croatica (Pers.) is endemic to The Dinaric Alps, a mountain range in Southern

Europe. In Serbia it can be found on Mokra Gora. It is also present in Croatia, Bosnia and

Herzegovina and Montenegro. Micromeria croatica is an endangered species and it is listed

on the Red List of Vascular Plants of Serbia and Montenegro. According to the existing

literature this species has not been introduced in vitro culture. Different regulators of growth

were used for examinations of the possibility of regeneration of Micromeria croatica through

induction of axillary buds on nodal explants. Our results show that the most effective

combinations of growth regulators were: 1 μM Kin and 0,57μM IAA, and 30 μM Kin and

0,57 μM IAA. The axillary buds developed this way were elongated on a hormone-free

surface. After that root initiation started due to the effects of auxin 0,1 μM NAA. In this way

Micromeria croatica was successfully regenerated in in vitro conditions.

Keywords: Micromeria croatica, kinetine, axillary buds.

SADRŽAJ:

1. UVOD 1

1. 1. Micromeria croatica (Pers.) Schott. 3

1.2. Kultura in vitro 4

1.3. Vegetativno razmnožavanje in vitro 4

1.4. Mikropropagacija 5

1.5. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro 6

2. CILJ RADA 9

3. MATERIJAL I METODE 11

3.1. Biljni material 12

3.2 Sterilizacija biljnog mterijala 12

3.3. Sterilizacija hranljivih podloga i pribora 12

3.4. Hranljive podloge – postupak pripremanja 12

3.4.1. Hranljiva podloga MS 13

3.4.2. Hranljive podloge za koje su korišćene indukciju aksilarnih pupoljaka

Micromeria croatica 14

3.4.3. Hranljive podloge koje su korišćene za razviće aksilarnih pupoljaka

Micromeria croatica 15

3.4.4. Hranljive podloge koje su korišćene za indukciju korenova na aksilarnim

izdancima Micromeria croatica 15

3.5. Statistička analiza 15

4. REZULTATI 16

4.1. Uspostavljenje kulture in vitro kod vrste M. croatica 17

4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. croatica 17

4.3. Indukcija korenova na aksilarnim izdancima Micromeria croatica 24

5. DISKUSIJA 26

6. ZAKLJUČAK 29

7. LITERATURA 31

SKRAĆENICE

Kinetin - 6-furfuril-aminopurin IAA - indol-3-sirćetna kiselina NAA – α - naftil- sirćetna kiselina

1

1. UVOD

2

Familija usnatica (Lamiaceae, Labiatae) obuhvata, prema različitim autorima, između 6900 i

7200 vrsta koje su grupisane u 233 do 263 roda. Predstavnici familije Lamiaceae su

kosmopolitskog rasprostranjenja, ali najveći broj vrsta naseljava Mediteransku oblast i

centralnu Aziju. Ovoj familiji pripadaju uglavnom zeljaste jednogodišnje ili višegodišnje

biljke, nešto ređe polužbunovi i žbunovi, a retko niske drvenaste vrste. Kod biljaka ove

familije žlezde na epidermisu su uglavnom dobro razvijene i sadrže etarska ulja (mešavinu

terpenoidnih jedinjenja) ili ugljene hidrate. Zbog karakteristično raspoređenog kolenhima,

stabljike ovih biljaka su na poprečnom preseku četvorouglaste. Listovi imaju unakrsan lisni

raspored što znači da su listovi naspramno postavljeni, a da su unakrsno raspoređeni. Kod

najvećeg broja predstavnika familije usnatica listovi su pokriveni mehaničkim dlakama,

žlezdanim dlakama i žlezdanim ljuspama. Listovi obično imaju dobro razvijenu lisnu dršku, a

obod liske može biti ceo, testerast, grubo ili samo donekle nazubljen, a poznati su i

predstavnici sa perasto usečenim obodima liski. Zalisci nisu razvijeni.

Predstavnici familije Lamiaceae naseljavaju najčešće svetla, sunčana i otvorena staništa kao

što su livade, pašnjaci, kamenjari, do gornje šumske granice. Javljaju se i u šumskim

ekosistemima, a poznate su i korovske, kao i rudimentalne vrste. Veći ekonomski značaj

imaju biljke koje sadrže aromatične sastojke koji se koriste u industriji parfema, medicini,

farmaciji, ili kao začinske biljke. Među najpoznatijim i najefikasnijim gajenim i divljim

lekovitim biljkama upravo su predstavnici familije usnatica poput nane, žalfije, miloduha,

origana, ruzmarina, lavande, majčine dušice, rtanjskog čaja, podubice i mnogih drugih.

Većina usnatica spada u kategoriju dobrih medonosnih biljaka. Ove biljke se intenzivno

istražuju u cilju korišćenja njihovih antimikrobnih aktivnosti (Tatić, Blečić, 1984).

Usnatice imaju značajnu primenu u narodnoj medicini, jer sadrže veliki broj aktivnih

sastojaka. Na prvom mestu one sadrže etarska ulja. Etarsko ulje privlači insekte oprašivače,

deluje toksično na insekte, ljutog je ukusa pa odbija životinje, toksično je i za bakterije i

gljivice. U tradicionalnoj medicini biljke sa etarskim uljima se upotrebljavaju protiv

infekcija, kod bolova u stomaku, da podstaknu iskašljavanje... Еtarsko ulje npr. vrste

Micromeria pulegium sadrži od 27 do 39 sastojaka, od kojih su najreprezetativniji kariofilen-

oksid i E-kariofilen (Slavkovska et al. 2005).

3

1. 1. Micromeria croatica (Pers.) Schott.

