UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO - MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Sanja Ničić

Uticaj etarskog ulja ruzmarina (Rosmarinus officinalis L.) na rast Salmonella enterica subsp.

enteritidis u mesu

MASTER RAD

Niš, 2015

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO - MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj etarskog ulja ruzmarina (Rosmarinus officinalis L.) na rast Salmonella enterica subsp.

enteritidis u mesu

MASTER RAD Kandidat: Mentor: Sanja Ničić dr Zorica Stojanović-Radić Broj indeksa: 120

Niš, 2015

UNIVERSITY OF NIŠFACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Effect of rosemary essential oil (Rosmarinus officinalis

L.) to the growth of Salmonella enterica subsp. enteritidis

in meat

Master thesis

Candidate: Mentor: Sanja Ničić 120 PhD Zorica Stojanović-Radić

Niš, 2015

ZAHVALNICA

Najiskrenije se zahvaljujem svojoj mentorki dr Zorici Stojanović‐Radić na 

ukazanom poverenju, ogromnoj i nesebičnoj pomoći tokom izrade ovog 

master rada.

Beskrajnu zahvalnost dugujem svojim roditeljima, na 

neizmernoj ljubavi, moralnoj podršci i razumevanju tokom 

studiranja. 

BIOGRAFIJA

Sanja Ničić, rođena je 13.5.1990. godine u Vranju. Osnovnu školu

˝Branko Radičević˝ u Bujanovcu završava 2005. godine. Iste godine

upisuje Gimnaziju ˝Bora Stanković˝ u Vranju, društveno-jezički smer

koju završava 2009. Prirodno matematički fakultet Univerziteta u Nišu

upisala je 2009/2010. godine, na Departmanu za biologiju i ekologiju.

2013. godine završava osnovne akademske studije sa zvanjem “biolog” i

upisuje master akademske studije, smer biologija, na istom fakultetu.

Sažetak

Ruzmarin (Rosmarinus officinalis L.) predstavlja biljnu vrstu iz familije usnatica

odnosno Lamiaceae. To je zimzeleni aromatični žbun, visine do 2 m, jakog i prijatnog

mirisa.Niz aktivnih supstanci koje su prisutne u ruzmarinu čine ga jako korisnim u

prehrambenoj i farmaceutskoj industriji. Etarska ulja i ekstrakti dobijeni iz ruzmarina

karakterišu se visokom antimikrobnom aktivnošću.

Iako je industrija mesa ostvarila veliki napredak na polju higijene i kontrole mesa,

Salmonella spp. i dalje predstavljaju najčešće patogene koje se prenose hranom. U

brojnim ogledima ispitano je antimikrobno dejstvo etarskog ulja ruzmarina (Rosmarinus

officinalis), ali nema istraživanja na temu njegovog konzervirajućeg efekta nakon

dodavanja u razne vrste hrane. Zbog toga je cilj ovog master rada bio ispitivanje

njegovog dejstva na rast Salmonella enterica subsp. enteritidis u pilećem mesu kao

modelu hrane. Nakon destilacije etarskog ulja iz osušenog biljnog materijala, određene su

njegova minimalna inhibitorna (MIK) i minimalna baktericidna koncentracija (MBK) u

odnosu na referentni soj Salmonella enterica subsp. enteritidis (ATCC 13076).

Eksperiment na mesu kao modelu hrane je rađen sa etarskim uljem u koncentracijama

MIK (5 mg/ml) i 4 x MIK (20 mg/ml). Meso inokulisano bakterijom i sa različitom

količinom dodatog etarskog ulja inkubirano je na sobnoj temperaturi tokom četiri

različitih vremenskih perioda inkubacije. Nakon ukupnog perioda inkubacije od 72 časa,

izvršeno je vijabilno brojanje preživelih ćelija u tretiranom mesu. Rezultati su pokazali da

se etarsko ulje ruzmarina ne može koristiti kao dodatak mesu u cilju prevencije njegovog

kvarenja, jer ne vrši značajnu inhibiciju razmnožavanja ćelija salmonele.

Ključne reči: etarsko ulje, ruzmarin (Rosmarinus officinalis L.), antimikrobna

aktivnost, Salmonella, pileće meso

Abstract

Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) is a plant species of the family Lamiaceae.

It is an aromatic evergreen shrub, up to 2 m, with strong camphor like odor. A number of

active substances that are present in rosemary make it very useful in the food and

pharmaceutical industries. Essential oils and extracts obtained from rosemary are

characterized by high antimicrobial activity.

Although the meat industry has made great progress in the field of hygiene and

the control of meat, Salmonella spp. continues to represent the most common pathogens

that are transmitted by food. In a number of experiments, antimicrobial activity of

essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis) was tested, but there are anystudies on

the subject of its preservative effect when addedinto various types of food. Therefore, the

goal of thismaster thesis was to investigateits effect to the growth of Salmonella enterica

subsp. enteritidis in chicken meat as a foodmodel. After distillation of the essential oil

from the dried plant material,minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimum

bactericidal concentration (MBC) were determined against the reference strain of

Salmonella enterica subsp. enteritidis (ATCC 13076). The experiment on the meat as a

food model was doneatMIK (5 mg/ml) and 4 x MIC (20 mg/ml) concentractions of

essential oil. The meat samples were inoculated with bacteria and different amounts of

added essential oil and incubated at room temperature for four different periods of

incubation. After a total incubation period of 72 hours,a viable count of surviving cells in

the treated meat was carried out. The results pointed to the fact that the essential oil of

rosemary can not be used as a preservative agent in meat, because its inhibition of

salmonella cell growth is not significant.

Keywords: essential oil, rosemary (Rosmarinus officinalis L.), antimicrobial

activity, Salmonella, chicken meat.

Sadržaj

1.  UVOD .......................................................................................................................... 1 

1.1. Etarska ulja ............................................................................................................... 2 

1.2. Opšte karakteristike roda Rosmarinus ...................................................................... 4 

1.2.1. Sastav i antimikrobna aktivnost sekundarnih metabolita ruzmarina ................. 6 

1.3. Istorijat, morfologija, klasifikacija i taksonomija roda Salmonella ......................... 9 

1.3.1. Morfološke, kulturelne i biohemijske karakteristike salmonela ..................... 10 

1.3.2. Toksini i patogenost salmonele ....................................................................... 12 

1.3.3. Pregled istraživanja efikasnosti etarskih ulja na rast salmonele u različitim

modelima hrane ......................................................................................................... 14 

1.4. Ciljevi istraživanja .................................................................................................. 16 

2. MATERIJAL I METODE ............................................................................................. 17 

2.1. Rastvori i podloge ................................................................................................... 17 

2.2. Bakterijski sojevi .................................................................................................... 18 

2.3. Izolacija etarskog ulja ruzmarina ............................................................................ 19 

2.3.1. Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja ruzmarina ........................ 20 

2.3.2. Određivanje efekta etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji na

rast i razmnožavanje vrste Salmonela enterica subsp. enteritidis na modelu hrane . 22 

2.4. Statistička analiza dobijenih rezultata .................................................................... 23 

3.REZULTATI I DISKUSIJA ........................................................................................... 24 

3.1. Prinos etarskog ulja ruzmarina ............................................................................... 24 

3.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Rosmarinus officinalis ............ 24 

3.3. Efekat etarskog ulja ruzmarina na rast Salmonella enterica subsp. enteritidis u

modelu hrane ................................................................................................................. 26 

4. ZAKLJUČAK ................................................................................................................ 29 

5. LITERATURA: ............................................................................................................. 30 

1

1. Uvod

Upotreba biljaka kao začina stara je koliko i čovečanstvo, a njihovo viševekovno

korišćenje kao dodataka hrani i piću potvrđuje njihovo blagotvorno dejstvo (Elgayyar et

al., 2001). Još u preantičkom i antičkom periodu, primećeno je da dodavanje određenih

biljaka hrani, pored toga što poboljšava njen ukus i miris, sprečava njeno kvarenje i

produžava joj rok trajanja. Kasnije, sa istraživanjem začinskih biljaka došlo se do

saznanja da one poseduju razne supstance koje imaju antimikrobno, antifungalno i

antioksidativno dejstvo (Bubonja-Šonje et al., 2011). Jedna od najznačajnijih komponenti

začinskih biljaka jesu etarska ulja. Etarska ulja predstavljaju smeše mirišljavih, lako

isparljivih jedinjenja koja nastaju u sekretornim delovima biljaka koji se mogu naći u

cvetovima, stablu, listovima i drugim delovima biljke. Mogu se izolovati iz različitih

delova biljke, zbog čega njihov hemijski sastav, a samim tim i biološka aktivnost

značajno variraju.

Aromatične biljke i njihovi sekundarni metaboliti predstavljaju potencijalne

prirodne konzervanse hrane, čija bi uloga bila u produženju održivosti namirnica,

smanjenju broja ili potpunom eliminisanju bakterija i povećanju kvaliteta proizvoda

(Tajkarimi et al., 2010). Za razliku od sintetičkih konzervanasa, začini su neškodljivi po

zdravlje konzumenata hranetretirane na ovaj način. Jedna od ovih biljaka je i ruzmarin,

koja se u obradi hrane koristi kao začin i pojačivač arome salata i raznih vrsta pečenog

mesa, najčešće piletine i jagnjetine (Klaus et al., 2009).

Većina dosadašnjih istraživanja koja su se odnosila na aktivnost etarskog ulja

ruzmarina bazirana su pre svega na proučavanju sastojaka koji imaju antioksidativna

svojstva, radi mogućnosti upotrebe u prehrambenoj industriji, sa ciljem održavanja boje i

svežine mesa. U ovom master radu, cilj istraživanja bio je ispitivanje antimikrobnog

2

potencijala etarskog ulja ruzmarina na pilećem mesu kao modelu hrane koji, za razliku od

klasičnih mikrobioloških podloga, pruža uvid u efikasnost ovog ulja u realnim uslovima.

