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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA Evaluación bacteriológica de leche cruda, sometida a tres concentraciones de ozono, mediante su comprobación microbiológica en placas petrifilm. Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del Título de Médico Veterinario Zootecnista. Autor: Alex Wladimir Soque Díaz Tutor: Dr. Jorge Adalberto Mosquera Andrade Quito, mayo 2019

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA … · 2019-06-04 · disminución de la carga bacteriana presente en la leche cruda. Las distintas muestras de leche cruda recolectadas

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  • UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

    FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

    CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

    Evaluación bacteriológica de leche cruda, sometida a tres concentraciones de

    ozono, mediante su comprobación microbiológica en placas petrifilm.

    Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del

    Título de Médico Veterinario Zootecnista.

    Autor:

    Alex Wladimir Soque Díaz

    Tutor:

    Dr. Jorge Adalberto Mosquera Andrade

    Quito, mayo 2019

  • i

    © DERECHOS DE AUTOR

    Yo, Alex Wladimir Soque Díaz en calidad de autor y titular de los derechos

    morales y patrimoniales del trabajo de titulación “EVALUACIÓN

    BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES

    CONCENTRACIONES DE OZONO, MEDIANTE SU COMPROBACIÓN

    MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”, modalidad presencial.

    Proyectos de investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO

    ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,

    CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central

    del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no

    comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor

    todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

    Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

    digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual,

    de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación

    Superior.

    El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en

    su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo

    la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta

    causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

    Firma:

    Alex Wladimir Soque Díaz

    C.I.: 1723712780 Dirección electrónica: [email protected]

  • ii

    INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR

    En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor ALEX

    WLADIMIR SOQUE DIAZ, para optar por el Título de Médico Veterinario y

    Zootecnista, cuyo título es: “EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE

    CRUDA, SOMETIDA A TRES CONCENTRACIONES DE OZONO,

    MEDIANTE SU COMPROBACIÓN MICROBIOLÓGICA EN PLACAS

    PETRIFILM”. Considero que dicho trabajo, reúne los requisitos y méritos

    suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del

    tribunal examinador que se designe.

    En la ciudad de Quito, a los 22 días del mes de abril del 2019.

    Dr. Jorge Adalberto Mosquera Andrade

    C.I.: 1702609197

    E-mail: [email protected]

  • iii

    APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL

    El tribunal constituido por:

    Dr. Byron Puga, Dra. María Inés Baquero y Dra. Martha Naranjo.

    Luego de aceptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la

    obtención del título (o grado académico) de Médico Veterinario Zootecnista

    presentado por el señor Alex Wladimir Soque Díaz.

    Con título:

    “EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES

    CONCENTRACIONES DE OZONO, MEDIANTE SU COMPROBACIÓN

    MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”.

    Emiten el siguiente veredicto (aprobado/reprobado)

    Fecha

    Para constancia de lo actuado firman:

    Nombre y Apellido Calificación Firma

    Presidente Dr. Byron Puga

    Vocal Principal Dra. María Inés Baquero

    Vocal Principal Dra. Martha Naranjo

  • iv

    DEDICATORIA

    “Te he mandado que seas fuerte y valiente. No tengas, pues, miedo ni te acobardes, porque el Señor tu Dios estará contigo dondequiera que vayas.”

    Josué 1:9 Gracias Señor Dios por permitirme cumplir mis sueños y guiar mis pasos bajo tu guía

    y protección.

    A mis padres Inés y Apolinario por todo el cariño y entrega, además de enseñarme

    que la honestidad, la humildad y el amor son las armas más poderosas para enfrentar

    las adversidades del mundo.

    A mis hermanos Leonardo, Boris, Eduardo; a mi cuñada Flor Catalina y a mi sobrina

    Sofía.

    A todos ellos, mi familia, mis mejores amigos, el mejor regalo que Dios me dio. Ellos

    que siempre han creído en mí. Muchas gracias.

    Alex Soque Díaz

  • v

    RECONOCIMIENTO

    Quiero iniciar mencionando a la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de

    Medicina Veterinaria y Zootecnia por permitirme realizar mis estudios.

    Al Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria y

    Zootecnia por haberme prestado las facilidades para realizar la fase experimental de

    este estudio.

    Un reconocimiento especial al Doctor Jorge Mosquera por concederme la confianza

    para realizar este proyecto, por toda su paciencia y la orientación durante el desarrollo

    del mismo.

    A la Doctora María Inés Baquero un reconocimiento por toda la colaboración, las

    enseñanzas y el apoyo brindado durante la realización de mi tesis.

    Al Proyecto Semilla “Efecto del ozono en leche en la disminución de carga bacteriana

    y el mantenimiento de sus propiedades físico químicas” por permitirme ser parte del

    mismo.

    Y a todas las personas, amigos, compañeros de estudio, profesores, que de alguna

    manera me brindaron su apoyo durante la realización de este proyecto, muchas

    gracias a todos.

    Alex Soque Díaz

  • vi

    ÍNDICE GENERAL

    RESUMEN ................................................................................................................... x

    ABSTRACT ................................................................................................................. xi

    CAPÍTULO I ................................................................................................................ 1

    INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1

    CAPÍTULO II ............................................................................................................... 4

    OBJETIVOS ............................................................................................................. 4

    GENERAL ............................................................................................................. 4

    ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 4

    CAPÍTULO III .............................................................................................................. 5

    MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 5

    Generalidades ...................................................................................................... 5

    Ozono ................................................................................................................... 5

    Síntesis y Estructura Molecular del Ozono ........................................................... 6

    Características físico-químicas del ozono ............................................................. 8

    Principios del Tratamiento con Ozono .................................................................. 9

    Equipamiento para el tratamiento de ozono de los alimentos ............................... 9

    Ozono en Estado Acuoso ..................................................................................... 9

    Ozono en Estado Gaseoso ................................................................................... 9

    Ventajas y Desventajas de la Ozonoterapia ....................................................... 10

    Mecanismo de Acción Antimicrobiana del Ozono ............................................... 11

    Uso de petrifilm en el análisis microbiológico de alimentos ................................ 11

    CAPÍTULO IV ............................................................................................................ 14

    MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 14

  • vii

    Materiales ........................................................................................................... 14

    Metodología ........................................................................................................... 17

    Lugar de Estudio ................................................................................................. 17

    Tipo de Investigación .......................................................................................... 17

    Ozono y Tratamientos......................................................................................... 17

    Muestreo ............................................................................................................. 19

    Análisis Microbiológico........................................................................................ 19

    Análisis Estadístico ............................................................................................. 19

    CAPÍTULO V ............................................................................................................. 20

    RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 20

    Correlación estadística entre concentración (tiempo-dosis) y reducción del

    recuento microbiano ........................................................................................... 25

    Discusión ............................................................................................................ 25

    ANÁLISIS DE COSTOS PARCIALES .................................................................... 28

    CAPÍTULO VI ............................................................................................................ 31

    CONCLUSIONES .................................................................................................. 31

    CAPÍTULO VII ........................................................................................................... 32

    BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 32

    ANEXOS ................................................................................................................... 42

  • viii

    ÍNDICE DE TABLAS

    Tabla 1. Breve reseña de logros y certificaciones alcanzadas por el ozono. .............. 6

    Tabla 2.Características físico-químicas del ozono ...................................................... 8

    Tabla 3.Materiales biológicos utilizados en la fase de campo. .................................. 14

    Tabla 4.Materiales químicos empleados en la fase de campo. ................................. 14

    Tabla 5.Materiales físicos utilizados en la fase de campo. ........................................ 14

    Tabla 6. Materiales químicos utilizados durante la fase de laboratorio del estudio. .. 15

    Tabla 7.Materiales físicos utilizados durante la experimentación en el laboratorio. .. 15

    Tabla 8.Implementos y suministros adicionales durante la ejecución del estudio. .... 16

    Tabla 9.Lista de equipos empleados durante la realización del estudio. ................... 16

    Tabla 10.Tipos de tratamientos según la dosis de ozono y el tiempo de exposición. 18

    Tabla 11.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche

    tratada con ozono según dosis y tiempo de exposición. ........................................... 22