Carstvo: Plantae

Razdeo: Magnoliophyta

Klasa: Magnoliopsida

Red: Lamiales

Fam: Lamiaceae (Labiatae)

Rod: Micromeria

Micromeria croatica

Rod Micromeria je prvi opisao Bentham (1829), on pripada familiji Lamiaceae i sadrži 54

vrste, 32 podvrste i 13 sorti. Proširio se sa Makaronezijsko – Mediteranskog regiona u Južnu

Afriku, Indiju i Kinu (Brauchler i sar., 2008). Na osnovu morfoloških karakteristika i

filogenetskih odnosa, vrste roda Micromeria su podeljene u tri sekcije: Cymularia,

Eumicromeria i Pseudomelissa. Vrste ovog roda koje naseljavaju Srbiju pripadaju sekcijama

Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata i M. parviflora) i Pseudomelissa (M.

thymifolia, M. albanica, M. dalmatica i M. pulegium). Micromeria su uglavnom

kosmopolitskog rasprostranjenja, najveća raznolikost vrsta prisutna je u oblasti Mediterana,

Male i Centralne Azije. Micromeria croatica je endemična vrsta Ilirsko-Balkanskog regiona,

rasprostranjena u Hrvatskoj, Bosni i Hercegovini, Crnoj Gori i zapadnoj Srbiji. U Srbiji

Micromeria croatica naseljava relativno mali areal na Mokroj Gori (Kremer et al. 2012).

Ovaj patuljasti žbun raste u pukotinama krečnjačkih stena na visinama od 150 do 2000 m.

4

Ugrožena je vrsta na Crvenoj listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore (Stevanović i sar.

2003).

1.2. Kultura in vitro

Kultura biljnog tkiva predstavlja vegetatvno razmnožavanje biljaka u laboratorijskim

uslovima in vitro. Naime, iz vegetativnih delova biljke (lista, stabla, korena), donetih iz

prirode, moguće je proizvesti na hiljade novih jedinki u laboratorijskim uslovima,

aklimatizovati i vratiti ih na prirodna staništa. Dakle, kultura in vitro je postupak koji

podrazumeva gajenje organa, malih delova tkiva ili izolovanih ćelija u aseptičnim odnosno

sterilnim uslovima. Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro diferenciraju, dele i regenerišu

pojedine organe, ali i embrione ili kompletnu biljku je izraz njihove totipotencije

(sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele, i da regenerišu pojedine organe,

embrione ili, pak, celu biljku) i plastičnosti (sposobnost biljke da menja svoj program

rastenja, metabolizma i razvića u zavisnosti od uslova sredine.

1.3. Vegetativno razmnožavanje in vitro

Vegetativno razmnožavanje na klasičan način, u kome se dobija potomstvo genetički

identično majci biljci je: razmnožavanje putem reznica, krtola, lukovica, kao i pri

kalemljenju. Vegetativno razmnožavanje biljaka in vitro je metoda u kojoj odsečeni organi:

koren, stablo, list, čak i manji fragmenti mogu da izrastu u normalnu biljku. Po ovoj

sposobnosti se biljke razlikuju od životinja. Vegetativno potomstvo dobijeno na ovaj način je

genetički homogeno i identično početnom materijalu.

Vegetativna propagacija in vitro obuhvata nekoliko načina razmnožavanja, a to su:

1. Mikropropagacija - permanentna kultura pupoljaka;

2. Organogeneza - formiranje pupoljaka de novo;

3. Somatska embriogeneza - razviće embriona iz somatskih;

5

4. Androgeneza i ginogeneza - razviće biljaka iz haploidne ćelije muškog i ženskog

gametofita bez oplođenja

5. Somatska hibridizacija - somatske ćelije mogu da se ponašaju kao polne ćelije, i da

fuzijom daju novi organizam.

1.4. Mikropropagacija

U širem smislu mikropropagacija predstavlja razmnožavanje biljaka u kulturi in vitro. U

užem smislu označava razmnožavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih pupoljaka,

koji obuhvataju meristeme vrha stabla ili one koji su formirani u pazuhu lisnih primordija.

Regeneracija biljaka putem apikalnih i aksilarnih pupoljaka je postupak koji ima 4-5

karakterističnih faza što zavisi od osobina biljke koja se razmnožava. To su:

1. Inicijacija - uvođenje primarnih eksplantata u uslove in vitro. Vrh stabla se postavlja na

hranljivu podlogu (koja sadrži nutritivne elemente i relativno visoku dozu citokinina,

najčešće BA). Na ovoj podlozi se listovi izdužuju i formiraju lisnu rozetu, rastu i aksilarni

pupoljci, tako da se dobija vrlo razgranat žbun pupoljaka, koji se u sledećoj fazi razdvajaju i

prenose na novu podlogu;

2. Multiplikacija - umnožavanje izdanaka. Određenom kombinacijom hormona omogućava

se indukcija većeg broja bočnih pupoljaka (obično od jednog inokuluma dobija se 4-10

novih);

3. Izduživanje - razvoj i izduživanje pupoljaka u izdanke. Ovaj proces može da se desi

spontano, ili uz dodavanje giberelina;

4. Ožiljavanje - indukcija adventivnih korenova na eksplantatima koji su dostigli 1-2 cm, uz

pomoć auksina;

5. Aklimatizacija - presađivanje u zemlju i aklimatizacija. Ova faza obuhvata prenos biljaka

u nesterilne uslove i privikavanje na autotrofan način života.

Mikropropagacija se uspešno koristi za razmnožavanje sledećih grupa biljaka: lekovitih

biljaka u cilju obezbeđivanja sirovina za industrijsku preradu, elitnih primeraka šumskog

drveća čije su osobine visoko cenjene, dvodomih vrsta kada je za određivanje pola biljke

potrebno da prođe i nekoliko godina, podloga i plemki voćaka itd.