1.1. Etarska ulja

Termin etarsko ulje potiče još iz 16. veka i to od strane reformiste Švajcarske

medicine, Paracelsus von Hohenheim-a. Kao metod za proizvodnju etarskog ulja

destilacija je prvi put upotrebljena na Istoku (Egipat, Indija i Persija) pre više od 2000

godina (Guenther, 1948),a metodologija je usavršena od strane Arapa u 9. veku (Bauer et

al., 2001). Farmakološki efekti etarskih ulja su opisani i u farmakopejama (Bauer et al.,

2001), ali njihova upotreba nije bila rasprostranjena u Evropi sve do 16. veka

(Crosthwaite, 1998). Međutim, u početku su široko upotrebljavanisamo terpentin, kleka,

ruzmarin, lavanda, karanfilić, muskatni oraščić, anis i cimet. Već u 17. veku, apoteke su

bile opremljene sa 15-20 različitih vrsta etarskog ulja (Guenther, 1948).

Do sada je poznato oko 3000 vrsta etarskih ulja, od kojih su 300 komercijalno

značajna (Van de Braak and Leijten, 1999). Od davnina je poznato da etarska ulja imaju

antimikrobna svojstva (Guenther, 1948; Boyle, 1955), a kao začini se koriste zbog

njihovog mirisa, ukusa i konzervirajućih svojstava (Bauer et al., 2001). Aktivne

komponente etarskih ulja se na osnovu hemijske strukture mogu podeliti na terpene,

terpenoide, fenilpropene i „ostale“. Terpeni se sintetišu u citoplazmi iz acetil-Co A.

Glavne klase terpena čine monoterpeni i seskviterpeni, a u manjim koncentracijama, u

biljnim produktima često se nalaze i hemiterpeni, diterpeni, tripenteni i dr. Terpenoidi su

terpeni koji su podlegli enzimskim modifikacijama i sadrže kiseonik. Ova jedinjenja

mogu imati alkoholne, estarske, aldehidne, ketonske, etarske, fenolne i epoksidne

funkcionalne grupe. Za razliku od terpena, ova jedinjenja često poseduju veoma jaka

antibakterijska svojstva. Antimikrobna aktivnost terpenoida pripisuje se njihovoj

funkcionalnoj grupi ili fenolnoj strukturi (Bošković i sar., 2013).

3

Generalno, etarska ulja poseduju značajna antibakterijska svojstva, jer sadrže

visok procenat fenolnih jedinjenja kao što su karvakrol, eugenol i timol. Hemijska

struktura utiče na antibakterijsku aktivnost, a važnost prisustva određene funkcionalne

grupe je veoma velika, što je potvrđeno za hidroksilnu grupu u karvakrolu i timolu (Burt,

2007). Međutim, u jednom istraživanju je pronađeno da karvakrol i timol različito deluju

protiv Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija. Utvrđeno je da se dodavanjem

acetata na jedinjenje geraniol dobija geranil-acetat, koji ima veću antibakterijsku

aktivnost i protiv Gram pozitivnih i Gram negativnih bakterija od geraniola (Burt, 2007).

U velikom broju radova ispitana su antimikrobna, ali i antioksidativna

svojstvavećine poznatih etarskih ulja (Azzouz and Bullerman, 1982; Akgul and Kivanç,

1988; Burt, 2004; Tajkarimi et al., 2010). Etarska ulja pokazuju i antivirusno (Bishop,

1995), antiparazitsko (Pandey et al., 2000; Pessoa et al., 2002) i insekticidno svojstvo

(Konstantopoulou et al., 1992). Antimikrobna, ali i druge biološke aktivnosti su zapravo

posledica specifičnog hemijskog sastava etarskih ulja, tj. funkcije aktivnih jedinjenja u

njihovom sastavu (Guenther, 1948; Mahmoud and Croteau, 2002). Iako su antimikrobna

svojstva i komponente etarskih ulja u velikoj meri ispitani, mehanizam njihovog dejstva

još uvek nije detaljno poznat. Postoji nekoliko mesta u i na bakterijskoj ćeliji na koja

deluju etarska ulja, a zbog često jako velikog broja različitih hemijskih jedinjenja u

sastavu etarskog ulja, njihova antibakterijska aktivnost se ne može pripisati samo jednom

mehanizmu. Važna karakteristika etarskih ulja i njihovih komponenti je njihova

hidrofobnost, što im omogućava da se rastvore u lipidima bakterijske ćelijske membrane,

narušavajući njenu strukturu i čineći je neselektivno propustljivom. Povećana

propustljivost membrane vodi ka narušavanju membranskog potencijala i do određene

mere, ćelija je sposobna da zadrži vijabilnost, ali ako se membrana ne oporavi (ne povrati

svoju selektivnost), nastupiće smrt ćelije.

4

1.2. Opšte karakteristike roda Rosmarinus

Lekovite, aromatične i začinske biljke iz familije Lamiaceae (žalfija - Salvia

officinalis, ruzmarin - Rosmarinus officinalis i majčina dušica - Tymus vulgaris) su široko

rasprostranjene u Srbiji kao samonikle, ali i kao kultivisane vrste. Ove biljke se u

tradicionalnoj i zvaničnoj medicini koriste kao spazmolitik, stomahik, ekspektorans i

karminativ.

Ime roda Rosmarinus potiče od latinskih reči ˝ros marinus˝ što znači ˝morska

rosa˝. Monotipski je rod i njegove karakteristike su date u opisu vrste (Josifović, 1974).

Ruzmarin (Rosmarinus officinalis L.) predstavlja biljnu vrstu iz familije usnatica

(Lamiaceae). To je zimzeleni aromatični žbun, visine do 2m, jakog mirisa nalik na

kamfor. Stablo ruzmarina je jako razgranato, sa uspravnim granama i sivom korom.

Listovi su linearni, naspramni, kožasti, sedeći, dužine 2-3 cm i širine 2-4 mm, sa veoma

kratkom lisnom drškom. Sa gornje strane, listovi su tamnozelene boje, dok su sa donje

strane sivo beli i gusto pokriveni sitnim žlezdastim dlakama. Između listova na

peteljkama se nalaze sitni plavičasti cvetovi jakog mirisa.

Ruzmarin potiče sa Mediterana, i sastavni je deo makija sredozemne oblasti

(Borras-Linares et al., 2014).Raste u suvim klimatskim uslovima na priobalnom tlu

bogatim kalcijumom. Može se naći od južne Francuske do Grčke, u severnoj Africi i

zapadnim obalama Male Azije, kao i u priobalnim delovima Hrvatske i u Makedoniji.

Odavno je kultivisan širom sveta, gde se uzgaja kao ukrasna biljka po parkovima,

baštama i vrtovima. Rosmarinus officinalis L. je opisan kao čudesna biljka. Njegovo ulje

se široko primenjuje u proizvodnji visoko kvalitetnih parfema, u kozmetici i u pripremi

određenih lekova. U antičkom dobu, ruzmarin je bio posvećen grčkoj boginji Afroditi i

predstavljao je simbol ljubavi, mudrosti i lepote. U Grčkoj su studenti pravili vence od

ruzmarina i stavljali ih na glavu kada su pripremali ispite, zbog verovanja da ruzmarin

5

podstiče pamćenje. Grane ruzmarina se leti seku i suše, a zatim se njihovom destilacijom

dobija ruzmarinovo etarsko ulje (Aetheroleum rosmarini). Niz aktivnih supstanci koje su

prisutne u ruzmarinu čine ga jako korisnim u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji.

Tabela1: Sistematika Rosmarinus officinalis L.

Carstvo

Plantae

Razdeo

Magnoliophyta

Klasa

Magnoliopsida

Red

Lamiales

Familija

Lamiaceae

Rod

Rosmarinus

Vrsta

Rosmarinus

officinalis L.

Slika 1. Rosmarinus officinalis

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:259_Rosmarinus_officinalis_L.jpg

6

1.2.1. Sastav i antimikrobna aktivnost sekundarnih metabolita ruzmarina

List ruzmarina (Rosmarinus officinalis) sadrži oko 2.0% etarskog ulja. Glavni

sastojci Aetheroleum rosmarini su cineol, kamfor, pinen i borneol. Hemijski sastav

etarskih ulja zavisi od geografskog porekla vrste, faze razvoja i sastava zemljišta

(Bošković et al., 2013).Etarsko ulje ruzmarina dobija se destilacijom nadzemnog dela

biljke (Rosmarinus officinalis) pomoću vodene pare. Ulje je svetlo žute boje, sa veoma

karakterističnim jakim mirisom.

Najzastupljenije komponente etarskog ulja ruzmarina gajenog na Balkanskom

poluostrvu su: 1,8-cineol, kamfor, α-pinen i borneol. Etarsko ulje koje je dobijeno iz

ruzmarina koji je uzgajan u Beogradu sadržalo je kamfor (18.2–28.1%), 1,8-cineol (6.4–

18.0%), α-pinen (9.7–13.5%), borneol (4.4–9.5%), kamfen (5.1 – 8.7%), β-pinen (2.1–

8.1%), β-felandren (4.6 – 6.5%), mircen (3-4–5.9%) i bornil acetat (0.2–7.9%) (Lakušić,

2013).Koristi se kao holagog, dijaforetik, digestiv, diuretik, emenagog, laksativ i kao

tonik, kao i protiv glavobolje, menstrualnih bolova, umora, radi poboljšanja pamćenja,

protiv uganuća i modrica.