    Tabla 12: Comparación de los resultados de T9 (Log10 UFC/ml) con los parámetros

    establecidos en la Norma NTE INEN 10 Leche pasteurizada. Requisitos ................ 23

    Tabla 13.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche

    tratada con ozono (T9), leche hervida y leche UHT .................................................. 23

    Tabla 14.Valores de “p” para cada recuento, tras la comparación de T9 con la leche

    hervida, T9 con la leche UHT y T9 con el testigo (leche cruda). ............................... 24

    Tabla 15. Análisis de costos parciales del tratamiento testigo. ................................. 28

    Tabla 16. Análisis de costos parciales por tratamientos experimentales. ................. 28

    Tabla 17. Análisis de costos parciales de la leche pasteurizada UHT. ..................... 29

    Tabla 18. Análisis de costos parciales de la leche hervida ....................................... 29

    Tabla 19. Comparación de costos entre el testigo, la leche hervida, la leche

    pasteurizada UHT y el tratamiento de ozono (T9). .................................................... 29

  • ix

    ÍNDICE DE FIGURAS

    Figura 1. . Reacción química a partir de la molécula de oxígeno para generar ozono. 7

    Figura 2. Molécula de ozono. ...................................................................................... 7

    Figura 3.Diferencias en la carga bacteriana de la leche tras la aplicación de

    ozonización. .............................................................................................................. 20

    Figura 4. Diferencias en la carga bacteriana de la leche, donde a la dosis más alta se

    llegó a un valor de 0 para coliformes totales. ............................................................ 21

    Figura 5. Diferencias en la carga bacteriana de Escherichia coli donde a la dosis más

    alta se llegó a un valor de 0....................................................................................... 21

    Figura 6. Comparación de resultados de los tres distintos tratamientos en estudio. . 24

  • x

    TEMA: “EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES

    CONCENTRACIONES DE OZONO, MEDIANTE SU COMPROBACIÓN

    MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”.

    Autor: Alex Wladimir Soque Díaz

    Tutor: Jorge Adalberto Mosquera Andrade

    Fecha: Mayo 2019

    RESUMEN

    La presente investigación tuvo como objetivo determinar el efecto del ozono en la

    disminución de la carga bacteriana presente en la leche cruda.

    Las distintas muestras de leche cruda recolectadas fueron sometidas a cultivo antes y

    después de la aplicación de ozono a dosis de 50, 75 y 100 mg/l durante 10, 20 y 30

    minutos. Además, se cultivaron muestras de leche sometida a ebullición y

    ultrapasteurizada. La eficacia del ozono fue evaluada al cuantificar la carga microbiana

    de mesófilos aerobios totales, coliformes totales, Escherichia coli, Listeria

    monocytogenes y Salmonella spp.

    En la leche control (sin tratamiento), el conteo de mesófilos aerobios totales fue 3,90

    Log10UFC/ml; 3,68 Log10UFC/ml para coliformes totales y 3,67 Log10UFC/ml para

    Escherichia coli; no se demostró crecimiento de Listeria monocytogenes y Salmonella

    spp. El tratamiento con 100 mg de O3 por 30 minutos redujo la población de mesófilos

    aerobios totales a 1,37 Log10UFC/ml y a 0 Log10UFC/ml en coliformes totales y

    Escherichia coli. La leche hervida mostró recuentos bacterianos más altos que la leche

    UHT y la leche ozonizada (T9). La leche UHT presentó niveles de mesófilos aerobios

    totales más altos (p≥ 0.05) en relación a las muestras de leche tratadas con ozono.

    En conclusión, la ozonización fue efectiva para disminuir la carga bacteriana en leche

    cruda.

    PALABRAS CLAVE: LECHE, OZONO, TRATAMIENTO CON OZONO, CALIDAD

    MICROBIOLÓGICA

  • xi

    TITLE: “BACTERIOLOGICAL ASSESSMENT OF RAW MILK, AGAINST THREE OZONE CONCETRATION, USING MICROBIOLOGICAL CHECKING ON PETRIFILM PLATES”.

    Author: Alex Wladimir Soque Diaz Tutor: Jorge Adalberto Mosquera Andrade

    Date: May 2019

    ABSTRACT

    The present research work has as its main objective to determine the effect

    of ozone in the decrease of bacterial burden existing in raw milk.

    The different samples of raw milk collected were put into culture before and after of application of

    ozone in different dosages: 50, 75 and 100 mg/I during 10, 20 and 30 minutes. In addition,

    samples of milk to boiling point and ultra pasteurised were cultured. The efficacy of ozone was

    assessed when quantifying microbial burden of total mesophilic aerobic, total coliforms,

    Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Salmonella spp.

    In the control milk (no treatment), a count of total mesophilic aerobic was 3.90 Log10 UFC/ml; 3.68

    Log10 UFC/ml for total coliforms and 3.67 Log10 UFC/mI for Escherichia coli; no development of

    Listeria monocytogenes and Salmonella spp was shown. The treatment with 100 mg of O3 for 30

    minutes reduced population of total mesophilic aerobic to 1.37 Log10 UFC/ml and 0 Log10

    UFC/ml in total coliforms and Escherichia coli. Boiled milk showed higher bacterial

    count than UHT milk and ozonised milk (T9). UHT milk presented higher levels of

    mesophilic aerobic (p>0.05) in comparison with the samples of milk with ozone.

    In conclusion, ozonation was efective at diminishing bacterial burden in raw milk.

    KEY WORDS: MILK, OZONE, TREATMENT WITH OZONE, MICROBIOLOGICAL QUALITY.

    El Centro Educacional de Idiomas y Especializaciones Administrativas CENDIA C.A certifica, mediante firma del traductor y sello de la institución, haber realizado la traducción del presente documento.

  • 1

    CAPÍTULO I

    INTRODUCCIÓN

    Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura

    (FAO), la producción mundial de leche alcanzó los 833,5 millones de toneladas para

    el año 2017 (FAO, 2017). En Ecuador, de acuerdo a datos de la Encuesta de Superficie

    y Producción Agropecuaria Continua, la producción láctea para el año 2017 fue de

    5,135 millones de litros/día (INEC- ESPAC, 2017). La Asociación de Ganaderos de la

    Sierra y Oriente establece que, a nivel nacional, se consumen de 90 a 100 l/año/per

    capita de leche y productos derivados (AGSO, 2019).

    La leche es un alimento con alto grado de nutrientes; posee una consistencia líquida y

    un pH ligeramente ácido (Moncada, 2011), características que la convierten en un

    medio ideal para el crecimiento de microorganismos (Dahmer et al., 2007). La Norma

    Técnica Ecuatoriana del Instituto Nacional de Normalización NTE INEN 9 “Leche

    Cruda. Requisitos”, define a la leche cruda como aquella que no fue sometida a una

    temperatura superior a 40°C, estableciendo como límite máximo un recuento de

    microorganismos aerobios mesófilos de 1,5x106 UFC/ml (INEN, 2012). En el caso de

    leche pasteurizada, la norma NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada. Requisitos”

    establece un índice máximo permisible de buena calidad estimado en 3x104 UFC/ml

    de microorganismos aerobios mesófilos (INEN, 2012). Y para la leche larga vida, la

    normativa NTE INEN 701 “Leche Larga Vida. Requisistos” establece como límite

    máximo la presencia de hasta 10 colonias UFC/ml para ser declarada como leche

    comercialmente estéril (INEN, 2009).

    Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), por lo general, son de tipo

    infeccioso o tóxico, ocasionadas por bacterias, virus, parásitos o sustancias químicas

    contaminantes que pueden contener los productos finales o las materias primas, como

    es la leche cruda (OMS, 2016). En este sentido, y para garantizar el consumo de

    productos seguros e inocuos, la industria alimenticia ha investigado diversos procesos

  • 2

    que contrarresten a estos agentes microbianos, entre ellos el uso de ozono (Perry &

    Yousef, 2011).

