Selekcija i Screening i PCR

UNIVERZITET U SARAJEVU PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET ODSJEK ZA HEMIJU-SMJER OPI KABINET ZA HEMIJSKU TEHNOLOGIJU BIOTEHNOLOGIJA

SELEKCIJA I SCREENING TRANSFORMATA I PCRseminarski rad Zahirovi, A; Nii, M; Rami, E; Smaji, M; trbo, F; Sabljica,L; Makan, N;

Mentor: doc. dr. Mirza Nuhanovi Sarajevo, oktobar 2011.

Selekcija i screening transformata i PCR

S A D R A J 1. UVOD ................................................................................................................................ 3 2. PROCEDURE SELEKCIJE I SCREENINGA ............................................................... 4 2.1. Genetike metode .............................................................................................. 4 2.1.1. Selekcija na osnovu prisustva vektora.............................................. 4 2.1.2. Selekcija na bazi umetnute sekvence ...................................................... 6 2.2. Imunohemijske metode .............................................................................................. 6 2.2.1. Neobiljeene kvalitativne imunohemijske tehnike .......................... 8 2.2.2. Neobiljeene kvantitativne imunohemijske tehnike ...................... 11 2.3. Diferencijalni screening .................................................................................. 12 2.4. Hibridizacija nukleinskih kiselina.......................................................................... 14 2.5. Subtraktivno kloniranje i diferencijalni skrining.................................................. 16 2.5.1. HRT-hibrid-inducirana i HART-hibrid-zaustavljena translacija ..... 16 2.6. Rekombinantna DNK .............................................................................................. 17 2.7. PCR Polymerase Chain Reaction lanana reakcija polimerazom ...........21 2.7.1. Osnovne naznake i historijat ................................................................... 21 2.7.2. Osnova PCR metode ................................................................................ 21 2.7.3. Hipoteze molekularne biologije i PCR metode ................................... 22 2.7.4. Postupak PCR metode ............................................................................. 24 2.7.5. Labolaratorijski uslovi PCR-a ................................................................ 25 2.7.6. Amplifikacija dugih fragmenata............................................................. 29 2.7.7. Izvedenice PCR metode ...................................................................30 2.7.8. Primjena PCR ....................................................................................30 3. LITERATURA ........................................................................................................................... 32

2


1. UVOD Pred biotehnologiju, kao aplikativnu nauku, postavljaju se visoki ciljevi, ije ispunjavanje ne samo to je interdisciplinarno nego je i esto mukotrpno. Umetanje nvih gena u postojeu DNK sekvenciju i njihovo multipliciranje, a posebno izdvajanje i selekcija je jedan od sigurno najzahtjevnijih procesa molekularne biologije, genetike i biotehnologije. Nakon insercije eljenog DNK fragmenta u plazmid (vektor), sljedei korak je kloniranje, tj. prijenos cijelog gena u organizam domaina. Daleko najei domain za jednostavne eksperimente kloniranja je Escherichia coli sa specifinim genetikim svojstvima. U irokoj upotrebi su predtretirane elije E. coli poznate kao kompetentne elije, pripremljene za transformaciju, odnosno inkorporaciju strane DNK. U samom procesu transformacije omoguuje se kontakt elija domaina i izvjesne koliine transformirajueg agensa (strane DNK). Takva smjesa se podvrgne toplotnom oku to omoguava aktivaciju reparativnih mehanizama i revitalizaciju elija. Rezultat transformacije je smjesa bakterijskih elija koje sadre transformante i one koje ne sadre vektorske molekule sa ciljanom DNK. Uspjenost izolacije eljenih transformanti (rekombinanti) iz itave populacije bakterija u velikoj mjeri zavisi od strategije kloniranja. Ovo poglavlje daje kratki, pregled osnovnih principa koritenih procedura selekcije i snimanja (skrininga) rekombinanti kategoriziranih kao: genetike, imunohemijske, south-vestern hibridizacija nukleinskih kiselina, metode rekombinacije.

Iz onog to slijedi moe se uoiti da je tehnika hibridizacije nukleinskih kiselina sa oznaenim probama (sondama) generalno najprimjenjiviji i najpraktiniji metod.

3


2. PROCEDURE SELEKCIJE I SKRININGA

2.1. Genetike metode Smaji Mediha Razvoj molekularne genetike i genetske tehnologije omoguio je izolaciju gena, njihovih dijelova koji se u obliku transkripta mRNA (cDNK) mogu klonirati u vektore i kao takvi prenijeti i ugraditi u genom drugih vrsta koje novonastale promjene prenose na svoje potomstvo. Time se otvorila mogunost manipuliranja genetskim informacijama, mada postoji jo niz problema u vezi vremenske usklaenosti i pozicioniranosti eljene insercije novih sekvenci gena, prijenosa transgena na potomstvo i drugo. 2.1.1. Selekcija na osnovu prisustva vektora Kombinovan sa mikrobiolokim metodama, ovaj metod je mono sredstvo u selekciji (izdvajanju) rekombinanti u velikim populacijama. Za ovu vrstu selekcije koriste se razliiti tipovi vektora, koji svi imaju sposobnost replikacije (umnoavanja) u bakterijskoj eliji. Klasini vektori su plazmidi (kruni, dvolanani molekuli DNK koji se nalaze van glavnog hromozoma bakterije i stabilno se nasledjuju), bakteriofagi (virusi koji obavljaju ivotni ciklus u bakteriji) i kozmidi (plazmidna DNK smetena u omota faga). Izbor vektora zavisi od vrste upotrebljenog restrikcionog enzima, veliine fragmenta i sl. Od navedenih vektora, najvei fragment moe da se klonira u kozmidu (veliine do 50kb kilo baza, tj. hiljada baznih parova). U novije vrijeme postoje vektori koji omoguavaju ugradnju i kloniranje znatno veih fragmenata DNK, od nekoliko stotina kb, i koji stoga imaju znaajnu ulogu u projektu sekvenciranja genoma oveka. Proces prijenosa genetskog materijala na vektor, kao to su plazmidi, u nove stanice domaina, zove se transformacija. Fenomen transformacije doputa plazmidim vektorima da budu uvededni i izraeni u stanicama E. coli. Da bi bilo koristan u DNA kloniranju, plazmidni vektor mora sadravati odabirni gen, najee gen otporan na lijekove koji kodira enzim koja iskljuuje odreene antibiotike. Npr gen otporan na ampicilin kodira -laktamaze, to iskljuuje antibiotik ampicilin. Nakon to se plazmidni vektori inkubiraju u E. coli, one stanice zalijepljene za plazmid se mogu lako odabrati iz veeg broja stanica koje to ne ine uzgajajui ih u mediju koja sadri ampicilin. Sposobnost da se odaberu transformisane stanice je kljuna za DNA kloniranje putem tehnologije plazmidnih vektora jer transformacije E. coli s izoliranim plazmidom DNA su 4


