Tập 164, số 04, 2017

Tập 164, Số 04, 2017

T¹p chÝ Khoa häc vµ C«ng nghÖ

CHUYÊN SAN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP - LÂM NGHIỆP - Y DƯỢC

Môc lôc Trang

Nguyễn Thế Hùng, Nguyễn Thị Lân - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại cây trồng xen đến sinh trưởng và năng suất của giống dong riềng DR3 tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 3

Nguyễn Viết Hưng, Lê Thị Kiều Oanh, Hoàng Kim Diệu, Nguyễn Thị Trang - Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giống bí đỏ tại Thái Nguyên năm 2015 9

Lê Thị Kiều Oanh, Trần Văn Điền, Trần Đình Hà, Trần Trung Kiên - Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của một số giống đậu xanh trong vụ Hè Thu năm 2015 tại Thái Nguyên 15

Hà Đình Nghiêm, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thị Huệ - Quản lý cây trinh nữ móc (Mimosa diplotricha) bằng mô hình dự đoán phân bố, mức độ xâm lấn và sử dụng sinh khối để trồng nấm 21

Nguyễn Thị Lân, Nguyễn Thế Hùng - So sánh, lựa chọn giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt cho vụ mùa tại thành phố Sơn La, tỉnh Sơn La 27

Nguyễn Thị Tuyên, Nguyễn Việt Hưng - Phương pháp phòng trừ mối hại gỗ trong các công trình xây dựng thuộc Đại học Thái Nguyên 33

Nguyễn Hải Hòa, Trần Thị Phương Thúy, Dương Trung Hiếu, Nguyễn Thị Thu Hiền - Sử dụng ảnh SPOT 6 xây dựng bản đồ sinh khối và trữ lượng các bon rừng trồng thông thuần loài tại xã Nguyên Bình, huyện Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa 39

Nguyễn Việt Hưng, Nguyễn Thị Tuyên - Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học từ lá xoan trong bảo quản gỗ 47

Đặng Minh Tơn, Đặng Văn Minh, Nguyễn Văn Toàn - Các loại đất chính, phân bố và tính chất trên địa bàn vùng cam Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang 53

Nông Thị Huyền Chanh, Hoàng Hữu Chiến - Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt động khai thác cát sỏi đến biến động sử dụng đất nông nghiệp trên địa bàn xã Hợp Thịnh, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang 61

Triệu Mùi Chản, Chu Văn Trung, Đỗ Sơn Tùng, Nguyễn Đình Thi, Nguyễn Thảo Yến, Bùi Thị Hường, Hoàng Đông Quang - Xây dựng hệ thống lập quy hoạch kế hoạch sử dụng đất bán tự động 67

Nguyễn Văn Lợi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi chất lượng của quả vải thiều sau thu hoạch 75

Phạm Thị Phương, Nguyễn Thị Đoàn, Nguyễn Văn Bình, Nguyễn Thị Nhung, Lưu Hồng Sơn - Nghiên cứu hiệu quả bảo quản của compozit của chitosan khối lương phân tử thấp với axit oleic ứng dụng trong bảo quản đào Pháp 81

Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Ngân, Nguyễn Văn Quang, Phan Thị Hồng Phúc, Lê Minh, Phạm Diệu Thùy, Trần Nhật Thắng, Dương Thị Hồng Duyên - Xác định serotype, độc lực và tính kháng kháng sinh của 3 loại vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh 87

Nguyễn Thị Thúy Mỵ, Trần Thanh Vân, Đỗ Thị Kiều Duyên - Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm Mfeed+ đến sức sản xuất thịt của gà F1 (ri x Lương Phượng) nuôi nhốt tại Thái Nguyên 97

Từ Trung Kiên, Trần Thị Hoan, Nguyễn Văn Sơn - Ảnh hưởng của bổ sung dầu hạt lanh vào khẩu phần đến năng suất và chất lượng trứng gà Isa shaver 103

Trương Hữu Dũng, Nguyễn Thị Hằng, Phùng Đức Hoàn - Đánh giá khả năng sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn của 3 tổ hợp lợn lai thương phẩm (DP x CA); (PD x CA) VÀ (LP x CA) giai đoạn sơ sinh đến 56 ngày tuổi 109

