Upload
others
View
41
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
32
UNIVERSITATEA DE �TIIN�E AGRICOLE �I MEDICINĂ
VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE �I BIOTEHNOLOGII
�COALA DOCTORALĂ
Ing. MIHAI ŞUTEU
STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE
PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTELE SUINELOR
DOMESTICE
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
Conducători ştiinţifici:
Prof. univ. dr. AUGUSTIN VLAIC
Prof. univ. dr. ROBERT RENAVILLE
CLUJ-NAPOCA2011
UNIVERSITÉ DE LIÈGE
GEMBLOUX AGRO-BIO TECH
UNITÉ DE BIOLOGIE ANIMALE ET MICROBIENNE
33
CUPRINS
SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI IMPORTANŢA CERCETĂRILOR.......................
CAP. 1. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND PROTEINELE
MAJORE DIN LAPTE LA SPECIA SUINĂ…...................................................….
1.1. STUDIUL PROTEINELOR CE ALCĂTUIESC FRACŢIUNEA CAZEINICĂ...
1.1.1. Studiul polimorfismelor αS1-cazeinei porcine...........................................
1.1.2. Studiul polimorfismelor αS2-cazeinei porcine...........................................
1.1.3. Studiul polimorfismelor β-cazeinei porcine..............................................
1.1.4. Studiul polimorfismelor κ-cazeinei porcine..............................................
1.2. STUDIUL PROTEINELOR DIN LACTOSERUM...............................................
1.2.1 Studiul polimorfismelor α-lactalbuminei porcine.....................................
1.2.2. Studiul polimorfismelor β-lactoglobulinei porcine...................................
1.2.3. Studiul polimorfismelor WAP....................................................................
CAP. 2. STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE, LA
SPECIA SUINĂ, LA NIVEL DE PROTEINĂ..........................................................
2.1. MATERIALE ŞI METODE....................................................................................
2.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................
2.3. CONCLUZII ...........................................................................................................
CAP. 3. POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.647A>G….....................
3.1. MATERIALE ŞI METODE……............................................................................
3.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................
3.3. CONCLUZII ..........................................................................................................
CAP. 4. POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.294T>G...................…..
4.1. MATERIALE ŞI METODE……............................................................................
4.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................
4.3. CONCLUZII ..........................................................................................................
CAP. 5. POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.175G>A.........................
5.1. MATERIALE ŞI METODE……............................................................................
5.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................
5.3. CONCLUZII ..........................................................................................................
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ..................................................................................
pag.
34
37
38
38
39
40
41
42
42
43
44
45
45
45
48
49
49
50
54
55
55
55
57
58
58
58
61
62
34
SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI IMPORTANŢA CERCETĂRILOR
Polimorfismul biochimic al proteinelor este un fenomen cu o largă răspândire la
toate speciile de animale şi constă în faptul că la indivizii din cadrul aceleaşi specii o
proteină se poate prezenta sub mai multe forme moleculare.
Scopul cercetărilor a fost acela de a identifica şi caracteriza la nivel molecular
principalele polimorfisme ce apar în cazul celor 7 proteine majore din laptele suinelor
domestice. Acest scop prezintă o importan�ă �tiin�ifică deosebită, având în vedere
faptul că pe plan mondial există pu�ine studii similare �i că în România �i Belgia acest
aspect nu a fost niciodată investigat.
Obiecivele şi activităţile metodologice ale cercetării
Obiectivele �i activită�ile metodologice ale cercetării, în concordanţă cu cele
stabilite în Proiectul de cercetare, au fost următoarele:
1. Identificarea principalelor polimorfisme ce apar în cazul proteinelor
majore din lapte la specia suină
Acest obiectiv a vizat în principal identificarea principalelor polimorfisme ale
lacto-proteinelor speciei suine, iar pentru realizarea acestui obiectiv au fost întreprinse
următoarele acţiuni:
Au fost identificate ferme de creştere a porcilor în care să se regăsească animale
crescute în rasă curată (ştiut fiind faptul că în creşterea intensivă a suinelor se folosesc
exclusiv hibrizii);
Au fost recoltate probe de lapte/colostru de la scroafe aflate în lactaţie aparţinând
raselor: Mangaliţa, Bazna, Marele alb, Pietrain şi Duroc;
Identificarea cu ajutorul tehnicii IEF a polimorfismelor genetice, implicit a
indivizilor purtători ai unor variante polimorfe;
Stabilirea structurii genetice în populaţiile analizate.
2. Caracterizarea polimorfismelor identificate, la nivel de ADN
În cadrul acestui obiectiv a fost efectuată caracterizarea la nivel de ADN a
polimorfismelor β-cazeinei porcine. La locusul β-cazeinei a fost identificată o alelă nouă
35
– alela G (GenBank GU827390.1) precum şi un fenomen de maturare alternativă a ARN-
ului mesager precursor.
Pentru realizarea acestui obiectiv au fost derulate următoarele activităţi:
Extracţia ARN-ului din probele (de la animalele) identificate a fi polimorfe;
Designul unor primeri adecvaţi şi sinteza ADNc pentru probele identificate
polimorfe;
Secvenţierea variantelor identificate;
Alinierea secvenţelor;
Realizarea de hărţi de restricţie teoretice;
Conceperea unor teste de tip PCR-RFLP pentru diferenţierea variantelor
identificate.
3. Testarea influenţei diferitelor variante proteice asupra dinamicii de
creştere a loturilor de purcei în perioada de alăptare
În cadrul acestui obiectiv s-a dorit determinarea influenţelor pe care diferitele
variante proteice o au asupra dinamicii de creştere a loturilor de purcei. În acest sens am
utilizat polimorfismul c.175A>G al β-cazeinei porcine, întrucât acesta are cel mai
semnificativ impact la nivel de proteină.
Pentru realizarea acestui obiectiv s-au avut în vedere următoarele activităţi:
Depistarea unor scroafe care prezintă polimorfisme la locusul CSN2;
Confirmarea polimorfismelor (cu ajutorul testelor PCR – genotipizări bazate pe
protocoalele dezvoltate);
Alegerea scroafelor ce vor constitui loturile experimentale (acestea să aibă un grad
cât mai ridicat de asemănare genetică, să beneficieze de aceleaşi condiţii pe perioada
alăptării, să fie aproximativ de aceeaşi vârstă etc.)
Monitorizarea dinamicii de creştere a loturilor de purcei provenind de la scroafele
aflate în loturile experimentale (de la fătare până la înţărcare);
Centralizarea şi interpretarea statistică a datelor obţinute.
4. Analiza asocierilor dintre genotipul scroafelor la locusul β-cazeinei (CSN2)
şi performanţele reproductive ale acestora
Numeroase studii, prezentate amănun�it în cadrul tezei, au semnalat prezenţa
unor loci cu implicaţii în prolificitate pe perechea de cromozomi 8 de la specia suină
36
(SSC 8), loci cu implicaţii în determinismul caracterelor cantitative (quantitative trait loci
– QTL). După cunoştiinţele noastre, nu există până la această dată un marker molecular
care să fie folosit în selecţia asistată de markeri la suine, de pe SSC 8, pentru prolificiate.
În acest scop am folosit abordarea „genelor candidat”, pornind de la premisa ca locusul
CSN2 este de asemenea situat pe SSC 8. Astfel, s-a dorit ca prin studiul asocierilor dintre
genotipul scroafelor la locusul β-cazeinei şi performanţele acestora de reproducţie să
evidenţiem existenţa unor eventuale grupuri de linkage, care să permită ulterior
identificarea unor QTL-uri cu implicaţii în prolificitate pe baza genotipurilor β-cazeinei.
