Seminar IV

Ultrazvocna manipulacija mikromehurckov vterapiji

Avtor: Rok PodlipecMentor: doc. dr. Janez Strancar

1. november 2010

PovzetekUltrazvok se kot terapevtsko sredstvo uporablja v vedno vec medicinskih aplikacijah. Akusticno en-

ergijo visoko energijskega fokusiranega ultrazvoka (High Intensity Focused Ultrasound) lahko prenesemona poljubna mesta v telesu, kjer lahko lokalno povzrocimo odmiranje tkiva. Osnovni fizikalni mehanizemHIFU je pretvorba te energije v toploto, ki je zaradi nelinearnosti sirjenja in sipanja na kavitacijskihmehurckih pogosto se povecana.V zadnjih letih se v klinicnih aplikacijah povecuje uporaba mikromehurckov. Narejeni so iz bio-materialov,zato so nekateri z injiciranjem v krvni obtok primerni za tovrstno uporabo. Mikromehurcki, na katerelahko vezemo ucinkovine kot npr. molekule DNA pod ustreznim ultrazvocnim poljem razpadejo. Tafizikalni mehanizem nam pomaga pri prenosu ucinkovin na izbrana mesta v telesu in se poveca njihovucinek. Ultrazvocno polje lahko fokusiramo lokalno, na izbrana tkiva in organe, s tem pa minimiziramonezazelene stranske ucinke.Dobro razumevanje fizikalnih mehanizmov pa je pogoj za nadaljnji razvoj ultrazvoka v terapiji.

1

Kazalo

1 Uvod 21.1 Zgodovina uporabe ultrazvoka v terapiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2 Fizika ultrazvoka 22.1 Osnove . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.2 Zvocno polje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.3 Atenuacija, odboj in lom zvocnih valov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.4 Numericno modeliranje in kalibracija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3 Mikromehurcki 63.1 Mehanizmi razpada mikromehurckov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73.2 Dinamika mikromehurckov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

4 Ultrazvok v terapiji 104.1 HIFU terapija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114.2 Ultrazvocno manipuliran prenos ucinkovin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

5 Zakljucek 15

Literatura 16

1 Uvod

Pomembna lastnost ultrazvoka v terapiji je klinicno ucinkovanje na dele telesa brez poskodb okoliskega tkiva.Med raznolikimi terapijami v medicinskih aplikacijah je uporaba visoko energijskega fokusiranega ultrazvoka(HIFU) najobetavnejsa. V fokusiranem polju ultrazvoka je namrec v blizini piezoelektricnega pretvornika1

akusticna moc zadosti majhna, da se tkivo tam ne poskoduje, medtem ko je v goriscu moc mnogo vecja in jeabsorpcija zvocnega polja toliksna, da lahko termicno preobrazi proteine v tkivu. Piezoelektricni pretvornik,ki ga rocno premikamo po kozi, tako neagresivno izzove krvavitev ali odmiranje tumorja globoko v nasemtelesu, kamor smo usmerili fokus. HIFU terapija vzdrzuje homeostazo 2, vkljucuje kirurski poseg in stimu-lacijo imunskega odziva. Nedavne raziskave so pripomogle, da se je uporaba ultrazvoka v terapiji razsirila naveliko medicinskih aplikacij [1].Ena izmed pomembnih aplikacij je prenos ucinkovin po telesu v ciljna tkiva kot npr. genska terapija. Medicin-ska tehnologija za gensko analizo je mocno napredovala in nam omogoca identificirati tiste gene, ki so kriviza razvoj, reguliranje in ozdravitev bolezenskih stanj v telesu. Terapija obsega klinicno zdravljenje dednih,rakastih ali nalezljivih bolezni s cim varnejsim in ucinkovitim prenosom primernih terapevtskih genov naciljna tkiva [2]. Pomemben faktor v genski terapiji je nacrt primernega in efektivnega prenosa genov naciljna bolezenjska stanja, ki bi bil varno uporabljen v zivem organizmu. Najobetavnejsa je metoda uporabemikromehurckov, ki pod vplivom ultrazvoka izboljsajo prenos ucinkovin na zeljena mesta [3, 4].

1.1 Zgodovina uporabe ultrazvoka v terapiji

Uporaba ultrazvoka v terapiji ima zelo dolgo zgodovino [1]. V Franciji je leta 1917 Langevin opazoval smrtrib med razvijanjem sonarja. V Zdruzenih drzavah sta med letoma 1926 in 1927 Woods in Loomis proucevalaefekte ultrazvoka na celicah, tkivih, ribah in zabah, v Nemciji leta 1938 pa Zeiss kot prvi na oceh. SkupinaLynna je prva iznasla in uporabila terapijo s fokusiranim ultrazvokom. Sestavili so visoko energijski ultra-zvocni piezoelektricni pretvornik z goriscem v tkivu, s katerim so po obsevanju zaznali lokalno poskodovanosttkiva. V 40. letih Wall, v 50. Fry, oba iz ZDA, ter v 60. letih Oka iz Japonske, so razvili fokusirani ultrazvokza raziskave centralnega zivcnega sistema in vivo. Istocasno sta Burov in Andreevskaya v Laboratoriju za

1Pretvarja elektricne pulze v zvocne valove.2Ohranjanje notranjega okolja v obmocju, ki je optimalno za zivljenje.

2

Anizotropne Strukture, Akademije Znanosti USSR, testirala ucinek nizko energijskega nefokusiranega ultra-zvoka na rakaste tumorje in odkrila povecan imunski odziv. Vecino teh raziskav je bilo objavljenih sele predkratkim, pripomogle pa so k zdajsnji uporabi ultrazvoka v stevilnih oblikah in podrocjih zdravljenja [1].

2 Fizika ultrazvoka

2.1 Osnove

Visokofrekvencne zvocne valove uporabljamo ponavadi za odkrivanje razpok v materialih in pri klinicnemslikanju oz. terapiji. Generiramo jih z piezoelektricnimi pretvorniki, ki elektricne pulze pretvorijo v mehanskovalovanje. Aktivni element je kristal, del polariziranega materiala (piezoelektricna keramika), ki ima nanasprotnih straneh pritrjene elektrode. Ko vzpostavimo elektricno polje, se polarizirane molekule (imajopozitivno in negativno nabiti del) usmerijo glede na smer polja in inducirajo dipol, ob tem pa se spremenidimenzija materiala [5].Imamo tlacne, longitudinalne cp in strizne, transverzalne cs valove (znacilni za trdne snovi), ki se v snovehrazsirjajo z razlicnimi hitrostmi. Hitrost tlacnega valovanja v razlicnih tkivih je podana v tabeli 1.

Tabela 1: Hitrosti valov v razlicnih tkivih.