    El procesamiento de la leche es esencial para asegurar su inocuidad y extender su

    vida útil, siendo la pasteurización el tratamiento térmico más usado. Los tratamientos

    térmicos han influenciado sobre propiedades nutricionales como la proteína del suero

    y el contenido de vitaminas de la leche, debido a que son componentes muy

    termolábiles. Además de causar cambios en la viscosidad y sabor de la misma (Lopes

    et al., 2016; Mejía-López et al., 2017).

    Debido a este impacto negativo sobre la calidad nutricional de la leche, han emergido

    nuevas técnicas y procedimientos no térmicos que buscan un producto de calidad

    (Lopes et al., 2016)

    El ozono es un desinfectante de rápida acción, cuyo efecto se basa en la oxidación

    que se produce en ácidos grasos polinsaturados que constituyen parte de la pared

    celular, provocando una pérdida de la permeabilidad selectiva y posterior disrupción

    celular (Cavalcante et al., 2013), ocasionando la inactivación de bacterias, células

    vegetativas y esporuladas, levaduras, mohos y virus (Pretell et al., 2016). En el caso

    de micotoxinas (aflatoxinas), el ozono reacciona sobre el enlace C8-C9 del anillo de

    furano, produciendo aldehídos, cetonas y CO2 (Diao et al., 2013). Esto, sumado a su

    alta capacidad de difusión en la materia orgánica (hasta 3000 veces más rápida que

    el cloro), lo convierte en una estrategia a considerar en la obtención de alimentos

    inocuos (Patil et al, 2009).

    Estudios experimentales previos demuestran la efectividad del ozono aplicado por

    burbujeo sobre bacterias psicrófilas, enterobacterias y Staphylococcus (Cavalcante et

    al., 2013; Mariaselvam & Muthukumar, 2011; Varga & Szigeti, 2016). No se dispone

    información sobre la aplicación directa del ozono en el tanque de leche que será

    transportada al centro de acopio. La Food and Drug Administration (FDA) no estipula

    una dosis máxima de ozono que pueda ser aplicada a los alimentos, sin embargo

    afirma su actividad microbiológica efectiva permitiendo su uso, siempre y cuando no

    altere la composición del alimento tratado o ponga en riesgo al medio ambiente o al

  • 3

    operario (FDA, 2001). Las dosis establecidas en este estudio se direccionaron al

    cumplimiento bacteriológico de la leche pasteurizada, acordes a la normativa técnica

    ecuatoriana NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada. Requisitos” (INEN, 2012).

    La presente investigación se realizó con el objetivo de evaluar bacteriológicamente la

    leche cruda antes y después de ser sometida directamente a la acción desinfectante

    del ozono, con el antecedente de no existir una investigación similar documentada en

    el Ecuador.

  • 4

    CAPÍTULO II

    OBJETIVOS

    GENERAL

    Evaluar bacteriológicamente la leche cruda tras ser sometida a tres

    concentraciones y tres tiempos de ozono mediante su comprobación

    microbiológica.

    ESPECÍFICOS

    Determinar a qué concentración de ozono le corresponde la mayor acción

    antibacteriana en leche cruda.

    Determinar cuál periodo de exposición al ozono posee la más alta eficacia

    contra las bacterias en la leche cruda.

  • 5

    CAPÍTULO III

    MARCO TEÓRICO

    Generalidades

    La leche al ser de naturaleza líquida, con alto grado de contenido de agua, y con un

    pH cercano a la neutralidad convierten a la leche en el medio propicio para el

    desarrollo de diversos microorganismos que ocasionan su temprana descomposición,

    además de ocasionar posibles intoxicaciones en los consumidores (Sarkar, 2016).

    Ozono

    La contaminación alimentaria se ha constituido en uno de los problemas más latentes

    dentro de la industria de alimentos, problema que requiere un continuo control en cada

    paso dentro de la cadena de producción. El ozono ha sido usado como agente

    descontaminante para controlar y eliminar la presencia de microorganismos en los

    alimentos (Brodowska et al., 2018).

    El ozono fue descubierto por Schönbein en 1839, quien observó que la electrólisis del

    agua producía un gas con olor. El primer uso comercial que se le dio al ozono fue como

    desinfectante de agua destinada al consumo humano en Francia a inicios del siglo XX

    (Bocci, 2011).

  • 6

    Tabla 1. Breve reseña de logros y certificaciones alcanzadas por el ozono.

    Año Suceso

    1839 Ozono descubierto por Schönbein

    1886 Se reconoce la acción desinfectante del ozono sobre agua contaminada en Europa

    1891 Pruebas positivas contra bacterias en Alemania

    1895 Soret determina la fórmula molecular del ozono

    1906 Francia inaugura la primera planta de tratamiento de agua a base de ozono

    1909 El ozono es utilizado para preservar carne en Alemania

    1939 El ozono previene el crecimiento de mohos y levaduras durante el almacenamiento de frutas

    1970 El ozono es usado para el control de algas en Francia

    1982 US FDA otorga el estatus de GRAS al ozono

    1997 se declara al ozono como seguro para su contacto directo con alimentos

    2001 FDA aprueba el uso de ozono en la cadena de procesamiento de alimentos, como agente antimicrobiano o aditivo

    2004 La FDA proporciona una guía de recomendaciones para el uso de ozono con propósito de reducción de patógenos en jugo de manzana o cidra

    Fuente (Donnell & Cullen, 2012)

    Síntesis y Estructura Molecular del Ozono

    El ozono es una molécula triatómica de oxígeno, cuya estructura molecular le

    proporciona un alto poder oxidativo (Bocci, 2011; Sun et al., 2014) Durante la síntesis

    de la molécula de ozono, la molécula de oxígeno se divide en dos átomos no

    apareados de oxígeno (radicales libres), cada uno de los cuales ocupa una órbita 2p.

    Este átomo de oxígeno que contiene un par no emparejado (radical libre) se combina

    con una molécula de oxígeno para conformar la estructura del ozono (Donnell & Cullen,

    2012).

  • 7

    Figura 1. . Reacción química a partir de la molécula de oxígeno para generar ozono. Fuente: (Manoj Kumar & Sabikhi, 2019)

    Figura 2. Molécula de ozono. Fuente: (Donnell & Cullen, 2012)

  • 8

    Características físico-químicas del ozono

    Tabla 2.Características físico-químicas del ozono

    Características

    Color o Azul (generado del aire) o Incoloro (generado de oxígeno puro) o Azul oscuro (fase líquida)

    Olor Acre

    Punto de fusión -192.5 ± 0.4°C

    Punto de ebullición -119.9 ± 0.3°C

    Temperatura crítica -12.1°C

    Presión crítica 54.6 atm

    Densidad 2.14 g/L a 0°C

    Potencial óxido-reducción 2.07 V

    Peso molecular g/mol 47.9982

    Solubilidad en agua, ppm a 20°C 3

    Calor de formación KJ/mol 144.7

    Gravedad específica 1.658

    Fuente: (Manoj Kumar & Sabikhi, 2019)

    Un gran número de investigadores han llegado a comprobar, a través de la

    experimentación, las propiedades y aplicaciones el ozono sobre todo tipo de alimentos

    (desde frutas, vegetales, especies, carne cruda, mariscos, bebidas, etc.) (Brodowska

    et al., 2018).

    El uso de ozono es uno entre muchos procedimientos que contribuyen al mejoramiento

    de la inocuidad y la calidad de los alimentos (Freitas-Silva & Souza, 2016).

    El tratamiento de ozono u ozonoterapia sobre los alimentos es un método químico en

    el cual muestras de alimentos contaminados son expuestas ante el ozono en su fase

    acuosa o en su fase gaseosa (Brodowska et al., 2018).

    Los efectos bactericidas del ozono han sido demostrados sobre una amplia variedad

    de bacterias Gram negativas y Gram positivas, así como esporas bacterianas

    (Pandiselvam et al., 2019).

    La aplicación de ozono mejora la calidad microbiológica de los productos alimenticios

    sin cambios sustanciales en sus propiedades nutricionales, químicas y físicas (Freitas-

    Silva & Souza, 2016).