Slika 2. Hemijska struktura borneola, kamfora i 1.8-cineola

Najveći deo pronađenih podataka u literaturi se odnosi na antioksidativne i

antimikrobne osobine etarskog ulja ruzmarina. Brojni autori su utvrdili da dejstvo

7

etarskog ulja ruzmarina na odabrane mikroorganizme zavisi od njegovog sastava,

karakteristika biljnog materijala i koncentracije koja se koristi.

Analizirajući ekstrakte ruzmarina koji sadrže 30% karnozinske kiseline, 16%

karnozina i 5% ruzmarinske kiseline, Moreno et al. (2006) su primetili da su oni

efikasniji protiv Gram-pozitivnih nego protiv Gram-negativnih bakterija ili gljivica.

Ekstrakti su pokazali relativno slab inhibitorni efekat na Gram-negativne bakterije, ali pri

koncentracijama od 0.06-1.00% oni su inhibirali rast Gram-pozitivnih patogena

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes i Bacillus cereus (Moreno et al., 2006).

Etarska ulja i ekstrakti (dva vodena i jedan uljani) dobijeni iz ruzmarina pokazali su

antimikrobnu aktivnost, a bakterijski sojevi koji su bili posebno osetljivi na aktivnost

etarskog ulja ruzmarina bili su Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis i Klebsiella pneumonia (Celiktas et al.,

2007). Posebno osetljive na aktivnost ekstrakta ruzmarina su takođe i bakterije iz roda

Lactobacillus i Brochothrix (Del Campo et al., 2000; Moyosoluwa et al., 2004;

Fernandez-Lopez et al., 2005). Prema podacima Svetske Zdravstvene Organizacije

(WHO, 2009), etarsko ulje ruzmarina se smatra slabim antimikrobnim agensom, jer ne

inhibira u potpunosti rast mikroorganizama (Acinetobacter iwoffi, Bacillus subtilis,

Erwinia carotovora, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes i

Yersinia enterocolitica). Takođe, utvrđeno je da se zbog prisustva kamfora, čija je

maksimalna dnevna doza za ljude 1.43 mg/kg telesne mase, kao i nekih drugih

potencijalno toksičnih jedinjenja (borneol, timol), ovo ulje mora koristiti sa izvesnom

dozom opreza.

Pored mnogih istraživanja koja su određivala antimikrobnu aktivnost, određeni

broj studija bio je usmeren na efekat sekundarnih metabolita (etarskog ulja i ekstrakta)

ruzmarina na rast bakterija u različitim modelima hrane. Wieczorkiewicz-Gurnik (2003)

je prilikom ispitivanja efekta ulja ruzmarina na bakteriju Pseudomonas fluorescens,

utvrdio da je ovaj soj inhibiran tek nakon dodatka ulja u koncentraciji preko 1%. U

istraživanju Georgantelis et al. (2007) ispitanje antimikrobni efekat ekstrakta ruzmarina

8

na svežoj svinjskoj kobasici kao modelu hrane.Utvrđenoje da je broj mikroorganizama iz

familije Enterobacteriaceae povećan posle 20 dana čuvanja na 4 °C u kobasicama koje

su pripremljene bez dodavanja ekstrakta ruzmarina. U kobasicama kojima je dodat

ruzmarin,zabeleženje drastičan pad brojnosti ćelija (Georgantilis et al., 2007). Burt et al.

(2007) utvrdili su da je karvakrol u gasovitoj fazi bio u stanju da smanji ili eliminiše

kolonije Salmonella enterica subsp. enteritidis kojom je bilo inokulisano sirovo pileće

meso, kao i da etarsko ulje majčine dušice ima veću antilisterijsku aktivnost od etarskog

ulja ruzmarina. Govaris et al. (2007) zaključili su da hranjenje mladih ćurki suvim

ruzmarinom do četvrte nedelje starostipoboljšava kvalitet mesa, koje je kasnije dobijeno.

Takođe, ćureći file od ovako hranjenih životinja je ostao svež duži vremenski period

tokom skladištenja u hladnjačama,što se verovatno dešava zbog aktivnosti jedinjenja

ruzmarina koja sprečavaju oksidaciju lipida. Karpinska-Timoszczik (2008) proučavali su

efekat 1% ulja ruzmarina na turske kebabe, koji su bili termički obrađeni i čuvani na

temperaturi između -1°C i -3°C. Uočenoje da dodatak ulja doprinosi inhibiciji rasta

psihrofilnih bakterija. Ekstrakti ruzmarina u obliku emulzije, praha ili rastvora ulja, mogu

se koristiti kao zamena za BHA (butilovani hidroksianizol), kao dodatak dehidratisanim

kokošjim jajima, mesu i ribi, kobasicama, makaronima, kikiriki puteru i ulju (Hać-

Szymańczuk et al, 2011). Istraživanje sa ciljem da se utvrdi dejstvo ruzmarina na

saprofitsku mikrofloru i proces oksidacije masti izvršeno je na svinjskom mesu kao

modelu hrane, tokom njenog skladištenja u rashlađenim uslovima (4-6 ºC).Rezultati

dobijeni u ovom radu pokazali su da preparati ruzmarina primenjeni u eksperimentalnim

dozama nisu imali značajan uticaj na inhibiciju oksidacije lipida, verovatno zbog niskog

sadržaja jedinjenja koja su za to odgovorna. Takođe, ekstrakti ruzmarina nisu inhibirali

rast mezofilnih anaerobnih bakterija, ali su pokazali visoku antimikrobnu aktivnost protiv

E. coli. Dodavanjem etarskog ulja ruzmarina u svinjsko meso primećeno je da ono

inhibira rast koliformnih bakterija i enterokoka (Hać-Szymańczuk et al, 2011). U radu de

Oliveira et al. (2013), dokazana je antilisterijska aktivnost etarskog ulja ruzmarina na

svinjskoj kobasici, viršlama i mlevenom goveđom mesu.

9

1.3. Istorijat, morfologija, klasifikacija i taksonomija roda

Salmonella

Prvu salmonelu, bacil tifusa, otkrio je 1880. Eberth u slezini i mezenterijalnim

limfnim žlezdama bolesnika koji je umro od crevnog tifusa. Međutim, tek 1884. godine

Gaffky je uspeo da je kultiviše, a zatim i detaljno opiše. Salmon i Smith su iz svinja koje

su bolovale od svinjske kolere izolovali drugu bakteriju koja je po mnogim osobinama

ličila na bakteriju koja je uzročnik crevnog tifusa. Gärtner je 1888. godine našao

salmonelu u slezini čoveka koji je umro od teškog enterokolitisa i ona je nazvana

Salmonella gartneri, a kasnije Salmonella Enteritidis. Ime “Salmonella” su dobile po

doktoru Danielu Salmonu (Karakašević, 1987). Do danas je otkriveno 2500 različitih

serotipova bakterija koje se ubrajaju u rod Salmonella, a stalno se izoluju, opisuju i

objavljuju novi serotipovi (Grimont & Weill, 2007).

Salmonele su ranije bile klasifikovane na vrste na osnovu rezultata serotipizacije,

gde je svaki serotip smatran posebnom vrstom, pa su serotipovima davani nazivi prema

Lineovoj binominalnoj nomenklaturi. Međutim ovaj opšteprihvaćen koncept je morao biti

redefinisan, nakon 1973. godine kada su Cross i saradnici DNK-DNK hibridizacijom

dokazali da su svi serotipovi salmonela veoma srodni, osim, Salmonella bongori

(Kozoderović, 2012).Danas je poznato da postoje dve vrste roda Salmonella: Salmonella

enterica i Salmonella bongori. Salmonella enterica je dalje podeljena na 6 podvrsta na

osnovu biohemijskih karakteristika i fenotipskih osobina (litičke osetljivosti na

bakteriofag Felix O1): Podvrsta I enterica, podvrsta II salamae, podvrsta IIIa arizonae,

IIIb diarizonae, IV podvrsta hautenae i VI podvrsta indica.

Salmonella enterica subsp. enterica je najznačajnija, jer obuhvata većinu kliničkih

izolata. Podvrste se dalje identifikuju kao serotipovi (serovari) koji generalno dobijaju

imena na osnovu geografskog porekla izolacije (Guthrie, 1992) (S. Kentucky, S. Dublin,

S. Newport), prema sindromu koji izazivaju (S. Typhi, S. Paratyphi) ili specifičnim

domaćinima (S. Gallinarium) (Grimont & Weill, 2007).Prihvaćeno je da se umesto

10

Salmonella enterica subsp. enterica serotip Enteritidis koristi naziv Salmonella

Enteritidis (gde je Enteritidis oznaka serotipa, a ne vrste) (Gunell, 2010; Kozoderović,

2012).

1.3.1. Morfološke, kulturelne i biohemijske karakteristike salmonela

Sve salmonele su Gram negativni, fakultativno anaerobni, katalaza-pozitivni,

oksidaza-negativni (Adams & Moss, 2008) štapići asocirani sa crevnim sadržajem, koji

su veličine od 0.7-1.5 do 2.0-5.0 µm (Grimont et al., 2000). Kreću se peritrihim

flagelama. Ne obrazuju spore i nemaju kapsulu (Karakašević, 1987). Njihov rast je

zabeležen na temperaturama od 5–47 ºC, a optimalni rast je pri temperature od 37 ºC

(Adams & Moss, 2008) i na pH od 4-8. Temperatura od 56 ºC ubija ćelije salmonela za

20-30 minuta. Osetljive su na prisustvo hlora, a otporne na benzil-penicilin i sulfonamide.

Slabo su osetljive na streptomicin i na većinu cefalosporina. Veći broj sojeva salmonela

osetljiv je na hloramfenikol, ureido-peniciline i aminoglikozide (Karakašević, 1987).