Activităţi desfăşurate:
Genotipizarea unui număr de 150 de scroafe, pentru locusul CSN2 (recoltare de
sânge, extracţie de ADN, amplificare, migrare, restricţie enzimatică, migrare,
centralizarea genotipurilor);
Centralizarea şi prelucrarea performanţelor înregistrate pentru caracterele urmărite
şi interpretarea statistică a rezultatelor.
Importanţa cercetării rezidă în faptul că rezultatele obţinute privind studiul
polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din laptele suinelor domestice vor
contribui substanţial la îmbogăţirea patrimoniului ştiinţific mondial în domeniu.
Cercetările efectuate, aferente tezei de doctorat, au evidenţiat faptul că dintre cele şapte
proteine majore din laptele suinelor domestice, β-cazeina prezintă cel mai pronunţat
polimorfism în cadrul raselor analizate, atât în România, cât �i în Belgia.
Studiul asocierilor dintre genotipul scoafelor la locusul β-cazeinei �i
performan�ele acestora de produc�ie/reproduc�ie sunt elemente de noutate absolută,
fiind primele studii de acest gen la specia suină.
Trebuie avut în vedere că cercetările efectuate la alte specii (capră, vacă, oaie,
iepuroaică) au relevat diferenţe semnificative determinate de genotip, astfel încât multe
gene codificatoare ale lacto-proteinelor sunt actualmente utilizate în selecţie. Este deci,
posibil ca aceste rezultate să îşi găsească o aplicabilitate practică în selecţia astistată de
markeri (MAS).
37
CAPITOLUL I
STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND PROTEINELE
MAJORE DIN LAPTE LA SPECIA SUINĂ
Proteinele din lapte se împart în două mari grupe: fracţiunea cazeinică şi proteinele
din lactoserum. Prima grupă este alcătuită din cazeine şi anume: αS1-, αS2-, β- şi κ-cazeina.
Proteinele din lactoserum sunt reprezentate la majoritatea speciilor de către α-
lactalbumină şi β-lactoglobulină. Destul de recent (1998) la specia suină a fost
descoperită o a treia proteină majoră din lactoserum şi anume WAP (whey acidic proteic
proteina acidă din ser).
Primul polimorfism al unei proteine din lapte a fost evidenţiat la bovine în anul
1955, de către Aschaffenburg şi Drewry, fiind descrise două variante polimorfe ale β-
lactoglobulinei, denumite A, respectiv B
Polimorfismele proteinelor din lapte au fost intens studiate la specii cum ar fi:
ovinele, bovinele sau caprinele. Este de ajuns să menţionez că doar la locusul αS1-
cazeinei, la specia caprină, sunt cunoscute 18 variante alelice.
În România, printe primele studii ce au vizat polimorfismele genetice ale
proteinelor din lapte, au fost efectuate în cadrul disciplinei de Genetică şi ameliorarea
animalelor, a Facultăţii de Zootehnie şi Biotehnologii, din cadrul USAMV Cluj-Napoca,
studii axate pe polimorfismul κ-cazeinei bovine (Vlaic �i colab., 2001).
Pe baza datelor pe care le avem la dispoziţie se poate afirma că tematica
polimorfismelor proteinelor din lapte la specia suină nu a fost abordată pe plan naţional.
Pe plan internaţional polimorfisme ale proteinelor din lapte la specia suină au
fost evidenţiate începând cu anii ’60.
Abordând această tematică, cele mai notabile rezultate au fost obţinute de
colectivul condus de către prof. dr. Jason Lee Alexander, din Statele Unite ale Americii,
care la începutul anilor ’90 a secvenţiat pentru prima oară toate genele, care codifică
proteinele majore din lapte.
38
1.1. STUDIUL PROTEINELOR CE ALCĂTUIESC FRACŢIUNEA CAZEINICĂ
Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită dintr-un grup de 4
fosfoproteine sintetizate de către epiteliul glandei mamare în lacta�ie: αS1-cazeina, αS2-
cazeina, β-cazeina şi κ-cazeina. Acestea sunt cele mai semnificative proteine din lapte, la
specia suină având o pondere de peste 60% din totalul proteinelor din lapte (Aimutis �i
colab., 1981). Indiferent de specie cazeinele sunt caracterizate printr-o solubilitate
limitată (precipită) în intervalul de pH: 4 – 5.
În lapte, cazeinele (denumire generică a celor patru proteine ce alcătuiesc această
fracţiune) se prezintă sub forma unor micelii. Miceliile de cazeină sunt agregate coloidale
formate din cazeine şi fosfat de calciu. Au fost identificate sub această formă în laptele
tuturor speciilor investigate. Având rol de proteine de transport, miceliile transformă
laptele într-un lichid cu vâscozitate scăzută permiţând astfel transportul unor cantităţi
ridicate de calciu şi fosfor. Aceste minerale la concentraţiile la care se găsesc, în absenţa
cazeinelor, ar precipita în interiorul glandei mamare (Horne �i colab., 2002).
În cazul speciei suine, aceste proteine sunt codificate de gene autosomale
codominante situate pe perechea de cromozomi 8 (Archibald �i colab., 1994).
1.1.1. Studiul polimorfismelor αS1-cazeinei porcine
Fără peptida semnal (15 AA) αS1-cazeina porcină, are în componenţa sa un număr
de 191 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 22576,03 Da şi un punct
izoelectric pI=5,88 (Şuteu şi colab., 2009).
La nivel de proteină, Erhardt în 1989, folosind cromatografia cu schimb de ioni,
a izolat o proteină pe care a denumit-o αS1-cazeina porcină, dar poziţia acestei proteine la
migrarea electroforetică folosind tehnica UREA-PAGE sugerează faptul că nu ar fi vorba
despre cazeina αS1, întrucât prezintă un profil de migrare mai lent decât β-cazeina porcină
(Gallagher �i colab., 1996).
La nivel de ADN primii care au determinat întreaga secvenţă a cADN-ului αS1-
cazeinei porcine au fost Alexander şi Beattie (1992a). Aceştia au calculat pe baza
39
compoziţiei în aminoacizi (191), sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 24273
Da.
La nivelul acestei gene, Alexander şi Beattie (1992a), menţionează că ar exista un
polimorfism de lungime, unele clonele folosite în vederea secvenţierii fiind caracterizate
prin lipsa regiunii Gly93 – Gln112, respectiv Glu107 – Gln112.
De asemenea, la acest locus, Archibald �i colab. (1994) folosind enzima TaqI,
semnalează existenţa unui polimorfism. În urma analizelor PRC-RFLP folosind enzima
menţionată anterior, au rezultat doi produşi de restricţie: ~ 8,7 kb �i ~ 7,7 kb.
Denumirea locusului: CSN1S1.
1.1.2. Studiul polimorfismelor αS2-cazeinei porcine
Fără peptida semnal (15 AA), αS2-cazeina porcină, are în componenţa sa un
număr de 220 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 25866 Da şi un punct
izoelectric pI=5,78 (Şuteu şi colab., 2009).
La nivel de proteină a fost izolată pentru prima oară în anul 1984 de către
Cerning-Beroard, cu ajutorul cromatografiei de afinitate, acesta relatând faptul că
varianta porcină ar conţine 200 – 201 AA (cu 6 – 7 mai puţini decât αS2-cazeina bovină).
De asemenea acest studiu a consemnat faptul că αS2-cazeina porcină prezintă un conţinut
mai sărac în Thr, Leu, Tyr şi Arg şi mai ridicat în Ser, Glx, Ile şi His decât varianta
bovină (Gallagher �i colab., 1996). Greutatea moleculară a acesteia, în cazul în care ar
avea ataşate 15 sau 16 grupări fosfat a fost calculată ca fiind în jurul valorii de 24500 Da.
