Sadržaj - andragog.hr · Stranica 5 | proteinske Ag. U limfnim se čvorovima zbiva imunološka reakcija na Ag iz limfne cirkulacije. HEMATOPOEZNE MATIČNE STANICE Stanice koje cirkuliraju

S t r a n i c a 1 |

Sadržaj

HEMATOPOEZA................................................................................................................... 4

HEMATOPOETSKI ORGANI ............................................................................................. 4

HEMATOPOEZNE MATIČNE STANICE............................................................................ 5

KONTROLA HEMATOPOEZE – HEMATOPOETSKI FAKTORI RASTA............................ 7

ERITROCITI.......................................................................................................................... 8

HEMOGLOBIN .................................................................................................................10

ŽELJEZO (BM 2012;22:311-28)........................................................................................13

VITAMIN B12 I FOLNA KISELINA ....................................................................................17

LEUKOCITI ..........................................................................................................................20

GRANULOCITI..............................................................................................................20

MONOCITI ....................................................................................................................21

LIMFOCITI ....................................................................................................................23

ANTIGENI I ANTITIJELA ..................................................................................................28

Sustav komplementa.....................................................................................................29

TROMBOCITI.......................................................................................................................31

POREMEĆAJI TROMBOCITA..........................................................................................32

KVANTITATIVNI POREMEĆAJI TROMBOCITA...............................................................32

KVALITATIVNI (FUNKCIONALNI) POREMEĆAJI TROMBOCITA....................................35

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA NASLJEDNIH POREMEĆAJA TROMBOCITA ......39

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA TROMBOCITA (članak)................41

ANEMIJE..............................................................................................................................48

KLASIFIKACIJA ANEMIJA................................................................................................48

Smanjeno stvaranje eritrocita (poremećaj proliferacije i maturacije) ..............................48

Ubrzano propadanje eritrocita (poremećaj preživljenja) .................................................49

Gubitak eritrocita (poremećaj preživljenja).....................................................................49

Makrocitna anemija .......................................................................................................49

Normocitna anemija ......................................................................................................50

Mikrocitna anemija ........................................................................................................50

S t r a n i c a 2 |

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA ANEMIJA...............................................................50

1. HIPOPROLIFERACIJSKE ANEMIJE ........................................................................54

Aplastična anemija ........................................................................................................55

2. ANEMIJE ZBOG POREMEĆAJA SAZRIJEVANJA...................................................58

Hemoglobinopatije.........................................................................................................63

Talasemije.....................................................................................................................65

Poremećaji u sazrijevanju jezgre ...................................................................................69

3. ANEMIJE ZBOG SKRAĆENOG ŽIVOTNOG VIJEKA ERITROCITA U KRVOTOKU ....72

Hemolitičke anemije ......................................................................................................72

Hereditarna sferocitoza (HS) .........................................................................................76

Hereditarna eliptocitoza (HE).........................................................................................79

Hereditarna piropoikilocitoza .........................................................................................80

Hereditarna stomatocitoza.............................................................................................80

Akantocitoza..................................................................................................................81

Deficit enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6P-DH) .............................................81

Deficit enzima piruvat kinaze.........................................................................................82

Imunosne hemolitičke anemije ......................................................................................82

HEMOLITIČKA BOLEST FETUSA I NOVOROĐENČETA.............................................83

AUTOMATSKI HEMATOLOŠKI ANALIZATORI ...................................................................84

Principi analize..................................................................................................................84

SUMNJIVI REZULTATI DOBIVENI AUTOMATSKIM HEMATOLOŠKIM ANALIZATORIMA.........................................................................................................................................87

1. Leukociti ....................................................................................................................87

2. Hemoglobin, eritrociti, eritrocitne konstante ...............................................................88

3. Trombociti .................................................................................................................89

BENIGNE BOLESTI LEUKOCITA ........................................................................................91

LEUKEMIJE .........................................................................................................................92

Laboratorijske tehnike u dijagnozi i klasifikaciji neoplazmi ................................................93

MIJELOPROLIFERATIVNE NEOPLAZME (MPD).........................................................94

AKUTNE MIJELOIČNE LEUKEMIJE...........................................................................100

S t r a n i c a 3 |

AKUTNE LIMFATIČNE LEUKEMIJE...........................................................................103

LIMFOIDNE NEOPLAZME..........................................................................................103

WHO klasifikacija mijeloidnih neoplazmi i akutnih leukemija ...........................................108

WHO klasifikacija limfoidnih neoplazmi ...........................................................................110

KOAGULACIJA ..................................................................................................................114

Modeli zgrušavanja: ....................................................................................................114

STANIČNI MODEL HEMOSTAZE...............................................................................116

ULOGA ENDOTELNIH STANICA ...............................................................................121

FIBRINOLIZA (ELIMINACIJSKA FAZA) ......................................................................123

UNUTRAŠNJI PUT KOAGULACIJE............................................................................124

VANJSKI PUT KOAGULACIJE ...................................................................................125

ZAJEDNIČKI PUT KOAGULACIJE..............................................................................126

FIBRINOLIZA ..............................................................................................................127

FIZIOLOŠKA KONTROLA HEMOSTAZE....................................................................130

METODE U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI..........................................................132

PREDANALITIKA U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI .........................................132

METODE U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI ......................................................136

DIJAGNOSTIČKA HEMOSTAZA ................................................................................139

NASLJEDNI I STEČENI ČIMBENICI TROMBOFILIJE....................................................143

NASLJEDNA TROMBOFILIJA ....................................................................................144

S t r a n i c a 4 |

HEMATOPOEZA

Hematopoeza je proces sinteze krvnih stanica iz prekursorskih stanica koje su prisutne u koštanoj srži. Regulirana je nizom citokina (stimulirajući i inhibirajući čimbenici rasta) i događa se u specijaliziranom mikrookolišu koji dodatno regulira proces hematopoeze.

HEMATOPOETSKI ORGANI Hematopoeza započinje 18. dana nakon oplodnje u žumanjčanoj vrečici. U trećem mjesecu fetalnog života jetra preuzima glavnu ulogu u hematopoezi (sinteza eritroidnih, mijeloidnih i limfoidnih stanica). Oko 6. gestacijskog mjeseca hematopoeza se premješta u koštanu srž, koja postaje primarnim hematopoetskim organom. Od kasnog fetalnog razdoblja pa do kraja djetinjstva se u timusu zadržava sinteza T limfocita. Hematopoetski organi su oni u kojima se događaju procesi proliferacije, sazrijevanja i destrukcije krvnih stanica. To su koštana srž (KS), timus, slezena i limfni čvorovi. U KS se razvijaju mijeloidna, eritroidna, megakariocitna i limfoidna linija. Timus, slezena i limfni čvorovi su mjesta razvoja stanica prvenstveno limfoidne linije. Limfoidna se tkiva dodatno dijele na primarna (KS i timus; sazrijevanje T i B stanica do imunokompetentnih stanica) i sekundarna limfoidna tkiva (slezena i limfni čvorovi; imunokompetentne T i B stanice dalje sazrijevaju i dijele se kao odgovor na antigene). U odrasle osobe se KS sastoji od masnog tkiva („žute srži“) i hematopoetskog tkiva („crvene srži“). Crvena se srž zadržava u kralješcima, lubanji, prsnoj kosti, zdjeličnim kostima i u epifizama dugih kostiju. Mikrookoliš KS u kostima čine venski sinusi i stanice strome smještene u koštanim lamelama (supstantia spongiosa). Stanice mikrookoliša (strome) sudjeluju u hematopoezi na 2 načina: potiču matične hematopoetske stanice na diferencijaciju i proliferaciju, te luče hematopoetske faktore rasta. Diferencijacija je proces kojim se stvaraju različite stanične populacije sa specifičnim funkcijama u organizmu. U procesu diferencijacije se iz inicijalno ekvivalentnih stanica stvaraju stanice sa različitim svojstvima – usmjeravaju se u različite razvojne putove. Organ u kojem sazrijevaju limfociti T je timus. Iz nezrelih T limfocita koji se nalaze u korteksu timusa, putujući prema meduli sazrijevaju pomočnički (CD4) i supresorsko-citotoksični limfociti T (CD8). Slezena je sposobna stvarati eritroidne, megakariocitne, monocitno-makrofagne i limfoidne stanice. Važan je organ u kojem se odstranjuju manje vrijedni i ostajeli eritrociti, bakterije i druge čestice iz cirkulacije. Pojačana funkcija slezene (hipersplenizam) praćena je citopenijom. Služi kao skladište krvnih stanica (1/3 trombocita se nalazi u slezeni). Limfni čvorovi djeluju kao filtri i ima ih po cijelom tijelu uzduž limfnih žila. Dendritične stanice predočuju antigen limfocitima B koji onda proliferiraju i sazrijevaju u plazma stanice i izlučuju specifična At. Limfociti T omogućuju imunološku reakciju na

S t r a n i c a 5 |

proteinske Ag. U limfnim se čvorovima zbiva imunološka reakcija na Ag iz limfne cirkulacije.

HEMATOPOEZNE MATIČNE STANICE Stanice koje cirkuliraju u perifernoj krvi su krajnje (terminalno) diferencirane, nemaju sposobnost umnažanja (mitoze) i imaju ograničen životni vijek. Konstantno uklanjanje cirkulirajućih stanica apoptozom znači da se one moraju zamijeniti novim stanicama, i to iz prekursorskih stanica smještenih pretežno u koštanoj srži. Te prekursorske stanice su organizirane hijerarhijski i imaju ogroman proliferativni potencijal. Hematopoetske matične stanice su najnezrelije (najnediferenciranije) prekursorske stanice, predstavljaju 0.5% stanica s jezgrom u koštanoj srži, njihovom proliferacijom i diferencijacijom mogu nastati sve hematopoetske stanice. Nazivaju se i multipotentne (pluripotentne) matične stanice jer iz njih mogu nastati sve loze krvnih stanica (mijeloidna i limfoidna). Osim toga, imaju sposobnost samoobnavljati se (replicirati). Većina ih se nalazi u G0 fazi (mirovanju). Nisu morfološki prepoznatljive. Iz ishodišne pluripotentne matične stanice nastaje diferencijacijom multipotentna mijeloidna i limfoidna matična stanica, a iz njih daljnjom diferencijacijom i sazrijevanjem nastaju usmjerene prethodne nezrele stanice: CFU-GEMM (granulocyte, erytrocyte, macrophage and megakaryocyte) i CFU-TNK odnosno CFU-B, stanice koje postupno gube multipotentnost i usmjeravaju se na jedinstvenu staničnu liniju (granulociti, eritrociti, monociti, trombociti, limfociti). Nemaju sposobnost samoobnavljanja već njihovo sazrijevanje završava terminalno diferenciranim krvnim stanicama sa ograničenim životnim vijekom. Nisu morfološki prepoznatljive, ali su mitotički vrlo aktivne stanice.

S t r a n i c a 6 |

Matičnu je stanicu moguće odrediti funkcionalnim testovima ili određivanjem površinskih biljega (fenotipa, i to protočnom citometrijom). U točno određenim uvjetima se in vitro uz dodatak faktora rasta iz matične stanice mogu stvoriti kolonije zrelih stanica različitih hematopoetskih loza (CFU-GEMM test). Na površini ishodišnih matičnih stanica prisutan je biljeg CD34 i receptor SCF (stem cell factor, faktor rasta matičnih stanica), dok su one CD38 negativne (to je biljeg nezrelih limfoidnih stanica). Matične stanice se danas upotrebljavaju u liječenju transplantacijom, i to kod zloćudnih tumorskih bolesti koštane srži ili slabosti njezine funkcije, te kod nasljednih bolesti hematopoetskog sustava. Kao izvorište matičnih stanica koristi se KS,

S t r a n i c a 7 |

određenim se postupcima potiče njihov izlazak u krv te se onda leukoferezom prikuplja dovoljan broj matičnih stanica za liječenje. Krv iz pupkovine je dodatan izvor matičnih stanica. Najranija stanica iz pojedine loze koja se može morfološki prepoznati označava se sufiksom –blast (limfoblast, mijeloblast, megakarioblast).