Tkivo cp [ms−1] Tkivo cp [ms−1]

Pljuca 600 Ledvice 1550Mascoba 1460 Misice 1600

Jetra 1510 Ocesno zrklo 1620Lobanja 4080

2.2 Zvocno polje

V zvocnem polju pri konstantni frekvenci lahko z Rayleigh-Sommerfeldovim integralom izracunamo tlakvalov iz ravnega piezoelektricnega pretvornika, ki se razsirjajo v tekocino, kot superpozicija tockastih izvorovexp(−iωt) na ravni odprtini [5]:

p(x, ω) =−iωρ

2π

∫S

v(y, ω)eikr

rdS(y) (2.1)

ρ je gostota, k = ω/c valovni vektor in r = |x−y| razdalja med tocko x v tekocini in tocko y na odprtini.Hitrost v(y, ω) je hitrost v smeri normale na povrsino odprtine S(y). Integral se resi le numericno, v posebnihprimerih pa tudi analiticno.V primeru razsirjanja valov v tkivo ponavadi nimamo idealne, homogene tekocine, valovi se na razlicnihmejnih plasteh odbijajo, lomijo, pri pa tem nastajajo poleg obstojecih longitudinalnih tudi transverzalnivalovi. Tlacne enacbe predstavljene tu torej veljajo le za idealen primer, ko se valovi razsirjajo po homogenitekocini.Rayleigh-Sommerfeldov integral lahko uporabimo tudi za modeliranje fokusiranega zvocnega polja, ce ravno

odprtino S zamenjamo z ukrivljeno, sfericno, na kateri je hitrost definirana v smeri normale vn (slika 1 levo).Analiticno resitev zvocnega polja na geometrijski osi dobimo ob predpostavki konstantne hitrosti [5]:

p(z, ω) =ρcv0

q0

[eikz − eikre

](2.2)

kjer so q0 = 1− z/R0, re =√[

(z − h)2 + a2]

in h = R0−√

(R20 − a2). Resitev enacbe za vrednosti tlaka

na geometrijski osi je graficno prikazana na sliki 1, desno. Na grafu opazimo minimume in maksimume terpozicijo geometrijskega gorisca z = R0, ki pa je dlje kot pravo gorisce fokusiranega ultrazvoka. Prava goriscnarazdalja Rf je zaradi loma ultrazvoka vedno krajsa od geometrijske R0. Razdalji Rf in R0 sta priblizno enakile v primeru zelo visokih frekvenc ultrazvoka. Razdaljo Rf lahko izracunamo numericno s pomocjo enacbe

3

Slika 1: Levo: shema sfericne oblike piezoelektricnega pretvornika, ki fokusira zvocne valove v gorisce. Puscicepredstavljajo smer hitrostnega polja zvocnih valov. Desno: normalizirana vrednost tlaka na geometrijski osi.Frekvenca sfericnega piezoelektricnega pretvornika je 10 MHz, premer 12.7 mm in goriscna razdalja 76.2 mm.Meritev je bila narejena v vodi [5].

(2.2).Analiticno se da izracunati tlak v precni smeri, in sicer v ravnini geometrijskega gorisca z = R0 [5]:

p(x, ω) = −iωρv0a2 eikR0

R0

J1(ka sin θ)

ka sin θ(2.3)

Prvi clen v enacbi 2.3 predstavlja frekvencno odvisno amplitudo, drugi clen razsirjajoce valovanje, tretji pa

Slika 2: Levo: trije parametri, ki nam definirajo karakteristike sfericnega piezoelektricnega pretvornika: legapravega gorisca Rf , sirina v goriscu Wf ter globina gorisca Df . Desno: odbiti in prepusceni ravni valovi namejni plasti tekocina - trdna snov. Z debelimi puscicami so prikazane polarizacije hitrosti valov [5].

kotno odvisno amplitudo v precni smeri, kjer je J1 Besselova funkcija prvega reda. Enacbo lahko uporabimoza ocenjevanje precne sirine polja ultrazvoka v geometrijski goriscni ravnini Wf in globine gorisca ultrazvokaDf , tako, da opazujemo znizanje tlaka iz maksimuma na doloceno vrednost (slika 2, levo) [5].Bolj tocne vrednosti dobimo iz numericnega resevanja enacbe (2.2). Prava goriscna razdalja Rf , sirina poljav goriscu Wf in globina gorisca Df opisujejo polozaj in velikost obmocja v katerem je delovanje fokusiranegaultrazvoka najvecje [5]. To so trije kljucni parametri, ki nam opisujejo razsirjajoce fokusirano ultrazvocnopolje, katerih vrednosti se morajo za efektivno klinicno zdravljenje ujemati z polozajem in velikostjo bolezen-jskega stanja v telesu (tumorji).

2.3 Atenuacija, odboj in lom zvocnih valov

Amplituda valovanja se pri prehodu skozi snov manjsa kot posledica sipanja in absorpcije [5]:

4

A2

A1= e−α(f)d (2.4)

kjer je A1 amplituda na razdalji x1 v smeri razsirjanja valovanja, amplituda A2 pa na razdalji x1 + d.Faktor α(f) predstavlja atenuacijski koeficient, ki je funkcija frekvence f ultrazvoka. V splosnem z vecanjemfrekvence absorbcija narasca. V primeru vode pri sobni temperaturi, je bila izmerjena atenuacija, α(f) =25.3× 10−15f2 Np m−1, kjer izraz f pomeni frekvenco v Hz, Np pa je brezdimenzijska logaritemska enota zaizrazanje razmerij tlacnih amplitud. Atenuacijo zvoka ponavadi merimo v dB/dolzinsko enoto, kjer decibel(dB) izraza moc in je prav tako kot Neper (Np) definiran v logaritemski skali, le da tu osnova ni Eulerjevostevilo (e = 2.71828), ampak 10. 1 Np=8.686 dB [5].Tlacno valovanje generirano v tekocini, se preko ravne mejne plasti (tekocina - trdna snov) v idealnem primerurazsirja po Snellovem zakonu, ki pravi:

sin θp1cp1

=sin θp2cp2

=sin θs2cs2

, (2.5)

kjer sta cp1 in cp2 hitrosti tlacnih valov v tekocini in trdni snovi, cs2 pa generirana strizna hitrost v trdnisnovi (slika 2 desno). Hitrosti striznih valov so v splosnem enkrat pocasnejse kot longitudinalnih. Ker se UZpolje skozi telo razsirja preko razlicnih plasti (tekocina-tkivo), se polje tam lomi, pri tem pa meje niso povsemravne in je potrebno v izracunu to upostevati. Amplitude razsirjajocih valov so dolocene z refleksijskimi intransmisijskimi koeficienti, ki so v splosnem odvisni od vpadnega kota, hitrosti valov v posameznem podrocjuin akusticne impedance, Zp,s, ki je definirana kot Zp,s = ρcp,s [5].

2.4 Numericno modeliranje in kalibracija

Pri numericnem modeliranju in simuliranju propagacije visoko energijskih zvocnih valov iz HIFU piezoelek-tricnega pretvornika moramo upostevati nelinearnost zvocnega polja zaradi distorzije valovnih front, ki soposledica frekvencno odvisnega segrevanja tkiv in kavitacije, hidrodinamskega toka, striznih napetosti, ne-homogene strukture tkiv in tudi loma na meji med tekocino in tkivi (glej Snellov zakon, enacba 2.5). Vsplosnem si pomagamo z nelinearno enacbo Khokhlov-Zabolotskaya-Kuznetsov (KZK), ki je bila izpeljana zaopis nelinearnih zvocnih valov v viskoznem mediju [1]:

∂p

∂z− β

c30p∂p

∂τ− b

2c30ρ0

∂2p

∂τ2=c02

∫ τ

−∞∆⊥p(τ

′)dτ ′ (2.6)

P predstavlja zvocni tlak, z koordinato v smeri sirjenja valov, c0 zvocno hitrost, ρ0 gostoto medija,τ = t− z/c0 retardiran cas, β koeficient nelinearnosti, b parameter disipativnosti, ∆⊥ pa Laplaceov operatorv precni smeri, r=(x,y). Robni pogoj p0(τ, r) je dan pri z=0.Enacba je najenostavnejsi model, ki dovolj natancno opise nelinearne pojave in sipanje fokusiranih ultra-zvocnih valov, ne opisuje pa npr. odbitih valovanj. Obstajajo se natancnejsi modeli, ki se bolje ujemajo zeksperimentalnimi podatki o frekvencno in intenzitetno odvisni absorbciji ultrazvoka v tkivih, kjer npr. kav-itacijska jedra odbijajo ultrazvocne valove in prestavijo fokus in kjer se pri zadosti visokih tlakih tkivo tuditermicno in mehansko spremeni. Pri taksnih dogodkih se spremenijo parametri, ki jih je v modelu potrebnoupostevati [1].Resitev enacbe 2.6 lahko poiscemo v frekvencnem prostoru v obliki Fourierovega razvoja [1]:

p(z, r, τ) =

∞∑n=−∞

Cn(z, r)e−inω0τ (2.7)