La nivel de ADN primii care au determinat întreaga secvenţă a cADN-ului αS2-
cazeinei porcine au fost Alexander şi Beattie (1992). Aceştia au raportat o lungime a
cADN-ului de 1093 pb. Pentru această proteină, pe baza compoziţiei în aminoacizi (220
AA) au calculat, sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 29744 Da.
Se remarcă faptul că există unele neconcordanţe între secvenţa proteinei publicată
în articol şi cea descărcată în baza de date GenBank în poziţiile 126, 128 – 139, 141 –
142 şi 145.
40
La locusul αS2-cazeinei, în urma unor teste PCR-RFLP, la nivel de ADNc, a fost
detectat un polimorfism de tip BamHI, în urma digestiei enzimatice rezultând produşi de
~ 15,6 kb, respectiv ~ 12,1 kb (Archibald �i colab., 1994).
Denumirea locusului: CSN1S2.
1.1.3. Studiul polimorfismelor β-cazeinei porcine
Fără peptida semnal (15 AA), β-cazeina porcină, are în componenţa sa un număr
de 217 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 24377,32 Da şi un punct
izoelectric pI=5,77 (Şuteu şi colab., 2009).
La nivel de proteină, β-cazeina porcină a fost izolată pentru prima oară în anul
1969 de către Woychik şi Wondolowski, fără a fi caracterizată (Gallagher şi colab.,
1996).
Secvenţa completă a acestei proteine a fost obţinută pe baza secvenţei cADN-ului
(Alexander �i Beattie, 1992b).
β-cazeina porcină conţine nivele mai ridicate de Ala, Leu şi Lys decât în cazul β-
cazeinei bovine. Varianta întâlnită la specia suină nu conţine Trp şi Cys. Proteina descrisă
de Alexander �i Beattie (1992b) prezintă 6 posibile situsuri de fosforilare şi o masă
moleculară de 24397 Da, în formă nefosforilată.
Primul polimorfism în cazul β-cazeinei porcine a fost depistat de către Glasnak
(1966, 1968), acesta identificând β1-cazeinaB, β1-cazeinac şi β2-cazeina. În 1969, Gerrits
identifică un polimorfism în ceea ce el numea la vremea respectivă cazeina3, identificând
două variante pe care le denumeşte A, respectiv B. Ulterior s-a dovedit faptul că
variantele A şi B ale lui Gerrits corespund variantelor β1-cazeinaB, respectiv β1-cazeinac
identificate de către Glasnak (Gallagher şi colab., 1996, Şuteu şi colab., 2009).
Ulterior, în 1987 şi 1989, o echipă de cercetători germani, condusă de G. Erhardt,
întâlnesc din nou un polimorfism al β-cazeinei porcine, numind cele două variante A şi B
(Gallagher şi colab., 1996). În anul 1992, Ng-Kwai-Hang şi Groschclaude (citaţi de către
Gallagher şi colab., 1996) conchid că variantele A şi B ale lui Erhardt sunt probabil
aceleaşi cu variantele A şi B ale lui Gerrits, precum şi cu variantele B şi C ale lui
Glasnak.
41
La nivel de ADN şi această genă a fost pentru prima oară secvenţiată tot de către
Alexander şi Beattie (1992b). Aceştia au raportat o lungime a cADN-ului de 1100 pb,
excluzând terminaţia poliA. Pentru această proteină, pe baza compoziţiei în aminoacizi
(217) au calculat, sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 24397 Da.
Archibald şi colab. (1994) semnalează la locusul β-cazeinei porcine, în urma unor
analize PCR-RFLP, un polimorfism de tip SacI, în urma digestiei rezultând fragmente de
~ 16 kb, respectiv ~14,4 kb.
Denumirea locusului: CSN2.
1.1.4.Studiul polimorfismelor κ-cazeinei porcine
Fără peptida semnal (21 AA), κ-cazeina porcină, con�ine 167 AA, fiind
caracterizată printr-o masă moleculară de 18877,46 Da şi un punct izoelectric pI=8,68
(Şuteu şi colab., 2009).
La nivel de proteină aceasta a fost pentru prima oară izolată de către Woychik şi
Wondolowski, în anul 1969 (Gallagher şi colab.,1996).
Cerning-Beroard (1984) a izolat şi caracterizat κ-cazeina porcină, afirmând că
aceasta prezintă o compoziţie în aminoacizi similară cu cea a κ-cazeinei bovine, cu toate
că proteina porcină conţine aproximativ 177 AA comparativ cu ce bovină care conţine
169 (Mercier şi colab., 1976).
O altă variantă a acestei proteine este cea derivată din secvenţa cADN-ului κ-
cazeinei porcine (Levine şi colab., 1992). Aceasta conţine cu 10 AA mai puţin decât cea
descrisă de Cerning-Beroard (1984).
La nivel de ADN primii care au determinat întreaga secvenţă a cADN-ului κ-
cazeinei porcine au fost Levine şi colab. (1992). Aceştia au raportat o lungime a cADN-
ului de 851 pb. Pentru proteina matură, pe baza compoziţiei în aminoacizi (167) au
calculat, sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 18689 Da.
La acest locus, Archibald (1994) arată faptul că ar putea exista un polimorfism de
tip EcoRI,, dar menţionează că fragmentele obţinute au avut o intensitate scăzută.
Denumirea locusului: CSN3.
42
1.2. STUDIUL PROTEINELOR DIN LACTOSERUM
Proteinele din lactoserum, denumite şi „proteine serice” sunt reprezentate la majoritatea
speciilor de două proteine majore şi anume: α-lactalbumină şi β-lactoglobulină. Relativ
recent (1998) la specia suină a fost identificată o a treia proteină majoră aparţinând
acestei categorii, mai exact: proteina acidă din ser whey acidic protein (WAP).
Proteinele din lactoserum se caracterizează prin faptul că acestea sunt solubile (nu
precipită) în prezenţă unui pH acid (4 -5).
1.2.1. Studiul polimorfismelor α-lactalbuminei porcine
Fără peptida semnal (19 AA), α-lactalbumina porcină, are în componenţa sa un
număr de 122 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 14155,14 Da şi un
punct izoelectric pI=4,68 (Şuteu şi colab., 2009).
La nivel de proteină, α-lactalbumina porcină a fost pentru prima oară izolată de
către Karlsson, în anul 1966, dar nu a fost caracterizată (Gallagher şi colab., 1996).
Schmidt şi Ebner (1971) izolează α-lactalbumina porcină, şi afirmă că aceasta
conţine 118 AA, având o masă moleculară de 14218 Da. Folosind electroforeza în gel de
amidon Schmidt şi Ebner (1972) pun în evidenţă prezenţa a două variante ale acestei
proteine, pe care le denumesc (în funcţie de profilul de migrare) „rapidă”, respectiv
„lentă”.
Bell şi colab. (1981) pun în evidenţă existenţa a două variante genetice ale acestei
proteine, pe care le denumesc A, respectiv B.
La nivel de ADN, secvenţa cADN-ului α-lactalbuminei porcine a fost determinată
de către Das Gupta şi colab. (1992). Aceştia raportează o similaritate de 83,1% între
varianta porcină şi cea bovină la nivel de secvenţă nucleotidică, respectiv 75,2% în ceea
ce priveşte secvenţa de aminoacizi.
Bleck şi colab. (1995) identifică în cadrul acestei gene un polimorfism cauzat de o
mutaţie punctiformă şi descarcă în GenBank cele două secvenţe: L31944, respectiv
L31945.
Denumirea locusului: LALBA.
43
1.2.2. Studiul polimorfismelor β-lactoglobulinei porcine
Fără peptida semnal β-lactoglobulina porcină (18 AA), are în componenţa sa un
număr de 160 AA fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 18877,46 Da şi un
punct izoelectric pI=4,60 (Şuteu şi colab., 2009).