  • 9

    Principios del Tratamiento con Ozono

    Existen diferentes formas por las que el ozono puede ser producido. Este compuesto

    puede ser generado por la exposición de oxígeno a una fuente de energía como un

    campo eléctrico de alta energía (método de la corona de descarga), radiación

    ultravioleta (método fitoquímico) o la conversión de moléculas de oxígeno O2 a ozono

    O3 (método químico) (Srinath.D et al., 2017). Otros métodos de generación de ozono

    incluyen la electrolisis, la reacción elemental del fósforo con agua y la producción

    radioquímica; pero estos últimos procedimientos se encuentran aún en fases de

    desarrollo y su relación costo beneficio es negativa (Fukui et al., 2014)

    Equipamiento para el tratamiento de ozono de los alimentos

    Para la aplicación de ozono se puede utilizar en su fase gaseosa o en su fase acuosa.

    En la práctica, los sistemas de ozonoterapia poseen algunos componentes básicos:

    gas (oxígeno puro o aire), un generador de ozono, una fuente de energía eléctrica, un

    reactor, una unidad de eliminación de gas y un analizador de ozono (Sharma, 2008).

    Ozono en Estado Acuoso

    Con el principal objetivo de purificar y desinfectar agua, se ha utilizado soluciones de

    ozono a distintas concentraciones (Brodowska et al., 2018).

    La degradación del ozono disuelto en agua es mucho más veloz que cuando se

    encuentra disuelto en oxígeno o en el aire (Srinath D. et al., 2017).

    Los principales factores que afectan la solubilidad del ozono con el agua son el pH, la

    temperatura y la calidad del agua (pureza) (Brodowska et al., 2018).

    Ozono en Estado Gaseoso

    El ozono en estado gaseoso es relativamente más estable que en su estado acuoso.

    Esta estabilidad puede verse afectada por factores como la concentración de ozono,

    la temperatura, la presión, la presencia de contaminantes y catálisis (Brodowska et al.,

    2018). Al contrario con su fase acuosa, el ozono gaseoso posee una vida media más

    prolongada (Donnell & Cullen, 2012).

  • 10

    Está documentada la eficacia del ozono en su forma gaseosa como agente

    antimicrobiano en el empaque y almacenamiento de alimentos (James et al, 2002). Su

    acción ha sido comprobada contra Salmonella infatis y Pseudomona aeruginosa en

    carcasas de pollo (Al-Haddad et al, 2005). Además, es eficaz contra residuos de

    fungicidas en la producción de vino (Karaca et al, 2012) y su acción antimicrobiana en

    frutas tales como melón (Marı, 2008), arándanos (Varese et al, 2015), higos secos

    (Kırog, 2006) y uvas (Saavedra et al, 2016). La eficiencia antibacteriana del ozono en

    solución acuosa fue investigada en productos como el pimiento rojo, berros y fresas

    (Alexandre et al, 2011).

    Ventajas y Desventajas de la Ozonoterapia

    Ventajas

    Está libre de residuos químicos. Al contrario de métodos como el uso de cloro, el

    cual al reaccionar con material orgánico forma residuos potencialmente peligrosos

    (trihalometanos) (Trindade et al., 2012)

    Puede ser aplicado en todo tipo de alimentos (vegetales, carne, agua, bebidas,

    etc.)

    Es efectivo sobre alimentos frescos y conservados (congelados).

    No altera el aspecto visual, las propiedades físicas (textura) y la calidad nutricional

    de los alimentos.

    Es una tecnología amigable con el medio ambiente y en constante mejoramiento.

    (Brodowska et al., 2018)

    Desventajas

    Diversos niveles de sensibilidad de microorganismos ante el ozono.

    La efectividad de la terapia depende de la dosis adecuada de ozono.

    Al ser inestable en solución acuosa, su acción es inhibida por la presencia de

    pesticidas o solventes clorados.

    Aún no es económicamente viable.

    La percepción del consumidor ante productos tratados con ozono.

  • 11

    (Brodowska et al., 2018)

    Mecanismo de Acción Antimicrobiana del Ozono

    El ozono posee un amplio espectro de actividades antimicrobianas, el cual es el

    resultado del poder oxidante de los radicales libres, producto de su degradación. Estos

    radicales son hidroxil, hidroperoxi y superóxido; sin embargo, se declara al ozono

    molecular como el principal inactivador de microorganismos (Brodowska et al., 2018;

    Donnell & Cullen, 2012).

    La inactivación bacteriana durante el tratamiento con ozono es un proceso complejo

    debido a que el ozono ataca a los constituyentes de la membrana celular (proteínas,

    enzimas respiratorias y lípidos insaturados), la pared celular (peptidoglicanos), el

    citoplasma (enzimas y ácidos nucleicos), esporas y cápsides víricas (Brodowska et al.,

    2018; Manoj Kumar & Sabikhi, 2019).

    La mayoría de investigadores han llegado a señalar que existen dos posibles

    mecanismos de la acción antimicrobiana del ozono:

    Oxidación de los grupos sulfhidrilo y aminoácidos (enzimas y proteínas) para

    producir péptidos más pequeños, durante la exposición al ozono.

    Oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados en ácidos peróxidos.

    La acción sobre las células bacterias constituye un proceso secuencial donde el daño

    superficial va seguido de la formación de poros en la pared celular, la membrana

    celular expulsa material al exterior y permite el ingreso de agua, ocasionando un

    agrandamiento, por lo que se produce una destrucción de los ácidos nucleicos y la

    posterior muerte celular (Brodowska et al., 2018; Donnell & Cullen, 2012; Manoj Kumar

    & Sabikhi, 2019).

    Uso de petrifilm en el análisis microbiológico de alimentos

    El aseguramiento de la calidad e inocuidad de los alimentos se ha constituido en un

    desafío a nivel mundial, por tanto, el análisis frecuente de alimentos en laboratorios

    analíticos juega un papel significante. Analizar los alimentos dentro de parámetros

    microbiológicos es de vital importancia para determinar la calidad e higiene de los

    productos (IOM & NCR, 2010).

  • 12

    Dentro del análisis microbiológico de los alimentos, las técnicas convencionales son

    consideradas laboriosas (Spanu et al., 2014) y envuelven una serie de procedimientos

    entre los cuales tenemos la rehidratación del medio de cultivo, la esterilización del

    equipo, la preparación de la muestra, la inoculación en los medios de cultivo y la

    incubación a una temperatura y tiempo determinados (Perkins, 2016).

    Los petrifilms son productos que permiten la cuantificación de cepas bacterianas

    viables. Los cuales están compuestos de películas recubiertas de nutrientes (medio de

    cultivo), agentes gelidificantes solubles en agua fría y un indicador de tetrazolium para

    su fácil interpretación (Fritz et al., 2015). La Association of Official Analytical Chemists

    (AOAC International) validó el sistema petrifilm dentro de la implementación de

    tecnologías alternativas para la cuantificación de bacterias. Además de recomendar su

    utilización por fácil uso y su alta eficiencia (Nelson et al., 2013). El sistema petrifilm

    suprime la necesidad de preparación de medios tradicionales, anteriormente usados

    en técnicas de enumeración de microorganismos (Shen & Zhang, 2017).

    La capacidad del sistema petrifilm fue comparada ante los medios tradicionales en un

    estudio donde se buscaba aislar colonias de Escherichia coli, coliformes totales y

    contaje de aerobios totales, en muestras de leche en polvo, carne de pollo y leche de

    fórmula (Lakmini & Madhujith, 2012).

    Dentro de la industria láctea, el método petrifilm ha demostrado su efectividad en

    aislamiento de microorganismos coliformes en muestras de yogurt griego (Hervert el

    al, 2016). De la misma manera, Souza demostró la efectividad del sistema petrifilm

    frente a los métodos tradicionales, buscando aislar cepas de Staphylococcus aureus,

    Escherichia coli y coliformes totales, en muestras de leche de oveja (Souza et al, 2015).

    Viçosa et al (2010) lograron determinar la presencia de Staphylococcus aureus en la

    leche cruda de bovinos, tras analizarla a través del sistema petrifilm.