S tem nastavkom lahko iz enacbe 2.6 dobimo set nelinearnih, sklopljenih diferencialnih enacb za Cn privsakem koraku oz. razlicnih z-jih v smeri razsirjanja valovanja. Cn predstavlja amplitudo n-tega harmonikav spektru razsirjajocih valov v kompleksnem obmocju. Resevanje v frekvencnem obmocju je za modeliranjeutrazvoka v terapiji bolj primerno kot resevanje v casovnem obmocju. V frekvencnem obmocju izracunamotudi absorbcijski clen neposredno iz resitev amplitud harmonicnih nihanj Cn po preteku razdalje ∆z [1]:

Cn(z + ∆z) = Cn(z)e−αn∆z (2.8)

5

Vrednost αn = (nω0)2b/2c30ρ0 predstavlja atenuacijski koeficient. V vecini tkiv je atenuacija reda 0.1Np/cm/MHz. Z zgornjim numericnim modelom lahko izracunamo absorpcijo zvoka v dolocenem volumnu nadoloceni globini, Q = −∇ ∗ I, kjer je I =< pv > intenziteta povprecena po casu in ocenimo najprimernejsofrekvenco UZ izvora pri posameznem zdravljenju. Pogoj za maksimalen prenos toplote na tkivo na doloceniglobini L je ∂Q/∂α = 0, ki pripada frekvenci ω0 z absorpcijsko dolzino α−1 = 2L [1].

Slika 3: Temperaturna porazdelitev v tkivu po vzbu-janju s HIFU piezoelektricnim pretvornikom. Zgornjisliki prikazujeta izracunano in z infrardeco kameroizmerjeno porast temperature v tkivu. Na sliki spodajje postavitev eksperimenta z 2 MHz piezoelektricnimpretvornikom, 60 W moci, z goriscno razdaljo 55 mmin premera 35 mm. Pri eksperimentu so kot medijuporabili jetra, ki so jih namestili v smeri osi zarka.Termicno spremembo zgornje plasti so posneli po 10sekundah v HIFU polju [1].

Matematicni model za dolocanje temperature ob-sevanega tkiva temelji na BioHeat Transfer Equation(BHTE)3, ki uposteva difuzijo toplote, pretakanjekrvi in absorpcijo toplote [1]:

∂T

∂t= k∆T − T − T0

τ+Q

cv(2.9)

T (r, t) je temperatura tkiva, T0 ravnovesnatemperatura, k = K/cv lokalna temperaturnaprevodnost, kjer je K toplotna prevodnost,cv pa toplotna kapaciteta. Q izracunamos pomocjo KZK enacbe, medtem, ko lahkovpliv pretoka krvi (clen s τ) pogosto zanema-rimo. τ je namrec reda sto sekund, zato gaza casovno krajsa HIFU zdravljenja ni trebaupostevati. Slika 3 prikazuje dobro uje-manje med izmerjeno in izracunano temper-aturno porazdelitvijo s pomocjo enacb 2.6 in2.9. Poskus je bil narejen na amputiranih jetrih[1].Ti izracuni so osnova za boljse razumevanjeinterakcije tkiv z ultrazvokom ter so pomem-bni za planiranje in optimiziranje protokolovzdravljenja, ki so pri HIFU terapiji se slabodoloceni.

3 Mikromehurcki

Preden se posvetimo aplikacijam ultrazvoka vterapiji je nujno omeniti vlogo mehurckov oz.mikromehurckov. Ti v ultrazvocnem polju namrecbistveno vplivajo na ucinkovitost zdravljenja ra-zlicnih bolezni.Delimo jih v dve skupini. Prva so prosti zracnimehurcki, ki nastanejo z vplinjanjem tekocine ali z

rastjo majhnih kavitacijskih jeder pod vplivom negativnega tlacnega polja [1]. Periodicno negativno in poz-itivno tlacno polje, ki ga generira ultrazvok, v snovi povzroci gostotni gradient. Negativni tlak lahko ze prinizki frekvenci ultrazvoka povzroci nastanek mehurckov, medtem, ko je amplituda polja, ki je potrebna zanastanek le teh, odvisna od vsebnosti plina v tekocini. Kavitacija mehurckov je lahko stabilna ali prehodna.Pri slednji je dinamika nelinearna, mehurcki neenakomerno oscilirajo, rastejo in nazadnje razpadejo (slika4). Pri tem dosezejo temeperature tudi nekaj tisoc K, lokalni tlak pa lahko naraste do nekaj sto atmosfer.Posledica na lokalno okolje so tako hidrodinamski kot tudi mehanski efekti, kot je generiranje tako imeno-vanega mikrotoka tekocine in polja striznih napetosti [2].

Druga skupina so umetno narejeni mikromehurcki z npr. lipidno sestavo ovoja. V primeru vbrizganja vozilje jih lahko koristno uporabimo pri zdravljenju razlicnih bolezni, predvsem tumorjev in tudi slikanju.

3Enacba, ki jo je za opis spreminjanja temperature pri raziskavi temperature krvi v podlaketi leta 1948 vpeljal Harry H.Pennes.

6

Slika 4: Obnasanje mehurcka v ul-trazvocnem polju. Shema prikazujespreminjanje velikosti mehurcka prikavitaciji v tekocem mediju. Mehurckise generirajo v podrocjih negativnegatlaka, nato sledi nestabilno osciliranjes povecevanjem njihove resonancne ve-likosti dokler ne razpadejo [2].

Prva sta mikromehurcke kot kontrastna sredstva sipanja ultrazvoka v srcni aorti leta 1968 uporabila Gramiakin Shah. Prvi mikromehurcki so bili napolnjeni z zrakom, vendar so zaradi visoke topnosti v krvi in tanke(10− 15 nm) proteinske lupine, ki ni dobro preprecevala difuzije plinov, v nekaj sekundah izginili iz krvnegaobtoka. Drugo in tretjo generacijo mikromehurckov pa sestavljajo neaktivni plini z veliko molekularno masokot je npr. zveplov heksafluorid, ki ima manjso topnost in nizji difuzijski koeficient. To se odraza v vecji sta-bilnosti in daljsem obstoju v krvnem obtoku. Plinasto jedro obicajno obdaja proteinski, lipidni ali polimerniovoj (od 2 do 500 nm). To bistveno zmanjsa izgube vsebovanega plina in hitrost raztapljanja in zlivanjamikromehurckov samih. Zunanji ovoj obenem poskrbi za manjso povrsinsko napetost mikromehurcka, ki sekaze v daljsem razpadnem casu. Trdoto, odpornost na tlacno polje ultrazvoka in prepoznavanje oz. razgrad-njo v telesnem okolju (retikuloendotelijski sistem4) doloca sestava ovoja mikromehurcka [3].Mikromehurcki so zaradi njihove notranje stisljivosti (do 17000 bolj stisljivi kot voda) dobri sipalci ultra-zvoka, kar je bistveno za metode slikanja in vpliva tudi na efektivnost HIFU terapije. Sipanje je odvisnood stisljivosti plina, velikosti mehurcka, trdote, viskoznosti in gostote ovoja mehurcka, lastnosti okoliskegamedija ter frekvence in moci generiranega ultrazvoka. Sipalni presek ultrazvoka na vecjih mikromehurckihse povecuje z r6. V klinicni uporabi se frekvence gibljejo od 2 do 13 MHz. Mikromehurcki so pri dolocenihfrekvencah polja lahko v resonanci. Te so odvisne od premera in lastnosti ovoja mehurcka. Resonancnafrekvenca se z manjsanjem radija povecuje, ce pri tem lastnosti ovoja ostanejo nespremenjene [6, 7].