Sử Thanh Long, Nguyễn Công Toản, Trần Văn Vũ - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian mang thai của bò sữa nuôi tại xí nghiệp bò Phù Đổng, Hà Nội 115

Trần Thị Hoan, Từ Trung Kiên, Nguyễn Thị Hiền - Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay thế thức ăn viên hỗn hợp bằng cỏ Ghinê (panicum maximum) trong khẩu phần đến hiệu quả sử dụng thức ăn và năng suất của thỏ thịt New Zealand 121

Hoàng Đình Hòa, Nguyễn Văn Lợi - Xác định các cấu tử hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây kinh giới dày Hà Giang (Elsholtzia winitiana craib) 127

Journal of Science and Technology 164(04)

N¨m 2017

Vũ Khánh Linh, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Lâm, Lương Hùng Tiến - Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật phân giải cellulose hướng tới tạo ra chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 133

Vũ Hoài Nam, Dương Văn Cường - Tăng cường sinh tổng hợp β-carotene trong Escherichia coli tái tổ hợp được bổ sung một phần con đường mevalonate 141

Nguyễn Thị Thu Ngà, Sỹ Danh Thường, Cao Thị Phương Thảo - Sử dụng mã vạch DNA để định loại loài Màn màn vàng (Cleome viscosa L.) ở Việt Nam 147

Trịnh Đình Khá, Lý A Hù, Đặng Duy Phong, Nguyễn Hữu Quyền, Hoàng Thị Thiên Hương - Tổng hợp nano bạc bằng dịch chiết lá đào Prunus persica và hoạt tính kháng khuẩn của nó 153

Nguyễn Thị Thu Hà, Chu Thị Na, Cao Thị Phương Thảo - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu một số loài cây cảnh hạn sinh thuộc họ thuốc bỏng (Crassulaceae) 157

Phạm Thị Mỹ, Hoàng Thị Mai, Vi Đại Lâm, Dương Mạnh Cường - Thử nghiệm điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn phân giải nitơ phân lập từ một số mẫu nước tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 165

Hoàng Thị Lan Anh, Dương Thị Minh Hòa - Nghiên cứu ứng dụng mô hình lọc tái tuần hoàn nước thải khu ký túc xá Trường Đại học Nông Lâm bằng sét Kabenlis 3 171

Dương Hữu Lộc, Nguyễn Xuân Vũ, Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm - Đặc điểm nông sinh học và mối quan hệ di truyền của một số giống quýt (Citrus Recutilata Blanco) tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 177

Đinh Thị Huyền Chuyên, Sỹ Danh Thường, Trịnh Đình Khá, NguyễnThị Yến - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và hoạt tính kháng khuẩn của loài màn màn vàng thu thập ở tỉnh Thái Nguyên 183

La Việt Hồng, Trần Hồng Thu, Phạm Thị Quy, Đinh Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Ngọc Khánh - Xác định chỉ thị phân tử và tái sinh chồi in vitro của loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll ex Hemsl.) thu tại Sa pa - Lào Cai 189

Nguyễn Hải Linh, Ma Diệu Quỳnh, Ma Thị Thu Lệ, Bùi Thị Thu Thủy, Vũ Thị Minh Hồng, Nguyễn Thị Hồng Hạnh - Cao cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.) có tác dụng hỗ trợ điều trị béo phì trên chuột nhắt trắng 195

Lê Phong Thu, Nguyễn Thu Thủy, Tạ Văn Tờ - Tổng quan đáp ứng mô bệnh học ung thư vú sau điều trị hóa chất tiền phẫu

201

Hà Trọng Quỳnh - Lượng giá thiệt hại sức khỏe cộng đồng do ô nhiễm không khí tại phường Tân Long, thành phố Thái Nguyên 207

Nguyễn Thị Trung - Nghiên cứu khả năng nhận biết đặc hiệu các kháng nguyên của Listeria monocytogenes của một số kháng thể đơn dòng nhằm sử dụng trong tạo que thử nhanh 215

Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146

141

TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP β-caroteneTRONG Escherichia coli TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC BỔ SUNG MỘT PHẦN CON ĐƯỜNG MEVALONATE

Vũ Hoài Nam1, Dương Văn Cường1,2*

1Viện Khoa học sự sống - ĐH Thái Nguyên 2Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên

TÓM TẮT

β-carotene là một sắc tố thuộc nhóm carotenoid có giá trị thương mại. Với mục đích tăng cường sinh tổng hợp β-carotenetrong E. coli tái tổ hợp, một phần con đường mevalonate được bổ sung thêm để tăng cường nguồn tiền chất IPP.Ba genemvaK1, mvaK2 và mvaD được tách dòng từ Enterococcus faecium phân lập tại Việt Nam và đưa vào vector biểu hiện pET28 tạo nên vector pET28-mvaK1K2D. Vector biểu hiện tái tổ hợp này sau đó được biến nạp vào dòng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp đã mang sẵn vector pRSET-iEIBY mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp β-carotene từ tiền chất IPP. Hai hệ vector được biểu hiện đồng thời tạo ra khuẩn lạc màu vàng đặc trưng củaβ-carotene. Đánh giá sơ bộ cho thấy dòng E. coli được bổ sung thêm một phần con đường mevalonate có khả năng sinh tổng hợp β-carotene mạnh hơn so với dòng không được bổ sung. Từ khóa: β-carotene, mvaK1, mvaK2, mvaD, mevalonate pathway.

ĐẶT VẤN ĐỀ *

β-carotene là một chất thuộc nhóm

carotenoid, được tìm thấy chủ yếu ở một số

loại thực vật như cà rốt, bí ngô, đậu Hà

Lan,… [4]. β-caroteneđược biết đến với vai

trò là tiền chất để tổng hợp vitamin A – một

loại vitamin rất cần thiết cho mắt. Theo một

số nghiên cứu chỉ ra rằng, β-carotenecó khả

năng làm chậm quá trình thoái hóa điểm

vàng, từ đó giảm nguy cơ mù lòa [6], [9]. Bên

cạnh đó, β-carotene được chứng minh là có

khả năng chống oxi hóa mạnh, vì vậy có tác

dụng ngăn ngừa bệnh ung thư và một số bệnh

về tim mạch [2].

Do đó, β-carotene được sử dụng rộng rãi trong

sản xuất công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và

thực phẩm [7]. Hiện nay, hơn 90% β-carotene

thương mại được sản xuất bằng tổng hợp hóa

học [10], tuy nhiên do mối lo ngại an toàn thực

phẩm việc sử dụng β-carotene tổng hợp hóa

học làm chất phụ gia đã bị kiểm soát chặt chẽ

trong những năm gần đây. Trong khi đó việc

khai thác β carotene từ nguồn sẵn có trong tự

nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ,

phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng

nguyên liệu. Điều này dẫn tới nhu cầu tìm

* Tel: 0913 804 003; Email: duongvancuong1980@yahoo.com

kiếm nguồn β-carotene tự nhiên bằng lên men

vi sinh vật. Trong đó, kỹ thuật điều hướng trao

đổi chất β-carotene trong các vi sinh vật không

có khả năng sản sinh carotenoid đang được

quan tâm hiện nay [8]. Đặc biệt, E. coli là một

vật chủ thích hợp cho sản sinh β-carotene vì

tốc độ chuyển hóa và tăng trưởng nhanh và nó

đã được sử dụng thành công trong sản xuất các

loại carotenoid khác như lycopene, astaxanthin

và zeaxanthin [1], [3].

Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất carotenoid được chia thành 2 giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất là sự tổng hợp Isopentenyl diphosphate (IPP) - đơn vị cấu thành cơ bản của tất cả các hợp chất carotenoid. Hai con đường sinh tổng hợp IPP là mevalonate (MEV) và non-mevolonate (MEP). Giai đoạn thứ hai là dây chuyền tạo thành các carotenoid từ IPP. Trong E. coli chỉ tồn tại con đường MEP mà không tồn tại con đường MEV và E.coli thiếu các enzyme chuyển hóa từ IPP đến carotenoid. Để tăng khả năng sản xuất β-carotene trong E. coli, một phần con đường MEV không có trong E.coli tự nhiên có thể được bổ sung vào chủng E. coli biểu hiện β-carotene để tăng cường nguồn tiền chất IPP nhằm đảm bảo cân bằng trao đổi chất cho vật chủ, nâng cao và ổn định khả năng sản xuất β-carotene.

Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146

142

Xuất phát từ những luận điểm trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu bổ sung thêm các gene mva mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp tiền chất IPP vào trong vi khuẩn E. coli với mục đích tăng cường khả năng sinh tổng hợp β-carotene.

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

Vi khuẩn Enterococcus faeciumcung cấp bở Vietnam Type Culture Collection. Vi khuẩn E. coli DH5α tại Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên.

- Vi khuẩn E. coli BL21(DE3) mang vector pR-iEIBY là vector biểu hiện pRSET-A mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình xúc tác sinh tổng hợp β-carotene đã được thiết kế thành công trước đó.

- Vector tách dòng pLUG (LifeTechnology).

- Cặp mồi khuếch đại các gene mva bao gồm: mvaK1, mvaK2, mvaD được thiết kế dựa trên trình tự gene đã công bố trên ngân hàng gene NCBI mã sốAF290095.1. Khi thiết kế trình tự mồi, trình tự các enzyme giới hạn được thêm vào để thuận tiện cho việc thiết kế vector sau này. Trình tự cặp mồi được thể hiện trong bảng 1.

Bảng 1. Thông tin trình tự cặp mồi mva

Tên mồi

Trình tự 5’-3’

K1-F CCATGGATGGCAAACTATGGCCAAG

K1-R GAATTCTTAAACATAGGTATGTACTCCT

K2-F GAATTCATGATTGAAGTATCTGCACCA

K2-R GAGCTCTCATCGGTTTTCCTTTCTTTGA

D-F GAGCTCATGTTTAAAGGCAAAGCACG

D-R GCGGCCGCTTATTCAATAATCGCAATTCCTG

Phương pháp nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số

DNAvi khuẩn Enterococcus faecium được

tách chiết bằng CTAB 2% dựa theo phương

pháp tách chiết của Doyle và cs [5]. Sản phẩm

DNA được dùng để làm nguyên liệu cho các

nghiên cứu tiếp theo.

- PCR các gene mva

Các gene mvaK1, mvaK2, mvaD được khuếch

đại từ genome vi khuẩn E. faecium nhờ cặp

mồi đặc hiệu (Bảng 1). Thành phần phản ứng

bao gồm: 19.3 μl nước cất khử ion, 1 μl DNA,

2.5 μl buffer 10X, 0.1 μl enzyme Taq

DNApolymerase, 0.5 μl dNTP 10 mM, 0.5 μl

primer mva-F (10 pm/l), 0.5 μl primer mva-R

(10 pm/μl). Chu trình nhiệt được thực hiện như

sau: 95oC: 5 phút, 30 chu kỳ của (95oC: 45

giây; 55oC: 45 giây; 72oC: 1 phút), 72oC: 10

phút, bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 1%.

- Gắn nối đoạn gene mong muốn lên vector

Đoạn gene mong muốn được gắn lên cấu trúc

vector mở vòng nhờ enzyme T4 ligase, thành

phần phản ứng gắn nối như sau: 3 μl buffer

ligase 10X, 5 μl vector, 5 μl đoạn xen và 1 μl

enzyme nối T4 ligase, 16 μl nước. Ủ hỗn hợp

phản ứng ở 220C trong 1 giờ. Sản phẩm phản

ứng gắn nối được biến nạp vào tế bào khả

biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc

nhiệt 42oC trong 90 giây. Sản phẩm biến nạp

được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ

sung kháng sinh chọn lọc.

- Cảm ứng biểu hiện gene trong vi khuẩn

E. coli

Vector biểu hiện được biến nạp vào vi khuẩn

tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) bằng

phương pháp sốc nhiệt, sau đó cấy trải trên

môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh.

Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch được nhặt nuôi

riêng rẽ trong 5 ml LB lỏng có bổ sung

ampicilin ở 37 oC qua đêm. Cấy chuyển 5 μl

mỗi dòng khuẩn nuôi trong 5 ml LB lỏng có

bổ sung ampicilin, nuôi lắc 37 oC sau 2 giờ

rồi đo OD600 nm. Đến khi OD đạt 0,3 đến 0,5

bổ sung IPTG đến nồng độ cuối là 0,5 mM,

nuôi lắc ở 37oC trong 6 giờ.

Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146

143

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả tách dòng và xác định trình tự

gene mvaK1, mvaK2, mvaD

Sản phẩm khuếch đại các gene mva được điện

di trên gel agarose (hình 1A), kết quả chỉ thu

được một băng duy nhất với kích thước xấp xỉ

1kb tương ứng độ dài các gene mva theo lý

thuyết (mvaK1: 945 bp, mvaK2: 1088 bp;

mvaD: 978 bp). Điều này cho thấy chúng tôi

đã khuếch đại thành công ba gene mva.

Sản phẩm PCR sau đó được gắn vào vector

tách dòng pLUG và biến nạp vào vi khuẩn

E.coli DH5α, sau đó cấy trải trên môi trường

thạch LB có bổ sung ampicilin, X-gal và

IPTG. Chọn các dòng khuẩn lạc trắng nuôi

tăng sinh trong LB lỏng để tách chiết plasmid

và kiểm tra kích thước vector. Những dòng

khuẩn lạc có kích thước lớn hơn so với đối

chứng (dòng chưa có đoạn chèn) được tiếp

tục chọn lọc bằng enzyme giới hạn. Kết quả

được thể hiện như trên hình 1B.

A B

Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (A),

sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp (B).

(A) L: Thang chuẩn DNA GeneRulerTM 1kb;

đường chạy 1-3: tương ứng với sản phẩm PCR

các gene mvaK1, mvaK2, mvaD

(B): L: Thang chuẩn DNA GeneRulerTM 1kb;

đường chạy 1-3: tương ứng với sản phẩm cắt các

gene mvaK1, mvaK2, mvaD

Kết quả cho thấy sản phẩm cắt các dòng nghi

ngờ đều có hai băng: Một băng có kích thước

3 kb tương đương kích thước vetor pLUG và

1 băng kích thước xấp xỉ 1 kb tương đương

kích thuớc các gene mva.

Tuy nhiên, để khẳng định chính xác hơn,

đồng thời kiểm tra mức độ ổn định thông tin

di truyền, các dòng plasmid tái tổ hợp này

được dùng để giải trình tự. Sau khi giải trình

tự, chiều dài các gene được bảo toàn: mvaK1:

945 bp; mvaK2: 1088 bp; mvaD: 978 bp. Sử

dụng công cụ NCBI BLAST, trình tự gene

mvaK1, mvaK2, mvaD tách dòng trong

nghiên cứu này có độ tương đồng 100% so

với trình tự gene mvaK1, mvaK2, mvaD của

vi khuẩn Enterococcus faecium (mã số

AF290095) đã được dùng để thiết kế mồi cho

phản ứng PCR.

Kết quả dịch mã In-silicobằng công cụ trực

tuyến EMBOSS Transeq cho thấy gene được

dịch mã thành công, không xuất hiện các đột

biến stop codon vô nghĩa (hình 2). Như vậy

chúng tôi đã tách dòng thành công các gene

mvaK1, mvaK2, mvaD.

“MANYGQGESSGKIILMGEHAVVYGEPAIAFPFYATKVTAFLEELDAMDDQLVSSYYSGNLAEAPHALKNIKKLFIHLKKQHDIQKNLQLTIESTIPAERGMGSSAAVATAVTRAFYDYLAFPLSREILLENVQLSEKIAHGNPSGIDAAATSSLQPIYFTKGHPFDYFSLNIDAFLIVADTGIKGQTREAVKDVAHLFETQPHETGQMIQKLGYLTKQAKQAIIENSPETLAQTMDESQSLLEKLTISNDFLNLLIQTAKDTGALGAKLTGGGRGGCMIALAQTKTKAQEISQALEDAGAAETWIQGLGVHTYV”

(A) “MIEVSAPGKLYIAGEYAVVETGHPAVIAAVDQFVTVTVESARKVGSIQSAQYSGMPVRWTRRNGELVLDIRENPFHYILAAIRLTEKYAQEKNILLSFYDLKVTSELDSSNGRKYGLGSSGAVTVATVKALNVFYALNLSQLEIFKIAALANLAVQDNGSCGDIAASCYGGWIAFSTFDHPWLQEQETQHSISELLALDWPGLSIEPLIAPEDLRLLIGWTGSPASTSDLVDQVHRSREDKMVAYQLFLKNSTECVNEMIKGFKENNVTLIQQMIRKNRQLLHDLSAITGVVIETPALNKLCNLAEQYEGAAKSSGAGGGDCGIVIVDQKSGILPLMSAWEKAEITPLPLHVYSDQRKENR”