6

Vegetativno razmnožavanje in vitro ima niz prednosti: razmnožavanje in vitro je mnogo brže

od razmnožavanja in vivo; moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti in

vivo; mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže nego biljke koje rastu in vivo, jer su

oslobođene patogena i infekcija bakterijama i gljivama; in vitro omogućava razmnožavanje

samo zdravih biljaka; mikropropagacija ima veliki značaj u borbi za suzbijanje i eliminaciju

biljnih virusa obzirom da se ovim načinom razmnožavanja dobijaju bezvirusne biljke;

vegetativno razmnožavanje in vitro se može započeti sa vrlo malo biljnog materijala kao

početnog eksplantata; zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski

proizvodnju određenih kultura; veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti

ugroženih i retkih biljnih vrsta (Parić et al. 2011, Vinterhalter, Vinterhalter, 1996).

1.5. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro

Nužni zahtevi pri kultivisanju biljnih kultura su:

- Odgovarajuće tkivo (neka tkiva su pogodnija za kultivaciju od drugih). Kultura tkiva

počinje iz delova biljke ili organa koji se nazivaju eksplantati. Koji delovi biljke (majka

biljka) će biti korišćeni kao eksplantati zavisi od: tipa kulture koji će biti iniciran; svrhe

predložene kulture i biljne vrste koja se koristi. Izbor eksplantata je vrlo važan korak kulture

in vitro, jer korektan izbor eksplantata znatno utiče na uspeh kulture. Izolacija eksplantata

započinje izolacijom početnog eksplantata (deo ili čitava biljka), koji se nakon sterilizacije

uvode u kulturu u sterilnim uslovima. Kao početni eksplantat može poslužiti bilo koji deo

biljke, ali se najčešće upotrebljavaju seme i meristemi. Eksplantati uzeti sa majke biljke u

različitom vremenu godine ne daje uvek dobre reproduktivne rezultate. Razlog može biti

varijacija u nivou eksternih kontaminanata ili sezonske promene u nivou endogenih (internih)

regulatora rasta kod stock biljaka.

- Pogodna podloga za gajenje, koja mora sadržati izvor energije i neorganskih soli u

koncentraciji koja je neophodna za normalno rastenje i razviće biljnih ćelija, organa i tkiva.

Uspešnost kulture ćelija, tkiva ili organa zavisi od sastava same podloge, koja bi trebalo da zadovolji

7

nutritivne i fiziološke potrebe ćelija u kulturi. Osnovni nutritivni zahtevi kulture biljnih ćelija su vrlo

slični onima kod biljaka koje rastu u prirodnom okruženju, ipak sastav podloge varira, što zavisi

od: tipa ćelija, tipa tkiva ili organa, porekla biljne vrste. Bez obzira na različitost hranljivih

podloga, zajedničko za sve je da one moraju da sadrže sledeće: vodu, agar, mineralne soli,

ugljene hidrate (najčešće saharozu), vitamine, aminokiseline, regulatore rastenja.

- Regulatori rastenja (za gajenje biljaka in vitro su najznačajniji auksini i citokinini). Biljni

hormoni su organski sastojci koje prirodno sintetišu više biljke, koji primenjeni u relativno

malim količinama utiču na rastenje i razviće biljaka. Pored ovih prirodnih sastojaka

sintetisane su i sintetičke komponente, koje po funkciji odgovaraju prirodnim hormonima.

Sintetički hormoni se nazivaju regulatori rastenja. Auksini: Indol-3-sirćetna kiselina (IAA)

indol-buterna kiselina (IBA), naftil-sirćetna kiselina (NAA) ili 2,4-dihlor-fenoksisirćetna

kiselina (2,4-D) se često dodaju hranljivim podlogama. Prouzrokuju izduživanje ćelija i

bubrenje tkiva, ćelijsku deobu (obrazovanje kalusa) i obrazovanje adventivnih korenova,

inhibiciju obrazovanja adventivnih i bočnih izdanaka, a često i embriogenezu u suspenzionim

kulturama. Citokinini se često koriste za stimulaciju rastenja i razvića. Najviše se koriste

kinetin, 6-benzil-aminopurin (BA) i 2-izopentiladenin (2iP). Oni obično pokreću deobu

ćelija, naročito ako se dodaju zajedno sa auksinima. U većim koncentracijama (1-10 mg/l)

mogu indukovati obrazovanje adventivnih izdanaka, ali se obrazovanje korenova u tom

slučaju zaustavlja. Citokinini pokreću obrazovanje pomoćnih (bočnih) izdanaka uz smanjenje

apikalne dominacije, a usporavaju i starenje.

- Svetlost i temperatura kao spoljašnji faktori koji utiču na rast biljnih kultura in vitro.

Svetlost je važan faktor jer reguliše rastenje biljnih kultura in vitro na više načina, i to preko

dužine dana, intenziteta zračenja kao i spektralnog sastava. Obično se bira dužina dana od 16

ili 8h, mada se koristi i neprekidno osvetljenje. U posebnim slučajevima, rastenje se dešava u

neprekidnoj tami (tamu zahtevaju sitna semena). Temperatura se obično održava na

konstantnoj vrednosti 24-26 °C, zavisno od eksperimentalnih vrsta. Niža temperatura se

koristi za lukovičaste vrste (oko 18 °C), a viša za tropske vrste (28-29 °C).

8

- Aseptični (sterilni) uslovi rada. Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptičnim uslovima,

kako ne bi došlo do razvoja gljiva i bakterija koje sprečavaju rastenje i razviće biljaka.

- Česta subkultivacija (pasažiranje). Pasažiranje je prenošenje kultura (eksplantata) sa

prethodne, istrošene podloge na svežu. Izvodi se, takođe, u sterilnim uslovima.