neuinkovite. Normalno je da stanice E. coli ne mogu uzeti plazmidne DNK iz medija. Izloenost stanica visokoj koncentraciji odreenih dvovalentnih kationa , ini mali dio stanica propustljivom za strani DNA. U tipinom postupku, E. coli stanice su tretirane CaCl2 i

pomijeane s plazmidnim vektorima, obino, samo 1 stanica u oko 10.000 ili vie elija postaje sposobna (kompetentna) za uzimaje stranih DNK. Svaka kompetentna stanica sadri jednu plazmidnu DNK molekulu, koja nosi gena otporan na antibiotik. Kada se tretirane stanice stave na-u Petrijevu zdjelicu hranjivih agara koji sadri antibiotik, samo rijetke transformirane stanice koje sadre gen otporan na antibiotik na plazmidnom vektoru e preivjeti. Svi plazmidi u takvoj koloniji odabranih transformiranih stanica potjeu od jednog plazmida kojeg je preuzela elije koja je osnovala koloniju. Ova tehnika zahtijeva da se stanice domaina izloe promjeni u okoline, to ih ini "kompetentnim" ili privremeno propustljivim za vektor. Vei DNK segmenati se lake

kloniraniraju koristei bakteriofag, retrovirus ili druge viralne vektore ili kozmide u metodi koja se zove pretvaranje. Kada je jedna molekula rekombinantne DNA , sastavljena od

vektora plus - umetnutog DNK fragmenta, uvedena u stanicu domaina, umetnuta DNK se reproducira zajedno s vektorom, proizvodei veliki broj molekula rekombinantne DNA koje ukljuuju fragmente DNK izvorno povezane s vektor. SveSlika 1: Opti postupak kloniranja DNK fragmenta u plazmid vektor

funkcionalne vektorske molekule nose neki selektivni marker iii svojstvo. Plazmidi i kozmidi (npr.), sade markere koji nose otpornost na lijekove ili specifina nutritivna svojstva. U sluaju faga, njihova osobina formiranja plaka sama je po sebi

selektivno svojstvo. Genetika selekcija na bazi prisustva vektora obavezan je korak u procesu izdvajanja rekombinantnih populacija. Na ovaj je nain mogue razlikovati rekombinovani molekul od nerekombinovanog, parentalnog vektora, te na tom principu izolovati rekombinantne

5


elije (organizme). Primjeri za ovaj tip selekcije su insercionalna inaktivacija markera za otpornost na antibiotik.

2.1.2. Selekcija na bazi umetnute sekvence Ako je dolo do ekspresije umetnutog gena u genom domaina, onda je genetika selekcija najjednostavniji metod za izolaciju klonova sa eljenom genskom sekvencom. Insercija fragmenata koji nose biosintetike gene u genom E. coli moe biti identificirana na osnovu kompenzacije ireverzibilnih auksotrofnih mutacija u elijskoj liniji domaina. Kao primjer navodi se selekcija rekombinanti sa miijom sekvencom (Chang et al., 1978). Naime, iRNK za miiji enzim dihidrofolat reduktaza (DHFR) biva znaajno tee inhibirana od strane trimetoprima. Tako rekombinante koje su sadrale klonirani miiji gen u podlozi sa trimetoprimom lako su mogle biti separirane od E. coli sa bakterijskim genom na osnovu rezistentnosti na inaktivirajui agens. Ovo je jedan od ranih primjera ekspresije sisarskih strukturnih gena u E. coli. Faktori koji utiu na ekspresiju heterologih gena su kompleksni, to treba imati u vidu kod izbora efikasnog selektivnog metoda, kako bismo zaista izolirali klonove sa miijom sekvencom od onih koji sadre neaktivni DHFR cDNK.

2.2. Imunohemijske metode Nii Marijana Imunohemijska detekcija klonova koji sintetiu strani protein je naroito eflkasna kod klonova sa aktivnim genom. Ovaj metod primjenjiv je kod detekcije gena koji ne doprinose nikakvoj selektivnoj osobini, ali, naravno, "prepoznaju" specifino antitijelo. U ranom periodu razvoja tehnologije rekombinantne DNK, razni laboratoriji su objavili dosta sline protokole za imunohemijsku detekciju, ali je najilustrativniji bio Broome & Gilbert metod. Ta se procedura bazirala na tri osnovna principa: imunoserum sa nekoliko IgG-tipova sa specifinim vezivanjem za antitijela, antitijela se snano veu za polivinil i ne mogu se skinuti klasinim ispiranjem, IgG se lako obiljevaju radioaktivnim jodom (125I) jodinacijom in vitro Danas je ovaj metod prevazidjen koritenjem metoda baziranih na formiranju plaka, a radioaktivno obiljeavanje antitijela je, supstituirano neradioaktivnim. Bitno je spomenuti jo neke karakteristike imunohemijske metode. Kao prvo, modifikacija proteina ne onemoguava kros-reakciju sa 6


ishodinim antitijelom. Naprimjer, mogue je koritenjem istog antitijela detektovati dvije alternativne forme istog proteina (npr., proinsulina pacova), koje se razlikuju u nekoliko aminokiselinskih jedinica. Drugo, tip detekcije na dva mjesta vrlo je primjenjiv kod detekcije novih, inenjerisanih formi proteina. U tom sluaju neophodno je hibridizirati novi protein-antitijelo koji e samo u sluaju rekombinantnog proteina rezultirati kros-reakcijom i pozitivnim nalazom. Imunohemijske tehnike koje se primjenjuju za otkrivanje, razlikovanje i mjerenje koncentracije razliitih antigena ( Ag ) i protutijela (At ) osnivaju se na reakciji izmeu antigena i protutijela. Zbog izuzetne specifinosti ove reakcije, imunohemijske tehnike se odlikuju: osjetljivou, reproducibilnou i jednostavnou. U veini imunohemijskih tehnika, koje se primjenjuju u klinikim laboratorijima, protutijela su radni reagens za kvalitativnu ili kvantitativnu analizu antigena u ispitivanom uzorku. S obzirom na nain otkrivanja reakcije izmeu antigena i protutijela, imunohemijske tehnike mogue je podijeliti u dvije skupine: Neobiljeene ili izravne tehnike, u kojima se mjerenja izvode u zoni ekvivalencije reaktanata kada dolazi do stvaranja netopivih imunoprecipitata. Njih moemo dalje podijeliti na: imunoelektroforeza protusmjerna imunoelektroforeza imunofiksacija imunoselekcija Kvantitativne: radijalna imunodifuzija imunoturbidimetrija imunonefelometrija Obiljeene tehnike, kod kojih se mjeri primarna reakcija izmeu Ag i At uz koritenje obiljeenih reaktanata. Pripadaju najvanijim analitikim tehnikama u klinikoj hemiji. Pronalazak ovih tehnika znaio je ogroman napredak u daljnjem prouavanju fiziologije i patologije ovjeka. Pridonio je znaajnom razvoju raznih grana medicine, a posebno endokrinologije. Ovim tehnikama omogueno je mjerenje tvari koje se u organizmu nalaze u vrlo malim koliinama (do 10-14 mol/L). One se takoer mogu podijeliti na: Kvalitativne: Kvantitativne: imunoblot radioimunoloke tehnike (RIA) enzimoimunohemijske tehnike, (ELISA) luminoimunohemijske tehnike (LIA) fluoroimunohemijske tehnike (FIA) Kvalitativne:

7


Vezanje antigena i protutijela dogaa se preko nespecifinih vodikovih, Coulombovih, hidrofobnih i Van der Waalsovih veza. Jakost tih veza vrlo je mala i postaje znatno vea tek nakon bliskog pristajanja antigena uz protutijelo. Jakost ili energija vezanja antigena i protutijela odreena je sa dva pojma: afinitet i avidnost. Afinitet oznaava jakost vezanja jednoga spojnog mjesta protutijela i jednog epitopa odnosno determinante antigena, dok avidnost oznaava jakost vezanja protutijelai cijele molekule antigena, odnosno zbroj afiniteta svih spojnih mjesta na protutijelu. Afinitet je stoga svojstvo antigena, a avidnost je svojsvo protutijela. Vezanje antigena i protutijela ravnotena je reakcija koja se zbiva u tri faze. U prvoj fazi ili primarnoj reakciji dolazi do vezanja vievalentnog antigena i dvovalentnog protutijela u kompleks antigenprotutijelo u razdoblju od nekoliko sekundi. Nakon nastanka primarnog kompleksa antigenprotutijelo slijedi rast kompleksa koji moe potrajati od nekoliko minuta do nekoliko dana. U treoj fazi, ovisno o relativnim koncentracijama antigena i protutijela, kompleksi se mogu krino povezivati pri emu nastanu veliki trodimenzionalni kompleksi koji precipitiraju iz otopine. Kad se uspostavi ravnoteno stanje izmeu svih nastalih kompleksa, prestaje njihov daljnji rast.

Slika 2: Vezivanje antigen - antitijelo

Brzina tih reakcija ovisna je o vrsti antigena i protutijela, afinitetu vezanja protutijela, kao i o koncentraciji elektrolita, pH i temperaturi. Razliiti linearni polimeri kao polietilenglikol, dekstran, preinaena celuloza, propilenglikol, polivinilni alkohol, imaju svojstvo da smanje topljivost bjelanevina, to se primjenjuje u nekim imunohemijskim tehnikama za poveanje precipitacije kompleksa antigen-protutijelo. 2.2.1. Neobiljeene kvalitativne imunohemijske tehnike Imunoelektroforeza je spoj zonske elektroforeze i reakcije izmeu antigena i protutijela i omoguuje razdvajanje razliitih antigena tj. proteina u jednoj biolokoj tekuini. Pomou

8


imunoelektroforeze mogu se pojedini proteini definirati prema njihovoj pokretljivosti u elektrinom polju kao i njihovoj specifinoj reakciji s homolognim protutijelima. Razliitim tehnikama bojenja mogu se razlikovati proteini, lipoproteini i glikoproteini, a specifinim reakcijama mogu se dokazati i enzimi. Imunoelektroforeza ima posebnu vanost u definiranju razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina kod monoklonskih gamapatija. Kako je monoklonski imunoglobulin proizvod jednoga klona plazma stanica, njegova osnovna karakteristika je hemijsko-fizika i imunoloka homogenost koja se na elferogramu vidi kao uska homogena proteinska vrpca, a na imunoelferogramu kao precipitacijska linija promijenjenog oblika, poloaja i intenziteta.

Slika 3: serum monospecifini antiserum i likvor polispecifini antiserum

Nakon elektroforetskog razdvajanja proteina u agar gelu, izvodi se imunohemijska reakcija precipitacije pojedinih proteina pomou monospecifinih ili polispecifinih antiseruma. Kako se ova metoda koristi prvenstveno za odreivanje razreda i tipa monoklonskih proteina , imunohemijska precipitacija izvodi se pomou specifinih antiseruma na teke lance imunoglobulina (G), (A), (M), vrlo rijetko (D) i (E), kao i na vezane i slobodne lake lance imunoglobulina kapa i lambda tipa. Protusmjerna imunoelektroforeza je vrlo slina dvostrukoj imunodifuziji, ali znatno bra jer pasivna difuzija je zamijenjena djelovanjem elektrinog polja. Ako se odaberu elektroforetski uvjeti pri kojima antigen ima pokretljivost prema anodi, a protutijelo prema katodi, pod uinkom elektrinog polja dolazi do njihova krianja u gelu agara. Kad su koncentracije antigena i protutijela optimalne, na mjestu susreta nastaje netopljiva precipitacijska linija koja vie ne putuje. Rabi se za razluivanje uzoraka po naelu ima-nema. Imunofiksacija je svakako tehnika izbora za odreivanje razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina. Izvodi se u gelu agaroze. Nakon elektroforetskog razdvajanja proteina u ispitivanom uzorku (serumu, mokrai, likvoru) u est jednakih, paralelnih kanala, izravno se 9


nanese u prvi (referentni) kanal otopina za fiksiranje proteina te redom na ostale kanale monospecifini antiserumi na teke lance (G), (A), (M) i vezane lagane lance kapa i lambda tipa. Monoklonske slobodne lagane lance imunoglobulina ( Bence Jones protein ) dokazujemo monospecifinim antiserumom na slobodne lagane lance kapa i lambda tipa. Ako je prisutan monoklonski imunoglobulin, nakon bojenja pojaviti e se uska homogena proteinska vrpca u kanalu razreda i tipa odreenog imunoglobulina (sl. 4.). Kod poliklonski sintetiziranih imunoglobulina nastat e iroke difuzne vrpce. Poloaj obojene i imunofiksirane proteinske vrpce usporeuje se s poloajem vrpce u referentnom kanalu.