KONTROLA HEMATOPOEZE – HEMATOPOETSKI FAKTORI RASTA Hematopoetski čimbenici rasta ili citokini su glikoproteini koji specifično i učinkovito upravljaju hematopoezom (preživljenjem prekursorskih stanica, samoobnavljanjem, proliferacijom, diferencijacijom). Radi se o glikoproteinima čija je uloga kompleksna međustanična komunikacija. Prvi prepoznati čimbenici rasta bili su CSFs (colony stimulating factors) jer su podržavali rast kolonija hematopoetskih stanica in vitro. Naknadno, kako ih se sve više otkrivalo, nomenklatura im je promijenjena u interleukine, pa tako danas imamo oko 30 ILs, koji imaju neurednu nomenklaturu (GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, kit-ligand/SCF, Flt3 ligand/FL itd.). Uloga čimbenika rasta je višestruka: potiču preživljavanje stanice supresijom apoptoze, potiču proliferaciju stanice, kontroliraju i reguliraju proces diferencijacije, kojim u konačnici nastaju zrele funkcionalne stanice iz multipotentnih progenitornih prekursorskih stanica. Karakteristike čimbenika rasta

1. Sintetiziraju ih različite stanice (monociti, makrofagi, aktivirani T limfociti, fibroblasti, endotelne stanice, osteoblasti, adipociti); jedina je iznimka eritropoetin (Epo) koji se sintetizira u bubregu i krvlju prenosi do koštane srži gdje potiče eritropoezu, on se smatra pravim hormonom (endokrini citokin)

2. Većina citokina djeluje lokalno (osim Epo), mogu djelovati autokrino, parakrino, endokrino

3. Pleiotropni su: jedan čimbenik rasta može imati višestruke biološke funkcije ovisno o ciljnoj stanici na koju djeluje

4. Redundantni su; nisu specifični za staničnu liniju, različiti citokini mogu djelovati slično ili isto

5. Kako bi ostvarili svoju funkciju moraju se vezati za receptore na površini ciljne stanice, obično je potrebno usklađeno djelovanje više citokina odjednom, čime se postiže amplifikacija signala.

Rani čimbenici rasta djeluju na multipotentne prekursorske stanice, stoga potiču proliferaciju stanica iz više linija. Kasniji čimbenici rasta potiču sazrijevanje unutar specifične stanične linije. Nisu specifični za staničnu liniju, ali pokazuju svoj učinak pretežno samo na prekursorskoj stanici jedne linije. Treba spomenuti i negativne regulatore hematopoeze koji inhibiraju staničnu proliferaciju. U tu skupinu se ubrajaju interferoni, TGF-ß, TNF-α, prostaglandini E i dr.

S t r a n i c a 8 |

ERITROCITI

Eritrocitopoeza je proces kojim se sintetiziraju eritrociti kako bi se njihov broj održao stalnim u perifernoj krvi. Životni vijek eritrocita je 120 dana, njihovu sintezu stimulira EPO. Stari se eritrociti uklanjaju fagocitozom u mononuklearnim stanicama jetre, slezene i KS. Stvaranje eritrocita započinje iz pluripotentne matične stanice. Njenom diferencijacijom nastaje unipotentna eritroidna progenitorna stanica, koja se sastoji od dvije populacije stanica (koje se ne mogu prepoznati pod mikroskopom, ali se prepoznaju po svojstvima u staničnim kulturama):

1. BFU-E (burst forming unit - erythroid ) i 2. CFU-E (colony forming unit - erythroid).

Sazrijevanjem BFU-E nastaju CFU-E progenitorne stanice. Najznačajnija je razlika među njima ta što CFU-E imaju visoku razinu receptora za EPO na površini stanice, te se upravo one smatraju najranijim eritroidnim prekursorom proeritroblasta (prvi koji se može morfološki prepoznati). BFU-E stanice su CD34+, dok CFU-E gube tu pozitivnost, a ispoljavaju površinske biljege eritroidne loze: glikoforin A, Rh antigene i ABH antigene.

U KS se mogu morfološki prepoznati eritroidne stanice u procesu sazrijevanja: nukleirani eritrocitni prekursori koji se skupno nazivaju eritroblasti. 6 je morfološki prepoznatljivih stadija sazrijevanja u KS:

1. Proeritroblast – najraniji prekursor eritrocita koji je morfološki prepoznatljiv, velika stanica sa velikom jezgrom koja sadrži nukleole (zauzima oko 80% stanice), rijedak je u KS; citoplazma mu je izrazito bazofilna sa ponekad prisutnom blijedom zonom uz jezgru (perinuklearni halo).

2. Bazofilni eritroblast – sličan proeritroblastu, manji je veličinom i sadrži manju jezgru; citoplazma je nešto svjetlija zbog manjeg sadržaja hemoglobina, može se vidjeti perinuklearni halo; kromatin je nešto grublji i izrazito ljubičast. Počinje se stvarati hemoglobin.

3. Polikromatofilni eritroblast – opet manja stanica od bazofilnog eritroblasta, sa smanjenom jezgrom i obilnijom sivo-plavom citoplazmom (velike količine hemoglobina, manje je RNA).

S t r a n i c a 9 |

4. Acidofilni eritroblast – mala stanica sa malim omjerom jezgra/citoplazma (to je onaj kojeg najčešće vidimo u razmazu), citoplazma je ružičasta, s malo plavičastih zona zaostale RNA; kromatin u jezgri je kondenziran, jezgra piknotična (ne vide se strukture u njoj) ili fragmentirana, priprema se da bude izbačena iz stanice.

5. Retikulocit – mladi RBC sa ostacima RNA u obliku mrežice, ali bez jezgre; oko 80% hemoglobina se sintetizira u fazi eritroblasta, a samo 20% u fazi retikulocita; otpušta se iz KS u perifernu krv gdje sazrijeva još 1-2 dana (bojenje briljant krezilnim modrilom, dolazi do precipitacije RNA i mitohondrija); do 3% retikulocita u zdrave odrasle osobe.

6. Zreli RBC – bikonkavna pločica, volumena 80-100 fL, boji se ružičasto zbog sadržaja hemoglobina.

Proces sazrijevanja uključuje postepeno smanjivanje veličine stanice sa progresivnom kondenzacijom kromatina u jezgri i konačnim izbacivanjem piknotične jezgre. Citoplazma se u mlađih stanica boji bazofilno (ljubičasto) zbog prevladavanja RNA. Sazrijevanjem se povećava sinteza hemoglobina koji uvjetuje acidofilno (ružičasto) bojenje citoplazme. Generacijsko vrijeme eritrocitopoeze je 3-5 dana. Epo je jedini bitni citokin u regulaciji posljednjih faza sazrijevanja eritrocita. To je glikoprotein koji se stvara u bubrezima, a najjači poticaj za njegovu sintezu je hipoksija u bubrežnom tkivu. Epo povećava broj BFU-E i CFU-E. Određuje se rutinski, T1/2 mu je 6-9 sati. Za normalnu eritrocitopoezu potrebni su i metali (želježo, kobalt), vitamini (B12, folat, vitamin C), ak te drugi faktori rasta. Njihov manjak obično dovodi do anemije. Eritrociti su bikonkavne pločice koje lako polaze kroz perifernu mikrocirkulaciju, fenestracije u venskim sinusima koštane srži i slezene. Eritrocit se sastoji od membrane, metaboličkih ciklusa, vode i hemoglobina. Sastav eritrocitne membrane Po sastavu je kompleks bipolarnog fosfolipidnog dvosloja i (gliko)proteina. Promjene u strukturi ili sastavu membrane mogu dovesti do gubitka njene funkcije i prerane smrti stanice (obzirom da zreli RBC nemaju organele i enzime za sintezu novih lipida i proteina). Lipidni se dio sastoji od fosfolipida, kolesterola i glikolipida. Glavni su fosfolipidi: fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilserin (PS) i sfingomijelin (SM). Proteini su integralni (transportni – Band 3 i glikoforini) ili periferni (sa citoplazmatske strane, spektrin, ankirin, aktin, odgovorni za bikonkavan oblik Erc). Najvažniji metabolički putovi u RBC-u su:

1. anaerobna glikoliza (stvara se ATP za održavanje oblika i fleksibilnosti Erc; te NADH – sudjeluje u redukciji metHb uz methemoglobin reduktazu u reducirani Hb - održava hem u reduciranom obliku, Fe2+; i 2,3-DPG koji regulira afinitet Hb za kisik),

2. heksoza-monofosfatni shunt (stvara se reducirajući spojev NADPH – koenzim glutation reduktaze, održava glutation u reduciranom obliku GSH, a on održava SH skupine na Hb i enzimima na membrani u aktivnom reduciranom obliku).

Eritrocitna membrana je ključna za razvoj i funkciju eritrocita. Ključna su njena osmotska svojstva (Erc bubre u hipotoničnim otopinama) i selektivna permeabilnost membrane, njena antigena svojstva, receptori za EPO i transferin tijekom sazrijevanja eritroblasta, izmjena bikarbonata i kloridnih iona – pufersko djelovanje.

S t r a n i c a 10 |

Odgovorna je i za fleksibilnost RBC koja je potrebna za preživljavanje u cirkulaciji 120 dana. Eritrocitna je membrana propusna za vodu i anione, ali nije propusna za mono- i divalentne katione (niska koncentracija Ca2+ i Na+, te visoka K+ u RBC-u se održava preko kationskih pumpi). Glukoza se preko transportera olakšanom difuzijom prenosi u stanicu.

HEMOGLOBIN Tetramer sastavljen od 4 globularne podjedinice. Svaka od tih podjedinica se sastoji od prostetičke skupine hema i globinskog lanca. Hem je tetrapirolni prsten sa ugrađenim željezom. Svaka podjedinica hema može prenositi jednu molekulu kisika. SINTEZA HEMOGLOBINA Sinteza hema Građen od prstena protoporfirina IX u koji je ugrađeno Fe2+. Sinteza hema započinje u mitohondrijima eritroblasta. ALA sintetaza katalizira kondenzaciju glicina i sukcinil-CoA čime nastaje delta-aminolevulinsku kiselinu (ALA). Ova je reakcija ograničavajuća (rate limiting), sinteza hema se događa samo u prisutnosti dovoljnih rezervi željeza u stanici. Dvije ALA molekule u prisutnosti ALA dehidrataze stvaraju porfobilinogen. Četiri molekule porfobilinogena, uz porfobilinogen deaminazu i uroporfirinogen-kosintetazu, stvaraju uropofirinogen III, pa dalje pod utjecajem uroporfirinogen-dekarboksilaze koproporfirinogen III. U prisutnosti koproporfirinogen-oksidaze koproporfirinogen III prelazi u protoporfirinogen IX, te uz protoporfirinogen-oksidazu nastaje protoporfirin IX koji se djelovanjem hem sintaze veže sa 4 atoma željeza čime nastaje hem.

Svi stadiji eritrocitopoeze koji sadrže mitohondrije mogu stvarati hem (do stadija retikulocita). Ali, u eritrocitu se više ne sintetizira hem!. Vidi biokemiju Hemoglobin (i porfirije). Sinteza globina Odigrava se na poliribosomima u citoplazmi ranih eritroblasta. Stvara se u prisutnosti mRNA, koja se potpuno gubi tijekom razvoja stanice, pa se kao ostatak vidi u retikulocitima: (substantia granulofilamentosa) ili polikromatofilija Erc. Globin se sastoji od 4 polipeptidna lanca, međusobno spojena peptidnom vezom. Ukupno 8 genetskih lokusa stvara 6 polipeptidnih globinskih lanaca:

• dva se nalaze samo tijekom embrionalnog razvoja (zeta i epsilon) • četiri tijekom fetalnog razvoja i nakon rođenja (alfa, beta, gama, delta).


Odrasla osoba ima 95% HbA (2α2β), 2% HbF(2α2γ) i HbA2 (2α2δ). Kod rođenja novorođenče ima najviše HbF, ovaj opada u korist HbA koji doseže vrijednosti odraslih do prve godine života.