    En el año 2014, Bird demostró la capacidad de este sistema al lograr aislar e identificar

    cepas de Salmonella spp. en muestras de carne cruda de res, carne cruda de pollo,

    carne cruda de cerdo, huevos pasteurizados, nuggets de pollo, camarones, espinacas

  • 13

    y alimento balanceado de perro, las que fueron inoculadas experimentalmente con

    esta cepa bacteriana (Bird et al., 2014).

    En la Universidad de Minnesota, con el sistema petrifilm se logró determinar la

    presencia de Staphylococcus aureus y Streptococcus spp., en muestras de leche

    mastítica (McCarron et al., 2009)

    Además, se demostró la efectividad de este sistema al detectar infecciones

    intramamarias en vacas al final del periodo de lactancia (Cameron et al., 2013).

    En el 2016, Hervert comparó distintos métodos para la detección de microrganismos

    de importancia sanitaria (Escherichia coli y coliformes), dentro de la industria de

    procesamiento de alimentos, dando como resultado una alta eficiencia por parte del

    sistema petrifilm (Hervert et al., 2016).

    También, se ha comprobado su capacidad de aislar cepas de Escherichia coli, tras el

    análisis de carcasas de cerdo y cordero luego del faenamiento (Hauge et al., 2017),

    así como se ha logrado su eficacia en el análisis de balanceado destinado a la crianza

    de pollos broiler (Pinto, 2018).

  • 14

    CAPÍTULO IV

    MATERIALES Y MÉTODOS

    Materiales

    De Campo

    Tabla 3.Materiales biológicos utilizados en la fase de campo.

    Materiales Biológicos

    Leche cruda de vaca Agua

    Tabla 4.Materiales químicos empleados en la fase de campo.

    Materiales Químicos

    Alcohol gel Oxígeno (gas)

    Tabla 5.Materiales físicos utilizados en la fase de campo.

    Materiales Físicos

    Mandil Gel Refrigerante

    Cubrebocas Recipientes contenedores

    Cofias Mangueras

    Guantes Frascos estériles para

    recolectar muestras de

    leche

    Botas

    Cooler

  • 15

    De Laboratorio

    Tabla 6. Materiales químicos utilizados durante la fase de laboratorio del estudio.

    Materiales Químicos

    Placas 3M™ Petrifilm™ para control

    de Listeria ambiental

    3M™ Suplemento para Enriquecimiento

    de Salmonella

    Placas 3M™ Petrifilm™ para

    Recuento de Aerobios

    TSI® (Triple Sugar Iron Agar. BIORAD.

    Lote: 1M112. (Francia)

    Caldo Urea MERCK

    Placas 3M™ Petrifilm™ para

    recuento de E. coli y Coliformes

    Reactivo de Kovacs

    Buffered Peptone Water DIFCO

    Placas 3M™ Petrifilm™ Salmonella

    Express SALX

    Lysine iron agar DIFCO

    SIM (Sulfuro Indol Motilidad). DIFCO.

    3M™ Base para Enriquecimiento de

    Salmonella

    Tabla 7.Materiales físicos utilizados durante la experimentación en el laboratorio.

    Materiales Físicos

    Guantes de Látex M Gradilla plástica

    Dispersor 3M™ Petrifilm™ para placas Matraz Erlenmeyer 500 ml

    Asa metálica Hisopos estériles

    Fundas plásticas estériles Vaso de precipitación

  • 16

    Suministros de Oficina

    Tabla 8.Implementos y suministros adicionales durante la ejecución del estudio.

    Lista de Implementos

    Computadora portátil

    Cuaderno de 100 hojas empastado

    Esferográfico

    Internet

    Marcador permanente punta fina Faber-Castell

    Marcador permanente punta gruesa Faber-Castell

    Etiquetas adhesivas

    Equipos

    Tabla 9.Lista de equipos empleados durante la realización del estudio.

    Equipos e Instrumental

    Generador de 6 gramos de Ozono (Ozonizador)

    Destilador de agua, Modelo Elit-3 Marca Barnstead Water Still

    Micropipeta Incubadora de convección forzada 42 °C

    Autoclave, Modelo SIM-E. Serie 058592, Markel Forge

    Incubadora 37 °C

    Balanza electrónica, Boeco Germany BLC 500

    Rerigeradora Durex RDE

    Cámara de flujo laminar con filtros HEPA: Biological Hazard Biobase Midcis Precision Scientific CO PS. Modelo BSC-15011 A2-X Marca Biobase

    Vortex marca Heidolph

  • 17

    Metodología

    Lugar de Estudio

    La fase de campo, donde se obtuvieron las muestras fueron de la hacienda “El

    Carmen” ubicada en la provincia de Pichincha, Cantón Quito, Parroquia de Amaguaña,

    sector Yanahuayco.

    El presente ensayo se llevó a cabo en el Laboratorio de Bacteriología y Micología,

    perteneciente a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad

    Central del Ecuador, ubicado en la ciudad de Quito en la calle Jerónimo Leyton s/n y

    Gatto Sobral, ciudadela universitaria.

    Tipo de Investigación

    El estudio fue determinado con un diseño experimental, longitudinal de tipo

    cuantitativo.

    Ozono y Tratamientos

    Para lograr determinar la concentración más efectiva de ozono, en miligramos (mg), y

    el tiempo de exposición de las muestras de leche en minutos, se adaptaron los

    procedimientos descritos en los estudios de Sung y Cavalcante (Sung et al, 2014)

    (Cavalcante et al., 2013), tras lo cual se llegaron a determinar tres concentraciones

    (50, 75 y 100 mg/l) durante tres periodos de tiempo (10, 20 y 30 minutos). Los

    tratamientos realizados se detallan a continuación.

  • 18

    Tabla 10.Tipos de tratamientos según la dosis de ozono y el tiempo de exposición.

    Tratamientos Concentración (mg/l) Tiempo (minutos)

    T1 50 10

    T2 50 20

    T3 50 30

    T4 75 10

    T5 75 20

    T6 75 30

    T7 100 10

    T8 100 20

    T9 100 30

    T0 Testigo o control (leche cruda)

    El ozono fue producido a partir de oxígeno médico a través de un generador (Bioline®)

    de 6 gramos. Durante la aplicación de ozono, cada una de las muestras de leche

    sometidas a un tratamiento fueron colocadas en bolsas plásticas herméticas estériles

    (una por tratamiento) y, a continuación, se realizó la aplicación de ozono de manera

    directa en la muestra con agitación constante durante la dispersión del mismo en

    función a la concentración y tiempo establecido para cada tratamiento. Concluida la

    inoculación y dispersión del ozono, se transportaron las muestras en contenedores

    herméticos a 4°C al Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de

    Medicina Veterinaria y Zootecnia.

  • 19

    Muestreo

    Las muestras de leche cruda fueron obtenidas directamente del tanque de recolección

    de la hacienda lechera seleccionada. Se recolectaron 10 litros de leche, durante tres

    semanas; las muestras fueron tomadas de ordeños aleatorios e independientes.

    Además, se recolectó muestras de leche hervida y leche UHT de marca comercial para

    los análisis respectivos para comparar con los resultados obtenidos en los

    especímenes de leche tratada con ozono.

    Análisis Microbiológico

    En el laboratorio de Bacteriología y Micología se realizó la cuantificación bacteriológica

    de aerobios mesófilos totales, coliformes totales, Escherichia coli, Listeria

    monocytogenes spp y Salmonella spp en cada una de las muestras tratadas con

    ozono. A cada muestra se realizó diluciones 10-1 y 10-2 en agua peptonada tamponada

    (Difco BD Sparks®) y se utilizó el sistema Petrifilm® de la casa 3M® para el cultivo,

    aplicando protocolos para mesófilos totales (AOAC 990.12), coliformes totales y

    Escherichia coli (AOAC 991.14), Listeria monocytogenes (AOAC-RI 030601) y para

    Salmonella spp (AOAC 2014.01).

    Análisis Estadístico

    Los datos microbiológicos fueron analizados mediante la prueba de varianza de una

    vía de Kruskal Wallis y la prueba de U de Mann Whitney, con un intervalo de confianza

    del 95%. Además, se realizó un análisis de correlación de Spearman para comparar el

    recuento microbiológico de las distintas muestras tratadas a dosis de ozono y tiempo

    de tratamiento predeterminados. Para el análisis estadístico, se utilizó el software IBM

    SPSS Statistics© versión 23.