(B) “MFKGKARAYTNIALIKYWGKKNEELILPMNNSLSLTLDAFYTETEVIFSDSYMVDEFYLDGTLQDEKATKKVSQFLDLFRKEAGLSLKASVISQNFVPTAAGLASSASGLAALAGACNTALKLGLDDLSLSRFARRGSGSACRSIFGGFVEWEKGHDDLSSYAKPVPSDSFEDDLAMVFVLINDQKKEVSSRNGMRRTVETSNFYQGWLDSVEGDLYQLKQAIKTKDFQLLGETMERNGLKMHGT

TLAAQPPFTYWSPNSLKAMDAVRQLRKQGIPCYFTMDAGPNVKVLVENSHLSEVQETFTKLFSKEQVITAHAGPGIAIIE” (C)

Hình 2. Kết quả dịch mã In-silico gene mvaK1 (A), mvaK2 (B) và mvaD (C)

Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146

144

Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET28-

mvaK1K2D

Gắn gene mvaK1 vào vector biểu hiện

pET28 tạo vector tái tổ hợp pET28-mvaK1

Sau khi gắn nối đoạn gene mvaK1 vào vector

pET28 mở vòng và biến nạp vào vi khuẩn E.

Coli DH5α. Kết quả sàng lọc các dòng plasmid

tái tổ hợp được thể hiện như trên hình 3.

Kết quả tách chiết plasmid cho thấy các dòng

khuẩn lạc thu được đều có kích thước cao hơn

so với đường chạy ĐC (vector pET28), nên

đây là những vector tái tổ hợp.

Hình 3. Plasmid các dòng có khả năng mang gene

mvaK1

Đường chạy ĐC: plasmid pET28, Đường chạy 1-

4: plasmid tái tổ hợp tách từ các dòng khuẩn lạc

trắng

Khi cắt các dòng khuẩn lạc này với enzyme

BamHI và EcoRI đều cho hai băng sáng: Một

băng kích thước xấp xỉ 5.3 kb tương đương

kích thước vector pET28 và một băng kích

thước xấp xỉ 1 kb tương đương kích thước

đoạn gene mvaK1 (hình 4). Như vậy đã gắn

thành công đoạn gene mvaK1 vào vector

pET28.

Hình 4. Sản phẩm cắt các dòng có khả năng mang

gene mvaK1

L: Thang chuẩn DNA 1kb, Đường chạy 1, 2, 3, 4:

Các dòng plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzyme

BamHI và EcoRI

Gắn gene mvaK2 vào vector biểu hiện

pET28-mvaK1 tạo vector tái tổ hợp pET28-

mvaK1K2

Đoạn gene mvaK2 và vector tái tổ hợp

pET28-mvaK1 được cắt đồng thời bằng hai

enzyme giới hạn là EcoRI và SacI với mục

đích thu đoạn gene mvaK2 và mở vòng vector

pET28-mvaK1.

Gene mvaK2 sau đó được gắn nối vào vector

pET28-mvaK1 và biến nạp vào tế bào khả biến

E. coli DH5α. Các khuẩn lạc được lựa chọn

ngẫu nhiên, tách chiết plasmid để sàng lọc các

dòng có khả năng mang đoạn chèn. Những

dòng có kích thước băng plasmid cao hơn so

với đối chứng (plasmid vector pET28-mvaK1)

được tiếp tục sử dụng để kiểm tra sự có mặt của

gene mvaK2 bằng enzyme giới hạn (hình 5).

Hình 5. Sản phẩm cắt plasmid các dòng có khả

năng mang gene mvaK2.

ĐC: Đối chứng vector pET28-mvaK1K2 không

cắt ; Đường chạy 1 -6 : sản phẩm cắt tương ứng

với các dòng 1, 2, 3, 4, 5, 6. Đường chạy L: Thang

chuẩn DNA GeneRulerTM 1 kb.

Kết quả thu được trên hình 5 cho thấy, tất cả

các dòng nghi ngờ đều có một băng duy nhất

với kích thước xấp xỉ7.4 kb (tương ứng với

tổng kích thước đoạn gene mvaK2 và vector

pET28-mvaK1). Như vậy đoạn gene mvaK2

đã được gắn thành công vào vector pET28-

mvaK1 tạo vector tái tổ hợp pET28-

mvaK1K2.