Stadij Hemoglobin Lanci Postotak Gower 1 Zeta + epsilon Gower 2 Alfa + epsilon

Embrij

Portland Zeta + gama Fetalni, HbF Alfa + gama 60 – 90 Fetus Adultni, HbA Alfa + beta 10 – 40 Adultni, HbA Alfa + beta 95 Adultni, HbA2 Alfa + delta 3,5

Odrasli

Fetalni, HbF Alfa + gama 1 – 2 FUNKCIJA HEMOGLOBINA Omogućuje unutarnje disanje, prenosi kisik iz pluća u tkiva i CO2 iz tkiva u pluća. Normalan afinitet prema kisiku uvjetovan je prisutnošću nejednakih globinskih lanaca u Hb. Hemoglobini sa istim lancima (Hb Barth – 4gama, HbH – beta4) imaju visok afinitet prema kisiku, pa su stoga funcionalno neupotrebljivi. Oksigenacija i deosigenacija hemoglobina mogu se prikazati krivuljom disocijacije kisika. KRIVULJA DISOCIJACIJE KISIKA Disocijacija kisika ovisi o pH krvi, koncentraciji 2,3-DPG i temperaturi.

Ako je pH snižen (acidoza) ili je povećana koncentracija 2,3-DPG, smanjuje se afinitet Hb za kisik, krivulja je pomaknuta udesno i više se kisika predaje tkivima. Obratno, ako je prisutna alkaloza (povećan je pH) i snižena koncentracije 2,3-DPG, povećava se afinitet Hb za kisik, pa se manje kisika predaje tkivma kod istog pO2. Promjena disocijacijske krivulje pod utjecajem pH naziva se Bohrov efekt. 2,3-DPG podupire deoksigenaciju, veže među lance deoksiHb i stabilizira ovaj konformacijski oblik. Razgradnja Hb se odigrava u stanicama monocitno-makrofagnog sustava. Prvo se Hb razgrađuje na hem i globin, iz hema se oslobađa željezo, a onda se


protoporfirinski prsten uz hem oksidazu oksidira u biliverdin, a ovaj reducira u bilirubin uz pomoć biliverdin reduktaze.

Oslobođeno se željezo reciklira i pohranjuje kao rezervno (feritin, hemosiderin). Za metabolizam bilirubina vidi Jetru. Prijenos CO2 Nakon što se storio u metaboličkim procesima u tkivima, CO2 se trima mehanizmima prenosi do pluća:

1. jedan dio kao otopljeni CO2 u plazmi 2. jedan dio kao karbamino-hemoglobin, vezujući se za N-terminalne amino

skupine 4 globinska lanca 3. a najveći dio u obliku bikarbonata.

Ulaskom CO2 u eritrocite, a u pristunosti eritrocitne karboanhidraze, CO2 reagira sa H2O stvarajući bikarbonatni anion i H+. Stvoreni se proton puferira vezanjem za deoksiHb, dok bikarbonati difundiraju iz Erc u plazmu. Na njihovo mjesto, kako bi se održala elektroneutralnost, u Erc ulaze kloridni ioni – taj se fenomen naziva pomakom klorida. Stečeni oblici nefunkcionalnog Hb Methemoglobin nastaje oksidacijom Fe2+ iz hema u Fe3+. Ne može vezati kisik, stoga dolazi do smanjenog kapaciteta vezanja kisika, ali uzrokuje i povećan afinitet vezanja kisika preostalih hema u Hb. Normalno se autoksidacijom stvara manje od 1.5% metHb dnevno. Za redukciju tako stvorenog metHb odgovorni su prvenstveno NADH metHb reduktaza, askorbinska kiselina, glutation i NADPH metHb reduktaza. Koncentracije se metHb povećavaju kada je organizam izložen oksidirajućim kemijskim supstancama i lijekovima. Cijanoza se razvija kod koncentracija metHb oko 10%, dok hipoksija nastupa kada su koncentracije metHb oko 40%. Antidot: metilensko plavilo ili askorbinska kiselina. Određuje se spektrofotometrijski, maksimum apsorpcije na 630 nm. Sulfhemoglobin Karboksihemoglobin nastaje prilikom izloženosti organizma CO. Afinitet vezanja CO za Hb je oko 200 puta veći od afiniteta vezanja kisika. Smanjen je prijenos kisika, ali i


otpuštanje O2 iz normalnog hema. Normalno se u krvi nalaze manje koncentracije karboksiHb koje nastaju prilikom razgradnje hema, a koncentracije karboksiHb su povećane i kod pušanja u odnosu na nepušače (do 10%). Akutna karboksiHb-emija uzrokuje nepovratno oštećenja tkiva i smrt od anoksije. Kronična izloženost dovodi do policitemije. Određuje se spektrofotometrijski, apsorpcijski maskimum na 541 nm.

ŽELJEZO (BM 2012;22:311-28) RASPODJELA Fe U ORGANIZMU Oko dvije trećine željeza pohranjuje se u Hb. Gotovo trećina željeza nalazi se u rezervama u skladištima u monocitno-makrofagnom sustavu prvenstveno jetre, koštane srži i slezene (u obliku feritina i hemosiderina). Mali dio željeza (oko 4%) nalazi se u mišićima ugrađeno u mioglobin, a ostatak u raznim enzimima (katalazama, perkosidazama, citokromima, ksantin-oksidazi i sl. ). Suvišak Fe može u organizmu biti potencijalno toksičan, jer višak Fe uzrokuje stvaranje oksidativnog stresa. Dakle, Fe je u organizmu pohranjeno u jetri u hepatocitima i Kupfferovim stanicama u obliku feritina i hemosiderina. Kada stanično Fe prelazi potrebe stanice, ono se pohranjuje u obliku feritina (bioraspoloživ oblik), i tako se stanice štite od potencijalno toksičnih reakcija kataliziranih Fe-om. Feritin ima skladišnu i detoksifikacijsku funkciju. Fe uskladišteno u feritinu koristi se kod povećane potrebe stanice za Fe-om. Iako se većina feritina nalazi unutar stanice, mala koncentracija feritina ulazi u cirkulaciju aktivnim izlučivanjem kroz lizosomalni put. Plazmatski feritin gotovo ne sadrži Fe i smatra se da je njegova biološka funkcija uklanajnje slobodnog Fe-a iz cirkulacije ili kao medijator upale. Koncentracija plazmatskog feritina koristi se kao koristan pokazatelj rezervi Fe-a. Hemosiderin je netopljivi degradacijski produkt nepotpune razgradnje feritina u lizosomima. Kod preopterećenja Fe-om, hemosiderin postaje dominantno skladište Fe-a. u fiziološkim uvjetima hemosiderin nije efektivan donor Fe-a, ali ima protektivnu ulogu. U uvjetima hipoksije i upale može postati donorom Fe-a i tako promovirati stvaranje ROS i oštećenje tkiva u kojima se Fe nakuplja. APSORPCIJA Fe-a Organizam ne stvara željezo i zato ga je potrebno unositi hranom. Nema poznatog reguliranog puta izlučivanja Fe-a, stoga je sadržaj željeza u organizmu reguliran precizno kontroliranom crijevnom apsorpcijom. Crijevna mukoza reagira na promjene u tjelesnim rezervama željeza, na tkivnu hipoksiju i na potražnju za Fe, te je prema tome odgovorna za regulaciju apsorpcije. U stanjima manjka Fe apsorpcija je povećana, i obratno. Gubici željeza se javljaju u epitelu kože, stanicama crijeva i crijevnim izlučevinama. Žena u reproduktivnoj dobi gubi dvostruko više Fe od muškarca zbog menstrualnih krvarenja prilikom trudnoće i poroda. Gubitak Fe je kod zdravih osoba kompenziran apsorpcijom iz hrane. Potrebe za željezom se povećavaju tijekom adolescencije (rast) i trudnoće (povećanje volumena krvi i rast fetusa). Prehranom čovjek unosi željezo u dva oblika: kao anorgansko Fe (90%) i kao hemsko Fe. Iako je hemsko Fe manje zastupljeno u hrani, ono je bioraspoloživi oblik Fe-a, a njegova je apsorpcija učinkovitija u odnosu na anorgansko Fe koje je pod utjecajem ostalih sastojaka hrane. Apsorpcija Fe je složen proces koji se odvija u dvanaesniku i gornjem dijelu jejunuma. Uključuje:


� proteine koji transportiraju Fe kroz apikalnu membranu (importeri) � proteine koji transportiraju Fe kroz bazolateralnu membranu enterocita

(eksporteri) � proteine koji mijenjaju redoks-status Fe i time pospješuju njegov transport.

Većina anorganskog Fe u hrani je u feri obliku (3+). Takvo, oksidirano željezo, se ne može apsorbirati, već se prvo mora reducirati u dvovalentno, fero-željezo. To se postiže djelovanjem feri-reduktaze iz četkaste prevlake dvanaesnika (citokroma D). Fero željezo se zatim veže za transporter DMT1 (divalent metal transporter) i transportira u stanicu. DMT1 nije specifičan transporter za Fe, već regulia transport i ostalih dvovalentnih metalnih kationa kao Zn, Mn, Cu, iako mu je transport Fe primarna fiziološka uloga. Hemsko željezo apsorbira se u enterocite ugrađeno u hem preko proteina HCP1 – transportnog proteina izraženog u velikim količinama u dvanaesniku. Unutar stanice se Fe otpušta iz protoporfirinskog prstena djelovanjem hem-oksigenaze (HOX1) i utapa u citosolni pool Fe u enterocitima. Čini se da je katalitičko djelovanje HOX1 ograničavajući faktor u apsorpciji hemskog Fe-a. Nakon ulaska Fe-a u enterocite kroz apikalnu membranu, željezo se može:

� odlagati u obliku feritina � trasportirati u cirkulaciju preko bazolateralne membrane.

Željezo koje se iz enterocita ne prenese u plazmu, gubi se ljuštenjem crijevnog epitela. Stoga, transportom Fe-a preko proteina feroportina I kroz bazolateralnu membranu utvrđuje se hoće li se Fe dopremiti u cirkulaciju ili eliminirati iz organizma. Funkcija ovg proteina je usko povezana sa funkcijom hefestina. Fe se kroz citoplazmu enterocita transportira na dva načina: povezan sa proteinima šaperonima ili transcitozom. O ovom se koraku u apsorpciji Fe-a najmanje zna. Feroportin I na bazolateralnoj membrani enterocita je jedini poznati izvoznik Fe-a. Ovaj je protein prisutan u svim tkivima koja izvoze Fe u plazmu:

� bazolateralne membrane enterocita dvanaesnika � membrane makrofaga RES-a � hepatociti � placentarne stanice.

Bazolateralni transport Fe iz enterocita zahtjeva promjenu redoks statusa Fe uz fero-oksidazu hefestin u dvanaesniku ili ceruloplazmin u drugim djelovima tijela. Oni su


odgovorni za oksidaciju Fe iz unutarstaničnog Fe2+ u izvanstanični Fe3+. Eritroblasti na svojoj membrani izražavaju značajnu razinu feroportina I. Transferin (ili siderofilin) je plazmatski protein koji je zadužen za prijenos željeza. (samo se Fe3+ može vezati za transferin). Vezanje Fe za transferin osigurava kontrolirani transport Fe-a do svih stanica u tijelu. Transferin je serumski glikoprotein koji ima specifična vezna mjesta za Fe3+. Afinitet transferina za Fe je pri fiziološkom pH ekstremno visok, tako da je gotovo sve ne-hemsko Fe u cirkulaciji vezano za transferin. Željezo tako vezano na transferin u prvom redu odlazi u koštanu srž, gdje je potreba za njim najveća. Transferin ga predaje eritroblastima. Internalizacija Fe u stanice događa se transferinom posredovanom endocitozom u tzv. transferinskom ciklusu. Ovaj ciklus omogućuje kontrolirani ulazak Fe u stanicu, jer pojedine stanice učinkovito reguliraju unos Fe reguliranjem ekspresije TfR1 na njihovoj površini u skladu sa potrebama za Fe-om. Transferinski receptori su TfR1 i TfR2. TfR1 je izražen na nezrelima eritroidnim stanicama, stanicama koje se brzo dijele (normalne i maligne) i placentarnom tkivu. Transferin za koji je vezano Fe ima veći afinitet vezanja za TfR1 od mono- ili apo transferina. Osim TfR1 vezanih za membranu, u serumu se nalazi i topljiva forma TfR1, a ona predstavlja topljivi fragment izvanstanične domene receptora. Razina sTfR odražava dostupnost funkcionalnog Fe-a. TRANSFERINSKI CIKLUS Prilikom vezanja diferi-transferina za TfR1 na površini stanice, aktivira se klatrinom posredovano stvaranje endosoma i započinje transferinski ciklus.