Subkultivacija je neophodna iz više razloga: iscrpljenost hranljive podloge; isušivanje

hranljive podloge (što vodi suviše visokoj koncentraciji soli i šećera); naraslost materijala do

ispunjavanja posude za gajenje kulture; potreba da se materijal dalje razmnožava; pojava

mrke ili crne boje u agaru (biljna tkiva ponekad otpuštaju toksične supstance u toku prvih

nedelja kultivacije, koje prodiru u agar ili tečnu podlogu);

9

2. CILJ RADA

10

Cilj ovog rada bio je ispitivanje efekata različitih regulatora rastenja na regeneraciju

Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro. Indukcija aksilarnih pupoljaka, njihova

multiplikacija i izduživanje je stimulisana korišćenjem različitih regulatora rastenja iz grupe

citokinina i auksina a ožiljavanje dobijenih izdanaka i formiranje kompletne biljke

korišćenjem auksina u različitim koncentracijama.

11

3. MATERIJAL I METODE

12

3.1 Biljni materijal

Za potrebe ovog eksperimentalnog rada biljke Micromeria croatica prikupljene su na Mokroj

Gori. Korišćen je biljni materijal Micromeria croatica iz vegetativne faze. U eksperimentu su

korišćeni nodalni eksplantati. Na svaku podlogu postavljano je po 30 nodalnih eksplantata.

Vršni pupoljak se nije koristio za eksplantat.

3.2 Sterilizacija biljnog mterijala

Sterilizacija nodalnih segmenata (u daljem tekstu eksplantat) Micromeria croatica obavljena

je 25% - nim rastvorom varikine (komercijalni naziv natrijum hipohlorita - NaOCl sa 60 g

aktivnog hlora/l) u trajanju od 25 minuta. Nakon sterilizacije eksplantati su isprani sterilnom

destilovanom vodom tri puta. U cilju eliminacije gljivične infekcije eksplantati su 24 časa

potapani u sterilni rastvor nistatina (5%), a zatim isprani sterilnom destilovanom vodom tri

puta. Ovako pripremljeni eksplantati su u aseptičnim uslovima postavljani na odgovarajuće

hranljive podloge.

3.3. Sterilizacija hranljivih podloga i pribora

Hranljive podloge su sterilisane u autoklavu na temperaturi 120 °C i pritisku od 1 Bar.

Dužina autoklaviranja podloge na ovoj temperaturi iznosi 25 minuta. Sterilizacija

instrumenata se započinje iskuvavanjem u destilovanoj vodi u trajanju od 30 minuta.

Iskuvani instrumenti se vade pomoću pincete i prebacuju u čašu sa 70-95% alkoholom. Pre

upotrebe opaljivanjem na plamenu špiritusne lampe instrumenti se dodatno sterilišu.

3.4. Hranljive podloge – postupak pripremanja Odmeriti menzurom vodu za pripremu podloge i presuti je u lonac za kuvanje. Uključiti

grejanje na najjače i u mlaku vodu dodati agar uz mešanje. Količina vode za podlogu

13

određuje se tako što se od finalne zapremine odbije zapremina nešto malo veća od zapremine

stoka makro soli. Uz povremeno mešanje sačekati da voda sa agarom provri. Lonac skinuti sa

vatre i dodati redom: saharozu, inozitol, makro soli, mikro soli, rastvor gvožđa, vitamine i

hormone. Zakuvana podloga vraća se u menzuru da bi se doterala zapremina dodavanjem

destilovane vode. Pre razlivanja u posude proverava se pH vrednost podloge koji treba da

bude 5,8 uz pomoć 0,1N NaOH ili 0,1N HCl.

3.4.1. Hranljiva podloga MS Hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu bila je Murashige, T. and Skoog, F. (1962)

– MS podloga. Ova hranljiva podloga ima određeni sastav makro, mikro mineralnih soli i

organskih dodataka. Sastav je prikazan u sledećim tabelama:

Makro mineralne soli MS (mg/l)

NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 × 2H2O 440 MgSO4 × 7H2O 370 KH2PO4 170

Mikro mineralne soli

MS (mg/l)

Mn SO4 × 4H2O 22.3 Zn SO4 × 7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KJ 0.83 NaMoO4 × 2H2O 0.25 CuSO4 × 5 H2O 0.025 CoCl2 × 6 H2O 0.025 FeSO4 × 7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3

14

Osim makro i mikro mineralnih soli hranljivim podlogama se dodaju i organski dodaci:

Organski dodaci

MS (mg/l)

vitamin B1 0.4 vitamin B6 0.5 nikotinska kiselina 0.5 Glicin 2.0

(g/l) Mioinozitol 0,15 Saharoza 45,0 Agar 10,5

3.4.2. Hranljive podloge koje su korišćene za indukciju aksilarnih pupoljaka

Micromeria croatica

Ispitivanje uticaja regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka je vršeno na podlozi

MS:

Hranljiva podloga

1 2 3 4 5 6 7 8

Kinetin (μM)

0 0 0,1 0,3 1,0 3,0 10,0 30,0

IAA (μM) 0

0,57

0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57

Eksplantati su postavljani u staklene teglice (5×5×12 cm). Svaka od pripremljenih hranljivih

podloga je razlivena u po 3 teglice. U svaku teglicu postavljeno je po 10 eksplantata, na taj

način je na svaki tretman postavljeno po 30 eksplantata. Uslovi za gajenje kulture bili su:

temperatura 21 ± 2 °C, fotoperiod od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka. Četiri nedelje nakon

postavljanja eksplantata na različite hranljive podloge utvrđen je broj aksilarnih pupoljaka po

eksplantatu i njihova dužina.

15

3.4.3. Hranljive podloge koje su korišćene za razviće aksilarnih pupoljaka Micromeria

croatica

U cilju izduživanja aksilarnih pupoljaka korišćena je podloga MS bez regulatora rastenja. Na

ovoj podlozi izdanci su gajeni 4 nedelje a nakon toga su preneti na podloge za ožiljavanje.