Salmonele se dobro razvijaju na svim klasičnim podlogama i u aerobnim i u

anaerobnim uslovima. Nakon perioda inkubacije od 12 h na površini hranljivog agara,

javlja se rast u vidu okruglih, glatkih, beličastih kolonija prečnika 2-3 mm.Za izolaciju

salmonela iz fecesa, urina i drugog materijala koriste se selektivne podloge, a najčešće

dezoksiholat-citratni agar (DCA), Wilson-Blairov agar i SS-agar (Salmonella-Shigella

agar).

Raznim biohemijskim testovima i testom aglutinacije na pločici se potvrđuje

identifikacija salmonela. U serološkoj identifikaciji, kao pomoćno sredstvo koristi se

Kauffmann-White-ova šema prema kojoj su salmonele podeljene na osnovu somatskih

antigena u 67 O grupa, ali najčešće uzročnici oboljenja kod ljudi pripadaju grupama A, B,

C1, C2, D i E. Dalja podela u serotipove se vrši prema H ili flagelarnim antigenima faze

1 i faze 2 (WHO, 2009; Kozoderović, 2012).

11

Sve salmonele fermentišu ugljene hidrate uz produkciju kiseline i gasa, osim S.

Typhi koja ne produkuje gas pri fermentaciji šećera. Pored toga su sposobne da redukuju

nitrate, ne proizvode citohrom oksidazu, ne hidrolizuju ureu i ne vrše dezaminaciju

triptofana i fenilalanina. Prilikom fermentacije glukoze proizvode gas i ne fermentišu

laktozu, adonitol, saharozu, salicin i 2-ketoglukonat. Produkuju H2S iz tiosulfata,

dekarboksiluju ornitin i lizin (Kozoderović, 2012).

Slika 3. Kolonije Salmonella enteritidis na hranljivom agaru

http://lib.jiangnan.edu.cn/ASM/075-1.jpg

12

1.3.2. Toksini i patogenost salmonele

Od svih toksina koje salmonela luči najznačajnija su tri i to: termolabilni

enterotoksin, vezuje se za gangliozide, povećava nivo intracelularnog cikličnog adenozin

monofosfata (cAMP) i povećava sekreciju tečnosti. Citotoksin je drugi toksin salmonele,

to je nelipopolisaharidna komponenta spoljašnje membrane, koja inhibira sintezu proteina

eukariota i dovodi do izduživanja ćelija tkivne kulture - CHO (Chinese Hamsters Ovary)

ćelija. Treći je endotoksin koji predstavlja glicido-lipido-polipeptidni kompleks koji se

nalazi na spoljnoj membrani ćelijskog zida. Endotoksin izaziva groznicu i propustljivost

kapilara, aktivira makrofage i limfocite, što za posledicu ima niz bioloških efekata:

povišenje temperature, leukocitozu i pad pritiska (Miljković-Selimović et al., 2010).

Pretpostavlja se da svi predstavnici roda Salmonella mogu biti patogeni, što

uključuje više od 2500 serotipova. Međutim postoje neki izolati koji su specifični samo

za određene domaćine. Sve bolesti uzrokovane salmonelom, mogu se generalno podeliti

na tifusne i ne-tifusne (Perry, 2010). Kod ljudi, salmoneloze mogu biti u vidu enterične

groznice i gastroenteritisa.

Enterična groznica, odnosno tifus se smatra ozbiljnijom bolešću uzrokovanom

salmonelom, ali se ređe javlja od ne-tifusnih bolesti. Uobičajeni simptomi su groznica,

glavobolja i opšta slabost, a ponekad i osip na koži (Crump et al., 2004). Uzročnicisu

isključivo Salmonella Typhi i Paratyphi serotipovi, koje se najčešće unose

konzumiranjem hrane i vode zagađene fekalijama. Tifus se i danas često javlja u

nerazvijenim područjima. Konzumacija antibiotika može dovesti do stvaranja rezistentnih

sojeva S. Typhi, što dodatno komplikuje lečenje (Rowe et al., 1997).

Gastroenteritis je česta infektivna bolestu narodu poznata i kao salmoneloza.

Bolest se javlja nakon konzumacije zagađene hrane, a karakteriše je mučnina, dijareja,

groznica i stomačni grčevi koji se javljaju u periodu od 8 do 72 h nakon uzimanja

kontaminirane hrane. Salmonela je najčešći bakterijski uzročnik oboljenja uzrokovanih

hranom u SAD, a u Evropi je odmah iza Campylobacter sp. Oko 1% infekcija zahteva

13

hospitalizaciju (Hoelzer et al., 2011). Od ukupnih slučajeva salmoneloze, procenjuje se

da je 96% uzrokovano hranom (Mead et al., 1999). Hrana životinjskog porekla je najčešći

uzročnik sporadičnih slučajeva i velikih epidemija salmoneloze (WHO, 2002).

Salmonela enterica subspecies enterica serotip Enteritidis je najčešći serotip

salmonela dokazan globalno kod ljudi, a posebno u Evropi, gde predstavlja 85%

slučajeva izazvanih vrstom Salmonella enterica (Guard-Petter, 2001). U Srbiji se S.

Enteritidis pojavljuje na prvom mestu po broju izolata 1984. godine (RZZZ, 1984), mada

je u niškom regionu postala dominantan serotip 1982. godine, sa 30 primoizolata u

odnosu na 160 izolovanih sojeva različitih serotipova (RZZO, 1982) (Miljković-

Selimović et al., 2010).

Salmonele se mogu naći u skoro svim grupama životinja. Kod nekih životinja

salmonele mogu izazvati oboljenja, dok su mnogeasimptomatskinosiocii predstavljaju

opasnost za ljude kao rezervoari infekcije. Potencijalni putinfekcije ljudi su upravo

životinje gajene za ljudsku upotrebu (Kozoderović, 2012).Poznato je da meso u toku

proizvodnje, prerade i prometa dolazi u kontakt sa mikroorganizmima, od čijeg broja i

vrste zavisi njegova higijenska ispravnost i održivost (Dimitrijević, 2000).

Salmoneloze kod živine se smatraju jako velikim problemom. Infekcije se mogu

javiti kao akutne ili hronične i mogu biti izazvane sa jednim ili više serotipova roda

Salmonella. Pilići se najčešće inficiraju oralnim putem, preko hrane ivode, mada je

infekcija moguća irespiratornim putem. Glavno mesto umnožavanja salmonele je njihov

digestivni trakt. Klinički simptomi izazvani od strane Salmonella Enteritidis su često

blagi i nezapaženo prolaze, međutim pilići postaju kliconoše. Takođe su zapažene i

akutne epidemije kod pilića koji su mlađi od dve nedelje (Velge et al., 2005). Pacovi

doprinose širenju salmonela na farmama pilića (Kabir, 2010).

14

1.3.3. Pregled istraživanja efikasnosti etarskih ulja na rast salmonele u različitim modelima hrane

Pošto se često može naći kao kontaminant u mesu, nekoliko istraživanja se bavilo

ispitivanjem sposobnosti etarskih ulja nekih začinskih biljaka da redukuju njen rast u

mesu. Burt et al. (2007) utvrdili su da je karvakrol, značajna fenolna komponenta etarskih

ulja, u gasovitoj fazi bio u stanju da smanji ili eliminiše kolonije Salmonella enterica

subsp. enteritidis kojom je bilo inokulisano sirovo pileće meso. Eksperiment je rađen in

vitro na temperaturi od 37 °C, koja je povoljna za lako isparavanje jedinjenja iz etarskog

ulja.

Hayouni i sar. (2008) su proučavali dejstvo etarskog ulja žalfije (Salvia officinalis)

i peruanskog bibera (Schinus molle) na S. anatum i S. enteritidis u koncentracijama od

0.02, 0.06, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 i 3.0%, u mlevenom goveđem mesu, skladištenom na

temperaturi od 4 °C do 7 °C tokom 15 dana. Etarsko ulje žalfije je ispoljilo

bakteriostatski efekat na obe bakterije, u koncentracijama 0.02, 0.06 i 0.10%, dok je ulje

peruanskog bibera ispoljilo isti efekat i u koncentraciji od 1.0%.

Govaris i sar. (2010) su ispitivali uticaj etarskog ulja origana na S. enteritidis u

mlevenom ovčijem mesu na temperaturama od 4° C i 10° C. Rezultati su pokazali da

etarsko ulje origana aplikovano u 0.6% kao i 0.9% koncentraciji, pokazuje antimikrobnu

aktivnost na obe temperature.

Rattanachaikunsopun i Phumkhachorn (2010) su u svom ogledu ispitivali dejstvo

više vrsta etarskih ulja, i dokazali su da najjači antimikrobni efekat na S. enteritidis ima

etarsko ulje bosiljka (Ocimum basilicum). Etarsko ulje bosiljka u koncentraciji od 50, 100

i 150 ppm je dodato u mešavinu mlevenog svinjskog mesa (62.5%), prokuvanih i

iseckanih svinjskih kožica (27.5%), soli (2.5%), šećera (2.5%) i mlevenog prženog

pirinča (10%) i skladišteno na 4° C, tokom pet dana. U kontroli u kojoj nije dodavano

etarsko ulje bosiljka broj bakterija je bio 5 log CFU/g nakon pet dana, u uzorku u kome je

15

dodato ulje u koncentraciji od 50 ppm nakon trećeg dana skladištenja se smanjio na 2 log

CFU/g, dok je nakon dodavanja većih koncentracija broj bakterija bio manji od 1 log

CFU/g. Pored ovih ogleda, rađeni su i ogledi u kojima je ispitivano dejstvo pojedinačnih

komponenti etarskih ulja na Salmonella spp. u mesu i dokazano da karvakol može da

spreči širenje Salmonella u mesu.