Slika 4: Imunofiksacija

Imunofiksacijom nativnog uzorka likvora , bilo da se proteini u likvoru razdvoje elektroforetski na acetat celuloznom nosau ili izoelektrinim fokusiranjem na poliakrilamidnom gelu (PAG), dokazuju se oligoklonski imunoglobulini. Nalaz oligoklonskih imunoglobulina upuuje na sigurnu intratekalnu sintezu imunoglobulina odnosno ukazuje na lokaliziranu imunoloku reakciju unutar centralnog nervnog sistema. Nakon to se proteini, putujui u elektrinom polju uguste u uskom podruju svoje izoelektrine toke (pI), nanose se specifini antiserumi izravno na gel uz bojenje proteina ili srebrom ili Coomassie-Blue bojom. Imunoselekcija je imuno hemijska tehnika kojom se mogu dokazati monoklonski sintetitzirani teki lanci. U gelu agara, u koji su prethodno dodani antiserumi na vezane lake lance kapa i lambda tipa, elektroforetski se razdvoje proteini u serumu. Pri tom dolazi do vezanja kompletnih molekula imunoglobulina, dok eventualno prisutni slobodni teki lanci ostaju nevezani. U slijedeem koraku izvodi se imuno hemijska reakcija precipitacije slobodnih tekih lanaca sa specifinim antiserumom na (G), (A) ili (M) teke lance. Sve bolesti tekih lanaca povezane su s istodobnim postojanjem jedne od malignih limfoproliferativnih bolesti. To su najee maligni limfomi i kronina limfocitna neoplazma. 10


2.2.2. Neobiljeene kvantitativne imunohemijske tehnike Radijalna imunodifuzija osniva se na pasivnoj difuziji antigena u agarozni gel koji sadri jednolino rasporeena protutijela. Pri prvom dodiru s protutijelima, antigen je u velikom suviku pa nastaju kompleksi Ag-At. Daljnje difundiranje antigena uzrokuje pad koncentracije antigena, dok koncentracija raspoloivih protutijela raste. Kad se postigne optimalan koncentracijski odnos izmeu antigena i protutijela, nastaje netopljiv i nepokretan precipitacijski prsten koji se moe mjeriti. Povrina precipitacijskog prstena razmjerna je koncentraciji antigena. Usporeivanjem s povrinama precipitacijskih prstena poznatih koncentracija antigena moe se mjeriti nepoznata koncentracija antigena u ispitivanom uzorku. Ovom tehnikom odreuju se koncentracije imunoglobulina, lipoproteina, hemoglobina kao i mnogih drugih specifinih proteina. Imunoturbidimetrija i imunonefelometrija su imunohemijske tehnike koje se izvode u tekuem mediju. Prva reakcija izmeu antigena i protutijela bila je provedena u otopini. Dodatkom otopine protutijela u otopinu koja sadri antigen nastaje zamuenje zbog nastalih kompleksa Ag-At. Mjerenje reakcije izmeu antigena i protutijela, u zoni ekvivalencije kad je postignuta maksimalna koncentracija kompleksa Ag-At, naziva se metoda krajnje toke ( Endpoint method). Svaki uzorak antigena pomijea se sa stalnom koncentracijom protutijela u prisutnosti polietilenglikola 6000 koji pojaava reakciju vezanja, pomie toku ekvivalencije prema viim koncentracijama antigena i odrava homogenost kompleksa Ag-At koji lebde u otopini. Nakon inkubacije mjeri se kod imunoturbidimetrije apsorpcija svjetla ili kod imunonefelometrije rasap svjetla. Standardna krivulja apsorpcije ili rasapa svjetlosti dobije se mjerenjem poznatih koncentracija antigena. Kod ovih tehnika mjeriti se moe i brzina stvaranja kompleksa Ag-At, i to unutar prvih nekoliko minuta reakcije izmeu antigena i protutijela, jer se tada dobiju najvee promene intenzteta apsorpcije ili rasapa svjetlosti s obzirom na vrijeme ( Fixed-time method). Osjetljivost imunonefelometrije je neto vea od imunoturbidimetrije i iznosi 1-10 g/mL.

11


2.3. Diferencijalni screening Sabljica Lejla Ovaj vid hibridizacije nuklenskih kiselina izrazito je podesan za izolaciju tkivno specifinih ili induciranih (razvojno reguliranih) cDNK sekvenci. Jedan od najeklatantnijih primjera za upotrebu one metode je, svakako, Dworkin i Davida (1980), gdje su istraivane razvojno regulirane razlike u elijama blastule i jaja. Izolirana je ukupna iRNK iz tkiva blastule. Ovaj genetsiki materijal je, zatim, kloniran pomou plazmidnog vektora u genom domaina (E. Coli). Paralelno su napravljena tri identina otiska bakterijskih kolonija (svaka kolonija nosi specifian iRNK/cDNK insert) na nitroceluloznom filter-papiru (kontrolna i dvije eksperimentalne). Pritom su cDNK oznaene probe iz banke za blastule i jajne elije Xenopus hibridizirane odvojeno sa svakim od eksperimentalnih membrana. Rezultati su interpretirani na sljedei nain: o nema hibridizacije - koliina (prisustvo) iRNK u izoliranom preparatu je ispod detektabilnog nivoa; o pozitivni nalaz hibridizacije paralelno u oba otiska ukazuje na prisustvo odreenog klona u oba tkiva, tj. aktivnost gena izraena je u oba razvojna stupnja; o pozitivni nalaz uoen samo kod hibridizacije sa cDNK jajne elije ukazuje na prisustvo tkivnospecifine sekvence. Pozitivni nalaz samo kod hibridizacije sa blastularnom cDNK takoer ukazuje na prisustvo tkivnospecifine sekvence, odnosno na gensku aktivnost na ovom razvojnom stupnju. U slijedeem postupku je ovu sekvencu mogu izolirati (eluirati) i dodatno analizirati. Veliki je broj primjera diferencijalnog skrininga genske aktivnosti, bilo prostomo ili vremenski specifine, a navest emo jedan i iz biljnog svijeta. Poznato je da biljke imaju mehanizme za otpornost na stres koji se ukljuuju i iskljuuju u odnosu na prisustvo stresnog faktora vanjske sredine. Tako, naprimjer, u sluaju sue, aktiviraju se odreeni geni ija se aktivnost direktno oituje na nivou prisustva ili poveane koliine specifine iRNK. Izolacijom i tipizacijom ovih genetskih faktora moe se deduktivno zakljuiti o karakteru gena koji uestvuju u odbrambenoj funkciji biljnog organizma, a neaktivni su, recimo, u "normalnim" uvjetima ivotne sredine (diferencijalni skrining). Isto tako, napad lisnih vai moe dovesti do aktivacije nekih specifinih gena, koji su u istim uvjetima neaktivni u drugim tkivima, primjerice korijenu ili ksilemu (diferencijalni 12


skrining tkivnospecifine aktivacije). Metod diferencijalnog skrininga su uspjeno primijenili Williams i Lloyd (1979) kod plijesni-sluznjaa (Dictyostelium). Ovaj istraivaki dvojac je doao do istog zakljuka kao i Dworkin i David (1980) na abama Xenpus laevis ovaj metod je primjenjiv i za kvantitativnu analizu aktivnosti gena, gdje je mogue detektirati razliku u aktivnosti (nivou iRNK) do pet puta.