3.1 Mehanizmi razpada mikromehurckov

Mikromehurcki zaradi delovanja ultrazvoka tudi razpadejo. Mehanizmi razpada so fragmentacija, kjer semikromehurcek razbije na manjse dele, naravna difuzija in akusticno pospesena difuzija, pri katerih plinprehaja v in iz mehurcka. Mehanizme lahko opazujemo z opticnimi in akusticnimi meritvami, npr. z metododekorelacije prejetega signala [1].

Slika 5: Opticni posnetki oscilirajocega mikromehurcka. Fragmentacija se zgodi med kompresijo oz. krcenjemle tega. (A) Velikost mikromehurcka. (B-G) Precni 2-D posnetki prikazujejo casovno spreminjanje radijamikromehurcka, ki se v celoti vidi na sliki H [3].

4Vrsi fagocitozo(proces, pri katerem celica pozre in prebavi delce trdne snovi), internalizacijo endotoksinov, regulira imunskiodgovor ter razgrajuje lipide.

7

Fragmentacija

Mikromehurcek lahko v zvocnem polju postane nestabilen in se posledicno razbije na manjse fragmente (slika5). Mocno raztezanje in krcenje le tega, ki je posledica ultrazvocnega polja privede do perturbacij sfericnesimetrije. Radialna deformacija je odvisna od vpadnih tlacnih valov in mehanskih lastnosti tekocine, plinater samega ovoja. Kriterij stabilnosti, ki sta ga pri analizi dinamike perturbacij uvedla Plesset in Mitchellleta 1956 [7]:

RTreshold ∼=Rmax

10(3.1)

doloca, da razpadajoc mikromehurcek postane nestabilen, ko njegov radij pade pod desetino vrednostiRmax

5. V primeru nesfericnih perturbacij reda velikosti radija mikromehurcka in vec, postane se manjstabilen. Na potek fragmentacije vpliva tudi povrsinska napetost mehurcka, ki je enakovredna energiji napovrsinsko enoto. Povzroca, da mehurcek ne glede na dinamiko tezi k sfericni obliki, kjer je volumen vsebo-vanega plina zaobjet z najmanjso mozno povrsino in posledicno minimizira povrsinsko energijo. Kot posledicozvocnega polja na mikromehurcke poznamo se tako imenovano neparametricno Rayleigh-Taylorjevo nestabil-nost. Pojavi se, ko se razpadajoc mehurcek naglo priblizuje svojem minimalnem radiju in pri tem v okoliskotekocino z velikim pospeskom oddaja vsebovan plin. To povzroci silovito fragmentacijo, ki je mnogo hitrejsaod same periode oscilacije. Casovna skala je reda velikosti le nekaj nanosekund. Meritve so izvedli opticno,z 20-nanosekundnim pulznim laserjem [7].

Naravna difuzija

Razpad pa ne poteka zgolj z fragmentacijo, temvec tudi z difuzijo. Slednja pomeni tok plinov iz notranjostiv okolijski medij brez upostevanja konvekcije.Hitrost difuzije je obratno sorazmerna z radijem in gostoto plina v mikromehurcku. Je sorazmerna difuzijskemkoeficientu in razliki zacetne koncentracije plina z ravnovesno koncentracijo v okoliskem mediju. Zacetna kon-centracija plina v okolici lahko varira od 0 pa do nasicenja, odvisno od plina in koncentracije mehurckov.Izracunamo lahko cas raztapljanja plinastih mehurckov razlicnih velikosti za razlicne pogoje (koncentracijeplina v mehurcku in okolici). Rezultati kazejo, da je raztapljanje redkejsih in manjsih plinastih mehurckovres hitrejse. V primeru zracnega mehurcka z radijem 2 µm pri 20◦C je cas raztopitve 8 ms, medtem, ko jeza plin C4F10 z veliko molekularno maso pri enakih eksperimentalnih pogojih 100 krat daljsi. Pomembno jetudi, da se z visanjem temperature difuzija upocasnjuje [7].

Difuzija pod vplivom ultrazvoka

Tlacne spremembe, ki so posledica ultrazvoka, vplivajo na dinamiko mejne plasti med tekocino in plinom terposledicno na difuzijo. Na difuzijo vpliva tudi povsinska napetost mehurcka, ki igra bistveno vecjo vlogo vprimeru poskodovanja ovoja. Kompletna difuzijska enacba plinastega mehurcka v tekocini je [7]:

∂C

∂t+ ν

∂C

∂R= κ∇2C (3.2)

kjer je C koncentracija plina v mehurcku, t cas, ν hitrost mejne plasti, R radij in κ difuzijski koeficientplina v tekocini. Drugi clen v enacbi predstavlja konvekcijski clen, ker opisuje gibanje povrsine mehurckazaradi toka plina cez mejno plast. Za razumevanje vpliva tlacnega polja na difuzijo je potreben natancnejsimodel, ki sta ga razvila Cha in Henry. Njuna enacba vsebuje se dodaten clen, ki uposteva tok plina cezmejno plast zaradi zunanjega spreminjanja tlaka. Pri ultrazvocnem vzbujanju mehurckov je tezko dolocitihitrost difuzije. Na razlicne hitrosti difuzije plina pri krcenju, kjer plin prehaja v zunanjost in pri raztezanjumehurcka, kjer plin prehaja nazaj v notranjost (v slednjem primeru je pocasnejsa difuzija), pomembno vpli-vajo dinamika ovoja, zacetni radij, oblika tlacnih valov, ipd. [7].

5Maksimalen radij mehurcka tekom ultrazvocnega obsevanja.

8

Mehanicni indeks

Tlacno polje, potrebno za razpad mikromehurcka, se z znizevanjem frekvence pri enaki intenziteti ultrazvokazmanjsuje. Odvisno je tudi od povrsinske napetosti mikromehurcka, kjer se s povecevanjem le te zmanjsuje.Apfel in Holland sta opazovala razmerje intenzitete tlacnega polja in kvadratnega korena frekvence polja terugotovila, da se razpadi mikromehurckov zgodijo pri dolocenih vrednostih le tega. Sledila je vpeljava novegaparametra, mehanicni indeks (MI), ki opisuje verjetnost za njihov razpad:

MI =(P−/MPa)√

(f/MHz)(3.3)

P− predstavlja maksimalni negativen tlak. Mehanicni indeks za razpad mehurcka se giblje med 0.3− 0.4,pri vrednosti okoli 0.7 se zacno pojavljati bioloski ucinki na mehurcke, pri MI > 1 pa so ti lahko ze skodljivi.Te vrednosti so bile dolocene pri generiranju enega samega ultrazvocnega pulza, ce pa je teh vec, se vrednostiMI zmanjsajo [8].Vpliv mehanicnega indeksa lahko predstavimo na primeru lipidnih mikromehurckov. Njihovo obnasanje vultrazvocnem polju je odvisno od intenzite polja (slika 6). Pri majhnih moceh (MI < 0.05− 0.1), mikrome-hurcki oscilirajo simetricno, spremembe njihovega volumna so obratno sorazmerne s tlacnimi spremembami,sipano polje pa je linearno (ima enako frekvenco). Pri mehanicnem indeksu med 0.1 − 0.3 mikromehurckipostanejo bolj odporni na krcenje, dinamika postane nelinearna, polje pa se siplje pri vec frekvencah. Privisjih moceh (MI > 0.3−0.6), mikromehurcki ze lahko razpadejo. En nacin je z difuzijo plina ven iz mehurckapri krcenju ali zaradi poskodb v ovoju, drugi nacin pa s fragmentacijo ovoja in plinastega jedra [3].