Ristić (2015) je ispitala efekat etarskog ulja bosiljka na rast Salmonella enterica

subsp. enteritidis na kuvanom pilećem mesu kao modelu hrane. Ispitivanje je vršeno na

sobnoj temperaturi pri različitim periodima inkubacije. Zaključeno je da i nakon ukupnog

perioda inkubacije od 72 časa, etarsko ulje bosiljka nije značajno redukovalo broj ćelija i

da se samim tim ne može očekivati prezervativni efekat ulja bosiljka u ovoj vrsti hrane.

16

1.4. Ciljevi istraživanja

Izolovanje etarskog ulja iz herbe ruzmarina metodom

hidrodestilacije

Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja herbe ruzmarina

na vrstu Salmonella enterica subsp. enteritidis u in vitro uslovima

Utvrđivanje uticaja etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj

koncentraciji na rast i razmnožavanje ćelija Salmonella enterica subsp. enteritidis

na pilećem mesu kao modelu hrane

Ispitivanje uticaja vremena inkubacije na efikasnost etarskog ulja

ruzmarinana pilećem mesu kao modelu hrane

Procena potencijala etarskog ulja ruzmarina kao dodatka hrani u

prevenciji kvarenja mesa uzrokovanog bakterijskom vrstom Salmonella enterica

subsp. enteritidis.

17

2. Materijal i metode

2.1. Rastvori i podloge

Fiziološki rastvor je 0.9% (m/V) rastvor natrijum hlorida u destilovanoj

sterilisanoj vodi. Dobija se rastvaranjem 0.9 g NaCl u 100 ml destilovane vode.

Miler Hinton bujon je podloga namenjena za određivanje minimalnih inhibitornih

koncentracija (MIK) antimikrobnih agenasa metodom dilucije u bujonu. 1litar gotove

podloge sadrži: mesni ekstrakt 30.00 g, kazein hidrolizat 17.50 g, štirak 1.50 g. Priprema

ove podloge vršena je suspendovanjem 21.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane

vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog

rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20 minuta na

121°C.

Hranljivi agar (Torlak) je homogen, rastresit prah svetlo žute boje. Primenjuje se

za kultivisanje velikog broja mikroorganizama. 1litar gotove podloge sadrži: pepton

15.00 g, mesni ekstrakt 3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat 0.3 g, agar-

agar 18.00 g. Priprema ove podloge vršena je suspendovanjem 21.00 g suve podloge u

1000 ml destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou

radi potpunog rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20

minuta na 121 °C.

18

2.2. Bakterijski sojevi

Ispitivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste Rosmarinus

officinalis vršeno je u odnosu na bakterijsku vrstu Salmonela enterica subsp. enteritidis.

Za potrebe ovog istraživanja korišćen je standardni soj ATCC (American Type Culture

Collection) 13076. Kulturaje održavana na kosom hranljivom agaru u Laboratoriji za

mikrobiologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.

19

2.3. Izolacija etarskog ulja ruzmarina

Izolacija etarskog ulja ruzmarina je izvršena pomoću metode hidrodestilacije

aparaturom po Klevendžeru (Clevenger, 1928). Ova aparatura se sastoji iz kondenzora,

bočne cevi sa čepom i oduškom i cevi koja služi za merenje volumena destilata.

Slika 2. Aparatura po Klevendžeru

http://www.technosklo.com/en/index.php?page=katalog/laboratory-glass/apparatus-for-determination-of-

volatile-oil-in-drugs/apparatus-for-determination-of-volatile-oil-in-drugs-with-accessories

Balon u kome se nalazi voda i biljni materijal se zagreva do tačke ključanja, usled

čega dolazi do izdvajanja vodene pare u kondenzor, a nastala vodena para sa sobom nosi i

20

etarsko ulje. U kondenzoru vodena para prelazi u tečno stanje i vraća se u balon za

destilaciju, a ulje ostaje u cevi, na površini vodenog stuba.

Nadzemni deo (herba) biljne vrste Rosmarinus officinalis je sakupljen u decembru

2014. godine, u selu Srpska Kuća, Opština Bujanovac (leg. Sanja Ničić). Prikupljeni

materijal je zatim sušen na promajnom mestu u hladu, u trajanju od 3 nedelje. Iz 80 g

suvog, usitnjenog biljnog materijala Rosmarinus officinalis, izolovano je etarsko ulje.

Usitnjen biljni materijal stavljen je u balon i preliven sa 1l destilovane vode, nakon čega

je sastavljena aparatura po Klevendžeru. Nakon destilacije koja je trajala 2 h, etarsko ulje

iz destilata ektrahovano je pomoću etra, a zatim osušeno anhidrovanim magnezijum-

sulfatom (MgSO4). MgSO4 je uklonjen fitriranjem, a etar uparavanjem na rotacionom

vakuum uparivaču. Izolovano čisto ulje je izmereno na analitičkoj vagi, aprinos je izražen

preko težinskih procenata (w/w), obračunatih na 100 g biljnog materijala.

2.3.1. Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja ruzmarina

Da bi se utvrdilo postojanje antimikrobne aktivnosti neke supstance i odredila

koncentracija pri kojoj je ta supstanca aktivna, korišćena je mikrodiluciona metoda. Uz

pomoć ove metode, može se utvrditi minimalna inhibitorna koncentracija (MIK), tj.

najniža koncentracija ispitivane supstance koja je sposobna da inhibira rast testiranog

mikroorganizma.

U ovom radu ispitana je antimikrobna aktivnost (MIK) etarskog ulja ruzmarina u

odnosu na vrstu Salmonela enterica subsp. enteritidis.Kulture ispitivane bakterijske vrste

su presejane na svežu podlogu Hranljivi agar i inkubirane na 37°C. Nakon inkubacije od

18časova, pravljene su suspenzije bakterija u sterilnom fiziološkom rastvoru. Zatim je

turbiditet ćelija prekonoćne kulture podešen na standardnu vrednostod 0.5 McFarland

jedinica (turbiditet koji odgovara koncentraciji bakterija od 108 ćelija/ml). Turbiditet je

određen na McFarland densitometru (DEN-1, Biosan).

21

Za izvođenje mikrodilucionog testa korišćene su mikrotitar ploče sa 96 bunarčića.

Nakon pravljenja suspenzija, mikrotitarske ploče su punjene sa po 100 μl Miler Hinton

bujona, koji je zasejan odgovarajućim volumenom suspenzije turbiditeta McFarland u

cilju dobijanja finalne koncentracije ćelija od ~ 106 CFU/ml (colony forming units – CFU

– jedinica za formiranje kolonija). Etarsko ulje je rastvoreno u 0.05% Tween-u, a početna

koncentracija iznosila je 20mg/ml. Zatim su u ploči pravljena dupla razređenja početnog

rastvora ulja. Zasejane ploče sa etarskim uljem u opadajućim koncentracijama su

inkubirane 24 h na 37 °C. Nakon perioda inkubacije, očitani su rezultati. Minimalna

inhibitorna koncentracija je određivana kao najniža koncentracija etarskog ulja na kojoj

nije bilo vidljivog rasta, odnosno zamućenja podloge. Eksperiment je rađen u triplikatu.

22

2.3.2. Određivanje efekta etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji na rast i razmnožavanje vrste Salmonela enterica

subsp. enteritidis na modelu hrane

Model hrane na kome je ispitivan efekat etarskog ulja ruzmarina bilo je sveže

pileće meso (pileće grudi, Biftek). Meso je najpre isečeno skalpelom na 24 komada od po

5 g, nakon čega je svaki komad sterilisan u autoklavu u zasebnoj Petri šolji (20minuta na

121 °C). Svaki komad mesaje zatim potapan u 100 ml bakterijske suspenzije turbiditeta

107 ćelija/ml u trajanju od 15 minuta. Nakon potapanja, komadi mesa su sušeni 30 minuta

u otvorenim Petri šoljama u neposrednoj blizini plamenika.

Kako bi se ispitao efekat različitih perioda inkubacije na efikasnost delovanja

etarskog ulja ruzmarina, eksperimentalni dizajn je uključivao četiri vremena inkubacije i

to 0 h, 24 h, 48 h i 72 h. Za svaki period inkubacije, korišćen je kontrolni uzorak

(netretiran komad mesa) i uzorak koji je potapan u rastvor etarskog ulja ruzmarina u

koncentracijama MIK i 4 x MIK.Nakon sušenja, 12 komada mesa ostavljena su kao

kontrolni uzorci, dok je 12 preostalih potopljeno u rastvor ulja ruzmarina u fiziološkom

rastvoru. Rastvor je napravljen u sterilnim flakonima, tako što je u 150 mg uljarastvoreno

u1ml Tween-a i dodato u 29 ml fiziološkog rastvora, što je koncentracija koja odgovara

minimalnoj inhibitornoj koncentraciji određenoj u prethodnom eksperimentu (5 mg/ml).

Rastvor je zatim homogenizovan u ultrazvučnom kupatilu, a zatim je u flakone ubačeno

inokulisano meso i ostavljeno u kontaktu sa rastvorenim uljem 15minuta. Meso je nakon

toga izvađeno i sušeno u Petri šoljama uz plamenik.

Odmah nakon potapanja, za period inkubacije 0 h, u triplikatu su uzeti uzorci iz

kontrolne i tretirane grupe. Preostalih 18 komada mesa ostavljeno je na sobnoj

temperaturi u sterilnim Petri šoljama (temperatura inkubacije). Uzorci za analizu su zatim

uzimani u intervalima od 24 h, 48 h i 72 h.

Svako uzorkovano parče je ubačeno u 30 ml sterilnog fiziološkog rastvora i

homogenizovano u njemu.

