UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN DE AREQUIPA

FACULTAD DE: INGENIERIA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL : INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

PRACTICA Nº: 6

“NUMERACION DE MICROORGANISMOS PSICROTROFICOS EN LA LECHE CRUDA”

I. OBJETIVOS

Conocer el método de determinación de microorganismos psicrotróficos y aplicarlo.

Determinar la cantidad de microorganismos presentes en las muestras de la leche cruda.

II. REVISION BIBLIOGRAFICA

Los microorganismos psicrotróficos bajo este nombre genérico se agrupan todas aquellas especies con

capacidad para crecer a temperaturas de refrigeración, comprendidas entre 4 y 20°C. De forma estricta,

los microorganismos psicrótrofos presentan una temperatura óptima de desarrollo entre 10 y 20°C,

aunque pueden llegar a crecer a valores inferiores a 5°C. Serían, por tanto, especies tolerantes. En

oposición, existen microorganismos que no sólo toleran, sino que demandan valores térmicos en torno a

0°C para mostrar un correcto grado de crecimiento. Son los denominados psicrófilos.

Especies Gram negativas

Especies Gram positivas

Además de las relacionadas en los anteriores cuadros, diferentes especies de reconocido carácter

patógeno, tales como Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes y Clostridium botulinum están

capacitadas para desarrollase a bajas temperaturas.

De todos los tratamientos conocidos para reducir el desarrollo de microorganismos en la leche cruda el

más utilizado es el descenso de la temperatura; sin embargo, los microorganismos psicrótrofos se han

reconocido como un problema recurrente en el almacenamiento, la refrigeración y la distribución de la

leche y otros productos lácteos perecederos, debido a que crecen fácilmente a bajas temperaturas.

Alrededor del año 1960, se propuso el termino psicrótrofo para designar a aquellos microorganismos que

son capaces de crecer a temperaturas comprendidas entre los 0 y 7ºC, y producir colonias visibles o

turbidez, en un tiempo menor a 10 días, aunque su temperatura optima de crecimiento es mayor.

El principal representante de la flora psicrotrófica de la leche es pseudomonas fluorescens, más del 50%

de la flora Gram negativa de la leche cruda esta representada por este género. Además se ha descrito que

Achromobacter, Pseudomonas, Flavobacterium, Hafnia, Proteus, Alcaligenes, Aeromonas, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia,

Serratia, AcinetobacterBacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptococcus,

Staphylococcus, Micrococcus

algunas de sus enzimas resisten temperaturas por encima de los 80ºC, por lo cual pueden causar

alteraciones aun en productos elaborados con leches pasteurizadas.

Aunque los microorganismos pueden ser finalmente destruidos, no sucede lo mismo con sus enzimas,

pudiendo actuar con posterioridad a los tratamientos térmicos. Esto provoca grandes problemas a la

industria láctea, en especial a aquellas dedicadas a la esterilizacion comercial de leche y productos

lácteos, ya que las enzimas resistentes al tratamiento térmico disponen de largos periodos para actuar. Por

ejemplo, las proteinasas liberadas producen alteraciones como deterioro de las caseínas en la leche fresca,

problemas de gelificación de leche larga vida, sabores amargos y disminucion del rendimiento en

productos lácteos.

Los defectos más comúnmente observados son el sabor frutas y amargo, los sabores pútridos, rancios a

papa, jabonosos y a pescado, que son asociados con proteólisis y lipólisis.

Los sabores amargos y pútridos usualmente se acompañan de la degradación de la proteína a péptidos y

su posterior transformación en aminoácidos; los sabores jabonosos y rancios son el resultado de la ruptura

de los lípidos en numerosos ácidos grasos como butírico, caproico, caprílico, cáprico y laúrico.

La calidad del agua en las instalaciones de ordeño y sus estrategias de uso son aspectos necesarios para

producir leche de calidad. El agua en el tambo puede ser utilizada para:

- El refrescado de la leche (75% a un 92% del consumo total del agua)

- El lavado de la maquina de ordeñar y del tanque de almacenamiento de leche

- La preparación e higiene de la ubre de las vacas

- Las instalaciones

III. PROCEDIMIENTO

III.1 Materiales

Tubos de dilución

Medio Agar Plate Count

Pipetas estériles o pipeta automática.