La nivel de proteină, conform celor enunţate de Gallagher şi colab. (1996),
această proteină a fost pentru prima oară izolată de către Karlsson în anul 1966.
Primul polimorfism al acestei proteine a fost identificat de către Kalan şi colab.
(1967, 1968), două variante fiind descrise (β-LG A şi β-LG B). În 1969, Kraeling şi
Gerrits, folosind electroforeza verticală în gel de poliacrilamidă, de asemenea identifică
un polimorfism în fracţiunea serică a laptelui speciei suine, denumind variantele
identificate: Whey1A, respectiv Whey1
B. Ulterior dovedindu-se că era vorba despre
acelaşi polimorfism (Kalan şi colab., 1971). De asemenea Kemmer identifică în anul
1969 două variante ale β-lactoglobulinei porcine, dar acestea nu sunt caracterizate
(Gallagher şi colab., 1996).
Bell şi colab. (1970) raportează izolarea β-lactoglobulinelor A şi B, însă nici
acestea nu sunt caracterizate. Ulterior, Bell şi colab. (1981) identifică o a treia variantă
polimorfă a β-LG porcine, pe care o denumesc C.
Folosind focalizarea izoelectrică, Conti şi colab. (1986) identifică 3 variante ale β-
lactoglobulinei, având punctele izoelectrice 4,4; 4,65 şi 4,9, pe care le denumesc β-LG 1,
β-LG 2, respectiv β-LG 3.
La nivel de ADN, această genă a fost secvenţiată de către Alexander şi Beattie
(1992c). Aceştia afirmă că întreaga lungime a cADN-ului β-lactoglobulinei porcine este
de 768 pb, iar aceasta codifică o proteină matură conţinând 160 AA, cu o masă
moleculară de 17811 Da.
Alexander şi Beattie (1992c) semnalează în cazul uneia din cele cinci clone
secvenţiate prezenţa unui codon în plus. Acest codon (AAA) aflat în regiunea 318 – 325
codifică aminoacidul lizină şi este considerat de către autori ca fiind dovada unui
polimorfism genetic la acest locus.
Denumirea locusului: LGB.
44
1.2.3. Studiul polimorfismelor proteinei acide din ser (WAP)
Proteina acidă din ser (WAP), a fost descoperită relativ recent (1998), motiv
pentru care ea nu a fost atât de intens studiată. Cu toate acestea numeroşi autori au relatat
prezenţa unei aşa-numite „proteină nouă din ser”, dar în majoritatea cazurilor aceasta ori
a fost confundată cu alte proteine, ori nu a fost caracterizată (Gallagher şi colab., 1996).
La nivel de proteină, WAP, fără peptida semnal, are în componenţa sa un număr
de 113 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 22985,86 Da şi un punct
izoelectric pI=5,04 (Şuteu şi colab., 2009). Peptida semnal are o lungime de 19 AA.
Această proteină, cunoscută ca fiind principala proteină din lactoserum la: şoarece,
şobolan, iepure şi cămilă, a fost pentru prima oară izolată şi caracterizată de către
Simpson şi colab. (1998) în cazul speciei suine.
Masa moleculară a WAP în cazul speciei suine în SDS PAGE s-a dovedit a fi
considerabil mai mare decât valoarea de 11,7 kDa calculată pe baza compoziţiei în AA,
ceea ce denotă faptul că această proteină ar fi glicozilată (Simpson şi colab., 1998).
La nivel de ADN, gena WAP a fost clonată şi caracterizată de către Sylvie Rival
şi colab. (2001). Aceasta are o lungime 2087 pb, având în componenţă un număr de 4
exoni. Întreaga secvenţă a genei WAP de la specia suină poate fi accesată în GenBank cu
ajutorul numărului de identificare: AF320306. Cu ajutorul tehnicii FISH, gena WAP, a
fost localizată în regiunea telomerică a perechii de cromozomi 18 (Sylvie Rival şi colab.,
2001).
45
CAPITOLUL II
STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE LA
SPECIA SUINĂ, LA NIVEL DE PROTEINĂ
2.1. MATERIALE �I METODE
Un număr de douăzeci�icinci de probe de lapte, respectiv colostru, provenite de la
diferite rase au fost analizate cu ajutorul tehnicii IEF, descrisă în detaliu de către Şuteu şi
colab., (2009).
2.2. REZULTATE �I DISCU�II
Întrucât această tehnică nu a mai fost utilizată pentru studierea polimorfismelor
lacto-proteinelor la specia suină, interpretarea benzilor rezultate în urma migrărilor IEF
este destul de dificil de realizat. Pentru aceasta au fost calculate punctele izoelectrice (pI)
pentru toate cele 7 proteine (Tab. 1). Acestea au fost calculate pe baza compoziţiei
aminoacide a proteinelor, cu ajutorul programului de pe pagina de Internet
www.uniprot.org. Trebuie menţionat faptul că aceste puncte izoelectrice aparţin
proteinelor în formă nefosforilată.
Tabelul 1.
Caracterizarea proteinelor majore din lapte la specia suină (fără peptida semnal)
ProteinaNumărul de aminoacizi
(AA)Punct izoelectric
(pI)Masa moleculară
(Da)
S1-CN 191 5,88 22576,03S2-CN 220 5,78 25866,00β-CN 217 5,77 24377,32κ-CN 167 8,68 18877,46-LA 122 4,68 14155,14β-LG 160 4,60 17863,51WAP 113 5,04 11985,86
46
Pe baza acestor puncte izoelectrice am determinat următoarea succesiune a
proteinelor în gelurile IEF: β-LG; -LA; WAP; β-CN; S2-CN; S1-CN; κ-CN. Utilizând
condi�iile actuale de migrare (pH=4,2-7), variantele κ-cazeinei nu pot fi vizualizate,
aceasta având pI=8,68 (Tab. 1).
Analiza profilelor electroforetice a probelor de colostru a scos în evidenţă
existenţa unui polimorfism în cazul indivizilor aparţinând rasei Marele alb. Având în
vedere regiunea din gel în care au fost observate profile electroforetice diferite şi ţinând
seama de punctele izoelectrice ale lacto-proteinelor speciei suine am concluzionat că este
vorba despre un polimorfism al β-cazeinei (Şuteu şi colab., 2009). Variantele proteice
care au prezentat profile electroforetice diferite, aparţinând β-cazeinei, au fost denumite
A, respectiv B. Fiind vorba despre markeri genetici codominanţi cele două variante au
generat trei genotipuri: AA, AB, respectiv BB. Proteina cu o mobilitate electroforetică
mai ridicată (care a migrat mai mult) a fost denumită varianta A, în timp ce varianta B
este cea care a migrat mai aproape de capătul anodic al gelului.
Polimorfisme ale β-cazeinei porcine au mai fost raportate (Glasnak, 1966; Gerrits,
1969; Erhardt �i colab., 1987, 1989, cita�i de către Gallagher �i colab., 1996), dar
având în vedere faptul că tehnicile folosite în detecţie au fost diferite nu putem compara
cele două variante (A şi B) cu cele descrise anterior, motiv pentru care este necesară
caracterizarea acestui polimorfism la nivel de ADN.
Figura 1 prezintă profilul de migrare al probelor de lapte provenite de la indivizi
din rasele Mangaliţa, Bazna, respectiv Marele alb (probele de colostru – folosite ca probe
de referinţă). Analizând acest gel se poate observa că polimorfismul β-CN, descris
anterior, este întâlnit şi la rasele autohtone luate în studiu, fiind identificate ambele
variante proteice la ambele rase.