23

Iz svakog ovako obrađenog uzorka, mikropipetom je uzeto po 100 μl supernatanta

i napravljena je serija razblaženja (faktor razblaženja 10x). Iz svakog razblaženja uzet je

uzorak i zasejan na hranljivi agar za vijabilno brojanje (Drop count metod). Nakon

inkubacije od 16 h, izvršeno je vijabilno brojanje kolonija i preračunavanje broja ćelija po

ml na osnovu sledeće formule:

N = broj kolonija x faktor korekcije do 1 ml x razblaženje

Isti postupak je ponovljen za sve ostale periode inkubacije (24 h, 48 h i 72 h).

Isti eksperiment je ponovljen uz korišćenje etarskog ulja u koncentraciji od

20mg/ml (4 x MIK).

2.4. Statistička analiza dobijenih rezultata

Statistička analiza podataka rađena je u programskom paketu Origin 7.

Eksperimenti su rađeni u triplikatu, a srednje vrednosti su poređene jednofaktorskom

analizom varijansi (ANOVA).

24

3.Rezultati i diskusija

3.1. Prinos etarskog ulja ruzmarina

Etarsko ulje dobijeno iz nadzemnog dela (herba) biljne vrste Rosmarinus

officinalis procesom hidrodestilacije pomoću aparature po Klevendžeru imalo je prinos

od 1.2% (v/w). Ulje se odlikovalo svetlo žutom bojom, i bilo je jakog karakterističnog,

prijatnog mirisa.

Prosečan prinos etarskog ulja ruzmarina izolovanog iz nadzemnog dela biljke

kreće se u opsegu između 0.5 do 2.0% (v/w) na 100 g suvog biljnog materijala

(Boutekedjiret et al., 2003).

3.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste

Rosmarinus officinalis

Mikrodilucionom metodom je utvrđeno da etarsko ulje ruzmarina inhibira rast

bakterije Salmonella enterica subsp.enteritidis pri MIKod 5 mg/ml. Zasejavanjem

bunarića u kojima nije bilo vidljivog rasta na hranljivi agar, utvrđeno je da je minimalna

baktericidna koncentracija (MBK) jednaka minimalnoj inhibitornoj koncentraciji (MIK).

Antibakterijsko dejstvo etarskog ulja ruzmarina je potvrđeno od strane mnogih

naučnika. Del Campo et al. (2000) su dokazali da antibakterijsko dejstvo etarskog ulja

ruzmarina potiče od fenola i diterpenoida. Od ostalih fenolnih jedinjenja, u ovom

etarskom ulju prisutni su i flavonoidi i fenolne kiseline (Babović & Petrović, 2011).

Mnogobrojni eksperimenti su urađeni u cilju određivanja antibakterijskog dejstva

etarskog ulja, i zaključeno je da su Gram pozitivne bakterije osetljivije na dejstvo

25

etarskog ulja, dok su Gram negativne bakterije, gde spada i Salmonella spp. bile

rezistentnije na testirano ulje. To se objašnjava razlikom u građi ćelijskog zida, tako što

on sprečava difuziju hidrofobnih jedinjenja kroz lipopolisaharidni omotač (Bošković et

al., 2013).

Roldan et al. (2010) ispitali su antimikrobnu aktivnost šest etarskih ulja izolovanih

iz biljaka iz porodice Lamiaceae, i to Mentha spicata, Mentha piperita, Ocimum

basilicum, Salvia officinalis, Rosmarinus officinalis i Thymus vulgaris.Antimikrobna

aktivnost ovih ulja je ispitana na pet vrsta bakterija:Escherichia coli, Salmonella

enteritidis, Salmonella typhimurium, Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium

breveagar dilucionom metodom. Etarsko ulje ruzmarina je pokazalo antibakterijsku

aktivnost protiv svih testiranih bakterija. Konkretno za Salmonella enterica subsp.

enteritidis(ATCC 13076)minimalna baktericidna koncentracija je iznosila 40 mg/ml. U

studiji Stojanović-Radić et al. (2010) je dokazana antimikrobna aktivnost ruzmarina

protiv pet bakterijskih sojeva, i to: Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. aureus

(klinički izolat), Escherichia coli (klinički izolat), Bacillus subtilis ATCC 6633

iKlebsiella pneumoniae (klinički izolat). Određene su MIK i MBK vrednosti za svaki soj.

MIK vrednosti etarskog ulja ruzmarina protiv testiranih bakterija se kreću u rasponu od

1.562 – 3.125 μl/ml, dok se MBK vrednosti kreću u rasponu od 1.562 do >25.00 μl/ml

(Stojanović-Radić et al., 2010). Minimalna inhibitorna koncentracija etarskog ulja

ruzmarina protiv bakterija Staphylococcus aureus ATCC 25923, Lysteria monocitogenes

ATCC 19117 i Bacilluscereus ATCC 11778 se kreće u u rasponu od 5.0-20.0 mg/ml, dok

je MBK između 10.0-20.0 mg/ml (da Silveira et al., 2012).

Pošto ova biljna vrsta ima dokazano antibakterijsko dejstvo, a u isto vreme

predstavlja i začinsku biljku, dalje istraživanje je bilo usmereno na ispitivanje uticaja

njenog etarskog ulja na bakterijsku vrstu Salmonella enterica subsp. enteritidis, koja je

patogen hrane, na mesu kao modelu hrane u kome je taj efekat testiran.

26

3.3. Efekat etarskog ulja ruzmarina na rast Salmonella

enterica subsp. enteritidis u modelu hrane

Nakon određivanja MIK i MBK etarsko ulje ruzmarina je ispitano na modelu

hrane u odnosu na vrstu Salmonellaenterica subsp. enteritidis. Kao model je korišćeno

pileće meso, na kome je ispitan efekat perioda inkubacije na aktivnost etarskog ulja. Na

grafiku 1. prikazane su krive rasta S. enterica subsp. enteritidis u toku ukupnog perioda

inkubacije od 72 h u prisustvu etarskog ulja ruzmarina u minimalnoj inhibitornoj

koncentraciji od 5 mg/ml, 4 x MIK odnosno 20 mg/ml. Prikazana je i kontrola, odnosno

brojnost bakterija u mesu koje nije tretirano etarskim uljem.

Grafik 1: Rast S. enterica subsp. enteritidis u pilećem mesu pod dejstvom etarskog ulja ruzmarina u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji, 4 x MIK i bez prisustva etarskog ulja (kontrola), u različitim

periodima inkubacije (0h, 24h, 48h i 72h)

Na grafiku zapažamo da je naneto ulje u startu delovalo (0 h) na bakterije,

redukovalo je znatan broj bakterija i rezultiralo nižom stopom rasta.Ćelije su se nakon tog

inicijalnog mikrobicidnog efekta oporavile i nastavile eksponencijalno razmnožavanje do

neke maksimalne vrednosti koja je slična kontrolnoj, dok nisu ušle u stacionarnu fazu (48

27

h) nakon čega, usled nedostatka resursa i nagomilavanja toksičnih produkata

metabolizma, njihova brojnost opada.

Slika 4. Rast kolonija salmonele iz mesa tretiranog etarskim uljem ruzmarina nakon 16 h inkubacije

Slika 5. Rast kolonija salmonele iz mesa koje nije tretirano etarskim uljem ruzmarina nakon 16 h

inkubacije

Pored toga što je antimikrobna aktivnost ruzmarina dokazana u mnogim naučnim

radovima, rezultati istraživanja na modelima hrane (Georgantelis et al., 2007; Karpinska-

28

Timoszczik, 2008; de Oliveira et al, 2013) koji su ukazivali na potencijal ovog ulja da

redukuje broj mikroorganizama u hrani nisu potvrđeni našim istraživanjem. Radovi na

različitim modelima hrane (mlevena govedina, pileće meso, ovčije mleveno meso)

kojima je tretirana salmonela ukazali su na činjenicu da određena etarska ulja imaju

mogućnost inhibicije njenog rasta (Burt et al., 2007; Hayouni et al., 2008; Govaris et al.,

2010; Rattanachaikunsopun & Phumkhachorn, 2010). Za razliku od njih, rezultati

postignuti ovim radom ukazuju na zanemarljiv efekat etarskog ulja kada se aplikuje na

pilećem mesu u koncentraciji do 2%.

Iako je eksperiment rađen sa dvema koncentracijama, etarsko ulje ruzmarina nije

pokazalo značajno inhibitorno dejstvo na rast ove bakterije u mesu. Međutim, u ovom

radu je korišćen veoma veliki početni inokulum od 107 ćelija po 5 g hrane za zaražavanje

mesa, što je veoma teško da se u realnim uslovima dogodi. Antimikrobni efekat etarskog

ulja ruzmarina bi se jače ispoljio ukoliko bi bio korišćen manji inokulum. Činjenica

proizašla iz ovog rada je da se u ovim koncentracijama etarsko ulje ruzmarina ne može

koristiti kao začinski dodatak koji će u isto vreme vršiti prevenciju kvarenja

mesauzrokovanog vrstom Salmonella enterica subsp. enteritidis.

29

4. Zaključak

Na osnovu rezultata prezentovanih u ovom radu zaključuje se:

1. Etarsko ulje dobijeno metodom hidrodestilacije iz nadzemnog dela biljne vrste R.

officinalis imalo je prinos 1.2% (v/w).Odlikovalo se svetlo žutom bojom, i bilo je

jakog karakterističnog, oporog mirisa, nalik na kamfor.

2. Mikrodilucionom metodom je ispitivana antimikrobna aktivnost etarskog ulja

nadzemnog dela ruzmarina i utvrđeno je dapri koncentraciji od 5 mg/ml etarsko

ulje pokazuje inhibitornu i mikrobicidnu aktivnost u odnosu na vrstu Salmonela

enterica subsp. enteritidis (ATCC 13076).

3. Prilikom upotrebe pilećeg mesa kao modela hrane, zapaženo je da je etarsko ulje

ruzmarina u samom startu značajno redukovalo brojnost bakterijskih ćelija.