Muestras de leche

Peptona, para uso microbiológico.

Bolsitas ziploc

Refrigeradora

III.2 EN EL LABORATORIO

III.2.1 Preparación de la sala

Primero se procede a desinfectar los mesones antes de comenzar la práctica.

9.5g 1000mlX240ml

X= 2.28g de Agua peptonada

22.5g 1000mlX96ml

X= 2.16g de Agar Plate Count

Preparación del agua peptonada

Preparación del Agar Plate Count

Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interés sanitario.

Agregar los 2.28g de agua peptonada a los 240ml de agua destilada.

Para el examen bacteriológico de comida, agua, leche y otros productos lácteos.

CALCULOS

CALCULOS

Se procede a tapar los matraces con las soluciones preparadas de agua de peptona y el agar

PLATE COUNT; también se tapa con pequeños algodones en las bocas de los tubos de ensayo,

posteriormente se envuelve con papel craft para luego llevar a la autoclave (nuestro caso OLLA

PRESION) para esterilizarlos a 121ºC por 15 minutos.

Preparación de la muestra

MUESTRA: Leche cruda de vaca

Registro Sanitario: no tiene

Fecha de vencimiento: no tiene

Expendida al público.

- Medir 10ml de la muestra que es liquida.

- Se añadió 10ml a los 90 ml del matraz que contenía el agua peptonada, ya esterilizado.

Esterilizacion121ºC x 15´

- Se mezcla uniformemente

- Luego se procede a realizar las diluciones.(En este caso solo se harán 4 diluciones)

- Se pipeteo a las placas petri estériles alícuotas de 1ml a partir de la dilución de 100, 10-1,

10-2, 10-3 ,10-4.

10ml + 90ml

- Agregar el agar Plate Count a cada caja petri y mezclar inmediatamente las alícuotas con el

agar mediante movimientos de vaivén y de rotación de las placas petri.

- Una vez solidificado el agar, colocar las placas dentro de la bolsita ziploc para que no

contamine la refrigeradora debido al desarrollo de los microorganismos que pasado el

tiempo va a ocurrir; luego llevar las placas a incubar en la refrigeradora a una temperatura

de 0-7ºC por 10 días.

- Pasado el tiempo contar separadamente colonias de microorganismos psicrotróficos.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Factor de dilución Nº de colonias Ufc/g de muestra

100 Número elevado Número elevado

10-1 2020 colonias 2020 x 101 ufc/ml

10-2 237 colonias 237 x 102 ufc/ml

10-3 190 colonias 190 x 103 ufc/ml

Al observar los resultados: Se puede concluir que la cantidad de microorganismos presentes en

cada placa es demasiada, por lo tanto la leche tiene un tiempo de vida corto ya que estos

microorganismos producen enzimas termoestables que degradan algunos componentes de la

leche deteriorando su calidad y la de sus derivados.

A

l observar el incremento de colonias en las demás placas se muestra la gran actividad

proteolítica sobre la fracción de las caseínas aumentando dicha actividad a medida que aumenta

el grado de contaminación.

V. CUESTIONARIO

1. Haga una lista de microorganismos psicrófilos

Son los denominados psicrófilos los siguientes:

2. ¿Por qué es importante la determinación de psicrótrofos en la leche y productos lácteos?

De todos los tratamientos conocidos para reducir el desarrollo de microorganismos en la leche

cruda el más utilizado es el descenso de la temperatura; sin embargo, los microorganismos

psicrótrofos se han reconocido como un problema recurrente en el almacenamiento, la refrigeración

y la distribución de la leche y otros productos lácteos perecederos, debido a que crecen fácilmente a

bajas temperaturas.

Aunque los microorganismos pueden ser finalmente destruidos, no sucede lo mismo con sus

enzimas, pudiendo actuar con posterioridad a los tratamientos térmicos. Esto provoca grandes

problemas a la industria láctea, en especial a aquellas dedicadas a la esterilizacion comercial de

leche y productos lácteos, ya que las enzimas resistentes al tratamiento térmico disponen de largos

periodos para actuar. Por ejemplo, las proteinasas liberadas producen alteraciones como deterioro

de las caseínas en la leche fresca, problemas de gelificación de leche larga vida, sabores amargos y

disminucion del rendimiento en productos lácteos.