  • 20

    CAPÍTULO V

    RESULTADOS Y DISCUSIÓN

    El recuento microbiano de las muestras control y especímenes tratados con ozono

    consta en la tabla 11. El mayor recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)

    correspondió a las muestras control (T0, leche cruda). Los especímenes de leche

    tratada con ozono presentaron carga microbiana, sin embargo, los recuentos en UFC

    fueron gradualmente disminuyendo en función a la dosis de ozono y tiempo de

    administración hasta alcanzar valores bajos a la dosis máxima de O3 (100 mg/l/30

    minutos), la cual evidencia mejores resultados (Fig.3, Fig. 4, Fig.5).

    Figura 3.Diferencias en la carga bacteriana de la leche tras la aplicación de ozonización.

    1,37

    1,69

    2,52

    2,70

    2,95

    3,04

    3,07

    3,15

    3,16

    3,90

    0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50

    T9

    T8

    T7

    T6

    T5

    T4

    T3

    T2

    T1

    Testigo

    Carga Bacteriana en la leche (log10 UFC/ml)

    Tra

    tam

    ien

    tos

    MESÓFILOS AEROBIOS TOTALES

  • 21

    Figura 4. Diferencias en la carga bacteriana de la leche, donde a la dosis más alta se llegó a un valor de 0 para coliformes totales.

    Figura 5. Diferencias en la carga bacteriana de Escherichia coli donde a la dosis más alta se llegó a un valor de 0.

    0,00

    1,00

    1,92

    2,23

    2,26

    2,31

    2,35

    2,38

    3,03

    3,68

    0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00

    T9

    T8

    T7

    T6

    T5

    T4

    T3

    T2

    T1

    Testigo

    Carga Bacteriana en la leche (log10 UFC/ml)

    Tra

    tam

    ien

    tos

    COLIFORMES TOTALES

    0,00

    0,70

    1,18

    1,76

    2,09

    2,23

    2,44

    2,51

    2,59

    3,67

    0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00

    T9

    T8

    T7

    T6

    T5

    T4

    T3

    T2

    T1

    Testigo

    Carga Bacteriana en la leche (log10 UFC/ml)

    Tra

    tam

    ien

    tos

    Escherichia coli

  • 22

    En promedio, si se compara con las muestras control, la reducción decimal de

    microorganismos posteriores al uso de ozono fue de 1,27, 1,73 y 1,89 Log10UFC/ml

    para mesófilos aerobios totales, coliformes y Escherichia coli, respectivamente. El

    análisis estadístico del recuento microbiano, para cada muestra tratada con ozono

    relacionada a dosis y tiempo, evidenció diferencia estadística significativa (p≤ 0,05)

    respecto a las muestras control. Resultados que se encuentran dentro de lo estipulado

    en la normativa nacional NTE INEN 10 (INEN, 2012), para el tratamiento 9 (Tabla 12).

    Se encontró similar recuento de microorganismos (mesófilos aerobios totales,

    coliformes totales y Escherichia coli) en los tratamientos T2 (50 mgO3/20 minutos) y

    T3 (50 mg O3/30 minutos); similar comportamiento fue observado en los tratamientos

    T8 (100 mg O3/20 minutos) y T9 (100 mg O3/30 minutos), sin demostrar diferencias

    estadísticamente significativas (p≥ 0,05).

    No se reportaron recuentos de Listeria monocytogenes y Salmonella spp. en los

    distintos tratamientos.

    Tabla 11.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche tratada con ozono según dosis y tiempo de exposición.

    Recuentos Microbianos

    Tratamientos

    T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

    Mesófilos aerobios totales 3,90 3,16 3,15 3,07 3,04 2,95 2,70 2,52 1,69 1,37

    Coliformes totales 3,68 3,03 2,38 2,35 2,31 2,26 2,23 1,92 1,00 0,00

    Escherichia coli 3,67 2,59 2,51 2,44 2,23 2,09 1,76 1,18 0,70 0,00

    Listeria monocytogenes A A A A A A A A A A

    Salmonella spp. A A A A A A A A A A

    A= ausencia. T0 = control T1 a T9 = tratamientos con ozono

    Los tratamientos con similar color indican ausencia de diferencia significativa (p≥ 0,05) en los tres parámetros estudiados.

  • 23

    Tabla 12. Comparación de los resultados de T9 (Log10 UFC/ml) con los parámetros establecidos en la Norma NTE INEN 10 Leche pasteurizada. Requisitos

    Recuentos Microbianos T9 Requisitos NTE INEN 10

    Mesófilos aerobios totales 1,37 4,48

    Coliformes totales 0 0

    Escherichia coli 0 0

    Listeria monocytogenes A 0

    Salmonella spp. A 0

    A= ausencia. T9= Tratamiento 9 (100 mg O3/30 minutos)

    El recuento microbiano en leche sometida a los diferentes esquemas de tratamiento

    con ozono comparado con leche hervida y UHT, mostró una reducción considerable;

    se observó disminución del recuento de mesófilos aerobios totales, coliformes y

    Escherichia coli, mientras que la leche hervida exhibió recuentos más altos a

    comparación con T9 (leche ozonizada) y leche UHT (tabla 13).

    Tabla 13.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche tratada con ozono (T9), leche hervida y leche UHT

    Tipo de leche

    Recuento Microbianos Leche cruda

    Leche hervida

    Leche UHT

    T9

    Mesófilos aerobios totales 3,90 3,71 2,50 1,37

    Coliformes totales 3,68 2,77 0,00 0,00

    Escherichia coli 3,67 1,44 0,00 0,00

    Listeria monocytogenes A A A A

    Salmonella spp. A A A A

    A= ausencia.

  • 24

    Figura 6. Comparación de resultados de los tres distintos tratamientos en estudio.

    Estadísticamente se realizó una comparación entre el tratamiento 9 (T9) con los

    resultados de la leche hervida y con los resultados de la leche UHT, respectivamente,

    a través de la prueba de U de Mann-Whitney, donde se aprecia que no existe una

    diferencia significativa entre T9 y leche UHT para los valores de coliformes totales y

    Escherichia coli (tabla 14).

    Tabla 14.Valores de “p” para cada recuento, tras la comparación de T9 con la leche hervida, T9 con la leche UHT y T9 con el testigo (leche cruda).

    Comparación entre tipos de leche

    Recuentos Microbianos

    Leche hervida - T9 Leche UHT - T9 Leche cruda - T9

    Mesófilos aerobios totales

    0,00* 0,035* 0,05*

    Coliformes totales 0,00* 1 0,03*

    Escherichia coli 0,00* 1 0,04*

    Listeria monocytogenes

    A A A

    Salmonella spp. A A A

    A= ausencia. * Valores que difieren estadísticamente (p≤ 0,05)

    3,9 3,71

    2,5

    1,37

    3,68

    2,77

    0 0

    3,67

    1,44

    0 00

    0,5

    1

    1,5

    2

    2,5

    3

    3,5

    4

    4,5

    LecheCruda

    LecheHervida

    LecheUHT

    T9

    Ca

    rga

    Ba

    cte

    ria

    na

    lo

    g1

    0 U

    FC

    /ml

    Mesófilos aerobios totales Coliformes totales Escherichia coli

  • 25

    Correlación estadística entre concentración (tiempo-dosis) y reducción del

    recuento microbiano

    Existió alta correlación entre concentración de O3 y reducción del recuento de

    mesófilos aerobios totales, coliformes y Escherichia coli. El tiempo de exposición al O3

    en relación al recuento bacteriano presentó moderada correlación. En este sentido, se

    observó que a medida que se aumentó la concentración de ozono disminuyó la carga

    bacteriana en la leche tratada. No se consideraron valores de referencia para Listeria

    monocytogenes y Salmonella spp., por no encontrarse en la muestra testigo (cruda) y

    en los distintos tratamientos con ozono, leche hervida o UHT.