Međutim, u kasnijim periodima inkubacije etarsko ulje pokazuje slabu

antimikrobnu aktivnost.

4. Rezultati su ukazali na činjenicu da se etarsko ulje ruzmarina ne može koristiti kao

dodatak mesu u cilju prevencije njegovog kvarenja, jer ne vrši značajnu inhibiciju

razmnožavanja ćelija salmonele.

30

5. Literatura:

Adams, M.R. & Moss, M.O., 2008: Food Microbiology (Third Edition).

University of Surrey, Guildford, UK.

Akgul, A., Kivanc¸, M., 1988: Inhibitory effects of selected Turkish spices and

oregano components on some foodborne fungi. - International Journal of Food

Microbiology 6: 263– 268.

Atti-Santos, A.C.; Rossato, M.; Fernandes Pauletti, G., Duarte Rota, L.; Ciro

Rech, J.; Regina Pansera, M.; Agostini, F.; Atti Serafini, L. i Moyna, P. 2005: Physico-

chemical Evaluation of Rosmarinus officinalis L. Essential Oils, - Brazilian archives of

biology and technology 6(48): 1035-1039.

Azzouz, M.A., Bullerman, L.B., 1982: Comparative antimycotic effects of

selected herbs, spices, plant components and commercial antifungal agents. - Journal of

Food Protection 45(14): 1298–1301.

Babović, N.V. &. Petrović, S.D., 2011: Izolovanje antioksidanasa postupkom

natkritične ekstrakcije. - Hem. ind. 65(1): 79–86.

Bauer, K. D., Garbe and H. Surburg , 2001: Common Fragrance and Flavor

Materials: Preparation, Properties and Uses. Wiley-VCH, Weinheim, 293.

Bishop, C.D., 1995: Antiviral activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia

(Maiden and Betche) Cheel (tea tree) against tobacco mosaic virus. - Journal of Essential

Oil Research 7: 641– 644.

31

Bona, D.M.M., Tânia, et al., 2012: Oregano, rosemary, cinnamon essential oil and

pepper extract to controlSalmonella, Eimeria and Clostridium in broiler chickens. - Pesq.

Vet. Bras. 32(5), - SciELO, Sao Paolo, Brazil.

Borras-Linares, I., Stojanovic, Z., Quirantes-Piné, R., Arráez-Román, D.,Švarc-

Gajić, J., Fernández-Gutiérrez, A., Segura-Carretero, A., 2014:Rosmarinus officinalis

Leaves as a Natural Source of Bioactive Compounds, - International Journal of

Molecular Sciences15: 20585-20606, - MDPI, Basel, Switzerland.

Bošković, M., Baltic, M., Janjic, J., Dokmanovic, M., Ivanovic, J., Markovic, T. et

al. 2013: Antimikrobna aktivnost etarskih ulja na Salmonella spp. u mesu i proizvodima

od mesa. – Lekovite sirovine 33: 39-52.

Boutekedjiret, C., Bentahar, F., Belabbes, R. & Bessiere, J., 2003: Extraction of

rosemary essential oil by steam distillation and hydrodistillation. - Flavour and

Fragrance J. 18: 481.

Boutoial, K., Ferrandini, E., Rovira, S., Garcia, V., López, B., 2013: Effect of

feeding goats with rosemary (Rosmarinus officinalisspp.) by-product on milk and cheese

properties,- Small Ruminant Research 112(1-3): 147–153, - Elsevier, Amsterdam.

Bozin, B., Mimica-Dukic, N., Samojlik, I., Jovin, E., 2007: Antimicrobial and

antioxidant properties of rosemary and sage (Rosmarinus officinalisL. and Salvia

officinalis L., Lamiaceae) essential oils. -Journal of agricultural and food chemistry

55(19): 7879-7885, - American Chemical Society,Washington.

Bubonja-Šonje, M., Giacometti, J., Abram, M., 2011: Antioxidant and antilisterial

activity of olive oil, cocoa and rosemary extract polyphenols. – Food Chemistry 127(4):

1821-1827, - Elsevier, Amsterdam.

Burt, S. 2007: Antibacterial activity of essential oils: potential applications in

food. - Ph.D. thesis

32

Burt, S., 2004: Essential oils: Their antibacterial properties and potential

applications in foods - a review. - International Journal of Food Microbiology 94: 223–

253, - Elsevier, Amsterdam.

Celiktas, O., Kocabas, E.E., Bedir E., Sukan, F., Ozek, T., Baser, K., 2007:

Antimicrobial activitiesof methanol extracts and essentials oils of Rosmarinus officinalis,

depending on location andseasonal variations. - Food Chem. 100 (2): 553-559.

Chalchat, J. C.; Garry, R. P.; Michet, A.; Benjilali, B. and Chabat, J. L., 1993:

Essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) The chemical composition of oils

of various origins (Maroccom Spain, France). - Journal of Essential Oils Research 5:

613-618.

Crosthwaite, D., 1998: UK trade within the flavour and fragrance industry.

International Federation of Essential Oils and Aroma Trades — 21st International

Conference on Essential Oils and Aroma’s. IFEAT, London, 6–12.

Crump, J. A., Luby, S. P., Mintz, E. D. 2004: The global burden of typhoid fever.

Bulletin of the World Health Organization.Supplement 82346.

da Silveira, S. M., Cunha Junior, A., Scheuermann, G. N., Secchi, F. L. & Vieira,

C. R., 2012: Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils from

selected herbs cultivated in the South of Brazil against food spoilage and foodborne

pathogens. - Cienia Rural 42(7): 1300-1306.

de Melo, A. M. A., Geraldine, M. R., Silveira, F. A. M., Lopes-Torres, C. M.,

Rezende, S., M., C., Fernandes, H. T., de Oliviera, N. A., 2012: Microbiological quality

and other characteristics of refrigerated chicken meat in contact with cellulose acetate-

based film incorporated with rosemary essential oil. - Braz J Microbiol. 43(4): 1419-

1427, - SciELO.

33

de Oliveira, M. M. M., Brugnera, D. F. & Piccoli, R. H., 2013: Essential oils of

thyme and rosemary in the control of Listeria monocytogenesin the raw beef. - Brazilian

Journal of Microbiology 44(4): 1181-1188.

Del Campo, J., Amiot, M., J., Nguyen-The, C., 2000: Antimicrobial Effect of

Rosemary Extracts. - Journal of Food Protection 10: 1315-1449; 1359-1368. -

International Association for Food Protection, Des Moines, Iowa.

Dimitrijević, D., 2000: Postupci sanitacije u proizvodnji i preradi mesa. -

Tehnologija mesa 41: 1–3, 39–48.

Duckova, V., Čanigová, M., Kročko, M., Bezeková, J., 2012:Antibacterial

Activity Of Thyme And Rosemary Essential Oil Against Enterococci Isolated From

Meat. – Potravinarstvo (Scientific Journal for Food Industry) 6(1): 10-13, - Association

HACCP Consulting, Nitrianske Hrnciarovce.

Elgayyar, M., Draughon, F. A., Golden, D. A., Mount, J. R., 2001: Antimicrobial

activity of essential oils from plants against selected pathogenic and saprophytic

microorganisms. - Journal of Food Protection 64(7): 1019-1024, - International

Association for Food Protection, Des Moines, Iowa.

Fernandez-Lopez, J., Zhi, N., Aleson-Carbonell, L., Pérez-Alvarez, J.A., Kuri, V.,

2005: Antioxidant and antibacterial activities of natural extracts: application in beef

meatballs. - Meat Science 69: 371-380. – Elsevier, Amsterdam.

Georgantelis, D., Ambrosiadis, I., Katikou, P., Blekas, G., Georgakis, S.A., 2007:

Effect of rosemary extract, chitosan and α-tocopherol on microbiological parameters and

lipid oxidation of fresh pork sausages stored at 4°C. - Meat Sci. 76(1): 172-181.

Govaris, A., Solomakos, N., Pexara, A., Chatzopoulou, P. S. (2010): The

antimicrobial effect of oregano essential oil, nisin and their combination against

34

Salmonella Enteritidis in minced sheep meat during refrigerated storage. International

Journal of Food Microbiology 137: 175-180.

Grimont, P. A. D., Weill, F. X. 2007: Antigenic Formulae of the Salmonella

Serovars, Ninth Edition, World Health Organization Collaborating Centre for Reference

and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France.

Guard-Petter, J. 2001: The chicken, the egg and Salmonella enteritidis. –

Environmental Microbiology 3(7): 421-430.

Guenther, E. 1948: The Essential Oils. D. Van Nostrand, New York.

Gunell M. 2010: Salmonella enterica: Mechanisms of Fluoroquinolone and

Macrolide Resistance. Thesis PhD. University of Turku, Finland.

Guthrie, R. K. 1992: Salmonella. Boca Raton, Florida: CRC Press.

Gutierrez, J., Barry-Ryan, C., Bourke, P., 2008: The antimicrobial efficacy of

plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. - International

Journal of Food Microbiology124(1): 91–97, - Elsevier, Amsterdam.

Hać-Szymańczuk, E., Lipińska, E. & Stasiukthe, M., 2011: Effect of rosemary

preparations on the microbial quality and tbars value of model pork batters. - Acta sci.

Pol., technol. Aliment., 10(2): 165-174. Warsaw Agricultural University – SGGW.

Han, J. H., Patel, D., Kim, E. J., Min, C. S., 2014: Retardation of listeria

monocytogenes growth in mozzarella cheese using antimicrobial sachets containing

rosemary oil and thyme oil. - J Food Sci.79(11): 2272-2278, - Institute of Food

Technologists, Chicago, Illinois, USA.