Protonska pumpa na endosomu zakiseljava endosomski sadržaj i dovodi do konformacijske promjene transferina i transferinskog receptora što rezultira otpuštanjem Fe. Zatim se Fe3+ reducira u Fe2+, a ovaj se transportira kroz membranu endosoma u citoplazmu preko DMT1 transportera. Endosom putuje na površinu stanice, spaja se sa membranom i tako se TfR vraćaju na površinu membrane, a iz endosoma otpušta apotransferin. Oslobođeno željezo u eritroblastu se prenosi do mitohondrija gdje ga koristi fero-kelataza i ugrađuje u hem. U ostalim, neeritroidnim stanicama, željezo se koristi za ugradnju u ostale enzime kojima je za aktivnost potrebno ili se u rezervama (slezena, jetra) čuva vezano kao feritin ili hemosiderin.


U normalnim okolnostima ulazak transferinski vezanog Fe je glavni put ulaska Fe u stanice, ali patološko nakupljanje Fe dovodi do zasićenja transferina i pojavljivanja Fe koje nije vezano za transferin, a ono može ući u stanice preko putova neovisnih o transferinu. Sistemska homeostaza Fe regulira:

1. crijevnu apsorpciju Fe 2. ulazak i mobilizaciju Fe iz rezervi kako bi se zadovoljile potrebe eritropoeze 3. osigurava stabilan okoliš u kojem svaka stanica regulira unos Fe prema

vlastitim potrebama. Ključni regulator homeostaze Fe je jetreni hormon hepcidin, a jetra je centralni organ sistemske homeostaze Fe. Jetra sintetizira hepcidin, sintetizira transferin te pohranjuje većinu željeza. HEPCIDIN je negativni regulator metabolizma Fe. On se veže za feroportin, i na taj način potiče njegovu internalizaciju, te u konačnici i lizosomsku razgradnju ovog izvoznika Fe. Gubitak feroportina sa stanične membrane uzrokuje zadržavanje Fe u stanicama te potiskuje otpuštanje Fe s mjesta njegovog glavnog toka (makrofagi, hepatociti i enterociti → krv), smanjuje na taj način saturaciju transferina i smanjuje dostupnost Fe. Disregulacija lučenja hepcidina uzrokuje poremećaj Fe. Kod zdravih osoba povećanje rezervi Fe u organizmu dovodi do povećane ekspresije hepcidina i posljedično smanjene apsorpcije Fe. Kod bolesnika s hereditarnom hemokromatozom, zbog neadekvatne i neučinkovite hepcidinom posredovane smanjenje regulacije feroportina, apsorpcija Fe se nastavlja odvijati unatoč visokom opterećenju organizma s Fe. Najmanje je 4 mehanizma regulacije lučenja hepcidina:

1. statusom Fe – Fe u hrani i Fe iz rezervi; mehanizmi nisu sasvim razjašnjeni 2. upala – sinteza hepcidina značajno je potaknuta infekcijom i upalom, IL-6 se

smatra ključnim pokretačem sinteze hepcidina tijekom upale; rezultat je zadržavanje Fe u stanicama i hipoferemija – čime se patogenima ograničava dostupnost Fe (komponenta urođenog imuniteta); ograničena dostupnost Fe je limitirajući faktor u sintezi Hb i rezultira nastankom anemije, u tom je smislu hepcidin povenica između imuniteta i metabolizma Fe i ključni medijator anemije kronične bolesti

3. hipoksija/anemija – povećana ekspresija Epo dovodi do stimulacije eritropoeze, paralelno s tim smanjuje se sinteza hepcidina, čime se omogućuje mobilizacija Fe iz RES i više se Fe apsorbira iz enterocita za daljnje prekursore eritroidnih stanica

4. eritrocitni faktori. Stanični unos i pohrana Fe u stanici regulirani su na posttraskripcijskoj razini IRE/IRP sustavom (iron responsive elements/iron regulatory protein). IRP1 i 2 su citoplazmatski proteini koji imaju sposobnost osjetiti razinu Fe u tranzitnom pool-u. Specifično se vežu za mRNA petlje IRE i posttranskripcijski modificiraju ekspresiju proteina uključenih u metabolizam Fe.


Određivanje statusa Fe Fe se određuje spektrofotometrijski: Fe se oslobađa iz veze sa transferinom te Fe2+ i kromogen (ferene, ferozin) stvaraju obojeni produkt. TIBC – dodatkom Fe u suvišku se transferin potpuno zasiti Fe-om, a nevezano Fe ukloni adsorpcijom na Mg-karbonat. Vezano se željezo određuje kromogenom metodom. Indirektno ukazuje na transferin. Transferin se može određivati imunokemijskim metodama. Općenito, promjene u uskladištenom Fe se očutuju i na koncentracije Fe i transferina u cirkulaciji. Ako se skladišni oblik Fe poveća, povećat će se koncentracija Fe u krvi, a sniziti koncentracija transferina, i obratno. Koncentracije feritina u serumu su izravno proporcionalne zalihama u organizmu. Feritin se određuje imunokemijskom metodom. Osjetljivim imunokemisjkim metodama mogu se određivati i sTfR, koji zrcale TfR na membranama stanica, a obrnuto su proporcionalne količini Fe u organizmu

VITAMIN B12 I FOLNA KISELINA Potrebni su za normalno sazrijevanje jezgre (DNA) eritroidnih nezrelih stanica. Njihov manjak uzrokuje nastanak megaloblastičnih anemija. U organizam vitamin B12 se unosi hranom. Građa vitamina B12 slična je građi hema – i njegovu osnovu čine četiri pirolska prstena, ali s kobaltom u središtu. Takav se prsten naziva korinskim prstenom, za razliku od protoporfirinskog u hemu. Spojevi koji sadrže korinski prsten zovu se korinoidi. Glavni je korinoid kobalamin, tj. vitamin B12 koji u svojoj strukturi sadrži CN skupinu – on je u stvari cijanokobalamin. Tri su temeljna strukturna elementa cijanokobalamina (B12): (1) korinski prsten, (2) nukleotid vezan na prsten i kobalt i (3) cijanid vezan za suprotnu stranu prstena.

Za apsorpciju vitamina B12 iz probavnog trakta potreban je unutrašnji faktor (IF) – glikoprotein koji veže vitamin B12 u omjeru 1:1. IF stvaraju parijetalne stanice želučane sluznice. Spoj IF-B12 do terminalnog ileuma gdje se IF, u prisutnosti kalcija, veže za intestinalni receptor mikrovila enterocita, što omogućuje apsorpciju vitamina B12 kroz sluznicu. Nakon apsorpcije, vitamin B12 se transportira krvlju vezan za transkobalamin II (TCII), beta-globulin koji se stvara u jetri, makrofagima i ileumu. TCII prenosi vitamin B12 do koštane srži i drugih tkiva. Ondje vitamin B12 ulazi receptorom potpomognutom endocitozom. TCII je glavni protein plazme koji prenosi vitamin B12, međutim količina vitamina vezana na TCII je mala i manjak TCII uzrokuje megaloblastičnu anemiju zbog nedostatnog unosa vitamina u eritroidne stanice. No, u takvih je bolesnika razina vitamina B12 u normalnim granicama jer je


većina vezana na transkobalamin I (TCI). Transkobalamin I je glikoprotein kojega stvaraju granulociti, pa je TCI iznimno povišen kod hiperplazije granulocitne loze, posebno kod mijeloproliferativnih bolesti. Vitamin B12 vezan na TCI ne prenosi se u stanice koštane srži, već se prenosi do do jetre, odakle se izlučuje u žuč. Vitamin B12 je kofaktor u reakciji metilacije homocisteina u metionin, pri čemu je davatelj metilne skupine metil-tetrahidrofolat (metil-THF). NastajeTHF koja se koristi u sintezi DNA (sinteza purina i timidilata). Uzroci nedostatka B12 su manjak IF (perniciona anemija), malapsorpcija, nedostatan unos hranom, poremećena mobilizacija iz tkiva. B12 je i kofaktor u konverziji metilmalonil-CoA u sukcinil-CoA, stoga kod nedostatka B12 postoji poremećaj u degradaciji proponil-CoA u sukcinil-CoA. Dolazi do akumulacije proponil-CoA, a on se koristi u sintezi MK umjesto acetil-CoA (MK sa neparnim brojem C atoma). Homocistein → propionil-CoA → MMA (metil-malonska kiselina) → metilmalonil-CoA (uz B12) → sukcinil-CoA Povećano izlučivanje MMA mokraćom, te povećana koncentracija homocisteina u plazmi su testovi koji vrlo rano mogu ukazivati na nedostatak vitamina B12 u organizmu (čak i kada su koncentracije B12 normalne u plazmi). Folna kiselina dolazi u prirodi u obliku svojih konjugata poliglutamata. Po kemijskoj je strukturi pteroilglutaminska kiselina. Strukturno je folna kiselina spoj pteridina, p-aminobenzojeve kiseline i lanca glutaminske kiseline. Tetrahidrofolat (THF) je aktivni oblik folata u organizmu, a nastaje redukcijom pteridinskog prstena. Dnevne potrebe za folnom kiselinom su male, dok trudnice trebaju uzimati veće količine folne kiseline jer je ona potrebna za razvoj neuralne tube fetusa. Folna se kiselina apsorbira duž čitavog tankog crijeva, ali najviše u gornjoj trećini jejunuma. Nakon prolaska kroz crijevnu sluznicu, svi se folati dekonjugiraju, reduciraju i metiliraju do (N5)metil-THF, koji predstavlja cirkulirajući oblik folne kiseline. Metil-THF dolazi cirkulacijom do stanica, a nakon ulaska u stanicu se mora demetilirati (u THF) i ponovo konjugirati kako bi se onemogućio njen izlazak iz stanice i dostupnost za transfer ostalih monokarbonskih jedinica (metilen za sintezu timina). Ključnu ulogu u toj demetilaciji ima B12 uz metionin sintazu (veza B12, metil-THF i homocisteina). Rezerve folne kiseline nalaze se u jetri. Metil-THF, zajedno s vitaminom B12, sudjeluje u sintezi DNA, tj. stvaranju purina i pirimidina (prvenstveno timina). Funkcija THF je prijenos monokarbonskih jedinica (formil, hidroksimetil, metilen, metil) sa molekula donora na molekulu akceptora. Pri tome ima važnu ulogu u de novo sintezi nukleotida, jer predaje monokarbonsku jedinicu dUMP-u pričem nastaje dTMP, koji se kasnije ugrađuje u DNA.


Sudjeluje i u sintezi metionina iz homocisteina (metil-THF je donor metilne skupine, a B12 djeluje kao kofaktor). Nedostatak folata ili B12 blokira ovu reakciju, što rezultira povećanjem homocisteina u plazmi. Uzroci nedostatka folata su neadekvatan unos hranom, povećane potrebe organizma, malapsorpcija ili inhibicija lijekovima. Makrocitoza (MCV ↑) koja se povezuje sa kroničnom konzumacijom alkohola posljedica je nedostatnog unosa folata hranom, retikulocitoze koja se pojavljuje zbog GI krvarenja i hemolize, prisutne jetrene bolesti i toskičnosti alkohola (interferencija sa metabolizmom folata).


LEUKOCITI

Leukociti su sve stanice sa jezgrom u perifernoj krvi. Po funkciji leukocite možemo podijeliti na fagocite i stanice imunosnog sustava. Fagociti su granulociti i monociti, a stanice imunosnog sustava su limfociti T i B, te NK stanice.