De asemenea, în Figura 1, poate fi observat şi cel de-al doilea polimorfism al
lacto-proteinelor speciei suine identificat utilizând această tehnică. Este vorba de un
polimorfism al β-lactoglobulinei, proteină care la toţi indivizii (exceptând 2 indivizi din
rasa Mangaliţa) a focalizat într-un singur punct, rezultând o singură bandă. A fost
denumită β-LG A variantă proteică majoritară. Caracterizarea la nivel molecular (prin
secvenţierea ADNc a genei codificatoare) a acestor două variante proteice şi compararea
cu secvenţele existente în bazele de date consacrate va permite atribuirea unor denumiri
47
finale acestor proteine. Varianta B este caracterizată de un profil de migrare mai catodic,
comparativ cu varianta A. Deocamdată a fost identificată doar la indivizi aparţinând rasei
Mangaliţa (Tab. 3) şi doar în combinaţie cu varianta A (în stare heterozigotă). În cazul în
care această variantă, pe baza unor studii mai ample, se dovedeşte a fi întâlnită doar la
rasa Mangaliţa, atunci β-LG B va putea fi testată/utilizată ca marker genetic de
apartenenţă la rasă sau pentru trasabilitatea produselor fabricate din carne provenită de la
animale din această rasă.
Figura 1. Profil IEF comparativ al unor probe de lapte, respectiv colostru provenind de la
specia suină. Câmpurile1 şi 2 rasa Mangaliţa, câmpurile 3 şi 4 rasa Bazna,
câmpurile 5, 6 şi 7 rasa Marele alb, probe de referinţă (original).
În ceea ce priveşte αS1-CN, αS2-CN, α-LA şi WAP, acestea, în cazul indivizilor
analizaţi, sunt monomorfe. Genotipurile identificate, la locii β-CN şi β-LG sunt
prezentate în Tabelul 2, respectiv Tabelul 3.
β-LG B
β-CN A
β-CN B
AB
β-LG A
48
Tabelul 2.
Numărul genotipurilor observate la locusul β-cazeinei porcine
RasaNumărul de
probeGenotipuri observate la locusul β-CN
AA AB BBMarele alb 13 6 4 3Pietrain 3 3 - -Duroc 4 4 - -Mangaliţa 3 1 2 -Bazna 2 - 1 1
Tabelul 3.
Numărul genotipurilor observate la locusul β-lactoglobulinei porcine
RasaNumărul de
probe Genotipuri observate la locusul β-LG
AA AB BBMarele alb 13 13 - -Pietrain 3 3 - -Duroc 4 4 - -Mangaliţa 3 1 2 -Bazna 2 2 - -
2.3. CONCLUZII
1. Utilizând tehnica IEF, a fost identificat un polimorfism al β-cazeinei porcine,
fiind identificate două variante care au fost denumite β-CN A, respectiv β-CN B. Rasele
Pietrain şi Duroc prezintă doar varianta β-CN A, în timp ce la rasele Marele alb,
Mangaliţa şi Bazna au fost identificate ambele variante.
2. În cazul β-lactoglobulinei porcine a fost detectată o nouă variantă polimorfă,
denumită provizoriu β-LG B. Studiile viitoare vor duce la o caracterizare completă şi o la
denumire finală a acestei variante. Deocamdată prezenţa acestei variante a fost semnalată
doar la rasa Mangaliţa.
3. În ceea ce priveşte αS1-CN, αS2-CN, α-LA şi WAP, acestea, în cazul indivizilor
analizaţi, sunt monomorfe.
49
CAPITOLUL III
POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.647A>G
3.1. MATERIALE �I METODE
Colectarea probelor de lapte Extracţia ARN s-a făcut, în cazul indivizilor
purtători ai unor variante diferite ale β-cazeine porcine, folosind aceleaşi probe de lapte
ca şi în cazul focalizării izoelectrice.
Colectarea probelor de sânge Au fost colectate un număr de 31 de probe de
sânge de la indivizi aparţinând raselor Bazna (12 cap.) şi Mangaliţa (19 cap.) din cadrul
S.C.D.A. Turda, în vederea extracţiei de ADN.
În cazul raselor Marele alb, Landrace �i Pietrain probe de sânge ne-au fost puse la
dispozi�ie de către Prof. Nadine Buys (KU Leuven), extrac�ia de ADN fiind realizată în
cadrul laboratorului PROGENUS.
Extracţia ARN-ului din lapte
În vederea secvenţierii cADN-ului β-cazeinei porcine, a fost extras ARN-ul de la
indivizii identificaţi a fi purtători ai unor variante diferite ale acestei proteine (AA, AB,
BB). Extracţia ARN-ului a fost efectuată folosind reactivul PureZOL (BioRad).
Obţinerea şi secvenţierea cADN-ului β-cazeinei porcine
Pentru obţinerea cADN-ului, a fost efectuată reverstranscripţia probelor de ARN
extrase, utilizând kit-ul RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(Fermentas), respectând instrucţiunile producătorului.
Pentru obţinerea cADN-ului β-cazeinei porcine, 2 μl de ADNc total au fost
amplificaţi utilizând kit-ul de amplificare GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega) şi
perechea de primeri BCZP-F şi BCZP-R. Primerii au fost creaţi cu ajutorul programului
Fermentas REviewer (http://www.fermentas.com) utilizând ca secvenţă de referinţă
secvenţa lui Alexander şi Beattie (1992), GenBank X54974, aceştia având următoarele
secvenţe:
BCZP-F 5'-3': GCA AGA GCG AAG GAA GAA CT
BCZP-R 5'-3': CAA AAG TGA GGA GAG GGC AT
50
3.2. REZULTATE �I DISCU�II
Pentru a caracteriza la nivel molecular variantele polimorfe ale β-cazeinei porcine
(identificate cu ajutorul IEF) a fost extras ARN-ul din probe de lapte provenite de la trei
indivizi cu următoarele genotipuri: AA, AB şi BB. Probele de ARN au fost
reverstranscriptate, iar cADN-ul total a fost amplificat cu ajutorul perechii de primeri
BCZP F şi R. Probele astfel ob�inute au fost secven�iate folosind aceea�i pereche de
primeri (Fig. 2).
Figura 2. Cromatogramele de secvenţiere ale cADN-ului β-cazeinei porcine provenind
de la trei indivizi purtători ai unor variante genetice diferite ale acestei gene. Evenimentul
mutaţional este marcat printr-o căsuţă (original).
Secvenţierea cADN-ului β-cazeinei porcine a confirmat polimorfismul identificat
la acest locus (Şuteu şi colab., 2009).
În Figura 2 poate fi observată porţiunea din cromatogramele de secvenţiere unde
se găseşte substituţia la nivel nucleotidic ce a cauzat apariţia a două variante proteice.
Această substituţie a avut loc în poziţia 647 a cADN-ului, dar pe cromatograme apare în
poziţia 578 întrucât primerul forward se ataşează în interiorul cADN-ului, după porţiunea
codificatoare a peptidei semnal.
BB-IEF201Q
AB-IEF201QR
AA-IEF201R
51
După cum se poate observa (Fig. 2) în cazul genotipului BB în poziţia 647 a
cADN-ului se găseşte o adenină, care în cazul genotipului AA a fost substituită de către o
guanină (c.647A>G). În cazul individului heterozigot se pot observa două peak-uri
suprapuse, unul de culoare verde şi unul de culoare neagră, ceea ce denotă faptul că în
această poziţie este prezentă atât guanina specifică varintei A cât şi adenina specifică
variantei B.
Substituţia A/G din poziţia 647 a cADN-ului modifică aminoacidul din poziţia 201
a proteinei mature, astfel codonul CAA codifică glutamina (Q), în timp ce codonul CGA
codifică arginina (R).