    Discusión

    El principal hallazgo del estudio fue el efecto del ozono en la reducción de la carga

    bacteriana de las muestras tratadas de leche respecto a las muestras control donde

    los recuentos microbiológicos son mayores. Se advierte que fueron detectadas

    bacterias en las muestras tratadas con ozono, reduciéndose gradualmente su recuento

    en función a la dosis y tiempo de ozono empleado en cada uno de los tratamientos, al

    punto que en la muestra T9 el conteo de mesófilos aerobios totales fue 1,37 Log10

    UFC/ml), coliformes totales (0 Log10 UFC/ml) y Escherichia coli (0 Log10 UFC/ml),

    parámetros aceptados en la normativa ecuatoriana NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada.

    Requisitos” (INEN, 2012) y europea (European Commission, 2005). Los resultados

    concuerdan con otros estudios realizados en alimentos tratados con ozono para

    disminuir la carga microbiana y aumentar la vida útil de los productos, por lo que se

    colige que se detectarán mayores recuentos microbianos en productos no tratados con

    ozono (Al-Haddad et al., 2005; Alexandre et al., 2011).

    El recuento de mesófilos aerobios totales presentó valores más altos en leche cruda

    (3,9 Log 10 UFC/ml), observándose en las muestras tratadas disminución de la carga

    microbiana a medida que se incrementó la concentración y tiempo de aplicación de

    ozono (tabla 9). Los resultados concuerdan con el estudio de Cavalcante y

    colaboradores (2013) que reportan un efecto similar del ozono para reducir la carga de

    mesófilos aerobios totales (1,5 mg O3 por litro durante 15 minutos). El conteo final de

  • 26

    coliformes totales en leche cruda fue 3,68 Log10 UFC/ml, siendo este el valor de

    recuento más alto; a medida que se trató con ozono las distintas muestras, la carga

    bacteriana se redujo hasta 0 Log10 UFC/ml en la muestra T9. La información disponible

    no reporta el efecto del tratamiento de la leche cruda con ozono sobre

    microorganismos coliformes; un estudio sobre el efecto del ozono en alimentos frescos

    (papaya) se traduce en recuentos bajos a una dosis de ozono de 9,2±2 µl/L (Yeoh et

    al, 2014).

    El contaje total de Escherichia coli en leche cruda fue 3,67 Log10 UFC/ml; en las

    muestras tratadas se demostró una disminución gradual en el recuento bacteriano a

    medida que se incrementó la dosis de ozono, registrándose un recuento de 0 Log10

    UFC/ml en T9, resultado que coincide con el reporte de Sung y colaboradores (2014),

    quienes destacan el efecto del ozono en forma gaseosa a dosis de 2-3 gramos

    O3/m3/minuto y calor, aplicados a jugo de manzana pasteurizada a la que previamente

    se inoculó experimentalmente Escherichia coli.

    En leche hervida, se logró las cargas bacterianas iniciales de mesófilos aerobios

    totales (3,71 Log10 UFC/ml), coliformes totales (2,77 Log10 UFC/ml) y Escherichia coli

    (1,44 Log10 UFC/ml), resultados que concuerdan con el reporte de Agarwal et al.

    (2012), donde se señala la reducción del recuento de mesófilos aerobios totales (de

    valor inicial a valor final) y coliformes (valor inicial y final).

    Difieren los valores iniciales y finales del recuento de Escherichia coli, donde reportan

    0 Log10 UFC/ml, atribuyéndose a que el estudio de Agarwal controló las variables

    tiempo y temperatura de ebullición de la leche. Con esta aclaración, se destaca la

    diferencia estadística significativa (p≤ 0,05) en la reducción del recuento bacteriano al

    comparar leche hervida y leche tratada con ozono.

    En la leche UHT se demostró la presencia de mesófilos aerobios totales (2,50 Log10

    UFC/ml), resultado similar al hallado en Turquía, donde fueron evaluadas muestras de

    leche UHT obtenidas de supermercados locales (Tekinsen et al, 2007).

    Debido a limitaciones de equipamiento, no se probaron dosis más bajas de ozono.

    Además, el estudio no midió la concentración de ozono residual luego de tratar las

  • 27

    distintas muestras de leche, por lo que, a mediano plazo, deberá complementarse

    nuevos estudios para determinar valores residuales y dosis menores a 50 mg/litro en

    10 minutos de exposición. Además, resta estimar el impacto del ozono sobre el medio

    ambiente y sobre el personal que labora para el sistema de manejo de la producción

    lechera del país.

    La presente investigación permitió demostrar la disminución de la carga bacteriana de

    la leche cruda a través de la ozonización, proceso que se equipararía a otros

    tradicionalmente utilizados. Serían necesarios estudios posteriores para conocer la

    factibilidad económica al reemplazar una planta pasteurizadora tradicional por una que

    utilice ozono en el proceso.

  • 28

    ANÁLISIS DE COSTOS PARCIALES

    El análisis económico se detalla a continuación:

    Tabla 15. Análisis de costos parciales del tratamiento testigo.

    Tratamiento Testigo

    Costo del Producto por

    litro

    Litro

    Costo Unitario

    Leche Cruda

    0,50 $

    1

    0,50 $

    Tabla 16.Análisis de costos parciales por tratamientos experimentales.

    Tratamientos Concentración

    de Ozono Tiempo de Exposición

    Costo del Tratamiento/ 1 L

    Costo Unitario

    O3 +Leche

    Diferencia

    T1 50 mg/l 10 minutos

    0,10 $ 0,60 $ +0,10 $

    T2 50 mg/l 20 minutos

    0,15 $ 0,65 $ +0,15 $

    T3 50 mg/l 30 minutos

    0,20 $ 0,70 $ +0,20 $

    T4 75 mg/l 10 minutos

    0,25 $ 0,75 $ +0,25 $

    T5 75mg/l 20 minutos

    0,30 $ 0,80 $ +0,30 $

    T6 75mg/l 30 minutos

    0,35 $ 0,85 $ +0,35 $

    T7 100 mg/l 10 minutos

    0,40 $ 0,90 $ +0,40 $

    T8 100 mg/l 20 minutos

    0,45 $ 0,95 $ +0,45 $

    T9 100mg/l 30 minutos

    0,50 $ 1,00 $ +0,50 $

  • 29

    Tabla 17.Análisis de costos parciales de la leche pasteurizada UHT.

    Tabla 18.Análisis de costos parciales de la leche hervida

    Tabla 19. Comparación de costos entre el testigo, la leche hervida, la leche pasteurizada UHT y el tratamiento de ozono (T9).

    Tratamientos

    Costo

    Unitario

    Costo Tratamiento

    Testigo

    Diferencia

    T9 1,00 $ 0,50 $ +0,50 $

    Leche UHT 0,85 $ 0,50 $ +0,35 $

    Leche Hervida 0,60 $ 0,50 $ +0,10 $

    De acuerdo con lo expuesto, el análisis de todos los tratamientos con ozono resulta en

    un costo más elevado con respecto al tratamiento testigo, con una diferencia

    económica que oscila desde 0,60 $ hasta 1,00 $.

    Cabe señalar que el tratamiento testigo solo correspondía a la leche cruda sin ninguna

    intervención o acción adicional, lo que explica el margen de diferencia económica entre

    tratamientos.

    Tal como se detalla en la tabla 19, se eligió al tratamiento 9 (T9) para su comparación

    con los costos de los tratamientos testigo, leche UHT y leche hervida, esto debido a la

    efectividad reportada tras el análisis microbiológico.

    Leche UHT

    Costo del Producto por

    litro

    Litros utilizados

    Costo Unitario

    Marca Comercial

    0,85 $

    1

    0,85 $

    Leche Hervida

    Costo del Producto por

    litro

    Costo del Tratamiento Proceso

    Costo Unitario

    Leche cruda +

    Ebullición

    0,50 $

    0,10 $

    0,60 $

  • 30

    El alto costo de ozonización se debe a que se utilizó apenas 1 litro de leche cruda para

    el proceso, debiendo disminuir conforme se incrementa la cantidad a ser procesada.