GRANULOCITI

Iz pluripotentne hematopoetske matične stanice nastaje mijeloidna matična stanica (pod kontrolom faktora rasta, IL-1, IL-3 i IL-6). Iz nje nastaje usmjerena matična stanica granulocitne loze. Granulociti uključuju tri tipa stanica: neutrofilne, eozinofilne i bazofilne granulocite. Sazrijevaju u koštanoj srži. Najnezreliji morfološki prepoznatljivi oblik granulocitne loze je mijeloblast. Ima veliku okruglu ili ovalnu jezgru s 3–5 nukleola i nezrelim, fino raspršenim kromatinom. Citoplazma je oskudna, agranulirana i tamnije plave boje. Nukleocitoplazmatski (N/C) omjer je visok. Mijeloblasti su pozitivni na mijeloperoksidazu i esterazu, iako nemaju granula! (MPO+ ih razlikuje od limfoblasta.) Pojava azurofilnih, primarnih granula određuje promijelocite. Oni su nešto veći od mi-jeloblasta i u citoplazmi se jasno vide azurofilne granule (tamnoplave i crvenkaste). Jezgra je okrugla, N/C omjer je visok. Stadij mijelocita počinje stvaranjem sekundarnih, specifičnih granula, koje su manje od primarnih azurofilnih i pod mikroskopom svjetlije (svijetlosmeđe). Jezgra mijelocita je manja i ovalna, kromatin je kondenziraniji, a jezgrice se više ne vide. U stadiju mijelocita mogu se, prema specifičnim granulama, razlikovati neutrofilna, eozinofilna i bazofilna loza. N/C omjer je manji. Metamijelocit ima ekscentrično smještenu bubrežastu jezgru. Kromatin je kondenziran, a u citoplazmi vidljive su sekundarne i sekretorne granule. Nesegmentirani granulocit ima jezgru u obliku kifle, vrlo zgusnutog kromatina. Stani-cu ubrajamo u nesegmentirani granulocit ako je jezgra na sredini debljine manje od polovice promjera hipotetske okrugle jezgre.

Segmentirani granulocit je zreli oblik koji u prosjeku sadrži 3–5 segmenata jezgre. Kod žena se uz krajnji segment nalazi Barrovo tjelešce, inaktivirani X kromosom. Eozinofilni granulociti sadrže grublje, crvene granule, a jezgra nema više od 3 segmenta (najčešće 2). Kao najraniji stadij prepoznaje se eozinofilni mijelocit, a


nezreliji se oblici ne mogu razlikovati od neutrofilnih prethodnih stanica. Eozinofilne granule sadrže uglavnom peroksidazu i lizozim. Najveći dio granula eozinofila sadrži glavni bazični protein, koji je citotoksičan za parazite, te inducira oslobađanje histamina iz bazofilnih granulocita i mastocita. Eozinofili se često nađu u upalnim eksudatima i kroničnim upalama, a imaju i važnu ulogu u alergijskim reakcijama, u obrani od parazita i bakterija koje fagocitiraju, te pri odstranjenju fibrina stvorenog u upali. Bazofilni granulociti imaju izrazito velike, tamno plave granule u citoplazmi, koje pre-krivaju jezgru. Granule sadrže heparin i histamin, koji se pri degranulaciji oslobađaju. Na membrani imaju receptore za IgE. Vezanjem IgE na njegov receptor dolazi do degranulacije i otpuštanja raznih vazoaktivnih, kemotaktičnih i bronhokonstriktivnih tvari. Bazofili su česti u upalnim reakcijama, posebno reakcijama hiperosjetljivosti - astmi, alergijskom rinitisu i anafilaktičkoj reakciji. Bazofil koji se nalazi u tkivu naziva se mastocit. Mastociti se ne pojavljuju u perifernoj krvi. Koštana srž je rezervoar zrelih, segmentiranih granulocita – u normalnim je uvjetima u koštanoj srži pohranjeno 10–15 puta više granulocita nego što se nalazi u perifernoj krvi. Nakon ulaska u krv, granulociti provode oko 10 sati u cirkulaciji, a potom prelaze u tkiva, gdje obavljaju svoju funkciju – fagocitozu.

MONOCITI

Monociti se ubrajaju u bijele krvne stanice i glavni su sastavni dio mononuklearno-fagocitnog sustava čija je glavna funkcija fagocitoza. Monociti nastaju u koštanoj srži iz matičnih hematopoetskih stanica. Prethodne nezrele stanice monocitne loze na svojoj površini imaju biljege. Određivanjem tih biljega moguće je utvrditi zrelost stanica monocitne loze. Nezrele monocitne stanice eksprimiraju M-CSF receptor, lizozim, Fc-gama receptor, dok zreli monociti eksprimiraju u velikoj količini CD11b/CD18 Ag. Najvažniji površinski biljeg monocitno-makrofagne loze je CD14 – receptor na koji se vežu liposaharidi, koji uzrokuju aktivaciju tih stanica. Iz monoblasta, koji se morfološki ne može točno odrediti, nastaje promonocit, stanica s izrazito bazofilnom citoplazmom, koja pokazuje bljeđu perinuklearnu zonu te pojavu granula. Monocit je nešto manji od svojih prethodnik stanica, ali mu veličina isto izrazito varira (10 –18 µm). Citoplazma je sivkastomodra s rijetkim granulama i jezgrom bubrežasta izgleda ili poput potkove. Granule se dijele na primarne (MPOpoz) i sekundarne (MPOneg). Primarne granule sadrže mijeloperoksidazu, a sekundarne tvari koje posreduju u procesima adhezije i dijapedeze. Monociti cirkuliraju u perifernoj krvi 8-72 sata, a potom prelaze u tkiva, gdje sazrijevaju u tkivne makrofage (histiocite). Dužina života makrofaga je nekoliko mjeseci. Histiociti u određenim tkivima imaju i poseban naziv: jetra – Kupfferove stanice, pluća – alveolarni makrofagi, koža – Langerhansove stanice i dendritičke stanice, mozak – mikroglija.


FAGOCITOZA Osnovna funkcija granulocita i monocita (makrofaga) je fagocitoza. Odvija se u nekoliko faza: kemotaksija, neposredna fagocitoza, digestija i uništavanje fagocitiranih čestica Kemotaksija je mobilizacija i migracija fagocita na mjesto upale ili invazije bakterija posredovanjem kemokina koji se oslobađaju iz oštećenog tkiva ili aktiviranog komplementa. Kemokine stvaraju endotelne stanice, neutrofili, monociti, trombociti i limfociti T. Fagociti se kreću prema rastućoj koncentraciji kemokina, kojega detektiraju preko receptora na svojoj membrani. Adhezijske molekule Adhezijske molekule su glikoproteini koji posreduju u međustaničnim reakcijama i interakcijama. Adhezijske molekule na površini leukocita nazivaju se receptorima i vežu se za molekule zvane ligandi koje se nalaze na površini ciljnih stanica. Važne su u posredovanju i podržavanju imunog i upalnog odgovora, kao i u reakciji između trombocita, leukocita i endotela krvnih žila. Adhezijske molekule čine:

� Selektini – površinski receptori koji se nalaze na leukocitima (L-selektini), na endotelu postkapilarnih venula (E-selektini), na trombocitima i endotelnim stanicama (P-selektini).

� Integrini – ekspresija integrina na membrani granulocita povećava se utjecajem kemokina – oni izazivaju zamjenu granulocitnih selektina s integrinima na površini membrane

� Unutarstanične adhezijske molekule (ICAM). ICAM-1 prisutan je na endotelnim stanicama i u stanju upale mu se povećava ekspresija. ICAM-2 također se nalazi na endotelnim stanicama, ali ne pokazuje odgovor na upalne citokine (IL-1, TNF-alfa, IFN-gama). ICAM-3 nalazi se na granulocitima, monocitima i limfocitima.

Kemokini uzrokuju zamjenu granulocitnih selektina s integrinima, a isto tako zamjenu ICAM-2 na endotelnim stanicama (koji ne veže leukocite) s E-selektinom koji privlači leukocite, a potom i s ICAM-1, koji jače veže leukocite. L-selektini leukocita omogućuju blago prijanjanje na površinu endotela krvnih žila, dok ICAM-1 čvrsto veže integrine leukocita i omogućuje mu kotrljanje po stijenci krvne žile. Sekrecijom enzima (želatinaze B i elastaze) leukocit razara subendotelnu bazalnu membranu na maloj površini i leukocit ulazi u tkivo na mjestu upale.


I monociti i granulociti na svojoj površini imaju Fc receptor koji može vezati Ig (IgG) i C3b komponentu komplementa. Prisutnost tih receptora uvelike povećava sposobnost vezanja fagocita za strane tvari (bakterije ili stanice obložene s IgG ili C3). Fagocitoza Vezanje kemokina na transmembranski receptor aktivira G-protein koji kaskadnom reakcijom prenosi signal u stanicu. Posljedica je promjena oblika uz povećanu sklonost priljubljivanju i fagocitozi, te sekreciju sadržaja granula. Proces internalizacije stranih tvari (bakterije, gljivice i sl.) ili stanica domaćina koje su oštetili fagociti naziva se fagocitozom. Taj proces znatno olakšava opsonizacija, proces koji dovodi do oštećenja površine npr. bakterije imunoglobulinom ili komponentama komplementa (opsonini). Time receptori fagocita mnogo lakše prepoznaju strane tvari. Glavni su opsonini IgG, a u respiratornom sustavu to je IgA. Proces opsonizacije strane čestice završava fagocitozom. Proces fagocitoze zbiva se tako da fagocit okruži česticu izdancima svoje citoplazme, koji se potom spoje. Pseudopod je bogat aktinom. Tako nastaje fagocitna vakuola ili fagosom. Fagosom se nakon internalizacije pomiče prema jezgri. Vrlo brzo dolazi do fuzije granula s fagosomom, tj. dolazi do degranulacije.

LIMFOCITI

IMUNI SISTEM Definicija imunosti podrazumijeva otpornost na strane tvari, ne samo mikroorganizme, već i makromolekule. Stanice, tkiva i organi koji omogućavaju tu otpornost nazivaju se imunim sistemom. Reakcija organizma na ulazak patogena je imunosna reakcija. Mehanizmi imunosti uobičajeno se dijele na:

1. urođenu imunost (koža, sluznice, komplement, fagociti, NK-stanice, makrofagi i makrofagni citokini)

2. stečenu imunost (kožni i sluznični imunosni sustav, At, limfociti i limfocitni citokini).

Reakcije imunog sustava mogu biti: � Nespecifične – vezane pretežno uz urođenu imunost


� Specifične – koje se dijele se na (a) humoralnu imunost - posredovanu limfocitima B i (b) staničnu imunost - posredovanu limfocitima T

Nekoliko je karakteristika specifične imunosti: � specifičnost za antigen (antigen potakne specifični klon limfocita – teorija

klonske selekcije) � različitost – može prepoznati oko 109 Ag � imunološka memorija prvog susreta s antigenom (primarna imunoreakcija) i

pojačana reakcija nakon ponovnog susreta s istim antigenom (sekundarna imunoreakcija)

� samoograničavajuća reakcija – imuno reakcija postupno slabi nakon antigenske stimulacije

� razlikovanje vlastitog od stranog. Specifična se imunoreakcija razvija u tri faze :

1. Aferentna (spoznajna, kognitivna) – vezanje antigena za antigen specifičan receptor na limfocitu T i B.

2. Centralna (aktivacijska) – proliferacija i diferencijacija limfocita u specifičan klon. U toj fazi sudjeluju i druge stanice.