Especies Gram negativas

Achromobacter

Pseudomonas

Flavobacterium

Hafnia

Proteus

Alcaligenes

Aeromonas

Klebsiella

Enterobacter

Escherichia

Especies Gram positivas

Bacillus

Corynebacterium

Lactobacillus

Streptococcus

Staphylococcus

Micrococcus

3. Desarrolle acerca de las características de listeria monocytogenes, que enfermedad de

transmisión alimentaria puede producir, síntomas y prevención:

LISTERIA MONOCYTOGENES

El género Listeria está compuesto por bacterias gram positivas con bajo contenido G+C,

estrechamente relacionado con los géneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y

Staphylococcus.

Son bacilos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, no capsulados, catalasa positiva,

móviles entre 10 y 25ºC (Collins et al., 1991).

Listeria ha sido aislada de diferentes sitios ambientales, como; suelo, agua, efluentes, de una gran

variedad de alimentos y de heces humanas y animales. El habitat natural de estos microorganismos

es probablemente la materia orgánica vegetal en descomposición y los rumiantes domésticos

contribuyen al mantenimientos de Listeria spp. en el ambiente rural a través de un ciclo continuo de

enriquecimiento oral-fecal (Fenlon, 1999).

La amplia distribución de L. monocytogenes se debe a la capacidad de sobrevivir durante períodos

de tiempo prolongados en diferentes medios.

El género Listeria comprende seis especies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua,

L. welshimeri y L. grayi. Las dos especies potencialmente patógenas son L. monocytogenes y L.

ivanovii.

L. monocytogenes no fue considerado un patógeno animal hasta fines de la década del 70. A

principios de los años 80 emerge como uno de los patógenos humanos de origen alimentario más

importante. A partir de ese momento, la literatura sobre Listeria comenzó a incrementarse y a partir

de 1983 una serie de brotes epidémicos humanos en Norteamérica y Europa establecieron claramente

a la listeriosis como una grave infección alimentaria (Bille, 1990). Los alimentos más

frecuentemente asociados con brotes y con alto nivel de riesgo son quesos y productos lácteos, patés

y salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general productos industrializados, refrigerados,

listos para el consumo, sin requerimientos de cocción o calentamiento previo (Farber and Peterkin,

1991). Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabón de la cadena productiva, así como

también en el almacenamiento en frío.

En la actualidad, se estima que L. monocytogenes es la principal causa de muerte originada por

bacterias de origen alimentario en USA, aproximadamente se registran 2500 casos de listeriosis

humana por año, incluyendo 500 muertes (Mead et al., 2006).

En rumiantes, la infección por Listeria es transmitida por consumo de silaje en mal estado, en el cual

la bacteria se multiplica rápidamente, dando lugar a brotes en ganado (Fenlon, 1999).

El genoma de L. monocytogenes fue secuenciado recientemente y posee un cromosoma circular de

2.944.528 pb con un promedio de G+C de 39%. Se han identificado 2853 genes, sin embargo al

35.3% no se les conoce función. En el caso de L. innocua posee un único cromosoma circular de

3.011.209 pb con un contenido promedio de G+C del 37%. Dentro del género Listeria, estas dos

especies presentan alto grado de homología en la secuencia del 16S rRNA, siendo las de mayor

cercanía taxonómica (Von Both et al., 1999).

Listeria monocytogenes es un microorganismo telúrico, muy extendido en el medio ambiente (suelo,

vegetación, agua). Su temperatura óptima de crecimiento es de 30-37ºC, pero puede crecer incluso a

4ºC. Tiene una gran tolerancia a factores usados para controlar el desarrollo microbiano en los

alimentos, como alta acidez (pH ≈ 4.4), alta concentración de sal (12%) y baja actividad de agua

(0,92), aunque la combinación de estos factores disminuye la tolerancia.

Listeria monocytogenes es capaz de adherirse a las superficies (biofilms) de las instalaciones y

equipos, y por tanto contaminarlas.