3.4.4. Hranljive podloge koje su korišćene za indukciju korenova na aksilarnim

izdancima Micromeria croatica

Za ožiljavanje korišćeni su izdanci dužine ne manje od 10 mm. Hranljiva podloga korišćena

tokom ožiljavanja izdanaka sadržala je MS mineralni rastvor koja je dopunjena sa α-naftil-

sirćetna kiselina (NAA) u koncentracijama od 0,1 do 1μM. Vrednost pH hranljive podloge se

podešava na 5,8 pre autoklaviranja na temperaturi od 120 ºC i pritisku od 1 atm tokom 30

minuta. Ožiljavanje izdanaka obavljeno je u staklenim teglama (5×5×12 cm), koje su

sadržale po 70 ml hranljive podloge. Eksplantati su gajeni na fotoperiodu od 8 sati mraka i 16

sati svetlosti na temperaturi od 21°C. Nakon tri nedelje evidentiran je broj formiranih

korenova na bazalnom kraju eksplantata.

3.5. Statistička analiza

Obrada podataka je urađena statističko-grafičkim paketom Statgraphics, procedura ANOVA i

test LCD na nivou značajnosti p<0,05. Statistička analiza je urađena za svaki parametar i u

tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su različitim

slovima, ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.

16

4. REZULTATI

17

4.1. Uspostavljenje kulture in vitro kod vrste M. croatica

Prema podacima iz literature M. croatica do sada nije uvedena u kulturu in vitro. Nodalni

eksplantati su u sterilnim uslovima postavljeni na hranljivu podlogu MS bez regulatora

rastenja. Na ovoj podlozi eksplantati su proveli 4 nedelje i tokom trajanja ove faze

eliminisani su eksplantati koji su zaraženi bakterijskom ili gljivičnom infekcijom, kao i oni

koji su bili zahvaćeni nekrozom. Nakon 4 nedelje zdrav i nezaražen materijal je prenet na

svežu hranljivu podlogu. Ovaj biljni materijal je primarni eksplantat koji je korišćen za

indukciju aksilarnih pupoljaka na nodalnim segmentima M. croatica.

4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. croatica

Radi indukcije aksilarnih pupoljaka eksplantati M. croatica su gajeni na hranljivoj podlozi

MS sa različitim koncentracijama citokinina kinetina u rasponu od 0 – 30,0 μM i auksina

indol-3-sirćetnom kiselinom u koncentraciji od 0,57 μM. Nodalni eksplantati su bili

postavljeni i na kontrolnu hranljivu podlogu MS bez hormona. Dve nedelje nakon

postavljanja eksplantata na MS hranljivu podlogu sa regulatorima rastenja različitih

koncentracija uočava se uspešno razviće nodalnih eksplantata u uslovima in vitro. Bez obzira

na koncentraciju korišćenih regulatora rastenja tokom prvih nedelja došlo je od pojave

aksilarnih pupoljaka na gotovo svim nodalnim eksplantatima bez obzira na kojoj su

induktivnoj podlozi gajeni (Slika 1).

U tabeli 1. prikazan je procenat eksplantata sa formiranim aksilarnim pupoljcima, prosečan

broj i prosečna dužina aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima. Na podlogama sa

niskim koncentracijama kinetina prosečan broj pupoljaka po eksplantatu je manji nego kod

eksplantata koji su gajeni na podlozi bez regulatora rastenja (Tab. 1). Veći broj pupoljaka

nego na kontrolnim eksplantatima zabeležen je kod eksplanatata gajenih na podlozi sa 1 μM

kinetina i 0,57 μM IAA odnosno 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA, što pokazuje i statistička

analiza (Tab. 1). Prosečna dužina pupoljaka bila je najveća na eksplantatima koji su gajeni na

podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA odnosno 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA. Ove

18

visoke koncentracije kinetina dovele su do povećanja dužine pupoljaka u odnosu na

eksplantate gajene na podlozi bez regulatora rastenja (Tab. 1).

Tabela 1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria croatica

Tretman Eksplanati sa aksilarnim

pupoljcima (%)

Prosečan broj pupoljaka

po eksplantatu

Prosečna dužina pupoljaka (mm)

1 Bez hormona 100 8,21± 1,05abc 7,16 ± 0,44bc 2 0 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 6,32 ± 0,78a 6,95 ± 0,46bc 3 0,1 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 6,00 ± 0,67a 5,25 ± 0,42a 4 0,3 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 6,56 ± 0,76a 6,26 ± 0,43ab 5 1 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 9,81 ± 1,03c 6,81 ± 0,36b 6 3 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 7,50 ± 0,79ab 6,68 ± 0,37b 7 10 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 7,93 ± 0,76abc 8,16 ± 0,44c 8 30 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 9,94 ± 1,33c 8,04 ± 0,53c

Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p<0.05

Biljke Micromeria croatica uspešno su rasle na hranljivoj podlozi MS bez regulatora rastenja

(Slika 1). Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu na ovoj podlozi, koja služi kao kontrolna

podloga, bio 8,21 pupoljaka po eksplantatu, a prosečna dužina pupoljaka bila je 7,16 mm

(Tab. 1).

Slika 1. M. croatica na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja

19

Na hranljivoj podlozi MS sa 0,57 μM IAA prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je

6,32, što je značajno manje nego na eksplantatima sa kontrolne podloge (Tab.1). Niska

koncentracija auksina u podlozi dovela je do skraćivanja internodija, pa ove biljke imaju

žbunastu, nisku formu (Slika 2). Takođe, prosečna dužina pupoljaka je manja nego prosečna

dužina pupoljaka na kontrolnim eksplantatima i iznosi 6,95 mm (Tab.1).