Gắn gene mvaD vào vector biểu hiện

pET28-mvaK1K2 tạo vector tái tổ hợp

pET28-mvaK1K2D

Đoạn gene mvaD được chèn vào vector

pET28-mvaK1K2D, các vector tái tổ hợp

được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α.

Các dòng khuẩn lạc được kiểm tra bằng so

Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146

145

sánh kích thước vector và sản phẩm cắt bằng

enzyme giới hạn.

(A) (B)

Hình 6. Plasmid các dòng có khả năng mang gene

mvaD (A); sản phẩm cắt chọn lọc các dòng mang

gene mvaK2 (B).

(A): Đường chạy ĐC: plasmid pET28-mvaK1K2,

Đường chạy 1-4: plasmid tái tổ hợp tách từ các

dòng khuẩn lạc trắng.

(B) L: Thang chuẩn DNA 1kb, Đường chạy 1, 2, 3,

4: Các dòng plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzyme.

Kết quả trên hình 6A cho thấy các dòng

khuẩn lạc được chọn đều có kích thước băng

plasmid lớn hơn so với đối chứng, đây có thể

là các dòng mang đoạn chèn. Kết quả kiểm tra

bằng enzyme giới hạn cũng cho thấy các dòng

khuẩn lạc này đều có một băng duy nhất với

kích thước khoảng 8.3 kb, tương đương với

tổng kích thước của đoạn gene mvaD (978

bp) và vector tái tổ hợp pET28-mvaK1K2

(7401 bp) (hình 6B).

Từ những kết quả trên chứng tỏ việc thiết kế

vector biểu hiện mang policistron operon gồm

3 gene mvaK1-mvaK2-mvaD trên nền tảng

vector pET28 đã thành công.

Biểu hiện hai hệ vector pRSET-iEIBY và

pET28-mvaK1K2D trong E. coli BL21(DE3)

Để kiểm tra sự hoạt động của các gene mva

trên cấu trúc vector pET28, đồng thời đánh

giá sơ bộ ảnh hưởng của việc bổ sung một

phần con đường mevalonate đến khả năng

sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn E.

coli, vector pET28-mvaK1K2D được biến nạp

vào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp đã

mang sẵn vector pRSET-iEIBY mã hóa cho

các enzyme sinh tổng hợp β-carotene từ tiền

chất IPP.

Hình 7. Kết quả biểu hiện của hai hệ vector

pET28-mvaK1K2D và pRSET-iEIBYtrong E. coli

BL21(DE3)

(1) E. coli BL21 (DE3) không mang vector (đối

chứng); (2): E. coli BL21 (DE3) mang vector pR-

iEIBY (màu vàng nhạt); (3): E. coli BL21 (DE3)

mang đồng thời hai hệ vector vector vector

pET28-mvaK1K2D và pRSET-iEIBY (màu vàng

đậm – màu đặc trưng của β-carotene);

Kết quả biểu hiện cho thấy, ống 1 không có

sự biểu hiện màu sắc (cặn khuẩn màu trắng)

do chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) do

không có mang các gene mã hóa quá trình

sinh tổng hợp β-carotene. Ống số 2 và 3 cho

cặn tế bào có màu vàng nhạt và vàng sậm là

màu đặc trưng của β-carotene, như vậy các

gene được biến nạp vào vi khuẩn E. coli đều

hoạt động.

Qua đánh giá bằng cảm quan màu sắc cho

thấy ống số 3 (được tăng cường nguồn tiền

chất IPP bằng việc bổ sung các gene mva) có

sự sinh tổng hợp β-carotene mạnh hơn so với

ống số 2. Như vậy việc bổ sung thêm một

phần con đường mevalonatelàm tăng hàm

lượng β-carotene.

KẾT LUẬN

Đã tách dòng thành công 3 gene mvaK1,

mvaK2, mvaD có kích thước tương ứng lần

lượt là 945 bp, 1088 bp, 978 bp.

Thiết kế thành công vector biểu hiện pET28-

mvaK1K2D mang policistron gồm 3 genes

mvaK1, mvaK2, mvaD mã hoá cho các

enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp tiền

chất IPP.