Slika 6: Shematski prikaz lipidnih in polimernih mikromehurckov v narascajocem ultrazvocnem polju.Mehanicni indeks (MI) od zgoraj navzdol narasca [3].

3.2 Dinamika mikromehurckov

Dinamika mikromehurckov se razlikuje od dinamike prostih plinastih mehurckov. Opisemo jo z ustreznimnumericnim modelom. Enega izmed teh je razvil Prosperetti s popravljeno Keller-Miksisovo enacbo, kateregaresitve sovpadajo z dobljenimi pri resevanju celotne parcialne diferencialne enacbe za dinamiko tekocin vsirokem obmocju amplitud oscilacij. Ustrezen je tudi za siroko tlacno obmocje [6].(

1− R

c

)RR+

3

2R2(

1− R

3c

)=(Pρ

)+

1

ρc

d

dt

(RP), (3.4)

kjer je P (R, R, t) enak:

P (R, R, t) =(Pstat +

2χ

R0+

2σ

R0

)(R0

R

)3k

− 2σ

R− 4µ

R

R− 2χ

R

(R0

R

)2

− (12µshε)R

R(R− ε)Pstat −A (3.5)

9

R0 je ravnovesni radij mehurcka, Pstat okoliski tlak, σ povrsinska napetost, ρ gostota tekocine, µ vizkoznost,c zvocna hitrost, k politropni indeks plina v mehurcku, χ, µsh in ε pa so dodatni cleni zaradi ovoja mehurcka.Zadnji clen v enacbi predstavlja ultrazvocno polje npr. pri enojni frekvenci, A = Pa sin(2πν1t) [6]. Doenacbe 3.4 pridemo z resevanjem gibalne enacbe za neviskozno oz. viskozno tekocino, ∂u/∂t + u∂u/∂r =−1/ρ(∂p/∂r), kjer je u hitrost tekocine v okolici sfericnega mehurcka ob predpostavki ohranitve mase

in nestisljivosti tekocine div~V = 0, u(r, t) = R(R2/r2). Dinamiko opazujemo na meji med tekocino inmehurckom, zato v enacbi 3.4 r zamenjamo z R.Izracun enacbe v primeru enojne frekvence UZ pokaze, da je dinamika mikromehurckov zelo nelinearna inkaoticna, se posebej v primerih visokega tlacnega polja (Pa ' 4 MPa, ν ' 1 MHz), kakrsen je dejansko vprimeru je HIFU terapije. Ce v terapiji dodamo uporabo mikromehurckov (gej stran 12), je za njen vecjiucinek zato zelo pomembno, da poiscemo ultrazvocno metodo, s katero bi gibanje cim bolj determinirali.Numericni izracun pokaze, da je uporaba ultrazvoka z dvojno frekvenco ucinkovitejsa, ker zmanjsa kaoticnostoscilacij (slika 7, desno). Tokrat je zadnji clen v zgornji enacbi enak A = Pa sin(2πν1t) +βPa sin(2πν2t+α),kjer je β vrednost med 0 in 1, α pa fazni zamik. Opazne razlike pri enojni in dvojni frekvenci vidimo tudipri casovnem spreminjanju radija mehurcka (slika 8). Da se to zgodi, mora sekundarna frekvenca glede naprvo imeti ustrezen fazni zamik in tudi primerno velikost. Na koncu je treba upostevati, da numericni modelni povsem realen, saj ne uposteva interakcij med mehurcki [6].

Slika 7: Leva slika- Bifurkacijski diagram, ki prikazuje spreminjanje radija Albunex mikromehurcka s tlakom.Zacetni parametri so: R0 = 4 µm, ν1 = 2 MHz (ν2, α in β = 0). Desna slika- Bifurkacisjki diagram po dodanisekundarni frekvenci z ν2 = 2.5 MHz, α = π/3 in β = 1 [6].

Slika 8: Leva slika - casovno spreminjanje radija R mehurcka pri enojni frekvenci, ν1 = 200kHz in tlacniamplitudi Pa = 1.7 MPa je kaoticno. Desna slika - casovno spreminjanje radija pri dodani sekundarnifrekvenci (ν2 = 500 kHz, α = π/2 in β = 1). Opazimo ponavljajoce oscilacije, dinamika mehurcka je stabilna[6].

Ker je uporaba dvojne frekvence dokaj preprosta eksperimentalna metoda, se uporablja v vedno vecraziskavah, ki temeljijo na znizevanju kaoticnega gibanja mehurckov. To bi lahko imelo v prihodnosti velikpomen pri zdravljenju mozganskih tumorjev, kjer je, kot receno dovoljena prejeta ultrazvocna energija zaminimiziranje stranskih ucinkov omejena in bi z zmanjsanjem kaoticnosti mehurckov bistveno pripomogli k

10

njegovi efektivnosti. Diagnosticno slikanje, dostava ucinkovin, povecanje membranske prepustnosti, odpiranjemozganske krvne bariere in HIFU terapija, vse to so obetajoce medicinske aplikacije z uporabo mikrome-hurckov, kjer je prvi nujen korak prav zmanjsanje njihove kaoticnosti [6].

4 Ultrazvok v terapiji

Ultrazvok se pogosto uporablja v klinicnih aplikacijah. Nastejemo lahko nekaj najpomebnejsih [1]:

• Terapija s pomocjo visoko energijskega fokusiranega ultrazvoka (HIFU). Lokalno termicno segrevanjeomogoca odmiranje rakastih oz. tumornih tkiv z ohranjanjem notranjega okolja v obmocju optimalnemza zivljenje. To vkljucuje imunoterapijo, zaustavljanje krvavitve po operaciji ipd.

• Izboljsanje prenosa ucinkovin oz. zdravil v tarcna, predvsem tumorna tkiva (npr. genska terapija),litotripsija6, itd. [4].

V tabeli 2 so prikazane vrednosti glavnih treh parametrov ultrazvocnega polja, ki se od vrste terapijerazlikujejo [10].

Tabela 2: a Eksperimentalne tehnike: v raziskavah se vrednosti parametrov pri posamezni terapiji mocnospreminjajo. Akusticni parametri so lahko mocno pogojeni s trajanjem terapije in drugih faktorjev [10].

Terapija frekv. [MHz] Povp. intenziteta polja [W cm−2] Ampl. tlaka v goriscu [MPa]Fizioterapija 1− 3 1 < 0.5Litotripsija 0.5 zelo nizka > 20