Slika 5: Diferencijani screening

13


2.4. Hibridizacija nukleinskih kiselina trbo Fatima Grunstein i Hogness (1975) su razvili metod za detekciju DNK sekvenci u koloniji transformanti uz primjenu hibridizacije in situ sa radioaktivno oznaenom RNK probom. Ovom procedurom se rapidno utvruje koja kolonija meu hiljadama drugih sadri ciljanu sekvencu. Modifikacijom prvobitnog protokola mogu je brz snimak gusto nasaenih kolonija. Razne varijacije ove metode mogu se primijeniti i na kolonije faga. Tako filter-papirom "pokupimo" fage i slobodnu (rekombinovanu) DNK, a zatim ga tretiramo i hibridiziramo probom po standardnoj proceduri kako bismo dobili DNK fingerprint. Benton i Davis (1977) razvili su daleko najprimjenjiviji metod skrininga genskih transformanata. Ogromna prednost ove metode jeste u tome da ne zahtijeva ekspresivnost ciljane sekvence i primjenjiva je na praktino svaku sekvencu za koju se posjeduje adekvatna proba. Ovdje je bitno spomenuti da je primjenjivost one metode uveana nakon otkria i primjene neradioaktivnog obiljeavanja proba. Koritenjem metode hibridizacije nukleinskih kiselina danas je mogue izolovati praktino bilo koji gen iz bilo kojeg biolokog uzorka ukoliko za to postoji odgovarajua proba. Proba je, ustvari, jednolanana DNK ili RNK koja je po sekvenci komplementarna ciljanom genu. Ona se, po principu komplementarnosti, vezuje za traeno mjesto i kao oznaena fiziki ukazuje na prisustvo i poziciju gena ili odreene DNK sekvence. Stoga, kao glavna prepreka izolaciji gena postaje sinteza adekvatne probe, a taj se problem prevazilazi na slijedei nain. U nekim specijaliziranim tipovima elija ili tkivima, iRNK nekog gena jeiroko zastupljena. U ovom sluaju, odgovarajui cDNK klonovi se lako pronalaze i samo mali broj kolonija treba pretrati (metode shotgun sekvenciranja). One cDNK sekvence se, dalje, mogu koristiti kao probe za izolaciju genomskih sekvenci. Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju izvjesne proteine ostale su konzervirane tokom evolucije tako da je mogua hibridizacija nukleinskih kiselina izmeu pripadnika razliitih vrsta. To je i komparativna prednost one metode u eksperimentalnom smislu jer poznavanje probe za gen jedne vrste moe biti koriteno za izolaciju odgovarajueg gena iz druge bioloke vrste. Oligonukleotid (proba) koji treba biti duine oko 15-20 nukleotida, a koji odgovara sekvenci koja inkodira traeni protein, moe biti sintetisan hemijskim putem. To znai dalje da, u ovom postupku, moramo poznavati strukturu odgovarajueg oligopeptida, tj. njegovu aminokiselinsku sekvencu. Genetiki komplement za taj protein se izvede na osnonu principa kodiranja pojedinanih 14


aminokiselina. Degenerativnost koda oteava postupak jer je poznato da jednu aminokiselinu moe kodirati nekoliko razliitih sekvenci. Tada su izuzetno korisni oligopeptidi sa triptofanom i metioninom jer su ovo jedine aminokiseline sa unikatnim kodonom, to znaajno smanjuje broj moguih varijanti - potencijalnih proba. Tako, npr., oligopeptid His - Phe - Pro - Phe - Met moe biti inkodiran na sljedei nain (32 mogue kombinacije): 5 ' Cat/cTTt/cCCc/t/c/gTTt/cATG5 3 ' Sinteza oligonukleotida moe biti programirana tako da rezultira smjesom svake od moguih varijanti. Tako se sintetie mijeana proba, koja se dalje pripremi, oznai i koristi. Postavlja se pitanje koja duina probe je neophodna za uspjenu hibridizaciju. Tako se preporuuju najkrae l4-merne, a optimalno 16- merne probe. Lathe et al. (1985), s druge strane, umjesto smjese kraih, zagovaraju upotrebu duih proba koje podi specifinosti hibridizacije. Za specijalizirani vid nukleokiselinske hibridizacije, tzv. Southern blot, dovoljne su i ll-nukleotidne sekvence. Southern Blot,ukljuuje rastvaranje DNK pomou restrikcijskih endonukleaza koji se zatim prenesu elektroforetski na agarozni gel. Ovaj postupak razdvaja DNK ili restrikcijske fragmente po veliini na nain da se manji fragmenti kreu bre u odnosu na vee. DNK fragmenti u gelu se denaturiraju s luinom i postaju jednolanani a trajna kopija ovog jednolananog ulomka dobije se prenoenjem na nitrocelulozni filtar (nosa) koji vee jednolananu DNK postupkom koji se naziva Southern blot. Ciljni DNK ulomak koji se nalazi na nosau vizualizira se dodavanjem jednolanane p32 radioaktivno oznaene DNK poetnice koja e hibridizirati sa odgovarajuim homolognim DNK fragmentom na Southern blotu to se onda vizualizira autoradiografijom. Primjer upotrebe Southern blota je dijagnostiko testiranje pacijenata sa krhkim X kromosomom. Northern blot koristi iRNK kao ciljnu nukleinsku kiselinu u istom postupku; iRNK je vrlo nestabilna zbog intrinzine celularne ribonukleaze. Upotrebom inhibitora ribonukleaze mogue je izolirati iRNK koja kada se pusti na elektroforezi moe se prenijeti na filter ili nosa reakcije. Hibridiziranjem nosaa sa radioaktivno obiljeenim DNK probama mogue je odrediti veliinu i koliinu iRNK prijepisa, to se naziva Northern blot.

15


2.5. Subtraktivno kloniranje i diferencijalni skrining Makan Nihad

Primjena one metode unapreuje uspjenost skrininga. Bazira se na izolaciji ukupne iRNK i formiranju cDNK banke. Ubikvitozne sekvence (svugdje prisutne i nespecifine) se zatim izoliraju, a potencijalno specifine se sekvenciraju i karakteriziraju. Tako su npr. Nedivi i sar. (1993) ispitivali gene za uenje i pamenje. Pacove su tretirali kainom, supstancom koja izaziva fizioloke efekte i sinaptiku aktivnost kao kod uenja i pamenja. Zatim su izolirali ukupnu iRNK iz mozga pacova i kreirali cDNK bazu. Izolirali su one sekvence koje se javljaju ubikvitozno, a od dalje analiziranih ispostavilo se da je 1/3 poznatih, a 2/3 potpuno novih genskih sekvenci.