Slika 2. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,57 μM IAA

Na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM kinetina i 0,57 μM IAA je zabeležen najmanji prosečan

broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu koji iznosi 6.0 i najmanja prosečna dužina pupoljaka

od 5.25 mm (Tab.1). Niske koncentracije citokinina i auksina dovele su do značajnog

smanjenja broja formiranih pupoljaka na eksplantatima u poređenju sa kontrolnim

eksplantatima gajenim bez regulatora rastenja, takođe uticale su i da pupoljci imaju manju

dužinu (Tab.1). Na ovoj podlozi primećena je najveća raznolikost u izgledu i dužini

eksplantata, tako se mogu uočiti kratke izrazito žbunaste forme ali i one sa znatno izduženim

internodijama (Slika 3).

20

Slika 3. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM Kin i 0,57 μM IAA

Gajenjem M. pulegium na hranljivoj podlozi sa 0,3 μM kinetina i 0,57 μM IAA na

eksplantatima je formirano prosečno 6,56 aksilarnih pupoljaka čija je prosečna dužina bila

6.26 mm (Tab.1). Eksplantati gajeni na niskim koncentracijama auksina nisu se morfološki

razlikovali (Slika 4).

Slika 4. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,3 μM kinetina i 0,57 μM IAA

21

Na MS hranljivoj podlozi sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA došlo je do znatnog povećanja

prosečnog broja pupoljaka po eksplantatu koji je iznosio je 9,81 (Tab.1). Ipak, prosečna

dužina pupoljaka od 6,81 mm još uvek je manja nego kod kontrolnih eksplantata. Biljke

gajene na podlozi sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA su razgranate, zelene boje sa izduženim

internodijama (Slika 5, 6).

Slika 5. M. croatica na podlozi MS sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA

Slika 6. Eksplantati M. croatica na podlozi MS sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA

22

Na eksplantatima M. croatica gajenim na MS hranljivoj podlozi sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA

posečan broj formiranih aksilarnih pupoljaka bio je 7,50 a njihova prosečna dužina 6,68 mm

(Tab. 1). Eksplantati na ovoj podlozi su se razlikovali od biljaka koje su gajene na kontrolnoj

podlozi, biljke su kratke, žbunaste, skraćenih internodija (Sl. 7).

Slika 7. M. croatica na podlozi MS sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA

Na podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA na eksplantatima je prosečno formirano 7, 93

aksilarnih pupoljaka, što je manje nego kod kontrole a prosečna dužina pupoljaka bila je 8,16

mm što je veća dužina nego kod kontrolnih eksplantata (Tab. 1). Eksplantati su vitalni,

razgranati, zelene boje, ali kratkih internodija (Sl. 8).

23

Slika 8. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA

Na podlozi sa 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA došlo je do formiranja najvećeg prosečnog

broja pupoljka, 9,94, čija je prosečna dužina bila najveća 8,04 mm (Tab. 1). U poređenju sa

eksplantatima gajenim bez egzogeno dodatih regulatora rastenja ova podloga je i statistički

značajno uspešnija. Eksplantati su razgranati i vitalni sa izduženim internodijama (Sl. 9).

Slika 9. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA

24

Dobijeni rezultati predstavljeni su u histogramu 1. gde se vidi odnos između koncentracije

korišćenih regulatora rastenja i broja formiranih aksilarnih pupoljaka kao i njihove dužine.

Histogram1. Uticaj hranljive podloge i regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka

M. croatica

4.3. Indukcija korenova na aksilarnim izdancima Micromeria croatica Za indukciju rizogeneze korišćeni su izdanci Micromeria croatica dužine oko 10 mm koji su

dobijeni procesom indukcije aksilarnih pupoljaka. Hranljiva podloga za indukciju korenova

bila je MS sa četiri različite koncentracije auksina α - naftil sirćetne kiseline NAA (0,1 μM;

0,2 μM i 0,3 μM i 1 μM). Nakon tri nedelje došlo je do formiranja korenova na izdancima M.

croatica. Koren se uglavnom formirao na bazalnom kraju izdanka ili na nodusu stabla (slika

10).

0

2

4

6

8

10

12

kontrola 0,57 IAA 0,1 kin 0,57 IAA

0,3 kin 0,57 IAA

1 kin 0,57 IAA

3 kin 0,57 IAA

10 kin 0,57 IAA

30 kin 0,57 IAA

Prosečan broj pupoljaka po eksplantatuProsečna dužina pupoljaka (mm)

25

Slika 10. Ožiljavanje M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM NAA

Na hranljivoj podlozi sa 0,1μM IAA ožiljeno je 80 % postavljenih izdanaka, (Tab. 2) dok je

sa povećanjem korišćene koncentracije auksina procenat ožiljenih izdanaka bio manji.

Tabela 2. Indukcija korenova na aksilarnim izdancima M. croatica

Podloga

Procenat ukorenjenih izdanaka

NAA 0,1 mg/l 80,0 % NAA 0,2 mg/l 63,3 % NAA 0,3 mg/l 43,3 % NAA 1 mg/l 63,3 %

26

5. DISKUSIJA

27

Vegetativno razmnožavanje biljaka M. croatica nodalnim eksplantatima in vitro je bilo

uspešno. Na osnovu urađenog eksperimenta definisani su uslovi pod kojima dolazi do

indukcije aksilarnih pupoljaka, njihovog izduživanja i ožiljavanja izdanaka M. croatica.

Gajenjem eksplantata M. croatica na hranljivoj podlozi MS bez regulatora rastenja došlo je

do formiranja prosečno 8,21 aksilarnih pupoljaka po eksplantatu. Indukcija aksilarnih

pupoljaka bez egzogeno dodatih regulatora rastenja zabelešena je kod Micromeria pulegium

(Tošić et al. 2013) i kod Salvia brachyodon (Mišić et al. 2006).