Está reconocida actualmente en la sanidad humana como un agente patógeno de origen alimentario.

Puede encontrarse sobre todo en alimentos vegetales, embutidos y en los productos lácteos, en

particular quesos de pasta blanda. Aunque los alimentos contaminados son el origen de la mayoría de

los casos de listeriosis, la mayor parte de las personas tiene poco riesgo de padecerla. La listeriosis

afecta esencialmente a personas con el sistema inmunitario debilitado o modificado, como los

inmunodeprimidos, los recién nacidos, las embarazadas, los pacientes tratados con corticoides y

personas de edad avanzada.

Listeria monocytogenes es una bacteria que produce listeriosis, una enfermedad que se manifiesta en

la mayoría de los casos por encefalitis o meningoencefalitis, en los rumiantes adultos y por

septicemia con necrosis hepática focal en los rumiantes jóvenes y monogástricos. También pueden

producirse abortos en infección perinatal. La listeria es ubicua y extremadamente resistente a

condiciones ambientales adversas. Por tanto, puede convertirse en un problema para los ganaderos.

PATOFISIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR LISTERIA MONOCYTOGENES

Existen dos formas de presentación clínica de la infección:

a) listeriosis perinatal

b) listeriosis en el paciente adulto.

Las formas clínicas predominantes corresponden en ambos casos a la infección diseminada o a la

infección localizada en el sistema nervioso central. Es la infección de origen alimentario con mayor

tasa de mortalidad en humanos (20 al 30 % o mayor) a pesar del inicio del tratamiento antibiótico

previo (McLauchlin, 1990).

La infección generalmente comienza alrededor de las 20 horas después de la ingestión del alimento

contaminado en los casos de gastroenteritis (Dalton et al., 1997), mientras que el período de

incubación para la forma invasiva es generalmente más larga, alrededor de 20 a 30 días.(Lindan et

al.,1988). Los mismos períodos de incubación han sido descritos para animales, tanto para la

gastroenteritis como para la forma diseminada.

Los casos esporádicos tienen una tasa de incidencia muy baja, 2 a 8 casos anuales por millón de

población en Europa y USA (Farber and Peterkin, 1991). Por este motivo, L. monocytogenes parece

tener un potencial patógeno más bajo que otros microorganismos de transmisión alimentaria, lo cual

está de acuerdo con la dosis letal 50 (DL50), relativamente alta. El valor determinado para el ratón

infectado experimentalmente por vía oral es de 109 y por vía parenteral es de 105 a 106. La dosis

mínima requerida para la infección humana no ha sido determinada, pero el número de bacterias

detectadas en alimentos responsables de casos esporádicos y epidémicos de listeriosis sugiere que es

alto. Esta dosis también depende de otros factores como el estado inmunológico del huésped.

a) Listeriosis feto materna y listeriosis neonatal

La infección se produce por invasión del feto por vía placentaria y desarrollo de

corioamnionitis. Como consecuencia, puede ocurrir el aborto, generalmente a partir de los 5

meses de embarazo, el parto prematuro o el nacimiento a término con infección generalizada del

neonato, síndrome conocido como granulomatosis infantiséptica.

Se caracteriza por la presencia de microabscesos piogranulomatosos diseminados en el cuerpo y

con alta mortalidad (Klatt et al., 1986). En la madre, la infección es generalmente asintomática y

puede presentarse como un síndrome gripal leve con escalofríos, fatiga, dolor de cabeza,

muscular y articular alrededor de 2 a 14 días antes del aborto.