3. Eferentna (efektorska) – djelovanje diferenciranih efektorskih stanica i njihovih produkata, citokina i At.

Limfociti su stanice koje specifično prepoznaju imunogen i na njega reagiraju specifičnom imunoreakcijom. Potiču od matičnih stanica u koštanoj srži, a u zrele imunokompetentne stanice sazrijevaju primarnim limfopoetskim organima (timus i koštana srž). Limfoidna matična stanica diferencira se u B nezrele prethodne stanice i zajedničku prethodnu nezrelu T/NK stanicu, koja se zatim diferencira u nezrele stanice T loze i nezrele NK stanice. Limfoblast je prva stanica limfoidne loze koju je moguće prepoznati. Limfoblast ima veliki N/C omjer, raspleten i fini kromatin i vidljive nukleole. Citoplazma je vrlo oskudna, a ukoliko je vidljiva, boji se tamnije plavo. Limfoblaste i mijeloblaste je teško razlikovati (limfoblast ima manje citoplazme, koja je tamnija; nikada nema granule) – razlikuju se protočnom citometrijom i specifičnim bojanjima. Limfoblast je MPO i EST negativan, te Sudan black negativan (lipidi). Prolimfocit je malo veća stanica sa zrnatijom strukturom kromatina. Djeca dojenačke dobi često imaju limfocitozu, sa 70–80% limfocita, uz pojavu nezrelijih limfoidnih stanica, većinom tipa prolimfocita. Limfociti se na klasičnim krvnim razmazima međusobno razlikuju veličinom (8 – 10 µm) i morfološkim izgledom. Tipični mali limfocit ima veliku, bubrežastu jezgru, uski obodni sloj citoplazme s nešto mitohondrija, ribosoma i lizosoma, ali nema specifičnih granula. Citoplazma je modre boje. Veličina limfocita uspoređuje se s eritrocitima – mali limfocit je približno 1.5 puta veći od normalnog eritrocita.


Drugi morfološki oblik limfocita je veliki granulirani limfocit (LGL), koji ima obilniju citoplazmu i brojne specifične granule. Na temelju navedenih morfoloških svojstava nije moguće prepoznati subpopulacije limfocita: T, B i NK stanice. Te se stanice točno mogu odrediti pomoću monoklonskih protutijela metodom protočne citometrije. Morfologija normalnih, reaktivnih i malignih limfocitnih stanica U perifernoj krvi moguće je pronaći različite oblike limfocitnih stanica, od kojih nisu sve patološke, ali nam ukazuju na specifične imunosne procese koji se zbivaju u organizmu. Normalan razvoj: limfoblast – prolimfocit – limfocit – centrocit – centroblast – imunoblast – plazmoblast – proplazmocit – plazma stanica

Razvoj plazma stanice

Plazma stanica je potpuno diferencirani B-limfocit. Jezgra ima vrlo gusti kromatin poput žbica na kotaču, smještena je potpuno ekscentrično. Oko jezgre uočava se perinuklearno područje (perinuklearni halo). Citoplazma je izrazito bazofilna. Plazma stanica sintetizira i pohranjuje specifične imunoglobuline. U nekim patološkim stanjima moguće je pronaći plazma stanice drugačije morfologije: Reaktivne limfocitne stanice Limfoplazmociti – rijetko ih se nađe u perifernoj krvi. Oni su veće stanice sa ekscentrično položenom jezgrom, grudastim kromatinom, obilnijom, tamnoplavom citoplazmom, koja ponekad ima pojedinačne vakuole. Javljaju se u infektivnim bolestima, posebice rubeoli. Reaktivni, atipični limfociti se lako mogu zamijeniti za leukemijske limfoblaste ili monocite. Zovu se i virociti, Pffeiferove stanice, atipični ili podraženi limfociti. Izrazito su polimorfni, javljaju se u virusnim bolestima kao što je infektivna mononukleoza. Imaju nepravilnu ili poligonalnu jezgru, manje gust kromatin i obilniju svijetloplavu citoplazmu koja je uz rubove tamnije plava, često izvučena u obliku citoplazmatskih pseudopodija. U drugim tipovima reaktivnih limfocita citoplazma je bazofilnija, dok se kod nekih često vide azurofilna zrnca i vakuole. (Razlika od monocita: monocit ima


jednoličnije obojenu citoplazmu i često potkovastu ili sličnu jezgru, za razliku od reaktivnog limfocita. )

Maligne limfoidne stanice Limfociti kod CLL – javljaju se mali limfociti koji zapravo predstavljaju patološki klon limfocita. Odlikuju se okruglom ili ovalnom jezgrom, gustom strukturom kromatina i oskudnom svijetloplavom citoplazmom bez granulacije. Ovi limfociti su bogati glikogenom koji se citokemijski prikazuje PAS bojenjem. Vrlo su fragilni i u razmazu periferne krvi nalazimo puno zgnječenih, golih jezgara – Gumprechtove sjene.

SAZRIJEVANJE I PROLIFERACIJA LIMFOCITA Prethodne nezrele B-limfoidne stanice sazrijevaju u koštanoj srži, a nezreli prethodnici limfocita T sazrijevaju u timusu. Ovi procesi su pod kontrolom nespecifičnih citokina. Prethodnici limfocita T (pre-T) iz koštane srži odlaze u timus koji im pruža prikladan okoliš za vrlo složeni proces sazrijevanja u zrele imunokompetentne limfocite. Kompleksnim procesom proliferacije i diferencijacije timocita (nezrelih limfocita) uklanjaju se (negativna selekcija) one stanice koje specifično prepoznaju vlastite antigene glavnog sustava tkivne podnošljivosti (MHC, major histocompatibility complex), a očuvaju (pozitivna selekcija) one koje će omogućiti spregnuto prepoznavanje stranih antigena u kontekstu vlastitih MHC molekula. U tijeku tog procesa dolazi i do ekspresije gena čiji proteini tvore antigenski receptor – T-stanični receptor (TCR) limfocita T. U trenutku napuštanja timusa zreli limfociti T imaju nekoliko važnih razlikovnih biljega koji karakteriziraju različite funkcijske subpopulacije :

1. Pomagački limfociti T (Th) izražavaju specifičan fenotip – CD3+ CD4+ CD8-TCRa/b+. Oni prepoznaju tuđi antigen, tj. epitop vezan za molekulu MCH-klase II na membrani antigen predočujućih stanica – APC stanice. Ta antigen specifična aktivacija naivnih (djevičanskih) Th potakne njihovu proliferaciju i sekreciju citokina. Na temelju razlike u sekreciji pojedinih citokina razlikujemo dvije Th subpopulacije: Th1 (upalna subpopulacija) i Th2 (pomagačka subpopulacija).


Glavna funkcija Th1 subpopulacije je razvoj specifične stanične imunosti, tj. aktivacija citotoksičnih limfocita, makrofaga, NK stanica te reakcija kasne (odgođene) preosjetljivosti. Pomagačka Th2 subpopulacija pomaže diferencijaciju limfocita B i proizvodnju pro-tutijela, stimulira sekreciju IgE, te aktivira bazofile i mastocite. Nakon uklanjanja antigena imunoreakcija se obuzdava, a neki limfociti T, koji izlučuju male količine IL-2, preostaju kao dugotrajne memorijske stanice (ThM) koje pamte dodir s antigenom pa pri ponovnom dodiru razvijaju sekundarnu imunoreakciju.

2. Citotoksični limfociti T (CTL) izražavaju specifičan fenotip – CD3+CD4-CD8+TCRa/b+. Oni prepoznaju tuđi antigen (epitop) u sklopu MHC klase I. nakon što ih aktivira antigen, proliferiraju i diferenciraju se u efektorske CTL (pod djelovanjem IL-2 iz pomagačkih T limfocita) koji u izravnom kontaktu ubijaju ciljne stanice (stanice alotransplantata, tumora, vlastite stanice zaražene virusom).Osim toga, izlučuju i citokine IFN-γ i TNF-α koji aktiviraju makrofage.

3. Regulacijski limfociti T (Treg) pripadaju skupini CD4+CD25+. Oni koče imunoreakciju na vlastite i tuđe antigene djelujući na Th pomagačke limfocite ili izravno na limfocite B. Važni su za održavanje tolerancije na autoantigene, aloantigene, tumorske antigene te održavanje normalne trudnoće. Smatra se i da sprečavaju neželjene imunoreakcije na tuđe antigene (npr. alergije).

4. Limfociti NK-T podskupina su CD4+TCRalfa/beta+ limfocita. One prepoznaju glikolipidne antigene vezane na MHC molekule na predočujućim stanicama. Zbog nemogućnosti stvaranja imunološke memorije svrstavamo ih u urođenu imunost. Ovisno o aktivacijskom podražaju, mogu izlučivati proupalne (Th1 ) citokine (IFN-γ, TNF) ili protuupalne (Th2) citokine (IL-4, IL-10, IL-13). Koji imaju imunoregulacijsko djelovanje. Zato se smatra da su vrlo važni u diferencijaciji pomagačkih T limfocita, održavanju tolerancije na vlastite i tuđe antigene i kontroli tumorskog rasta.

Prethodnici limfocita B sazrijevaju u koštanoj srži. Nakon aktivacije antigenom, limfociti B počinju proliferirati i diferenciraju do plazma stanica koje izlučuju specifična protutijela. Ta se diferencijacija zbiva pod utjecajem različitih citokina koje izlučuju pomagački T limfociti. Stanice koje predočuju antigen (APC) su heterogena skupina stanica čije je zajedničko svojstvo predočavanje antigena pomagačkim limfocitima T. To svojstvo imaju mononuklearni fagociti, limfociti B, dendritičke stanice, folikularne dendritičke stanice i endotelne stanice krvnih žila. Dva su temeljna svojstva APC stanica :

1. ekspresija MHC molekula klase II 2. preradba proteinskih antigena u prikladne determinante koje se mogu vezati

za MHC i predočiti limfocitima Th.


Limfociti B prepoznaju antigen bez obzira na to je li predočen u kontekstu sustava MHC predočnih stanica. On prepozna je i neprerađeni antigen na površini APC, aktivira se i prelazi u plazma stanicu, koja producira i izlučuje specifična antitijela. Dio limfocita B ostaje kao memorijske stanice, specifične za taj antigen.

ANTIGENI I ANTITIJELA Antigen je tvar koju sa svojim antigen specifičnim receptorima mogu prepoznati limfo-citi T i B. Antigeni mogu uzrokovati i različite oblike alergijskih reakcija pa ih u tom slučaju nazivamo alergenima. Imunogen je tvar koja može nakon imunizacije potaknuti imunoreakciju (antigeni i superantigeni). Hapten je tvar male Mr koja se veže na specifična protutijela, iako nije imunogen i u pravilu ne može potaknuti imunoreakciju. Oni postaju imunogenični nakon vezanja za veliku molekulu-nosač (obično protein). Iz svega navedenog slijedi da je antigen tvar koja aktivira limfocite vezanjem za antigen specifične receptore limfocita T i B. Pozitivna aktivacija znači umnožavanje potaknutoga klona limfocita s posljedičnom produkcijom protutijela i sazrijevanjem efektorskih limfocita (imunološka reaktivnost). Potaknuti klon limfocita može imati kao posljedicu i imunološku nereaktivnost (toleranciju). Prema kemijskoj strukturi antigeni su proteini, polisaharidi, lipidi, nukleinske kiseline i spojevi kao što je trinitrofenil (TNP). Proteini su najmoćniji antigeni među organskim makromolekulama. Ugljikohidrati su slabiji imunogeni od proteina. Nalazimo ih u obliku glikolipida i glikoproteina. Npr. glikolipidi su antigeni bakterijskih stijenki i glavni krvnogrupni antigeni, a glikoproteini su slabiji antigeni, kao primjerice Rh antigen. Reakciju jedinke protiv antigena ponajprije određuju geni glavnog sustava tkivne podudarnosti (MHC), koji se zovu i geni imunosnog sustava. Interakcija antigena s produktima tih gena nužna je za prepoznavanje i aktivaciju specifične imunoreakcije na njega. Stoga jaka interakcija povećava imunogeničnost i pojačava imunoreakciju. Da bi neka tvar bila imunogenična, u pravilu mora imati Mr veću od 10 kDa. Treba naglasiti da imunogenična tvar, mora organizmu biti tuđa. Razlikujemo aloantigene (razlike između jedinki iste vrste), ksenoantigene (razlike između antigena jedinki različite vrste) i autoantigene (vlastite molekule na koje organizam reagira u iznimnim okolnostima). Antigenska determinanta – epitop – dio je antigenske molekule koji se veže za vezna mjesta (paratop) antigen specifičnih receptora limfocita T i B i specifičnih protutijela. Veće molekule, prema tome, mogu imati i više epitopa.