Dodavanje auksina u hranljivu podlogu dovelo je do smanjenog broja formiranih aksilarnih

pupoljaka po eksplantatu, suprotno rezultatima Sujana i Naidu (2011), koji su ustanovili

stimulativni efekat auksina na indukciju aksilarnih pupoljaka kod Mentha piperita. Takođe,

kombinacija auksina i niskih koncentracija kinetina indukuje manji broj aksilarnih pupoljaka

na eksplantatima u poređenju sa podlogom bez regulatora rastenja. Isti, inhibitorni efekat ima

kombinacija auksina i kinetina na dužinu aksilarnih pupoljaka.

Najveći broj aksilarnih pupoljaka formiran je na eksplantatima gajenim na podlogama kojima

je osim auksina dodat 1 μM kin ili 30 μM kin. U odnosu na kontrolu ove kombinacije

hormona su pokazale stimulativni efekat na indukciju aksilarnih pupoljaka. Niske

koncentracije auksina i različitih koncentracija citokinina imale su pozitivan uticaj na

indukciju aksilarnih pupoljaka kod Salvia (Cuenca et al. 2000), Calendulla (Çöçü et al.

2004), Cataranthus (Yuan et al. 1994). Kinetin u kombinaciji sa auksinom je pozitivno

delovao na indukciju pupoljaka kod Mentha piperita (Venkatramalingam and Ebbie, 2011).

Stimulativni efekat na dužinu pupoljaka imale su podloge sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA i

30 μM kinetina i 0,57 μM IAA, ostale korišćene podloge delovale su inhibitorno. Ovakvi

rezultati su suprotni od rezultata dobijenih kod Ocimum sanctum (Singh and Sehgal 1999),

Nepeta rtanjensis (Mišić et al. 2005) kod kojih su pupoljci eksplantata gajenih na podlozi bez

regulatora rastenja bili najduži.

28

Promene koje su uočene na izdancima koji su postavljeni na hranljive podloge za ožiljavanje

primećene su tokom treće nedelje. Začeci korena formiraju se u bazi izdanka i na prvom

nodusu stabla. Za stimulisanje ožiljavanja izdanaka M. croatica korišćena je α-naftil sirćetna

kiselina (NAA). Na podlozi sa najnižom koncentracijom NAA (0,1 μM) ožiljeno je 80%

izdanaka, sa povećanjem koncentracije NAA u podlozi procenat ukorenjenih biljaka bio je

manji, pa je na podlozi sa NAA 0,2 μM ožiljeno 63,3% izdanaka a na podlozi sa NAA 0,3

μM ožiljeno 43,3% i sa 1 μM ožiljeno je 63,3% izdanaka. Stimulativni uticaj različitih

koncentracija NAA na ožiljavanje zabeležen je kod izdanaka Salvia brachyodon (Mišić et al.

2006), kao i kod Salvia fruticosa (Arikat et al. 2004).

29

6. ZAKLJUČAK

30

Micromeria croatica je uspešno uvedena u kulturu in vitro. Najveći broj aksilarnih pupoljaka

9,94 dobijen je gajenjem nodalnih eksplantata M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 30

μM kinetina i 0,57 μM IAA. Najveća dužina pupoljaka (8,16 mm) dobijena je na

eksplantatima koji su gajeni na podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA.

Izdanci M. croatica dobijeni indukcijom su nakon izduživanja postavljani na podloge za

ožiljavanje. Ožiljavanje na podlogama sa NAA je bilo uspešno. Najniža korišćena

koncentracija NAA (0,1 μM) dovela je do ožiljavanja čak 80% eksplanata, a sa povećanjem

koncentracije NAA procenat ukorenjenih izdanaka bio je manji. Ožiljavanjem izdanaka

postignuta je kompletna regeneracija biljaka M. croatica.

Dobijeni rezultati pokazuju da je korišćenjem metode mikropropagacije moguće dobiti veliki

broj biljaka Micromeria croatica od početno male količine biljnog materijala.

31

7. LITERATURA

32

1. Arikat, N.A.; Jawad, F.M.; Karam, N.S. and Shibli, R.A. (2004): Micropropagation

and accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.). Scientia Hort. 100,

193-202.

2. Bräuchler, C., Ryding, O. and Heubl, G. (2008): The genus Micromeria

(Lamiaceae), a synoptical update. Willdenowia 38: 363-410.

3. Bentham G (1829). Micromeria Bot Reg 15: t. 1282.

4. Çöçü, S., Uranbey, S., İpek, A., Khawar, K.M., Sarihan, E.O., Kaya, M.D.,

Parmaksiz, İ., Özcan, S.: Adventitious shoot regeneration and micropropagation in

Calendulla officinalis L. - Biol. Plant. 48: 449-451, 2004.

5. Cuenca, S. and Amo-Marco, J.B. (2000): In vitro propagation of two Spanish

endemic species of Salvia through bud proliferation. In Vitro cell. Dev. Biol. Plant 36,

225-229.

6. Kremer D, Stabentheiner E, Dunkić V, Müller ID, Vujić L, Kosalec I, Ballian D,

Bogunić F, Bezić N. Chem Biodivers. (2012): Micromorphological and

chemotaxonomical traits of Micromeria croatica (Pers.) Schott. 9 (4): 755-680.

7. Mišić, D.; Grubišić, D.; Konjević, R. (2006): Micropropagation of Salvia

brachyodon through nodal explants. Volume 50, Number 3, pp. 473-476(4).

8. Mišić, D., Ghalawenji, N.A., Grubišić, D., Konjević, R.: Micropropagation and

reintroduction of Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević, an endemic and critically

endangered perennial of Serbia. - Phyton 45: 9-20, 2005.