Litotripsija mehkih tkiva 0.25 zelo nizka 5− 30HIFU 0.5− 5 1000− 10000 10

Prenos ucinkovina > 2 razlicno 0.2− 8

4.1 HIFU terapija

Glavna ideja HIFU terapije, ki je povzeta po clankih Lynna in Frya, je uporaba fokusiranega zvocnega polja,ki omogoca strjevanje in posledicno odmiranje tkiva. Metoda je bila uporabljena ze na mozganih, mehkihrakastih tkivih, benigno povecanih prostatah, raku na prostati, glavkomu7, ocesnem melanomu8, tumorjumaternice in mnogo drugih. Na sliki 9 je shematicen prikaz delovanja HIFU piezoelektricnega pretvornikana tkivo [1].Pri procesu odmiranja tumornega tkiva so ugotovili, da ultrazvok lahko zamasi krvne zile, zato so ga zaceli

uporabljati kot nujno medicinsko pomoc pri zivljenjsko nevarnih krvavitvah. Poleg tega so znanstvenikiugotovili se, da ultrazvok sprozi povecan imunski odziv, ki lokalno unici tumorno tkivo in ga zasciti prednadaljnjo rastjo. Ultrazvok nadaljne lahko vpliva na povecanje transporta snovi cez bioloske bariere, kot socelice, tkiva in krvni strdki [1].Pri HIFU terapiji je intenziteta zvocnega polja v goriscu reda 1000 W/cm2, tkivo pa se v 1 − 3 s ogreje do70◦C in vec. Frekvencno obmocje izvora je med 1 in 10 MHz. Za primerjavo je intenziteta ultrazvoka npr.pri slikanju telesa reda 1 W/cm2, tkivo pa se ogreje le za priblizno 1◦C.Glavni mehanizem HIFU je lokalno povisanje temperature v tkivu, ki je posledica absorbcije ultrazvoka.Absorbcija v grobem narasca linearno s frekvenco ultrazvoka. Zeljeno penetracijsko globino zato dosezemoz optimalno nastavljeno frekvenco ultrazvocnega izvora. Ob tem velja omeniti, da se absorbcija v tkivu stemperaturo povecuje, se posebej takrat, ko je toliksna, da ze omogoca denaturizacijo proteinov [1].

6Drobljenje kamna v ledvicnem mehu, secevodu ali secnem mehurju mehanicno ali z ultrazvokom kratkih mikrosekundnihpulzov

7bolezen ocesa s povecanim intraokularnim tlakom, ki povzroca patoloske spremembe na ocesnem ozadju, tipicnim izpadomvida in mocnimi bolecinami

8Tumor melaninskih celic

11

Slika 9: HIFU zarek fokusiramo na tumorna tkiva ali pa v podrocja kjer povzrocimo krvavitve brez poskodbv okolici. Ultrazvocna energija iz piezoelektricnega pretvornika se prenese v podrocje fokusa na majhenvolumen, priblizno velikosti rizevega zrna. Slika desno prikazuje premik podrocja fokusa UZ polja levo zaradikavitacije oz. sipanja na mikromehurckih in povecanja temperature v primarnem fokusu. Za ucinkovitostterapije je to potrebno upostevati [1].

Pri prenosu ultrazvocne energije na tarcno tkivo, dolocene z nastavitvami piezoelektricnega pretvornika, lahkopride do nezeljenih efektov, kot je nastajanje kavitacijskih mehurckov pred goriscem, kjer se profil prenosaenergije ultrazvoka po tkivu spremeni ( 9 desno) [1]. Pojav kavitacijskih mehurckov pa ima po drugi stranipotencialno zelo pomembno vlogo pri zdravljenju tumorjev in drugih bolezni [6].HIFU terapija ima nekaj slabosti, kot so dolgorocno zdravljenje vecjih tumorjev in neucinkovitost zdravljenjatumorjev blizu kosti, saj so mnogo vecji absorber ultrazvoka kot mehko tkivo in se posledicno pregrejejo.Slednje ovira zlasti zdravljenje mozganskih tumorjev zaradi blizine lobanje. Potrebno ultrazvocno moc zazdravljenje tumornega tkiva lahko zmanjsamo tudi za 90%, prav s pojavom kavitacijskih zracnih mehurckovali pa se bolje, uporabo injiciranih, tarcnih mikromehurckov. Pri uporabi le teh ni potrebe po visoki amplituditlacnega polja, ki je potrebna za nastanek prostih plinastih mehurckov. Mikromehurcki pod vplivom ultra-zvoka lokalno tkivo se bolj segrejejo in nanj ucinkujejo tudi mehansko. Problem pri ucinkovitosti taksnegazdravljenja so kaoticne oscilacije mikromehurckov, ki jih potencialno lahko minimiziramo npr. z dvojnofrekvenco (glej stran 10) [6].

Izzivi

Eden izmed glavnih izzivov za prenos energije v telo je veliko ojacanje zvocnega tlaka v samem goriscu. Naboljpogost stranski ucinek terapije so opekline na kozi, ker je absorbcija tam nekajkrat vecja kot v notranjemmehkem tkivu. Moc zvoka mora biti ob prehajanju cez kozo zato cim nizja. To naredimo z ucinkovitimzvocnim podvajanjem na kozi in hlajenjem piezoelektricnega pretvornika [1].Problem so, kot ze omenjeno tudi kosti, ker absorbirajo se vec ultrazvocne energije kot koza. Pri terapiji jepomembno, da cim bolj minimiziramo izpostavljenost kosti ultrazvoku. Za zdravljenje tumorjev so bile zato zepotrebne odstranitve delov kosti, kot npr. reber, pri zdravljenju tumorja na jetrih, lobanje, mozganskega tu-morja, itd [1]. Prav uporaba mikromehurckov bi lahko preprecila tovrstne posege in se izboljsala ucinkovitostzdravljenja.Pomemben izziv sta slikanje in kontrola bolezenjskih stanj, ki lahko pripomoreta k natancnejsi diagnozi intudi terapiji. Primer je uspesno klinicno zdravljenje glavkoma, ker je enostavno za slikanje in zdravljenje,prav zaradi moznosti natancne dolocitve lege bolezenjsega stanja. Dodatni izzivi so: natancna lokalizacijatumorjev ali podrocij krvavitve, ki bi med drugim omogocili natancen potek terapije za celotno odstranitevbolezenjskega stanja, optimalna nastavitev ultrazvocnega polja piezoelektricnega pretvornika, itd [1].

12

Numericne metode

Za boljse razumevanje fizikalnega ozadja interakcije ultrazvoka s tkivi in posledicno nacrtovanja ter opti-mizacije metod zdravljenja je potrebno numericno modeliranje, ki lahko zajema veliko spremenljivk. Donumericnega modela privedejo analiticne metode s katerimi kvalitativno predvidimo potek dinamike. Idealennumericni model mora vsebovati clen, ki opisuje nelinearno zvocno polje, ki je posledica sklopitve ultrazvokain pojavov, ki jih ta sprozi: segrevanje tkiv, kavitacija itd. ter clene, ki opisujejo tok, zvocni tlak, striznenapetosti, odbojnost, nehomogene strukture tkiv in lom preko morebitnih vmesnih tekocih tkiv (dober primerje uporaba nelinearne KZK enacbe - glej stran 5) [1].

4.2 Ultrazvocno manipuliran prenos ucinkovin

K izboljsanem prenosu ucinkovin na tarcna tkiva lahko pripomorejo tako mehanski efekti povzroceni z raz-padi mikromehurckov, kot tudi mikromehurcki sami, ki sluzijo kot prenasalci ucinkovin. Ce ti dve metodizdruzimo, lahko bistveno pripomoremo k ucinkovitejsem zdravljenju razlicnih bolezni.Pregrade kot so celicne membrane in endotelij preprecujejo prehajanje marsikaterih ucinkovin, se posebnogenov. Celicne membrane so sestavljene iz lipidnega dvosloja sirine manj kot 50 nm. Vmes in na povrsiniso vezane se proteinske molekule. Endotelij je sestavljen iz enega sloja tesno spojenih endotelijskih celic,ki obdajajo volumen krvnih zil. Te pregrade tezko prepuscajo delce, ki so vecji od velikosti molekul, zatoje uporaba ultrazvoka, ki lahko poveca prepustnost, toliko pomembna. Povecanje prepustnosti membran jeposledica mikromehurkov, ki v UZ polju delujejo kot kavitacijska jedra in pri razpadu generirajo mikrotokove.Ti so lahko dovolj mocni, da v celicni membrani ustvarijo pore, skozi katere ucinkovine lazje preidejo v no-tranjost. To se zgodi le v primeru mikromehurckov v neposredni blizini celicnih membran in v fokusu polja,ki ga usmerimo v lokalno podrocje v telesu, kjer se nahajajo mikromehurcki [3].Te pore so ze zaznali z presevnim oz. transmisijskem elektronskem mikroskopu, medtem, ko bi sam meha-nizem lahko razkrili z visoko-loclivostno kamero. To pa po vsej verjetnosti ni edini mehanizem, ki povecaprepustnost membran. Na to lahko vpliva tudi lokalno, prehodno povecanje temperature zaradi absorbcijein disipacije ultrazvocne energije, ki spremeni fluidnost fosfolipidnega dvosloja oz. membrane celice. Polegteh pa so se vedno aktivni transportni mehanizmi, kot je endocitoza9 ali fuzija mikromehurcka s fosfolipidnocelicno membrano.Za kvantitativno dolocanje prenosa ucinkovin preko celicne membrane v ultrazvocnem polju se uporabljajofluorescencna kontrastna sredstva razlicnih velikosti, ki so enkapsulirana v mikromehurckih (kalcein, FITC-dextran10) [3].