Hayouni, E. A., Chraief, I., Abedrabba, M., Bouix, M., Leveau, J. Y., Mohammed

H., Hamdi M., 2008: Tunisian Salvia officinalis L. and Schinus molle L. essential oils:

35

Their chemical compositions and their preservative effects against Salmonella inoculated

in minced beef meat. International Journal of Food Microbiology 125: 242-251.

Hoelzer, K, Switt, AIM and Wiedmann, M. 2011: Animal contact as a source of

human non-typhoidal salmonellosis. - Vet Res 42:34.

Ivanović, J., Aničić, N., Žižović, I., Petrović, S.D., 2007: Natkritični CO2 biljni

ekstrakti kao dodaci u proizvodnji i preradi mesa. - Tehnologija mesa 48: 5-6, 236-241. -

Institut za higijenu i tehnologiju mesa, Beograd.

Kabir, SML. 2010: Avian Colibacillosis and Salmonellosis: A Closer Look at

Epidemiology, Pathogenesis, Diagnosis, Control and Public Health Concerns. - Int J

Environ Res Public Health 7: 89-114.

Karakašević, B. 1987: Mikrobiologija i parazitologija.-Medicinska knjiga, str.677-

683, Beograd-Zagreb.

Karpinska-Tymoszczyk M., 2008: Effect of the addition of ground rosemary on

the quality and shelf-life of turkey meatballs during refrigerated storage. - British Poultry

Sci. 49(6), 742-750.

Klaus, A., Beatović, D., Nikšić, M., Jelačić, S., Petrović, T., 2009: Antibakterijska

aktivnost etarskih ulja iz aromatičnih biljaka iz Srbije na Listeria monocytogenes. -

Journal of Agricultural Sciences 54(2): 95-104, - Poljoprivredni fakultet, Beograd.

Klaus, A., Beatović, D., Nikšić, M., Jelačić, S., Petrović, T., 2009: Antibacterial

activity of aromatic plants essential oils from Serbia against the Listeria monocytogenes.

- Journal of Agricultural Sciences 54(2): 95-104, - Faculty of Agriculture, Belgrade.

Klaus, A., Beatović, D., Nikšić, M., Jelačić, S., Petrović, T., 2008: Influence of

ethereal oils extracted from Lamiaceae family plants on some pathogen microorganisms.

- Zbornik Matice srpske za prirodne nauke 115: 65-74, Novi Sad.

36

Konstantopoulou, I., Vassilopoulou, L., Mavragani-Tsipidou, P., Scouras, Z.G.,

1992: Insecticidal effects of essential oils. A study of the effects of essential oils

extracted from eleven Greek aromatic plants on Drosophila auraria. - Experientia 48 (6):

616– 619.

Kozoderović, G. 2012: Analiza prirode rezistencije na hinolone i molekularna

tipizacija odabranih serotipova Salmonella enterica subspecies enterica. Doktorska

disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.

Lakušić, D. V., Ristić, M. S., Slavkovska, V. N., Sinžar-Sekulić, J. B., Lakušić, B.

S. 2012: Environment-related variations of the composition of the essential oils of

rosemary (Rosmarinus officinalis L.) in the Balkan Penninsula. – Chemistry &

biodiversity 9(7): 1286-302.

Lakušić, D., Ristić, M.,Slavkovska, V. iLakusić, B. 2013: Seasonal variations in

the composition of the essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis, Lamiaceae). –

Natural product communications 8(1):131-4.

Mahmoud, S.S., Croteau, R.B., 2002: Strategies for transgenic manipulation of

monoterpene biosynthesis in plants. - Trends in Plant Science 7(8): 366–373.

Mead, P., Slutsker, L., Dietz, V., et al. 1999: Food-related illness and death in the

United States. - Emerging Infectious Diseases 5: 607–625.

Miljković-Selimović, B., Babic, T., Stojanovic, P. 2010: Salmonella enterica

subspecies enterica serotip Enteritidis – aktuelnost i znacaj. - Acta Medica Medianae

49(3): 71-75.

Moreno, S., Scheyer, T., Romano, C. S., Vojnov, A. A., 2006: Antioxidant and

antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition. -

Free Radic Res. 40(2): 223-31, - Informa Healtcare, Gubelstrasse, Switzerland.

37

Moyosoluwa, O., Kaatz, G.W., Gibbons, S., 2004: Antibacterial and resistance

modifying activity of Rosmarinus officinalis. - Phytochemistry 65(24): 3249-3254.

Pandey, R., Kalra, A., Tandon, S., Mehrotra, N., Singh, H.N., Kumar, S., 2000:

Essential oil compounds as potent source of nematicidal compounds. - Journal of

Phytopathology 148 (7–8), 501–502.

Perry, J. 2010: Ozone based treatments for inactivation of Salmonella enterica

serovar Enteritidis in shell eggs. - PhD Thesis, Food Science and Nutrition Graduate

Program, The Ohio State University.

Pessoa, L.M., Morais, S.M., Bevilaqua, C.M.L., Luciano, J.H.S., 2002:

Anthelmintic activity of essential oil of Ocimum gratissimum Linn. and eugenol against

Haemonchus contortus. - Veterinary Parasitology 109 (1– 2): 59–63.

Rattanachaikunsopon, P.& Phumkhachorn, P., 2010: Antimicrobial activity of

basil (Ocimum basilicum) oil against Salmonella enteritidis in vitro and in food. -

Bioscience, biotechnology, and biochemistry74(6): 1200-1204.

Ristić, J., 2015: Uticaj etarskog ulja bosiljka (Ocimum basilicum L.) na rast

Salmonella enterica subsp. enteritidis u mesu. PhD Master thesis. Prirodno matematički

fakultet, Univerzitet u Nišu.

Roldan, L. P., Gonzalo J Díaz, M. V., Duringer, M. J., 2010: Composition and

antibacterial activity of essential oils obtained from plants of the Lamiaceae family

against pathogenic and beneficial bacteria. - PhD thesis. Universidad Nacional de

Colombia, Bogotá.

Rowe, B., Ward, L. R., Threlfall, E. J. 1997: Multidrug-resistant Salmonella typhi:

A worldwide epidemic. - Clin Infect Dis 24: 106-109.

38

Stojanović-Radić, Z., Nešić, M., Čomić, Lj. i Radulović, N., 2010: Antimicrobial

activity and cytotoxicity of commercial rosemary essential oil (Rosmarinus officinalis

L.). - Biologica Nyssana 1 (1-2): 83-88.

Tajkarimi, M. M., Ibrahim, S. A., Cliver D. O. (2010): Antimicrobial herb and

spice compounds in food. Food Control 21: 1199-1218

Van de Braak, S.A.A.J., Leijten, G.C.J.J., 1999: Essential Oils and Oleoresins: A

Survey in the Netherlands and other Major Markets in the European Union. CBI, Centre

for the Promotion of Imports from Developing Countries, Rotterdam, p. 116.

Velge, P, Cloeckaert, A and Barrow, P. 2005: Emergence of Salmonella

epidemics: The problems related to Salmonella enterica serotype Enteritidis and multiple

antibiotic resistance in other major serotypes. - Vet Res 36: 267-288.

Wieczorkiewicz-Gornik M., 2003: Badanie skuteczności działania olejków

eterycznych metodą impedymetrii [Investigation on the effectiveness of essentials oils by

impedimentary method]. - Aromaterapia 9(3): 44-49 [in Polish].

World Health Organization (WHO), 2002: Risk assessments of Salmonella in eggs

and broiler chickens, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Geneva,

Switzerland.

World Health Organization (WHO), 2009: WHO monographs on selected

medicinal plants 4,Food and Agriculture Organization of the United Nations, Geneva,

Switzerland.

39

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Сања Ничић

Ментор, МН: Зорица Стојановић-Радић

Наслов рада, НР: Утицај етарског уља рузмарина (Rosmarinus officinalis L.) на раст Salmonella enterica subsp. enteritidis

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

38 стрaне, 1 табела, 6 слика, 1 график

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: микробиологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: етарско уље, рузмарин (Rosmarinus officinalis L.), антимикробна активност, Salmonella

УДК 547.913..635.71+561.23..641.12

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Циљ мастер рада је био да се истражи ефикасност етарског уља рузмарина у спречавању кварења пилећег меса. Пошто се Salmonella enterica subsp. enteritidis често може изоловати из ове врсте меса, истраживање је је усмерено ка ефикасности овог уља на дату врсту. Етарско уље је изоловано из сувог биљног материјала хидродестилацијом. Антимикробна активност је испитана одређивањем минималне инхибиторне концентрације микродилуционом методом, док је његов ефекат на раст испитиване бактерије тестиран на пилећем месу. Испитивање је вршено на собној температури при различитим периодима инкубације.

50 250Датум прихватања теме, ДП: 9.9.2015. Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master thesis

Author, AU: Sanja Ničić

Mentor, MN: Zorica Stojanović-Radić

Title, TI: Effect of rosemary essential oil (Rosmarinus officinalis L.) to the growth of Salmonella enterica subsp. enteritidis in meat

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

38 pages, 1 table, 6 pictures, 1 graph

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: microbiology

Subject/Key words, S/KW: Essential oil, rosemary (Rosmarinus officinalis L.), antimicrobial activity, Salmonella

E i idiUC 547.913..635.71+561.23..641.12

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The aim of the master thesis was to investigate the effectiveness of essential oils of rosemary in preventing spoilage of poultry meat. Since Salmonella enterica subsp. enteritidis often be isolated from this type of meat, the research is directed towards the efficiency of this type of oil to date. The oil was isolated from the dried plant material by distillation. Antimicrobial activity was tested by determining the minimal inhibitory concentrations microdilution method, while its effect on the growth of the test bacteria on the chicken meat tested. The test was performed at room temperature for various periods of incubation.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 9.9.2015.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1