2.5.1. HRT-hibrid-inducirana i HART-hibrid-zaustavljena translacija

Ovaj metod omoguava praenje povezanosti gena i genskog produkta. HRT je vrlo rairen, direktni metod u kojem se cDNK hibridizira na nitroceluloznom filter-papiru sa izoliranom iRNK ili ak totalnom RNK iz preparata. Hibridi se eluiraju sa membrane i uvedu u in vitro cell free translacijski mehanizam, to rezultira sintezom oznaenog proteina, koji se detektira na gelu. HART-hibridom zaustavljena translacija (Paterson et al., 1977) je metod koji se danas neo rjee koristi. Baziran je na pojavi da se kompletna ,smjesa nakon hibridizacije (hibridi i nehibridizirana cDNK i RNK) uvode u in vitro cell free translacijski sistem i da hibridizirane sekvence nee rezultirati sintezom peptida. Nakon denaturacije hibrida doi e do translacije.

16


2.6. Rekombinantna DNK Rami Emina Primjena tehnologije rekombinantne DNK i savremenih molekularnobiolokih metoda u medicinskoj genetici omoguila je nove prodore ne samo u oblasti istraivanja humanog genoma ve i u praktinoj dijagnostici i terapiji nasljednih i drugih oboljenja. Ove metode nalaze neposrednu primjenu u medicini prije svega u domenu monogenskih bolesti, gdje direktna ili indirektna detekcija genskih mutacija omoguava postavljanje dijagnoze i davanje preciznog genetikog savjeta obolelom. Molekularnogenetike metode podrazumijevaju rad sa nasljednim materijalom prije svega DNK, a po potrebi i RNK i proteinima. DNK koja se koristi u ovim postupcima moe se izolovati iz svake elije sa jedrom, a u medicinskoj praksi najee se dobija iz limfocita krvi. Izvor DNK moe da bude, po potrebi, korijen dlake, trag tjelesnih tenosti (kap krvi, sjemena tenost, pljuvaka) urin, likvor, isl. Izolovana ukupna genomska DNK moe da se uva u vidu vodenog rastvora

(-20 ili 700C) dugo vremena, i da se koristi za razliite analize. Primjera radi, iz 5ml krvi dobija se materijal za vie od sto pojedinanih analiza. Izolacija RNK je osetljiv postupak zbog velike mogunosti kontaminacije, a obavezno je uvanje materijala na 70C. Pojam rekombinantne ili rekombinovane DNK oznaava molekulu koja je nastala kombinovanjem dvije razliite molekule DNK. U tehnologiji rekombinantne DNK postoji pet bitnih faza rada: 1. stvaranje fragmenata DNK, sa ciljem da se u nekom od njih nae odreeni gen ili dio molekule DNK. 2. 3. 4. ugraivanje fragmenata DNK u pogodan vektor, to je u stvari rekombinantni dio procesa. uvoenje vektora u pogodnog domaina (najee Escherichia coli). kultivisanje kompleksa domain-vektor na hranljivim podlogama radi dobijanja klonova domaina, tj. dobijanja brojnih kopija fragmenta DNK ugraenog u vektor. 5. ubiranje klonova koji sadre odreeni fragment DNK.

17


Shema 1: Rekombinantna DNK

Do fragmenta DNK se moe doi i mehanikim sjeckanjem, ali je ovo nasumino pa su dobijeni fragmenti uvjek nedefinisani. Ranih sedamdesetih godina je postignut ogroman napredak otkriem da izvesni enzimi, poreklom od odreenih bakterijskih sojeva, presjecaju DNK na specifinim mjestima nukleotidnih nizova. Ovi enzimi su nazvani restrikcioni enzimi, a njihova uloga u bakterijskoj eliji je da isijecaju stranu DNK iz genoma bakterije (npr. fag), dok je bakterijska DNK zatiena od restrikcije. Restrikcione endonukleaze prepoznaju specifine, sekvence od 4-8 nukleotida i sjeku DNK na tano odreenom mjestu u okviru tih nizova. Mjesta presjeka se zovu restrikciona mjesta. Zahvaljujui komplementarnom karakteru baznog sparivanja u molekulu DNK, restrikcione endonukleaze dovode uvijek do prekida oba lanca DNK. Svaka restrikciona endonukleaza oznaava se prema mikroorganizmu iz koga potie, a postoji preko 300 vrsta ovih enzima. Kada se molekul DNK isjee pomou odreene restrikcione endonukelaze dobijeni fragmenti imaju jednolanane krajeve, koji su lepljivi. Na DNK vektora se takoe djeluje istim restrikcionim enzimom, a zatim se pomou enzima ligaze spajaju komplementarni krajevi fragmenta i DNK vektora. Tako dobijeni molekul DNK se naziva rekombinovana ili hibridna molekula. U pomenute svrhe koriste se razliiti tipovi vektora, koji svi imaju sposobnos replikacije (umnoavanja) u bakterijskoj eliji. Klasini vektori su plazmidi (kruni, dvolanani molekuli DNK koji se nalaze van glavnog hromozoma bakterije i stabilno se nasledjuju), bakteriofagi (virusi koji obavljaju ivotni ciklus u bakteriji) i kozmidi (plazmidna DNK smetena u omota faga). Izbor vektora zavisi od vrste upotrebljenog restrikcionog enzima, veliine fragmenta isl. Od navedenih 18


vektora, najvei fragment moe da se klonira u kozmidu (veliine do 50kb kilo baza, tj. hiljada baznih parova). U novije vrijeme postoje vektori koji omoguavaju ugradnju i kloniranje znatno veih fragmenata DNK, od nekoliko stotina kb, i koji stoga imaju znaajnu ulogu u projektu sekvenciranja genoma oveka. To su npr. YAC (yeast arteficial chromosome) ili BAC (bacterial arteficial chromosome). Vektori se unose u eliju domaina, a to je najee Escherichia coli, na vie naina: 1.transformacijom, 2. transfekcijom, 3. mikroinjiciranjem

Kompleks domain-vektor se umnoava kultivacijom in vitro, u cilju dobijanja klonova koji sadre odredjene fragmente ispitivane DNK. Za odabiranje klonova sa rekombinovanim fragmentom DNK se koristi itav niz postupaka. To moe da bude selekcija na osnovu promenjenih svojstava rekombinovane bakterije, ili hibridizacija otisaka bakterijskih kolonija sa obiljeenim DNK probama.