Cảm ứng biểu hiện hai hệ vector: Một hệ

vector liên quan đến sinh tổng hợp tiền chất

IPP, một hệ vector liên quan đến sinh tổng

hợp β-carotenetừ tiền chất IPP trong E. coli

Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146

146

BL21(DE3) thu được cặn khuẩn có màu

vàng-màu đặc trưng của β-carotene. Qua đánh

giá sơ bộ bằng cảm quan cho thấy việc bổ

sung thêm hệ vector liên quan đến sinh tổng

hợp tiền chất IPP trong E. coli để sản xuất β-

carotene có hiệu quả cao hơn so với chỉ biểu

hiện một hệ vector.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Albrecht M., Misawa N., Sandmann G. (1999), “Metabolic engineering of the terpenoid biosynthetic pathway of Escherichia coli for production of the carotenoids β-carotene and zeaxanthin”, BiotechnolLett, 21, pp. 791–795. 2. Britton, G. (1995), "Structure and properties of carotenoids in relation to function." Faseb J., 9(15), pp. 1551-1558. 3. Cheng Q. (2006), “Structural diversity and functional novelty of new carotenoid biosynthesis genes”, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 33, pp. 552 – 559. 4. Desobry S. A., Netto F. M. and Labuza T. P. (1998), "Preservation of beta-carotene from carrots." Crit. Rev. Food SciNutr., 38(5), pp. 381 - 396.

5. Doyle and Doyle, D. a. D., and Cullings (1987), “CTAB/Chloroform-Isoamyl Alcohol DNA Extraction Protocol”, Phytochemical Bulletin, 19, pp.11-15. 6. Gordon J. E. and Schooff M. (2002), "Can high-dose supplementation with vitamins C and E, beta carotene, and zinc slow the progression of macular degeneration?", J. Fam. Pract., 51(2), p.105. 7. Mehta B. J., Obraztsova I. N., Cerdá-Olmedo E. (2003), “Mutants and intersexual heterokaryons of Blakeslea trispora for production of β-carotene and lycopene”, Appl. Environ. Microbiol., 7, pp. 4043 - 4048. 8. Misawa N., Shimada H. (1998), “Metabolic engineering for the production of carotenoids in non-carotenogenic bacteria and yeasts”, J. Biotechnol., 59, pp. 169–181. 9. Wolf G. (2001), "The discovery of the visual function of vitamin A", J. Nutr., 131(6), pp. 1647-1650. 10. Yoon S. H., Lee S. H., Das A., Ryu H. K., Jang H. J., Kim J. Y., Oh D. K., Keasling J. D., Kim S. W. (2009), “Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene in E. coli”, J. Biotechnol., 140(3), pp. 218-221.

SUMMARY ENHANCE BIOSYNTHESIS OF Β-CAROTENE IN RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI HARBORING A PART OF MEVALONATE PATHWAY

Vu Hoai Nam1, Duong Van Cuong1,2,*

1University Agriculture and Forestry - TNU 2 Institute of Life Sciences - TNU

β-carotene is a carotenoid pigment which has commercial value. In order to improve the biosynthesis of this compound in a recombinant E. coli strain, a part of mevalonate partway was introduced for enhancing metabolic flow to isopentenyl diphosphate, the building block of all carotenoids. Three genes including mvaK1, mvaK2, and mvaDwere cloned from Enterococcus faecium isolated in Vietnam and introduced into pET28 vector forming pET28-mvaK1K2D. Subsequently, this recombinant expression vector was transfomed into a recombinant E. coli BL21 (DE3) containing pRSET-iEIBY vector encodes for enzymes responsible for biosynthesis of β-carotene from IPP. The two vectors were co-expressed, resulted in colonies in yellow – the color of β-carotene. Compared to the E. coli clone with pRSET-iEIBY only, β-carotene was synthesized stronger in the clone with the addition of a part of mevalonate pathway. Keywords: β-carotene, mvaK1, mvaK2, mvaD, mevalonate pathway.

Ngày nhận bài: 28/3/2017; Ngày phản biện: 10/4/2017; Ngày duyệt đăng: 27/4/2017

* Tel: 0913 804 003; Email: duongvancuong1980@yahoo.com