Rezultatele secvenţierii sunt în perfectă concordanţă cu rezultatele obţinte în urma
migrării IEF. Astfel, aminoacidul arginină (R) din poziţia 201 face ca proteina matură să
aibă un punct izoelectric pI=5,99 – fapt ce este reliefat la nivelul IEF printr-un profil de
migrare mai catodic (varianta A). Pe de altă parte, dacă în poziţia 201 a proteinei mature
se regăseşte aminoacidul glutamină (Q), punctul izoelectric al proteinei devine pI=5,77 –
conferind proteinei (varianta B) un profil de migrare mai anodic comparativ cu varianta
A. Desigur, profilul de migrare IEF al β-cazeinei porcine în cazul indivizilor heterozigoţi
este caracterizat prin apariţia a două benzi.
Pentru a facilita discuţiile referitoare la aceste două variante, în continuare ele vor
fi denumite în funcţie de aminoacidul din poziţia 201 – cea care le diferenţiază (201R,
respectiv 201Q – Tab. 4).
Tabelul 4.
Denumirea finală a variantelor β-cazeinei porcine
Denumirea finală a
genotipurilor β-cazeinei
Caracterizarea variantelorDenumirea variantelor la migrarea
IEF
Nucleotida din
poziţia 647 a cADN-ului
Aminoacidul din poziţia 201 a
proteinei mature
Punctul izoelectric al
proteinei mature
201R AA GG Arginină (R) 5,99201Q BB AA Glutamină (Q) 5,77
201QR AB AGGlutamină/Arginină
Q/R5,77/5,99
52
În ceea ce priveşte mutaţia punctiformă din poziţia 647 a cADN-ului (substituţia
A/G), analizând secvenţele cunoscute până la această dată, observăm că la majoritatea lor
în această poziţie a fost identificată prin secvenţiere adenina (GenBank NM_214434,
X54974, EU025876, EU213063), în timp ce doar două secvenţe aflate în GenBank
semnalează prezenţa guaninei (EU242520, GU827390). Întrucât secvenţe similare (în
ceea ce priveşte poziţia 647 a cADN-ului β-cazeinei porcine) cu cele obţinute de către noi
în urma secvenţierii existau deja în GenBank, am decis să nu le depozităm în această
bază de date.
Protocol PCR – RFLP pentru evidenţierea polimorfismului Q201R
Prin efectuarea unor alinieri de secvenţe s-a constat că la nivelul genei, nucleotida
din poziţia 647 a cADN-ului face parte din exonul 6. Acesta este cel mai mare exon al
genei codificatoare a β-cazeinei la specia suină, având o lungime de 519 pb.
Amplificarea probelor de ADN extras din sânge s-a făcut cu ajutorul perechii de
primeri E6BP F şi R. Aceştia sunt complementari unor regiuni din intronii ce flanchează
exonul 6, fragmentul rezultat în urma amplificării având o lungime de 1216pb (Fig. 3).
Figura 3. Profilul electroforetic a trei probe de ADN provenite de la specia suină
amplificate cu primerii E6BP F şi R. Câmpul 1: GeneRuller 1 kb DNA Ladder
(Fermentas), câmpul 2: individ 201QR, câmpul 3: individ 201Q, câmpul 4: individ 201R,
câmpul 5: control negativ. Original.
53
Restricţia produşilor de amplificare a fost realizată cu ajtorul enzimei StyI
(Fermentas, FastDigest). În cazul alelei 201Q prezenţa unei adenine în poziţia 473 a
exonului 6 (647 din cADN) crează un situs suplimentar de restricţie pentru enzima mai
sus menţionată. Conform hărţii teoretice de restricţie a fragmentului amplificat, în urma
digestiei cu enzima StyI, rezultă următoarele fragmente:
201Q: 679pb + 434pb + 85pb + 18pb;
201R: 1113pb + 85pb + 18pb;
201QR: 1113pb + 679pb + 434pb + 85pb + 18pb.
Figura 4. Profilele de migrare aparţinând celor trei genotipuri de la acest locus;
consecutiv restricţiei produşilor de amplificare cu enzima StyI (Fermentas FastDigest).
Câmpul 1: produs nerestrictat, câmpul 2: AmpliSize Molecular Ruler 50-2,000 bp Ladder
(BioRad), câmpul 3: 201QR, câmpul 4: 201R, câmpul 5: 201Q (original).
Migrarea probelor de ADN amplificate cu ajutorul primerilor E6BP F şi R şi
restrictate cu enzima StyI, confirmă substituţia A/G identificată prin secvenţierea cADN-
ului β-cazeinei porcine (Fig. 2), confirmând de asemenea veridicitatea hărţii de restricţie
teoretice. Trebuie menţionat că fragmentul de 18 pb, datorită dimensiunii sale reduse, nu
poate fi vizualizat. Astfel cele prezentate anterior se constituie într-un protocol de
genotipizare adecvat evidenţierii polimorfismului Q201R din cadrul β-cazeinei porcine.
54
Genotipizările efectuate până în prezent, utilizând protocolul descris anterior, au
condus la obţinerea următoarelor rezultate:
Tabelul 5.
Structura genetică a popula�iilor analizate, la locusul β-cazeinei,
privind polimorfismul Q201R (c.647A>G)
RASA N
Numărul de indivizi apar�inând fiecărui
genotip
Frecven�ele genotipurilor
Frecven�ele genelor
201Q 201QR 201R P201Q H201QR Q201R p201Q q201R
Landrace 41 0 3 38 0 0.07 0.93 0.035 0.965Pietrain 40 0 0 40 0 0 1 0 1Large White 36 2 17 17 0.06 0.47 0.47 0.295 0.705Landrace (CRA–W) 26 0 0 26 0 0 1 0 1Mangali�a 13 0 3 10 0 0.23 0.77 0.115 0.885Bazna 11 1 8 2 0.09 0.73 0.18 0.445 0.545
3.3. CONCLUZII
1. Perechea de primerii BCZP F şi BCZP R, a căror design a fost realizat în cadrul
echipei de cercetare, sunt adecvaţi amplificării şi secvenţierii cADN-ului β-cazeinei
porcine.
2. Prin secvenţierea cADN-ului β-cazeinei porcine a fost caracterizat polimorfismul
acestei proteine identificat cu ajutorul IEF. Astfel, o substituţie A/G în poziţia 647 a
cADN-ului (473 a exonului 6) face ca în poziţia 201 a proteinei mature să fie introdusă o
glutamină (în cazul existenţie unei guanine) sau o arginină (în cazul existenţei unei
adenine). Aminoacidul din această poziţie modifică punctul izoelectric al proteinei
mature, fenomen ce a stat la baza apariţiei unor profile diferite de migrare IEF. Acest
polimorfism a fost denumit „Q201R”.
3. Perechea de primeri E6BP F şi R amplifică cu succes exonul 6 al genei CSN2,
unde se regăseşte la nivel de ADN SNP-ul descris la punctul anterior. Deoarece adenina
din poziţia 473 a exonului 6 (647 din cADN) crează un situs suplimentar de restricţie
pentru enzima StyI, a putut fi pus la punct un protocol de genotipizare având la bază
55
această enzimă, ce poate face diferenţa la nivel alelic între variantele 201Q, 201R,
respectiv poate evidenţia genotipul 201QR.
CAPITOLUL IV
POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.294T>G
4.1. MATERIALE �I METODE
Materialele �i metodele utilizate pentru caracterizarea acestui polimorfism sunt
identice cu cele amintite în capitolul anterior.
Pentru dezvoltarea protocolului de genotipizare au fost utiliza�i aceea�i primeri
(întrucât �i substitu�ia c.294T>G este localizată în exonul 6), dar restric�ia a fost
realizată cu ajutorul enzimei HpaII.