Nanodelci

Za prenos in dostavo ucinkovin v ciljna predvsem tumorna tkiva poznamo vec vrst nanodelcev. To so micele11,liposomi, nanoemulzije in suspenzije trdnih nanodelcev (slika 10). V bolezenjska tkiva lahko dostavijo visokokoncentracijo citotoksicnih ucinkovin z zanemarljivimi stranskimi ucinki na okolico. So velikosti od 1 nm do1 µm, njihova agregatna stanja pa so trdna, tekoca in tudi plinasta [8].

V farmaciji so za prenos ucinkovin najprej uporabljali micele, njihov ucinek pa zdaj poskusajo izboljsatitudi z uporabo ultrazvoka. Najveckrat uporabljajo polimerne micele, katerih prednost pred drugimi nan-odelci je, da imajo visoko molekulsko maso, zaradi cesar so dolgo casa stabilni. So tudi primerne velikostiza zlivanje in kopicenje na tumornih tkivih (15 − 30 nm). Micele imajo po vecini hidrofobno notranjostkamor vgradimo prav tako hidrofobne ucinkovine (to pa ne velja vedno, so namrec zelo dinamicne strukture,odvisne od molekulske mase gradnikov). Pripravimo jih preprosto z mesanjem ali pa se ucinkovine s kova-lentnimi vezmi povezejo s hidrofobnimi kopolimeri v notranjosti micela. Hidrofobni rep pogosto sestavljajodolge mascobne kisline. Primer uporabe polimerov je poli-etilen-oksid (PEO), ki je hidrofilen, poli-propilen-oksid, ki je hidrofoben itd. V raziskavah so pokazali, da so micele dobri prenasalci ucinkovin, saj so izmerilivecjo koncentracijo le teh na ciljnih in manjso na okoliskih tkivih, v primerjavi s prostimi ucinkovinami. Vdolocenih primerih pa se ucinkovine sprostijo sele ob ustreznem ultrazvocnem polju. Glavna slabost vecine

9Sprejem snovi iz zunajcelicnega prostora z ugrezanjem plazmaleme, ki mu sledi odcepitev in prehod endosoma v citoplazmo.10Fluorescein izotiocianat, derivat fluorescina, ki vsebuje na dnu obroca izotiocianatno funkcionalno skupino (-N=C=S)11Koloidni delec, sestavljen iz amfipaticnih molekul, obrnjenih s polarnimi skupinami proti zunanjosti in nepolarnimi proti

notranjosti.

13

Slika 10: Shematski prikaz razlicnih nanodelcev za uporabo pri ultrazvocno povecanem prenosu ucinkovin. A:Nepolimerna micela sestavljena iz amfifilnih povrsinskih molekul (kemijske komponente, ki imajo hidrofilnein lipofilne lastnosti). B: Polimerna micela sestavljena iz amfifilnih blocnih kopolimerov. C: Nanoemulzija shidrofobno tekoco notranjostjo. D: Kristalni nanodelci. E: Amorfen polimerni nanodelec. F: Kondenziranionski oligomer kot npr. DNA kondenzirana z poli-etilen-aminom. G: Liposom z amfifilnim dvoslojem, kiobdaja tekoco notranjost [8].

micelov je kratka obstojnost v krvozilnem sistemu, ki jo z dodatno zunanjo plastjo (npr. PEO), ki naj bipreprecevala adsorpcijo proteinov, poskusajo izboljsati [8].Kavitacijski mehurcki, ki sluzijo za povecanje prenosa ucinkovin, se razen v primeru izpostavljenosti visokemultrazvocnem polju, zaradi izredno majhne vsebnosti endogenih plinov v krvi oz. tkivih tezko generirajo. Vtem primeru lahko poskodujemo celice oz. tkiva, cesar si pa ne zelimo. S tako imenovanimi ultrazvocnimikontrastnimi sredstvi oz. mikromehurcki, ki jih po krvozilju injiciramo v telo, ultrazvocno mejo za kavitacijomocno zmanjsamo. Povedali smo ze, da je ovoj za stabilnost mikromehurckov zelo pomemben. V nasemprimeru je zgrajen iz fosfolipidnih ali polimernih molekul. V primeru fosfolipidnega ovoja imamo dve moznistrukturi: plinasti mehurcki z lipidnim enoslojem ali plinasti mehurcki z lipidnim dvoslojem, liposomi [11].Pri slednjih imamo dobro locena hidrofilna in hidrofobna podrocja. Hidrofobni deli lipidov so usmerjenivsaksebi in tvorijo jedro membrane, medtem, ko so hidrofilni deli usmerjeni proti vodni fazi, v notranjostin ven iz liposoma (slika 11). Pomebna lastnost liposomov je, da lahko hkrati prenasajo tako vodotopne,kot tudi ne-vodotopne ucinkovine [11]. Za potrebe terapije z ultrazvocnim vzbujanjem lahko pripravimo

Slika 11: Shematicni prikaz urejanja lipidov v dvoslojno membrano, ki tvori liposom [11].

liposome, ki dodatno vsebujejo enkapsuliran plin. Ta sluzi kot kontrastno sredstvo pri ultrazvocnem slikanjuin kot kavitacijski mehurcek. Plin je lahko porazdeljen po notranjosti lipidnega dvosloja ali pa se nahaja kotmehurcek v tekoci notrajosti (slika 12). Strukturo liposomov na sliki 13.A naredimo s postopkom liofilizacije12, na sliki 13.B s soniciranjem 13 PEG-liposomov in plina C3F8 in na sliki 13.C s povezovanjem obicanjihliposomov in stabilnih plinskih mehurckov z biotin-avidin14 spoji. Pri slednji strukturi se lahko na posamezenmikromehurcek veze do 10000 liposomov velikosti od 100 nm do 200 nm. Potrebno je dodati, da so te, zeloobetajoce strukture liposomov za prenos ucinkovin se v predklinicni fazi raziskav [11].Znano je ze, da ti liposomi ohranjajo karakteristike obicajnih liposomov, zato jih hkrati lahko napolnimo z

12Susenje z zamrzovanjem. Odstranimo vodo iz bioloskih in organskih snovi, ki bi jih s segrevanjem poskodovali, hkrati paohranimo njihovo strukturo in sestavo. Temelji na zamrznitvi vode, kateri sledi zmanjsevanje tlaka in dodajanje dovolj velikekolicine toplote, da zamrznjena voda v materialu sublimira neposredno iz trdnega v plinasto agregatno stanje.

13Ultrazvocno razbijanje delcev.14Biotin- vodotopni vitamin iz skupine vitaminov kompleksa B. Avidin- beljakovina v jajcnem beljaku, antivitamin, ki veze

biotin in ovira njegovo absorpcijo.