9. Murashige T. and Skoog F. (1962): A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobaco tissue cultures. Phisiol. Plant. 15: 473-497.

10. Parić, A., Pustahija, F., Karalija E. (2011): Propagacija biljaka kulturom in vitro.

Prirodno – Matematički fakultet, Sarajevo. 65 – 95.

11. Singh, N.K., Sehgal, C.B.: Micropropagation of ‘Holy Basil’ (Ocimum sanctum

Linn.) from young inflorescences of mature plants. - Plant Growth Regul. 29: 161-166,

1999.

12. Slavkovska V. , Couladis M., Bojovic S., Tzakou O., Pavlovic M., Lakusic B., and

Jancic R. (2005): Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria

Bentham from Serbia and Montenegro. Pl. Syst. Evol. 255: 1–15.

33

13. Stevanović V. et al. (1999): Crvena knjiga flore Srbije. 1, Isčezli i krajnje

ugroženi taksoni Ministarstvo za životnu sredinu republike Srbije, Beograd; Biološki

fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd; Zavod za zaštitu prirode Republike Srbije,

Beograd, 380-382.

14. Sujana, P., Naidu, C.V., (2011): Impact of Different Carbohydrates on High

Frequency Plant Regeneration from Axillary Buds of Mentha piperita (L.) – An

Important Multipurpose Medicinal Plant. Journal of Phytology 2011, 3(5): 14-18.

15. Tatić B., Blečić V. (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka. Univerzitetski

udžbenik, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, 314 - 316.

16. Tošić, S., Stojičić, D., Zlatković, B., Mitrović, T., Stamenković, S., Spasić, J., Šelmić,

N. (2013): Micropropagation of Micromeria pulegium. 11th Symposium on the Flora of

Southeastern Serbia and Neighbouring Regions, Vlasina Lake, p.p. 76.

17. Venkatramalingam, K., Ebbie M.G. (2011): An efficient in vitro culture method of

shoot regeneration for a medicinary important plant Mentha piperita.

18. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija

biljaka. Axial, P.O., Beograd (15-54).

19. Yuan, Y.J., Hu, T.T., Yang, Y.M. (1994): Effects of auxins and cytokinins on

formation of Cataranthus roseus G. Don multiple shoots. - Plant Cell Tissue Organ Cult.

37: 193- 196,.

34

Biografija kandidata

Aleksandra Ristić rođena je 12. Marta 1988. godine u Leskovcu. Završila je osnovnu školu

,,Đura Jakšić” u Turekovcu (Leskovac), a nakon toga 2003. godine upisuje srednju

medicinsku školu, odsek laboratorijski tehničar.

Nakon završene srednje škole, 2007. godine, započinje osnovne akademske studije na

Prirodno-matematičkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i

ekologiju, koje završava 2010. godine sa zvanjem ,,biolog”. Iste godine upisuje master

akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju, smer Biologija, koje završava

2013.

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Aleksandra Ristić

Mentor, MN: Dragana Stojičić

Title, TI: “The effect of different growth regulators on the regeneration Micromeria croatica

(Pers.) Schott in vitro”

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2013

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

34 p. ; 10 figures, 2 tables, 1histogram

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Biology

Subject/Key words, S/KW: Micromeria croatica, kinetinе, axillary buds.

UC 581.143.5+581.143:582.929

Holding data, HD: Library

Note, N:

Abstract, AB: Micromeriacroatica (Pers.) is endemic to The Dinaric Alps, a mountain range in Southern

Europe. In Serbia it can be found on Mokra Gora. It is also present in Croatia, Bosnia and

Herzegovina and Montenegro. Micromeria croatica is an endangered species and it is

listed on the Red List of Vascular Plants of Serbia and Montenegro. According to the

existing literature this species has not been introduced in vitro culture. Different regulators

of growth were used for examinations of the possibility of regeneration of Micromeria

croatica through induction of axillary buds on nodal explants. Our results show that the

most effective combinations of growth regulators were: 1 μM Kin and 0,57μM IAA, and

30 μM Kin and 0,57 μM IAA. The axillary buds developed this way were elongated on a

hormone-free surface. After that root initiation started due to the effects of auxin 0,1 μM

NAA. In this way Micromeria croatica was successfully regenerated in in vitro conditions.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Александра Ристић

Ментор, МН: Драгана Стојичић

Наслов рада, НР: “Ефекти различитих регулатора растењa на регенерацију Micromeria croatica

(Pers.) Schott in vitro”

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2013.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

34 стр. ; 10 слика, 2 табеле, 1 хистограм

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Биологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria croatica, кинетин, аксиларни пупољци.

УДК 581.143.5+581.143:582.929

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Micromeria croatica (Pers.) je endemična vrsta Dinarida, planinskog masiva u južnoj

Evropi. Na teritoriji Srbije zabeležena je na Mokroj Gori. Takođe rasprostranjena je u

Hrvatskoj, Bosni i Hercegovini i Crnoj Gori. Micromeria croatica je ugrožena vrsta na

Crvenoj listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore. Prema dostupnoj literaturi ova biljna vrsta

do sada nije uvedena kulturu in vitro. Korišćenjem različitih regulatora rastenja ispitivana

je mogućnost regeneracije biljaka M. croatica putem indukcije aksilarnih pupoljaka na

nodalnim eksplantatima. Prema našim rezultatima najefikasnije kombinacije regulatora

rastenja bile su: 1 μM Kin i 0,57 μM IAA, i 30 μM Kin i 0,57 μM IAA. Dobijeni aksilarni

pupoljci su izduživani na podlozi bez hormona a zatim i ožiljeni delovanjem auksina 0,1

μM NAA. Na ovaj način je uspešno regenerisana Micromeria croatica u uslovima in vitro.

Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1