Jedna od metoda molekularne genetike, koja se primjenjuju i u medicinskoj genetici je Southern analiza tj. test hibridizacije. Southern analiza (Southern blotting, test hibridizacije) se zasniva na testu hibridizacije ispitivane DNK sa obiljeenom genskom probom (Southern, 1979.). Prvi korak u ovoj metodi je isjecanje genomske DNK na fragmente, koritenjem restrikcionih enzima koji prepoznaju specifine nukleotidne nizove. Dobijeni restrikcioni fragmenti DNK se u postupku gel-elektroforeze meusobno razdvajaju, jer se u elektrinom polju DNK kree ka pozitivnom polu, pri emu se krai fragmenti kreu bre a dui sporije djelovanjem alkalnih rastvora. Slijedi postupak denaturacije tj. razdvajanja dvolananih molekula DNK na jednolanane strukture, i blotting tj. prenoenje fragmenata DNK sa gela na specijalne nitrocelulozne filtere ili najlonske membrane. Ovako pripremljena DNK se inkubira sa denaturisanom i radioaktivno obeleenom genskom probom, pod tano definisanim uslovima (temperatura, pH). Genska proba je deo molekula DNK koji se koristi u testu hibridizacije. Izvor genske probe moe da bude biblioteka kloniranih segmenata DNK. Takodje, genska proba moe da bude tzv. cDNK ili komplementarna DNK, koja se dobija na osnovu molekula RNK, pomou enzima reverzna transkriptaza. U samom inu hibridizacije genska proba prepoznaje sebi komplementaran segment DNK i sa njim 19


ponovo formira dvolananu strukturu. Southern analiza je jedna od klasinih metoda molekularne genetike, medjutim ona pokazuje izvesne nedostatke. Osnovna ogranienja su duina postupka, koji traje nekoliko dana, i rad sa radioaktivnim obiljeivaima. Analogno Southern analizi na principima elektroforeze i blotting-a razvijene su tehnike Northern blotting (DNK proba hibridizuje sa ispitivanim uzorcima RNK) i Western blotting (analiza proteina, pri emu se obiljeeno specifino antitijelo spaja sa odgovarajuim proteinom). Najjednostavniji test hibridizacije se vri pri dot-blot analizi (ukupna genomska DNK iz uzorka se ne isjeca, ve samo denaturie i inubira sa DNK probom rezultat se oitava u vidu take veeg ili manjeg intenziteta, odakle i potie naziv.

20


2.7. PCR Polymerase Chain Reaction lanana reakcija polimerazom Zahirovi Adnan 2.7.1. Osnovne naznake i historijat Lanana reakcija sa polimerazom, polimerazna lanana reakcija, lanana sinteza polimerazom samo su neki od naina da se prevede izvorni naziv tehnike koja je doslovno izazvala revoluciju u oblasti molekularne genetike i biologije uope. Jednostavno i sutinski reeno PCR je metoda kojom se relativno kratki dio DNK umnoava u veliki broj identinih kopija, bez koritenja ivog organizma.Sve je poelo 1983. kada je Kary Mullis je pronaao PCR metodu kojom se DNK umnoava bezkloniranja i to iz marginalno male koliine DNK. Za to otkrie je 1993. godine dobio Nobelovu nagradu za kemiju. Cilj je umnoiti prisutnu dvonizu DNK - templatu (matrica ili mustra) koja je prisutna u veoma maloj koliini. Pritom se moe raditi samo o jednom genu iliSlika 7: Kary Mullis, razvio PCR

pak o jednom dijelu gena ili pak jedan nekodirani dio DNK sekvence. Upravo to je uspjelo Mullis-u i saradnicima

sa Odjela za humanu genetiku Korporae Cetus te su u asopisu Science 1985. godine objavili su rad u kojem prvi put opisuju tehniku specifinog umnoavanja fragmenta DNK in vitro

kataliziranog enzimom DNK polimeraza porijeklom iz Escherichia coli. U istom asopisu 1988, godine isti tim naunika publicira rad u kome umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNK polimerazu / izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq). Unato

brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa Ianane sinteze polimerazom, osnovne odrednice one tehnike utemeljene 1985. godine i 1988. godine nisu se

znaajnije izmijenile. 2.7.2. Osnova PCR metode Princip PCR metode je vrlo jednostavan. To je postupak sinteze DNK tokom vie puta ponavljanih ciklusa udupljavanja tako stalno uveavanog broja raspoloivih DNK, a sve uz pomo enzima po imenu DNK polimeraza. To znai da e oba jednolanana komplementarna 21


niza koji ine DNK dupli helix u odreenoj poziciji istovremeno poeti da sintetiziraju novi komplementarni niz. Za efikasnu primjenu metode vano je dijelove sekvenci DNK poznavati. Polimeraze lanana reakcija odvija se u termocikleru. Taj ureaj zagrijava i hladi reakcione posudice koje se nalaze u njemu i to vrlo preciznim temperaturama i duinama programiranih ciklusa. Da bi se sprijeiloSlika 8: Termocikler

isparavanje sve e biti hermetiki upakovano ili e reakcioni materijal biti prekriven slojem ulja. Da bi se izbjeglo gubljenje

minimalne koliine reakcionog materijala kondenzacijom na poklopcu, isti e biti zagrijavan na neto preko 100C. 2.7.3. Hipoteze molekularne biologije i PCR metode Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su slijedee: U nativnom stanju DNK je dvostruki heliks koji se sastoji od dva antiparalelna polinukleotidna lanca meusobno povezana vodikovim vezama; nukleotidi jednog polinukleotidnog lanca su meusobno povezani kovalentnom

vezom izmeu dezoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne grupe susjednog nukleotida, a vodikove veze koje odavaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvijek se formiraju izmeu komplementarnih baza, tj. adenin (A) se uvijek vea timin (T), a citozin (C) za guanin (G); Vodikove veze su energetski slabe i lako se remete zagrijavanjem (denaturacija), dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se odravaju, a hlaenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodikovih veza izmeu komplementamih baza

(renaturacija); DNK replikaciju in vivo inicira RNK Pol I sintetizirajui kratke RNK sekvence, time kreirajui supstrat za DNK Pol I (slobodnu -OH-grupu dezoksiriboze na 3'-kraju), a na optimalnoj temperaturi, DNK Pol I katalizira ugradnju slobodnih

dezoksiribonukleotid-3-fosfata na postojei oligonukleotidni lanac sa slobodnom -OHgrupom na 3'-Iaju, kada je isti vodikovim vezama povezan za matricu. 22