4.2. REZULTATE �I DISCU�II
Pe parcursul experimentelor efectuate în vederea caracterizării polimorfismului
Q201R al β-cazeinei porcine (capitolul anterior), în urma alinierii secvenţelor aferente
cADN-ului acestei gene, a fost identificată o alelă nouă la acest locus. Ca şi în situaţia
precedentă, cADN-ul a fost obţinut prin amplificarea cADN-ului total cu primerii BCZP
F şi R.
Fiind vorba despre o alelă necunoscută până la acea dată, secvenţa acesteia a fost
descărcată în baza de date GenBank, primind numărul de identificare GU827390.
Analizând cromatogramele de secven�iere (Fig. 5) putem constata că acestea sunt
identice, singura diferenţă dintre ele fiind nucleotida încadrată într-o căsuţă. La nivel de
ADNc această mutaţie punctiformă a avut loc în poziţia 294, poziţie în care toate
secvenţele β-cazeinei porcine existente la această dată în GenBank prezintă o timină
(Tab. 6). Tocmai guanina din poziţia 294, ce diferenţiază noua alelă de restul secvenţelor
întâlnite în GenBank, ne-a determinat să o denumim „alela G”.
56
Figura 5. Cromatograma de secvenţiere aparţinând alelei G a β-cazeinei porcine (partea
superioară) comparativ cu o alelă normală (partea inferioară). Evenimentul mutaţional
este marcat printr-o căsuţă (original).
Substituţia T/G, întâlnită în poziţia 294 a cADN-ului alelei G (c.294T>G), este de
fapt o „mutaţie silent” întrucât, atât codonul CCT, cât şi codonul CCG, codifică
aminoacidul prolină (P). Cu toate acestea, ţinând cont de toate mutaţiile întâlnite în cazul
acestei alele (Tab. 6), proteina obţinută pe baza translaţiei teoretice a secvenţei
nucleotidice este una distinctă, neexistând similarităţi de 100% la alinierea secvenţei
aminoacide cu orice altă secvenţă a β-cazeinei porcine cunoscută până la această dată.
Tabelul 6.
Centralizare a alinierilor de secvenţe pentru β-cazeina porcină
Secvenţa(GenBank Acc. No.)
Poziţia din cADN147 175 294 433 435 443 468 590 647
GU827390 T A G G T G C G GNM_214434 T A T G T T T G AX54974 T A T G T T T G AEU24520 A G T A T G C G GEU025876 T A T G T T T G AEU213063 T A T G C T T A A
57
Pornind de la mutaţia punctiformă din poziţia 249 a cADN-ului (la nivel de ADN
– nucleotida 120 a exonului 6), pe baza faptului că guanina din poziţia menţionată crează
un situs de restricţie pentru endonucleaza HpaII, a fost pus la punct un protocol de
genotipizare adecvat evidenţierii alelei G a β-cazeinei porcine (detaliat de către Şuteu şi
colab., 2010, 2011a).
Genotipizările efectuate până la această dată indică faptul că alela G nu este strict
limitată la rasa Mangaliţa (în cadrul căreia a fost descoperită), astfel:
Tabelul 7.
Structura genetică a popula�iilor analizate, la locusul β-cazeinei,
privind polimorfismul c.294T>G
RASA N
Numărul de indivizi apar�inând fiecărui
genotip
Frecven�ele genotipurilor
Frecven�ele genelor
TT TG GG PTT HTG QGG pT qG
Landrace 40 27 11 2 0.675 0.275 0.05 0.8125 0.1875Pietrain 38 11 19 8 0.29 0,5 0.21 0.54 0.46Large White 32 20 12 0 0.625 0.375 0 0.8125 0.1875Landrace (CRA–W) 26 17 9 0 0.65 0.35 0 0.825 0.175Mangalita 15 5 10 0 0.33 0.67 0 0.67 0.33
4.3. CONCLUZII
1) Experimentele ce au vizat caracterizarea polimorfismului Q201R al β-cazeinei
porcine, în speţă secvenţierea cADN-ului acestei gene, au permis identificarea unei noi
alele la acest locus, caracterizată prin prezenţa unei guanine în poziţia 294 a cADN-ului.
Această nouă alelă a fost denumită alela „G”, iar secvenţa ei se a fost descărcată în baza
de date GenBank, primind numărul de identificare GU827390.
2) Proteina dedusă prin translaţia teoretică a secvenţei nucleotidice a alelei G a β-
cazeinei porcine este de asemenea unică: ADE60010 (NCBI Protein, EBI), D5LG68
(UniProt). Deşi mutaţia care diferenţiază alela G de celelalte secvenţe ale β-cazeinei
porcine este o mutaţie silent (nu modifică aminoacidul), luată în întregime proteina
codificată de către alela G nu prezintă similaritate de 100% cu niciuna dintre secvenţele
aminoacide cunoscute până la această dată.
58
CAPITOLUL V
POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.175G>A
5.1. MATERIALE �I METODE
Reactivii �i metodele utilizate în cadrul acestui capitol sunt identice cu cele
amintite anterior.
Consecutiv migrării în gel de agaroză a produ�ilor PCR rezulta�i în urma
amplificării cADN-ului β-cazeinei porcine, pe lângă fragmentul a�teptat, având o lngime
de 693 pb, a putut fi vizualizat �i un fragment mai scurt (174 bp). Ini�ial am privit acest
fragment ca produs de amplificare nespecific, dar deoarece acesta a persitat �i după
modificarea parametrilor amplificării (cre�terea temperaturii de aliniere a primerilor,
scăderea concentra�iei primerilor) am decis să îl secven�iem. Pentru aceasta a fost
necesară decuparea acestuia din gel �i reamplificarea. Purificarea acestui fragment din
gel a fost realizată cu ajutorul kit-ului Zymoclean Gel DNA Recovery Kit.
5.2. REZULTATE �I DISCU�II
Probele de ARN total extrase din celulele somatice recuperate din lapte au fost
reverstranscriptate, ulterior fiind amplificate cu ajutorul perechii de primeri BCZP F �i
R, primeri specifici β-cazeinei porcine. Ace�ti primeri au fost crea�i pornind de la
secven�a lui Alexander �i Beattie (1992) – X54974. Consecutiv migrării în gel de
agaroză a probelor astfel ob�inute, pe lângă fragmentul a�teptat de 693 pb, un al doilea
produs de amplificare, mult mai scurt (174 pb) a putut fi vizualizat (Fig. 6, câmpul3).
Fragmentul de 174 pb (Fig. 6, câmpul 3) a fost purificat, reamplificat �i
secven�iat cu aceea�i primeri (BCZP F �i R). Secven�ierea fragmentului de 174 pb a
demonstrat că acesta este o variantă a β-cazeinei porcine căreia îi lipse�te exonul 6 (519
nt).
59
693 pb
174 pb
Secven�a acestei noi variante transcrip�ionale a β-cazeinei porcine a fost
descărcată în baza de date GenBank primind identificatorul HM114445.
Figura 6. Profilul de migrare al cADN-ului β-cazeinei porcine ob�inut prin amplificarea
probelor de cADN total cu primerii BCZP F �i R. L: 50 bp DNA Ladder (Fermentas).
Câmpul 1: cADN-ul unei scroafe care prezintă fenomenul de splicing alternativ. Câmpul
2: cADN al β-cazeinei porcine matural normal. Câmpul 3: fragmentul de 174 pb decupat
�i purificat din gel �i reamplificat. NC: control negativ. Original.