La listeriosis neonatal tardía se observa con menos frecuencia. Generalmente ocurre de 1 a 8

semanas posteriores al parto y se presenta con un síndrome febril acompañado por meningitis y

en algunos casos gastroenteritis y neumonía. La vía de contaminación del neonato es por

aspiración de exudados maternos contaminados durante el parto. También se han registrado

casos intrahospitalarios en unidades de neonatología por transmisión horizontal a través de

instrumental y las manos del personal de salud (Farber et al., 1991). La mortalidad de la

listeriosis neonatal tardía es más baja (10 al 20%), pero al igual que la listeriosis temprana,

puede dejar secuelas tales como hidrocefalia y retraso psicomotor (Lorber, 1996).

b) Listeriosis del adulto

La infección más frecuente en el adulto es la invasión del sistema nervioso central (SNC) (55 al

70% de los casos). Desarrolla generalmente como meningoencefalitis acompañada por cambios

severos de la conciencia, desordenes del movimiento y en algunos casos parálisis de los nervios

craneales. La mortalidad de la infección del SNC es del 20%, pero puede ser del 40 al 60% si

está asociada a una enfermedad de base. En ciertos grupos de riesgo, como enfermos de cáncer,

L. monocytogenes es la causa más frecuente de meningitis bacteriana (Lorber, 1996).

Otra forma frecuente de listeriosis es la bacteriemia o septicemia que tiene una alta tasa de

mortalidad (hasta el 70%), si está asociada a una enfermedad inmunosupresiva. Hay otras

formas clínicas atípicas (5 al 10% de casos) tales como endocarditis, miocarditis, arteritis,

neumonía, pleuritis, hepatitis, colecistitits, peritonitis, abscesos localizados, artritis. En vacas la

forma más frecuente es la mastitis (Blenden et al., 1987). Investigaciones de brotes alimentarios

han dado la evidencia de que un síndrome gastrointestinal es la manifestación clínica de la

infección por L. monocytogenes (Aureli et al., 2000).

TRATAMIENTO

Los antibióticos de elección son la penicilina o la ampicilina solos o asociadas a gentamicina.

La combinación de trimetoprima y sulfametoxazol se ha utilizado con éxito en pacientes alérgicos a

penicilinas, considerándose en la actualidad una terapia alternativa.

PATOGÉNESIS

El motivo por el que L. monocytogenes produce una grave infección, se debe a la capacidad que

tiene de inducir su propia fagocitosis por células fagocíticas y no fagocíticas del huésped, seguido

por la replicación en el interior de las mismas y su transferencia directa a otra célula.

Como L. monocytogenes es un microorganismo intracelular, se disemina protegido de las defensas

del huésped incluyendo anticuerpos y complemento (Cossart et al., 2003).

Antes de alcanzar el intestino, las bacterias ingeridas deben soportar el ambiente adverso del

estómago, al menos 13 proteínas de estrés oxidativo y 14 proteínas de “shock” tóxico, son inducidas

bajo condiciones de estrés en L. monocytogenes (Vázquez-Boland et al., 2001b).

Las bacterias ingresadas con el alimento son captados por los enterocitos o la células M próximas a

las placas de Peyer en el intestino delgado, multiplicándose luego en las células fagocíticas. Las

bacterias son transportadas por los macrófagos del intestino al hígado o al bazo, donde son destruidas

por los neutrófilos y las células de Kupffer. Si la respuesta inmune mediada por células T del

huésped es inadecuada, las listerias se multiplican en los hepatocitos y en los macrófagos y son

llevadas por la sangre a varios órganos, especialmente al cerebro y/o al útero, donde atraviesan la

barrera hematoencefálica o la placenta. Una intrincada serie de factores de virulencia son producidos

por L. monocytogenes para facilitar cada paso en su proceso de invasión.

VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se concluye lo siguiente:

Al realizar el recuento de microorganismo psicrotróficos se demuestra que la leche utilizada tiene

un tiempo de vida útil corto por la presencia de muchos microorganismos presentes, demostrando

el grado de contaminación del producto.

El grado de contaminación con bacterias determina el tiempo de vida útil de la leche.

VII. BIBLIOGRAFIA

INFLUENCIA DE LAS BACTERIAS PSICROTROFICAS EN LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE

LA LECHE. Novoa C.F., 2007. Dpto. de química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de

Colombia, [en línea]. Disponible en:

< http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/remevez/article/viewFile/17712/18569>. [Consulta: 04 Diciembre 2013].

CALIDAD DE LECHE REQUERIDA POR LA INDUSTRIA, Lic. Qco. Ricardo Vera Apaza, [en línea]

Disponible en: < http://www.infolactea.com/descargas/biblioteca/99.pdf >, [Consulta: 04 Diciembre 2013]