Protutijela su glikoproteini specifični za određeni antigen, a produciraju ih limfociti B. Nalazimo ih u serumu i ekstracelularnim tekućinama. Serum koji sadrži specifična antitijela zovemo antiserum. Imunost izazvanu protutijelima nazivamo humoralnom imunosti. Sva su protutijela građena od četiri polipeptidna lanca – dva laka lanca, L i dva teška lanca, H; međusobno povezana disulfidnim mostovima. U čovjeka nalazimo dva tipa lakih lanaca: kapa i lambda. Disulfidni mostovi povezuju lake lance s teškim, te međusobno dva laka, te dva teška lanca. Primarnu aminokiselinski strukturu lakih i teških polipeptidnih lanaca tvore ponavljajuće homologne jedinice sastavljene od oko 110 aminokiselina. Te se jedinice višekratno ponavljaju i zbog disulfidnih veza na kraju tvore kuglaste tvorbe nazvane imunoglobulinskim domenama. Laki lanci imaju dvije, a teški lanci četiri takve domene. Razlikujemo 5 razreda imunoglobulina: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Kod čovjeka IgG ima četiri podklase IgG1-4, a IgA dvije IgA1-2. Protutijela se međusobno razlikuju aminokiselinskim sastavom domene na N-krajevima lakih i teških lanaca. Zato se ta domena naziva varijabilnom (V) domenom. U ostatku lakih i teških lanaca aminokiselinski sastav neznatno varira pa se te regije nazivaju konstantnim (C) domenama. U intaktnom imunoglobulinu regije lakih i teških lanaca prostorno su tako povezane da tvore mjesto vezanja antigena – paratop, koji određuje antigensku specifičnost protutijela. Za biološke efektorske funkcije protutijela odgovorne su konstantne domene teških lanaca. Razlike u konstantnim regijama imunoglobulina nazvane su izotipovima. Razlike u varijabilnim regijama imunoglobulinskih lanaca nazvane su idiotipovima. Proteolitička razgradnja imunoglobulina, ovisno o proteolitičkom enzimu, daje različite proteolitičke fragmente. Papain razgradi molekulu na tri fragmenta. Dva su identične i građena su od lakog lanca i VH-CH1 fragmenta teškog lanca. Oba fragmenta zadržavaju sposobnost vezanja antigena pa su nazvani Fab fragmentima. Treći je fragment građen od CH2 i CH3 domene teškog lanca i nazvan je Fc fragment. Efektorske funkcije protutijela Protutijela, vežući se za antigenske determinante bakterija, virusa, parazita i njihovih toksina, kao i lijekova, nautraliziraju njihove toksične i infekcijske mogućnosti. Dalje, protutijela aktiviraju komplement klasičnim putem, pri čemu nastaju efektorske molekule odgovorne za većinu citotoksičnih i upalnih učinaka humoralne imunoreakcije. Protutijela procesom opsonizacije značajno olakšavaju fagocitozu.

Sustav komplementa

Kompleks komplementa je sustav membranskih i serumskih proteina koji su međusobno funkcionalno povezani i čija aktivacija pokreće kaskadu međusobno precizno reguliranih međureakcija. Tri su načina kojima se može aktivirati sustav komplementa :


1. Klasični put aktivacije počinje prepoznavanjem i reagiranjem komponente C1 komplementa i protutijela. Protutijelo stječe sposobnost prepoznavanja C1 tek nakon vezanja sa specifičnim antigenom. Ta interakcija mijenja prostornu konfiguraciju protutijela pa se na Fc fragmentu otkriva vezno mjesto za C1. Tako komponenta C1 postaje enzim koji cijepa C4 i C2 čiji fragment tvore C3-konvertazu klasičnog puta. Najveću sposobnost aktiviranja komplementa imaju IgM. Aktivirati komplement klasičnim putem mogu i apoptotične stanice, neki virusi i bakterije, te CRP vezan za ligand.

2. Lektinski put aktivacije komplementa sličan je klasičnom putu. Za njegovu aktivaciju nisu potrebna protutijela pa ga smatramo jednim od nespecifičnih mehanizama imunosne obrane. Aktivacija tog puta počinje vezanjem serumskih lektina s manozom i drugim šećerima na površini mnogih mikroorganizama.

3. Alternativni put aktivacije također pripada nespecifičnim mehanizmima imunosne obrane jer za njegovu aktivaciju nije potreban kompleks antigena i antitijela. Aktivacija tog puta osniva se na neprekidnoj spontanoj hidrolizi C3 komponente.

Jedan od najvažnijih učinaka aktivacije komplementa je poticanje fagocitoze. Druga funkcija komplementa je i poticanje upalne reakcije. C3a, C4a i C5a mogu izravno uzrokovati povećanu propusnost kapilara, vazodilataciju i kontrakciju glatkih mišića. Osim toga, C3a i C5a vežu se za specifične receptore na mastocitima i bazofilima uzrokujući njihovu degranulaciju i oslobađanje tvari s vazoaktivnim djelovanjem kao što su histamin i TNF-α. Fragment C5a pokazuje i kemotaktičnu aktivnost.


TROMBOCITI

Proces diferencijacije matične stanice u megakariocite i njihovo sazrijevanje, te stvaranje trombocita naziva se trombocitopoezom. Megakariociti potječu iz pluripotentne matične stanice iz koštane srži, procesom endomitoze se višestruko umnožava DNA ali bez dijeljenja citoplazme i jezgre čime nastaju poliploidni megakariociti. Zatim u megakariocitima započinje citoplazmatska ekspanzija, uz akumulaciju citoplazmatskih proteina i granula esencijalnih za funkciju trombocita. Na kraju nastaju citoplazmatske ekstenzije nazvane protrombociti.

Trombociti su pločice, sadrže granule (α-granule, guste granule i lizosome), te

mitohondrije i ER. Tamne (guste) granule sadrže ADP/ATP, serotonin i kalcij; α-granule sadrže fibrinogen, PGDF, fibronektin, TF4, vWF, TGF, trombospondin, FV, FXI, PAI-1, HMWK, β tromboglobulin; u citoplazmi se nalazi otopljeni FXIII. Na površini neaktiviranih trombocita postoji niz glikoproteina i glikoproteinskih kompleksa (možda najvažniji GP IIb/IIIa, GP Ib/IX/V). Najvažniji faktor rasta megakariocitopoeze je trombopoetin. TPO stvaraju četiri organa: jetra, bubreg, koštana srž i slezena. Najveći dio se, ipak, stvara u jetri i bubregu. Megakarioblast je najnezrelija morfološki prepoznatljiva prethodna stanica trombocitne loze, veličine od oko 15 µm. Ova stanica podsjeća na mijeloblast. Citoplazma ima izdanke. Promegakariocit je veća stanica od megakarioblasta s velikom jezgrom koja je režnjata, gušćeg kromatina i izrazito modre citoplazme. Promegakariocit je velika stanica – 80 µm. Megakariocit je jednako velika stanica kao i promegakariocit. Jezgra mu je multilobulirana, gustog kromatina, a citoplazma je ružičasta zbog stvaranja trombocita. Uz tipične vrlo nezrele biljege (CD34, HLA-DR), najvažniji biljeg megakariocitne loze je trombocitni GPIIb/IIIa (CD41). Zreli megakariociti očituju i trombocitni faktor 4, von Willebrandov faktor, trombospondin i trombomodulin. Zreli megakariociti gube sposobnost proliferacije, ali posjeduju sposobnost povećane sinteze DNA. Zbog toga zreli megakariociti imaju veći volumen, nego druge stanice u koštanoj srži. Krajnji ishod razvoja megakariocita je otpuštanje trombocita u krvi opticaj. Trombociti nastaju iz citoplazme megakariocita stvaranjem izduženih tankih protruzija nazvanih protrombociti, koji se obično nalaze na dijelu membrane megakariocita u blizini endotelnih stanica koje oblažu sinusoide. Trombociti u perifernoj krvi žive 9–11 dana. Mladi trombocit iz koštane srži odlazi u slezenu, koja sadrži oko trećine trombocita. Trombociti su diskoidnog oblika, ne sadrže jezgru, ER ili Golgijevo tjelešce. Za obavljanje svoje funkcije ovise o proteinima sintetiziranim u megakariocitima.


POREMEĆAJI TROMBOCITA Hemostatski odgovor obuhvaća vazokonstrikciju krvne žile, stvaranje primarnog hemostatskog ugruška aktivacijom trombocita, stvaranje fibrina nakon aktivacije faktora koagulacije i fiziološku funkciju inhibitora hemostaze koji ograničavaju aktivaciju hemostaze na mjesto ozljede krvne žile i reguliraju sistem hemostaze kako bi se ovaj aktivirao samo kada je to potrebno. Poremećaji bilo koje od komponenti u procesu stvaranja ugruška može dovesti do krvarenja, a poremećaj regulacije dovodi do tromboze. KLINIČKE MANIFESTACIJE Poremećaji u komponenti primarne hemostaze (vaskulatura, trombocit) obično se očituju kao krvarenje iz kože (petehije, ehimoze, hematomi) ili mukoze (krvarenje iz nosa - epistakse, zubnog mesa ili menoragija – abnormalno krvarenje tijekom menstruacije). Ako se radi o poremećajima faktora koagulacije, obično se pojavljuju unutrašnja krvarenja, najčešće u duboka tkiva i zglobove. POREMEĆAJI TROMBOCITA Ulog trombocita je stvaranje primarnog hemostatskog ugruška. Za to je potreban adekvatan broj cirkulirajućih trombocita sa očuvanom funkcijom. Stoga se poremećaji trombocita dijele na

1. kvantitativne (brojčane) – trombocitopenija i trombocitoza 2. kvalitativne (funkcionalne) – obuhvaćaju poremećaje funkcije trombocita.

KVANTITATIVNI POREMEĆAJI TROMBOCITA Broj trombocita (Trc) se određuje na automatskom analizatoru i rjeđe brojenjem pod mikroskopom, kada se može vidjeti i njihova morfologija i veličina. Trombocitopenijom se smatra broj trombocita manji od 150x109/L, međutim klinički simptomi (po život opasna krvarenja) se pojavljuju kada broj trombocita padne ispod 50. Kod bolesnika sa trombocitopenijom je vrijeme krvarenja produženo (ova se pretraga više ne radi). Trombocitopenija sama po sebi nije bolest, već je simptom neke bolesti u podlozi. Ovisno o patofiziološkom mehanizmu nastanka, trombocitopenija se može podijeliti na 5 kategorija:

� Trombocitopenija zbog povećane destrukcije - najčešća, obilježena smanjenim životnim vijekom trombocita; trombociti se eliminiraju iz krvi brže nego ih koštana srž može stvarati; uzroci mogu biti imune i neimune etiologije.

� Trombocitopenija zbog smanjene sinteze (slabost koštane srži u sintezi trombocita)

� Povećana sekvestracija u slezeni � Dilucijska trombocitopenija � Stanja sa višestrukim uzrocima trombocitopenije.


A. Trombocitopenija zbog povećane destrukcije Imunološki posredovana destrukcija trombocita uzrokovana je pojavom antitijela na trombocite (analogno antitijelima u imunim hemolitičnim anemijama). Antitijela se vežu na trombocite, a ovi se posljedično uklanjaju djelovanjem mononuklearno-

makrofagnog sistema u slezeni (i jetri). Monociti i makrofagi imaju Fcγ-receptore kojima prepoznaju i vežu antitijelima obložene trombocite. Antitijela (IgG, IgA) se vežu na trombocite Fab fragmentom za GP IIb/IIIa ili Ib/IX ili nespecifičnim vezanjem imunih kompleksa za trombocitne Fc receptore. Broj megakariocita u koštanoj srži je povećan kao rezultat stimulacije TPO-om. MPV je kod imunih trombocitopenija povećan, što može ukazivati na dijagnozu. Najčešći oblik je imuna trombocitopenična purpura ITP, autoimuni poremećaj sa autoreaktivnim antitijelima na trombocite.