14

Slika 12: Shematski prikaz treh razlicnih vrst sestave liposomov. A: Predlagana struktura liposoma, kjer najbi se ob ultrazvocnem polju tekoca vsebina z ucinkovinami sprostila v okolje. Pri pripravi taksnih liposomovpricakujejo precejsnjo heterogenost v neenakih delezih plinaste in tekoce faze. B: Liposom je sestavljen izpoli-etilen-glikol (PEG) liposomov in plina perfluoropropana (C3F8). C: Liposomi so pritrjeni na povrsinimikromehurcka z biotin-avidin vezmi [11].

ucinkovinami (proteini, peptidi, DNK, itd.). Njihova stabilnost v ultrazvocnem polju je odvisna predvsemod enkapsuliranega plina in lastnosti lipidnega dvosloja (hidrofobne interakcije, dimenzija, itd.). Plinastimikromehurcek znotraj liposoma (slika 13.A,B) pospesi razpad, ko se pod vplivom ultrazvocnega polja razsiri,do te mere, da pritisk na lipidni dvosloj preseze njegovo mejo elasticnosti in liposom poci. Ultrazvok dosezenajvecji ucinek pri pocasi ponavljajocih, mocnih sunkih [11].V primeru hidrofobnih ucinkovin vemo, da se po razpadu liposomov tezko sprostijo v okolje, saj v vodi nisotopni. Alternativno nanje vezemo ciklodekstrin, ki ima zunanjo povrsino hidrofilno, zaradi cesar se hidro-fobne ucinkovine obnasajo podobno kot hidrofilne [11].

Prenos DNA

Sestavo ovoja lahko spreminjamo z dodajanjem razlicnih vrst lipidov v pripravljeno emulzijo. Pozitivno nabitideli nekaterih sinteticnih lipidov lahko tvorijo elektrostaticno interakcijo s plazmidno DNA15, ki kot celotatvori negativni naboj. Vsaka molekula ima namrec porazdelitev naboja, ki v dolocenih primerih kot celotani nevtralna. Primer so molekule, ki sestojijo iz neenakega stevila fosfatnih (negativno nabitih) in amin-skih (pozitivno nabitih) skupin (fosfolipidi), kjer se posledicno kot celota ustvari presezek naboja. Nabitimmikromehurckom dodamo DNA tik pred uporabo, tako, da ju preprosto zmesamo. DNA ostane pritrjenana povrsino mikromehurcka tudi po induciranju ultrazvocnega polja in je zaradi elektrostatske sile zascitenapred encimsko razgradnjo. V primerjavi s sistemom, kjer so mikromehurcki in DNA loceni, je ucinkovitosttransfekcije16 vecja. Ce na mikromehurcke delujemo s fokusiranim ultrazvokom v neposredni blizini per-meabilnih celic se lokalna koncentracija DNA mocno poveca, medtem, ko se drugje, izven podrocja fokusa,plazmidna DNA razgradi in ne preide v ciljna tkiva oz. celice (slika 13) [3].Nedavno so uspeli v plinasto jedro biorazgradljivih polimernih mikromehurckov vgraditi veliko koncentracijoplazmidne DNA in jo pri tem zascititi pred nukleazo17 gostitelja. Pri obicajnih mikromehurckih, kjer seplazmid veze na ovoj, tako velike koncentracije ni mogoce doseci [3].

15Plazmid- samostojni zunajkromosomski obrocasti delcek nukleinske kisline, ki razmeroma lahko prehaja iz celice v celico ins tem omogoca prenos genov.

16Vnasanje tuje molekule DNA v celico, ki mu lahko sledi ekspresija enega ali vec genov iz te DNA.17Hidroliza fosfodiestrskih vezi v nukleinskih kislinah.

15

Slika 13: Mikroskopski posnetek misice kre-master v misi, v katero injiciramo pozi-tivno nabite mikromehurcke s fluorescentnooznacenimi plazmidi. (A) Mikrocirkulacijamikromehurckov 1 min po injiciranju. Nasliki so pri nemotenem prenosu plazmidi vidnovezani na mikromehurcke. (B) Nalaganjefluorescencno oznacene DNA na mestu, kjermikromehurcki razpadejo. Na sliki vidimose pretrganje in krvavitev zil. (C,D) Nala-ganje fluorescencno oznacene DNA v obzilnemtkivu po ultrazvocno povzrocenem razpadumikromehurckov. V tem primeru nimamo kr-vavitve. Merila v levih spodnjih kotih slikpredstavljajo 20 µm [3].

5 Zakljucek

Za izboljsanje prenosa oz. prodiranja ucinkovin v tkiva v ultrazvocnem polju uporabimo mikromehurcke.Povecanje prenosa genskega materiala ima velik potencial v klinicni uporabi, posebno v onkologiji in vasku-larnih aplikacijah. Ucinkovine, ki do ciljnih tkiv v telesu pripotujejo prosto, so pogosto vzrok za skodljivestranske ucinke, medtem ko v primeru enkapsuliranja ucinkovin v mikromehurcke te ucinke zelo mini-miziramo. Ucinkovine se sprostijo lokalno, v obmocju fokusa ultrazvoka, ki je obicajno usmerjen v podrocjabolezenjskih stanj. Uporaba mikromehurckov v ultrazvocnem polju ponuja veliko moznosti za izboljsanjein optimiziranje prenosa trenutno odobrenih ucinkovin in samih prenasalcev, kot so npr. liposomi. Enaizmed moznosti je boljse poznavanje njihove farmakokinetike18 ter izboljsanje prenosa na zelena mesta. Iztega stalisca je zelo pomembna in obetajoca uporaba neskodljivih, netoksicnih in do uporabe ultrazvokaneaktivnih ucinkovin. Veliko je idej za razvoj tega podrocja zdravljenja, ki bodo vsekakor predmet bodocihraziskav. Sele prihajajoca desetletja bodo pokazala, katere ucinkovine in kateri nacini prenosa ucinkovin bodonajbolj koristni in uporabni v klinicnih aplikacijah.

Literatura

[1] M. R. Bailey, V. A. Khokhlova, O. A. Sapozhnikov, S. G. Kargl in L. A. Crum, Acoustical Phys., Vol.49 No. 4, 369 (2003).

[2] T. Nozaki, R. Ogawa, A. Watanabe, R. Nishio, H. Fuse, T. Kondo, J Med Ultrasonics 33, 135 (2006).

[3] S. Hernot, A. L. Klibanov, Adv. Drug Delivery Rev. 60, 1153 (2008).

[4] V. Frenkel, Adv. Drug Delivery Rev. 60, 1193 (2008).

[5] L. W. Schmerr Jr., Ultrasonics/Nondestructive testing (Elsevier, Ames, 2001).

[6] S. Behnia, A.J. Sojahrood, W. Soltanpoor, O. Jahanbakhsh, Ultrason. Sonochem. 16, 502 (2009).

[7] J. E. Chomas, P. Dayton, J. Allen, K. Morgan in K. W. Ferrara, IEEE Trans. Ultrasonics, Vol. 48, No1, 232 (2001).

[8] G. A. Husseini, W. G. Pitt, Adv. Drug Delivery Rev., 60, 1137 (2008).

[9] A. A. Aganin in T. S. Guseva, Journal of Appl. Mech. and Tech. Physics, Vol. 46, No. 4, 471 (2005).

[10] A. Shaw, M. Hodnett, Ultrasonics 48, 234 (2008).

[11] S. L. Huang, Adv. Drug Delivery Rev. 60, 1167 (2008).

18Podrocje farmakologije, ki proucuje absorpcijo, porazdelitev, biotransformacijo zdravila v telesu in izlocanje iz njega

16