Poavi od ovih premisa, Mullis (1993) je pretpostavio da moe postii umnoavanje specifnog dijela DNK molekule koji lei izmedu dva regiona ija je sekvenca poznata. Selekcija specifiog dijela DNK molekule postie se primjenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNK sekvenci (20-30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane sekvence. U tipinoj PCR reakciji uestvuju dva prajmera sintetizirana u 5'3'-pravcu, tako da se na njihovom 3'-kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom -OH-grupom i obino se obiljeavaju sa F (foward) i R (reverse). Na temperaturi od 95 C pucaju vodikove veze koje odvaju dvolananu strukturu molekule iji se dio umnoava (template DNA -matrica) te se ona denaturie. Sputanjem

temperature stvaraju se uvjeti za renaturaciju, ali i za formiranje hibridnih molekula matrica-

prajmer. DNK PoI 1 pronalazi takve hibride i pod uvjetima fosfatne

odgovarajuim katalizira grupe fosfata vezivanje

dezoksinukleotid-3za 3'-OH-grupu

dezoksiriboze prajmera prema konstanti RezultatSlika 9: Model DNK molekule

komplementarnosti. je sintetiziran lanac matrici koji

naspramni komplementaran

moe posluiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlaenjem i sinteze naspramnog lanca moe se ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Takoer, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifino umnoavanog dijela DNK. Teorijski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela DNK molekule izmeu prajmerskih sekvenci, iznosi 2 n-2n (n = broj ciklusa) za svaku molekulu DNK matrice. Takoer teorijski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, moe dobiti 230-2*30 = 1,073.741.764 ciljanih 23


fragmenata. Ponavljanje ciklusa moe biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid-3-fosfata ill enzima). Ovisno od svrhe reakcije, veliine umnoavanog dijela DNK i eljene koncentracije, tipina PCR reakcija se odvija u 30-40 ciklusa. 2.7.4. Postupak PCR metode Za jedan eksperiment PCR metodom potrebno je imati kalupnu DNK, termostabilnu DNK polimerazu, dvije odgovarajue oligonukleotidne poetnice, pufer karakteristian za datu polimerazu i nukleotide: adenozin-, gvanozin-, citidin- i timidin-trifosfat. Injektiranjem ciljane DNK sekvence u sudove za PCR postupak (epindorfice) poinju procesi na umnoavanju eljene DNK sekvence in vitro. Faze koje se poinju deavati u termocikleru su sljedee: 1. Poetna denaturacija traje 5 minuta i odvija se pri temperaturi od najee 94C. Pritom se razdvajaju lanci dvostruke zavojnice kalupne molekule DNA - dolazi do denaturacije molekule DNA. Temperatura e zatim biti sniena na 55C da bi se omoguilo hibridiziranje - prijanjanje (annealing) oligonukleotidnih poetnica (primera) na denaturiranu DNA (jednonize). Potom e temperatura biti poviena na 72C. To je optimalna temperatura za Taq-polimeraze, stoga e se njome potai rad polimeraze, odnosno produljivanje lanaca od poetnica u smjeru 5'-3' sve dok se ne izgradi nova dvolanana molekula DNA koja je potpuno identina poetnoj molekuli DNA. Poto se izgradnja molekula dogaa na oba lanca poetne molekule DNA, tim e procesom dakle nastati dvije dvolanane molekule DNA broj e se udvostruiti. Postupak moemo u cijelosti u cilju umnoavanja poetne DNK, stalno ponavljati. Broj novonastalih DNK e se uveavati geometrijskim redom ( 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64,...). 2. Trideset ciklusa koji slijede se deava i to svaki:

Proces denaturacija (denaturation) prijanjanje (annealing) produivanje (elongation)

Temperatura [C] 94 55 72

Trajanje [s] 30 30 90

3. Na kraju ide zavrno produivanje lanaca u trajanju od 5 min pri temperaturi od 72C 4. Reakcija e konano biti ohlaena na 4C 24


2.7.5. Labolaratorijski uslovi PCR-a Denaturiranje. S jedne strane denaturiranje je jedan vrlo brz proces koji poinje ve na temperaturi od 70C. S druge strane sve komponente trpe zbog poveane temperature: Polimeraze bivaju denaturirane, nukleotidi se raspadaju, a DNK matrica kao i primer bivaju depurinirani. Dovoljno argumenata da se postupak denaturacije deava onoliko kratko koliko je to za postupak neophodno. Ustvari dovoljno je i vrijeme od 5 sekundi da se dva polinukleotidna lanca (niza) DNK duplog helixa razdvoje. Problem je jo uvijek tehnike prirode da se postiu precizno odgovarajue temperature u tubi PCR aparata. Annelling temperatura. Ona se rauna prema primeru koji emo upotrebljavati. Ima vie programa koji ne izraunavaju samo teoretsku temperaturu stapanja primera, nego i potencijalne sekundarne strukture. Za izraunavanje temperature stapanja primera postoje razliite formule. Evo jednog primjera koji se bazira na sadraju primera GC: Tm = 4*broj G + 2*broj A Ova formula je istini za volju primjenljiva samo zaShema 2: Prikaz PCR postupka

primere duine do 30 baza. Jedna prilino bolja ali i za upotrebu komplikovanija formula je od Baldina. Ona je

razvijena za izraunavanje temperature stapanja oligonukleotida pod uvjetima in-situ hibridiziranja. 'Tm = 81,5 + 16,6*(log10[ J+]) + 0,41*(%G+C) (875/n) 1,0*(%greka) 0,63* %FA J = koncentracija jednovalentnih kationa u mol/l, %G+C = udio baza guanin i citozin u procentima, 25


n = broj baza u oligonukleotidu, (%greka) = broj pogreno uparenih baza u procentima, (%FA) = Udio formamida u puferu u procentima. Ovaj dio formule otpada kod klasinog PCR-a. Gore spomenuta formula vai za kationu koncentraciju do 0,5 M, zatim GC izmeu 30 i 70% i duinu oligonukleotida do 100 baza. Nedostatak ove formule je u tome da nije pogodna za koritenje kod oligonukleotida koji imaju manje od 30 baza. Vrijeme elongacije mora biti podeeno duini produkta koji planiramo dobit. Ako je ono suvie kratko, polimeraze nee stii da zavre posao. Ako je suvie dugo, ostaje onda previe vremena polimerazama da da provode i pogrene sinteze. Kada se Taq polimeraza primjenjuje , biti e odvojeno 2 minute po 1 kb. Prelijevanje uljem. Kod klasinih PCR automata potrebno je reakcioni materijal preliti sa neto mineralnog ili parafinskog ulja da bi se sprijeilo isparavanje materijala u reakcionoj posudici. (tenost se inae kondenzira na poklopcu). Novi PCR automati zato imaju i grija poklopca koji zagrijava poklopac do iznad 100C,te se tako sprjeava kondenzacija. Time emo parati upotrebu ulja. Ipak oprez! Kondenzacione kapljice se ipak stvaraju. Sada na ivici tube izmeu grijaa i grijueg poklopca. Dok ovo nema bitnijeg utjecaja na vee volumine, dotle e kod manjih volumina (

Documents

Selekcija i Screening i PCR