Pentru a elucida mecanismul care a condus la apari�ia acestui fenomen de
maturare alternativă a ARN-ului mesager (splicing alternativ) au fost crea�i o pereche de
primeri complementari unor por�iuni din intronii care flanchează exonul 6 (E6BP F �i
R). Ace�ti primeri au fost folosi�i pentru a amplifica această regiune în cazul unor
scroafe la care fenomenul de splicing alternativ s-a manifestat (Fig. 6, câmpul 1),
respectiv scroafe al căror ARN a fost maturat corespunzător (Fig. 6, câmpul 2).
Secven�ierea acestei por�iuni indică faptul că o muta�ie punctiformă la nivelul
jonc�iunii intron-exon este cea care cauzează apari�ia fenomenului de splicing
alternativ (Fig. 7).
Substitu�ia identificată prin secven�iere (c.175G>A) afectează prima nucleotidă
a exonului 6. În cazul scroafelor la care prima nucleotidă a acestuia este A, ARN-ul
mesager este maturat alternativ, luând astfel na�tere doi transcri�i. Când este prezentă
guanina, ARN-ul mesager este maturat corect.
Muta�ia c.175G>A cauzează, în proteina cu lungime normală (217 AA) o
substitu�ie a aminoacizilor: p.Asp59Asn.
60
Se remarcă faptul că la to�i indivizii analiza�i fragmentul de 693 pb a fost
prezent într-o cantitate mai ridicată comparativ cu cel de 174 pb, ceea ce denotă că �i în
laptele scroafelor cu genotip AA proteina cu lungimea normală (217 AA) este prezentă
într-o cantitate superioară comparativ cu cea a varinatei de 44 aa.
Figura 7. Probe de ADN amplificate cu primerii E6BP F �i R �i secven�iate cu
primerul sens. Cromatograma de secven�iere de deasupra apar�ine unei scroafe l-a care
nu s-a manifestat fenomenul de splicing alternativ. Cromatograma de dedesubt apar�ine
unei scroafe care a prezentat doi transcri�i ai cADN-ului β-cazeine (a fost prezent
fragmentul de 174 pb – splicing alternativ). Evenimentul muta�ional, prima nucleotidă a
exonului 6 este marcată printr-o căsu�ă (original).
Substitu�ia c.175G>A (Fig. 7) poate fi pusă în eviden�ă prin intermediul unui
PCR–RFLP, deoarece când guanina este prezentă în această pozi�ie aceasta crează un
situs suplimentar de restric�ie pentru enzima PfoI. Acest protocol de genotipizare
(detaliat de către �uteu �i colab., 2011) permite depistarea scroafelor în al căror lapte va
fi prezent acest nou izoform al β-cazeinei porcine.
Varianta β-cazeinei porcine dedusă pe baza transla�iei teoretice a secven�ei
HM114445 are o lungime de doar 44 AA, fa�ă de 217 AA când ARN-ul este maturat
corespunzător. Fenomenul de splicing alternativ �i muta�ia cauzatoare (c.175G>A) au
fost confirmate prin secven�iere la 6 indivizi neînrudi�i, proveni�i din trei rase diferite.
61
Explica�ia faptului că această substitu�ie cauzează splicingul alternativ rezidă în
faptul că în cazul intronilor mari (în cazul de fa�ă 1206 nt) �i a exonilor mari (în cazul
de fa�ă 519 nt) arhitectura intro/exon joacă un rol crucial în recunoa�terea (de către
ma�inăria spliceosomală) a situsurilor de splicing (Hertel, 2008).
Întrucât rolul biologic al acestei variante noi a β-cazeinei porcine nu este încă
elucidat �i având în vedere că evenimente similare documentate în cazul altor specii au
avut un impact însemnat asupra calită�ii laptelui, este posibil ca β-cazeina (CSN2) să fie
următorul marker în selec�ia suinelor.
Un studiu preliminar, efectuat pe un număr de 26 de scroafe, apar�inând rasei
Landrace, nu a semnalat diferen�e sus�inute statistic asupra dinamicii de cre�tere a
loturilor de purcei proveni�i de la scroafe cu genotipuri diferite (pe parcursul perioadei
de alăptare).
5.3. CONCLUZII
1. Prin secven�iere a fost identificată substitu�ia primei nucleotice a exonului 6 a β-
cazeinei porcine (c.175G>A). În cazul scroafelor care prezintă în această pozi�ie A,
ARN-ul mesager al β-cazeinei este maturat alternativ, fiind prezente în laptele acestora
două variante ale acestei proteine. Prima variantă este cea normală, având o lungime de
217 AA, în timp ce a doua este mult mai scurtă, având în compozi�ia sa doar 44 AA,
întrucât substitu�ia c.175G>A modifică arhitectura intron/exon, iar în cazul prezen�ei
adeninei exonul 6 (519 nt) este înlăturat în timpul maturării ARN-ului mesager precursor
(splicing alternativ).
2. Molecula de ARN matur codificatoare a variantei scurte a β-cazeinei (44 AA) a
fost reverstranscriptată �i secven�iată. Secven�a a fost descărcată în GenBank primind
identificatorul HM114445.
3. Pe baza transla�iei teoretice a secven�elor nucleotidice s-a arătat că muta�ia
c.175G>A determină în cazul variantei normale a β-cazeinei o substitu�ie a
aminoacidului din pozi�ia 59 a proteinei, aspartanul fiind înlocuit de asparagină.
62
4. Pe baza faptului că G din pozi�ia 175 a cADN-ului crează un situs suplimentar de
restric�ie pentru endonucleaza Pfo I, am dezvoltat un test de tip PCR–RFLP care
permite diferen�ierea la nivel alelic.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Alexander, L. J., C. W. Beattie (1992a) The sequence of porcine αS1 – casein cDNA:
evidence for protein variants generated by altered RNA splicing. Animal
Genetics 23: 283-28.
2. Alexander, L. J., C. W. Beattie (1992b) The sequence of porcine β – casein cDNA.
Animal Genetics 23: 369-371.
3. Alexander, L.J., C. W. Beattie (1992c) Sequence of porcine β-lactoglobulin cDNA.
Animal Genetics 23: 263-265
4. Alexander, L. J., N. A. Das Gupta, C. W. Beattie (1992) The sequence of porcine αS2
– casein cDNA. Animal Genetics 23: 365-367.
5. Archibald, A. L., S. Couperwhite, C. S. Haley, C. W. Beattie, L. J. Alexander (1994)
RFLP and linkage analysis of the porcine casein loci-CASAS1, CASAS2,
CASB AND CASK. Animal Genetics 25: 349-351.
6. Bâlteanu, V. A. (2010) Teză de doctorat. USAMV Cluj-Napoca.
7. Gallagher, D. P., P. F. Cotter, D. M. Mulvihill (1996) Porcine milk protein: a review.
Int. Dairy J. 7: 99–118.
8. Simpson, K. J., P. Bird, D. Shaw, K. Nicholas (1998) Molecular characterization and
hormone-dependent expression of porcine whey acidic protein gene. Jurnal
of Molecular Endocrinology. 20: 27-35.
9. Şuteu, M., A. Vlaic, V. Balteanu, F. Pop (2009) Porcine milk protein polymorphisms
detection by means of isoelectric focusing. Bulletin of UASVM Cluj-Napoca.
Animal Science and Biotechnologies 66 (1-2): 146-151.
10. Şuteu, M., Vlaic A., V.A. Bâlteanu, Wavreille J., Renaville R. (2011b) Evidence of
alternative splicing of porcine β-casein (CSN2). Animal Genetics. doi:
10.1111/j.1365-2052.2011.0281.x.
63
11. Vlaic, A., D. Ciobanu, T. Oroian (2001) Research concerning the associations
between the genotypes at the kappa-casein locus and milk production traits
in cattle. Journal of Agricultural Sciences. 1: 45-48.