  • 31

    CAPÍTULO VI

    CONCLUSIONES

    Se lograron obtener resultados de la cuantificación de bacterias de las muestras de

    leche cruda (testigo), así como de las muestras de leche correspondientes a los

    distintos tratamientos de ozono.

    Con una concentración de 100 mg O3/l se logró que la leche tratada con ozono

    alcance los parámetros establecidos por la normativa ecuatoriana NTE INEN 10

    “Leche Pasteurizada. Requisitos” (INEN, 2012) y europea (European Commission,

    2005).

    Del mismo modo, con un periodo de acción de 30 minutos del ozono sobre la carga

    bacteriana de la leche se cumplieron estos estándares de calidad, que califican al

    producto apto para el consumo humano (NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada.

    Requisitos”, 2012; European Commission, 2005 )

    El Tratamiento 9 (100 mg O3/l durante 30 minutos), fue el más efectivo al permitir

    una reducción del 64,87% (2,53 Log10 UFC/ml) del conteo inicial de mesófilos

    aerobios totales, una reducción del 100% (3,68 Log 10 UFC/ml) para coliformes

    totales y una reducción del 100% (3,67 Log10 UFC/ml) para Escherichia coli.

  • 32

    CAPÍTULO VII

    BIBLIOGRAFÍA

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  • 42

    ANEXOS

    1. Resultados de la cuantificación de Mesófilos Aerobios Totales.

    Tratamientos con Ozono Leche Hervida

    Leche UHT Testigo T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

    UFC/ml 7966,67 1439,33 1400 1172,67 1100,0 898 501 328 48,67 23,33 5099,7 313,3

    Notación Científica

    8 x103 1,4 x10

    3 1,4 x10

    3 1,2 x10

    3 1,1 x10

    3 9 x10

    2 5 x10

    2 3,3 x10

    2 5 x10 2 x10 5,10X10

    3 3,1310

    2

    Log10

    UFC/ml 3,90 3,16 3,15 3,07 3,04 2,95 2,70 2,52 1,69 1,37 3,71 2,50

    2. Resultados de la cuantificación de Coliformes Totales. Tratamientos con Ozono Leche Hervi

    da Leche U

    HT Testigo

    T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

    UFC/ml 4787,33

    1074,67 238,33

    223,67 204 183,33

    171,67 82,33 10 0 583,7 0

    Notación Científica

    4,8x103 1,1 x10

    3 2,4 x

    102

    2,2x

    102

    2x102 1,8x

    102

    1,7x

    102

    8 x 10

    1 x 10 0 5,8X102 0

    Log10

    UFC/ml 3,68 3,03 2,38 2,35 2,31 2,26 2,23 1,92 1,00 0 2,77 0

    3. Resultados de la cuantificación de Escherichia coli. Tratamientos con Ozono Leche

    Hervida

    Leche UHT Testig

    o T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

    UFC/ml 4666,33

    388 324,33 273,33 170 123 57,33 15 5 0 27,3 0

    Notación Científica

    4,7x103 3,9x10

    2 3,2x10

    2 2,7x10

    2 1,7x10

    2 1,2x10

    2 6 x 10 1,5 x 1

    0 5 0 2,7X10 0

    log10UFC/ml 3,67 2,59 2,51 2,44 2,23 2,09 1,76 1,18 0,70 0 1,44 0

  • 43

    4. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis por Tratamientos.

    5. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis en base a la concentración de ozono.

    Prueba Aerobios Totales E. coli Coliformes totales

    Chi-cuadrado 26,741 27 23,765

    gl 3 3 3

    Sig. asintótica 0 0 0

    6. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis en base al tiempo de exposición al ozono.

    Prueba Aerobios Totales E. coli Coliformes totales

    Chi-cuadrado 9,166 9 8,441

    gl 3 3 3

    Sig. asintótica 0,027 0,03 0,038

    7. Prueba de U de Mann-Whitney analizando los tratamientos por parejas.

    Tratamientos

    Aerobios Totales

    Escherichia coli

    Coliformes totales

    Sig. Asintótica

    Existencia de Dif. Sig.

    Sig. Asintótica

    Existencia de Dif. Sig.

    Sig. Asintótica

    Existencia de Dif. Sig.

    1 – 2 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

    1 – 3 0,507 No 0,376 No 0,05 Si

    1 – 4 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si

    1 – 5 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    1 – 6 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    1 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    1 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    1 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si

    1 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

    2 – 3 0,197 No 0,178 No 0,261 No

    2 – 4 0,034 Si 0,043 Si 0,05 Si

    2 – 5 0,046 Si 0,046 Si 0,184 No

    2 – 6 0,046 Si 0,046 Si 0,376 No

    Prueba Aerobios Totales E. coli Coliformes totales

    Chi-cuadrado 28,474 28.152 27,75

    gl 9 9 9

    Sig. asintótica 0,001 0,001 0,001

  • 44

    2 – 7 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

    2 – 8 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

    2 – 9 0,046 Si 0,043 Si 0,037 Si

    2 – 10 0,046 Si 0,043 Si 0,05 Si

    3 – 4 0,034 Si 0,046 Si 0,05 Si

    3 – 5 0,046 Si 0,05 Si 0,658 No

    3 – 6 0,046 Si 0,05 Si 0,077 No

    3 – 7 0,046 Si 0,05 Si 0,05 Si

    3 – 8 0,046 Si 0,05 Si 0,05 Si

    3 – 9 0,046 Si 0,046 Si 0,037 Si

    3 – 10 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

    4 – 5 0,037 Si 0,105 No 0,05 Si

    4 – 6 0,037 Si 0,046 Si 0,513 No

    4 – 7 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si

    4 – 8 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si

    4 – 9 0,037 Si 0,043 Si 0,037 Si

    4 – 10 0,037 Si 0,043 Si 0,05 Si

    5 – 6 0,05 Si 0,127 No 0,05 Si

    5 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    5 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    5 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si

    5 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

    6 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    6 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

    6 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si

    6 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

    7 – 8 0,05 Si 0,077 No 0,05 Si

    7 – 9 0,05 Si 0,072 No 0,037 Si

    7 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

    8 – 9 0,077 No 0,121 No 0,121 No

    8 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

    9 – 10 0,05 Si 0,043 Si 0,037 Si

  • 45

    8. Prueba de Correlación relacionando a la concentración de ozono, tiempo de expos

    ición y UFC (crecimiento bacteriano).

    Rho de Spearman

    Aerobios Totales Escherichia coli Coliformes Totales

    Ozono Tiempo Ozono Tiempo Ozono Tiempo

    Coeficiente 0,96 0,452 0,961 0,44 0,894 0,399

    Sig. 0 0,012 0 0,0115 0 0,03

    Correlación Si Si Si Si Si Si

    Grado de

    Correlación

    Muy buena Correlación

    Moderada

    Correlación

    Muy buena Correlación

    Moderada

    Correlación

    Muy buena Correlación

    Baja

    Correlación

    9. ANOVA comparando al tratamiento 9, la leche hervida y la leche UHT.

    Tratamientos

    Aerobios Totales Escherichia coli Coliformes totales

    Sig. Asintóti

    ca

    Diferencia Significativa

    Sig. Asintótica

    Diferencia Significativa

    Sig. Asintótica

    Diferencia Significativa

    T9 – Hervida

    0 Si 0 Si 0 Si

    T9 – UHT

    0,035 Si 1 No 1 No

    Hervida – UHT

    0 Si 0 Si 0 Si

  • 46

    10. Registro de Toma de Muestras.

    11. Registro de Resultados.

    UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

    FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

    REGISTRO DE TOMA DE MUESTRAS

    Muestra N° :

    Fecha:

    Lugar:

    Tipo de Muestra:

    Cantidad:

    Observaciones:

    UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

    FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

    REGISTRO DE RESULTADOS

    Muestra N° : Fecha:

    Código:

    Repetición:

    Microorganismo Resultado

    Total 10

    -1 10

    -2

    Aerobios Totales

    Escherichia coli

    Coliformes Totales

    Salmonella spp.

    Listeria spp.

  • 47

    12. Procesamiento de Muestras.

  • 48

    13. Resultados en las placas petrifilm.