HEPARINOM INDUCIRANA TROMBOCITOPENIJA (HIT) Može biti uzrokovana imunim i neimunim mehanizmom. Heparin se koristi u prevenciji i liječenju tromboza. Kod nekih bolesnika heparin uzrokuje izravnu aktivaciju Trc (neimuni mehanizam). HIT je termin rezerviran za imuni mehanizam nastanka trombocitopenije. Radi se o imuno destrukciji Trc posredovanoj IgG antitijelima, a u ovisnosti o prisutnosti heparina. Trc-aktivirajuća IgG prepoznaju kompleske PF4 sa heparinom u cirkulaciji. Naime, PF4 se oslobađa iz Trc tijekom aktivacije, veže se za heparin u cirkulaciji, i taj kompleks inducira stvaranje At. Kompleks PF4-heparin-At se zatim veže za površinu Trc, uzrokujući destrukciju Trc i trombocitopeniju. U rijetkim slučajevima kompleks PF4-heparin-At može aktivirati sistem zgrušavanja i dovesti do tromboze. Povećana destrukcija trombocita može biti uzrokovana i neimunim mehanizmima. Trombociti se aktiviraju i troše agregacijom u cirkulaciji u poremećajima kao što su DIK, TTP (trombotska trombocitopenična purpura) i HUS (hemolitično uremični sindrom), HELLP sindrom. Mehanička destrukcija trombocita može se dogoditi u pacijenata sa umjetnim zaliscima ili vaskularnim presadcima.


B. Trombocitopenija zbog smanjene sinteze Poremećaji koštane srži u sintezi adekvatnog broja Trc za periferiju. Primarni se poremećaj utvrđuje pregledom koštane srži. Smanjeni broj Trc na periferiji posljedica je hipoplazije megakariocita u koštanoj srži, neučinkovite trombocitopoeze, ili nasljednog poremećaja u sintezi megakariocita. Nasljedne trombocitopenije su rijetke bolesti, nepoznate frekvencije jer postoji problem dijagnosticiranja. Uglavnom se nasljeđuju autosomno dominantno. Klasifikacija se obično temelji na veličini trombocita te prisutnosti/odsutnosti kliničkih značajki uz trombocitopeniju (sindromske ili nesindromske). Nasljedne trombocitopenije prema veličini Trc: � Mikrotrombociti (MPV do 7 fL) - sindrom Wiskott-Aldrich (WAS gena) i X-vezana

trombocitopenija (XLT); oba su poremećaja spolno vezana i nastaju zbog mutacije WAS gena; obilježene su trombocitopenija (


C. Povećana sekvestracija u slezeni Obično se u slezeni pohranjuje oko 1/3 Trc, taj je pool u ravnoteži sa cirkulirajućim Trc. U stanjima kongestivne splenomegalije, reaktivne splenomegalije ili hipesplenizma, kada je slezena povećana, u njoj se skladišti veći broj Trc (čak i do 90% od ukupne populacije), što rezultira trombocitopenijom. Splenomegalija se pojavljuje kod ciroze jetre, hemolitičke anemije, leukemijama, limfomima. I drugim poremećajima.

D. Dilucijska trombocitopenija Nakon davanja velikih volumena suptituenata plazme, nakon obilnih krvarenja.

E. Pseudotrombocitopenija In vitro artefakt koji se odnosi se na lažno sniženi broj trombocita kod određivanja na automatskom brojaču. Najčešće je EDTA posredovana. Vidi pogreške analizatora. Trombocitozom se smatra broj trombocita iznad gornje granice referentnog raspona. Uzroci su trombocitozi slijedeći:

1. primarna trombocitoza - obuhvaća esencijalnu trombocitozu, CML, policitemiju veru i dr. (Trc iznad 1000, u koštanoj srži hiperplazija megakariocita)

2. sekundarna (reaktivna) trombocitoza - kao posljedica akutnog krvarenja, operacije, nakon splenektomije, tijekom oporavka od alkoholom inducirane trombocitopenije i kemoterapije, zbog malignih bolesti, kroničnih upalnih procesa, anemije zbog nedostatka željeza i hemolitičke anemije

3. prolazna trombocitoza - nakon tjelovježbe, adrenalina, poroda.

KVALITATIVNI (FUNKCIONALNI) POREMEĆAJI TROMBOCITA Poremećaji mogu zahvatiti adheziju, agregaciju, prokoagulantne funkcije trombocita te izlučivanje sadržaja iz granula (ADP, TxA2). Nakon ozljede krvne žile trombociti adheriraju na subendotel izložen struji krvi (adhezija), zatim se aktiviraju (aktivacija) i secerniraju sadržaj iz granula (sekrecija) kao ADP i serotonin, koji interakcijom sa drugim trombocitnim receptorima u područje ozljede privlače dodatne trombocite (agregacija). Klasifikacija nasljednih poremećaja trombocita prema patološkoj funkciji (ili strukturi):

1. primarni poremećaji interakcije trombocita i stijenke krvne žile (poremećaji adhezije) - vWB i Bernard-Soulierov sindrom

2. primarni poremećaji interakcije između trombocita (poremećaji agregacije) - kongenitalna afibrinogenemija i Glanzmannova trombastenija

3. poremećaji trombocitnih granula, izlučivanja i prijenosa signala - storage pool diseases, poremećaji izlučivanja i prijenosa signala

4. poremećaji prokoagulacijske funkcije trombocita - poremećaji fosfolipidne mebrane Scottov sindrom, abnormalni trombocitni FV (FV New York)


5. poremećaji strukturnih ili citoskeletnih komponenti u trombocitima - MYH9 udruženi poremećaji, Wiskott-Aldrichov sindrom, trombocitna sferocitoza

1. Poremećaji adhezije (poremećaji trombocitnih receptora za adhezijske proteine) Adhezija na kolagen zahtjeva prisutnost adekvatne količine funkcionalnog vWF i prisutnost funkcionalnog receptora GP Ib/IX na trombocitnoj membrani. Obzirom da je adhezija na kolagen poremećena, agregacija i stvaranje primarnog hemostatskog ugruška su također poremećeni.

� Poremećaji glikoproteinskog kompleksa GP Ib-IX-V: o Bernard-Soulierov sindrom (BSS) o Trombocitni tip VWB ili pseudo VWB.

Dijagnostički test za gore navedene bolesti je test agregacije trombocita. BERNARD-SOULIEROV SINDROM (BSS) Obilježen umjerenom do izraženom trombocitopenijom i poremećenom funkcijom trombocita. Homozigoti imaju povećanu tendenciju krvareanju, dok heterozigoti nemaju značajne simptome krvarenja. Broj trombocita iznosi od 40x109/L do gotovo normalnih vrijednosti, prisutni su i

makrotrombociti u 60-80% (giant platelet syndrome), veličina Trc i do 20 µm (izrazito veliki) što se vidi u razmazu periferne krvi. Kao posljedica mutacije u genu dolazi do smanjene/izostale ekspresije kompleksa GPIb-IX na površini trombocita (receptor za vWF). Zbog nedostatka funkcionalnog receptora za vWF, nema vezanja trombocita za vWF i stoga izostaje adhezija trombocita na kolagen. Nasljeđuje se autosomno recesivno, učestalost je 1 na milijun. Uloga laboratorijske dijagnostike Za diferencijalnu dijagnozu drugih funkcionalnih poremećaja Trc i ostalih trombocitopenija. Pregledom periferne krvi nalaze se povećani trombociti i trombocitopenija. Vrijeme krvarenja (po Ivy-u) je produženo što ukazuje na poremećaj funkcije trombocita. Agregacija trombocita sa ADp-om, kolagenom i adrenalinom je normalna. Ali, izostaje aglutinacija Trc s ristocetinom, koja zahtjeva prisutnost vWF i GPIb/IX. Slični agregacijski odgovor dobiva se u slučaju vWB. Kako bi se one razlikovale, koristi se modifikacija ristocetinskog aglutinacijskog testa. Pacijentovim se trombocitima dodaje normalna plazma (dakle vWF), ako nema korekcije ristocetinskog testa radi se o BSS-u. Liječi se transfuzijama koncentrata trombocita. Trombocitni tip vWB (pseudo vWB) Posljedica je poremećene funkcije receptora GPIbα, koji pokazuje povećanu avidnost spram vWF i na taj način veže veće multimere te trombocite u stanju mirovanja, što rezultira njihovim uklanjanjem iz cirkulacije.


2. Poremećaji agregacije (receptora IIb-IIIa) Ključni protein u agregaciji je fibrinogen i njegov receptor na trombocitu GPIIb/IIIa. Ako se radi o nedostatku bilo koje od ovih komponenata, izostaje međusobna interakcija trombocita i nema primarne i sekundarne agregacije.

� Poremećaji glikoproteinskog kompleksa GPIIb-IIIa (ααααIIb-ββββ3) o Glanzmannova trombastenija.

GLANZMANNOVA TROMBASTENIJA (GT) Urođeni poremećaj u kojem je smanjena ili nema ekspresije kompleksa GPIIb/IIIa koji je receptor za Fbg. Fibrinogen je, uz kalcij, odgovoran za premošćivanje dva trombocita prilikom agregacije. Agregacija trombocita u ovom poremećaju izostaje jer trombociti nemaju mjesto za vezanje fibrinogena. Klinički se simptomi očituju samo u homozigota. Poremećaj nastaje zbog mutacija ili delecija u genima za GPIIb i GPIIIa (na kromosomu 17). Nasljeđuje se autosomno recesivno. Simptomi krvarenja su blagi: purpura, epistaksa, menoragija, krvarenja iz desni. Uloga laboratorijske dijagnostike Broj trombocita, njiohova veličina i oblik su normalni. Vrijeme krvarenja je izrazito produženo. Izostaje retrakcija ugruška što ukazuje na poremećaj funkcije Trc. Poremećaj je obilježen izostalom agregacijom trombocita sa svim agonistima (ADP, adrenalin, kolagen) zbog toga što na Trc nema mjesta za vezanje fibrinogena (nema agregacije). Normalna je aglutinacjia prisutna samo uz ristocetin. Nedostatak GPIb ili GPIIIa može se identificirati protočnom citometrijom. Terapija je suportivna, učestale transfuzije kada su potrebne. 3. Poremećaji trombocitnih granula (storage pool diseases) Nedostaju same granule ili je nedovoljno njihovog sadržaja u trombocitima i megakariocitima.

� Poremećaji zbog nedostatka δ (gustih) granula (sindrom tamnih granula, δ SPD - storage pool deficiency), obilježeni abnormalnom agregaci

Sadržaj - andragog.hr · Stranica 5 | proteinske Ag. U limfnim se čvorovima zbiva imunološka reakcija na Ag iz limfne cirkulacije. HEMATOPOEZNE MATIČNE STANICE Stanice koje cirkuliraju

Text of Sadržaj - andragog.hr · Stranica 5 | proteinske Ag. U limfnim se čvorovima zbiva imunološka...

10-Dioba stanice

Biologija stanice

KARAKTER NJEZINA - andragog.hr · slom kraljevine jugoslavije, uspostava nezavisne drŽave hrvatske i karakter njezina reŽima

Građa biljne stanice

Prezentacija Crpne Stanice

BIOPLYNOVÉ STANICE - eAGRI

BusPlus - stanice

Distributivne transformatorske stanice

Čerpací stanice 07/2011

Novell: Pracovní stanice

GEOSTACIONÁRNE STANICE

Poslovni red stanice

6269 is Autobusne Stanice

Pumpna Stanice

UNIVENTA, s.r.o. Výmenníkové stanice (BOST) · Odovzdávajúce stanice tepla, resp. bytové výmenníkové stanice (BOST) predstavujú významný prínos pri obnove bytového fondu

CRPNE STANICE

Čerpací stanice říjen 2011

Základní prvky počítačové stanice:

Mezinárodní vesmírná stanice

Chovatelská stanice Pupak

Autobuske stanice (Autobusne stanice)

Autobuske stanice

Odborný seminář Elektrické stanice

Oštećenje stanice

Krv i krvne stanice

Servisne stanice

Matične stanice

TELSIKS Lokalne Radio Stanice

4 - Upravljačke stanice i kutije ... - alfa-elektro.com stanice Schneider.pdf · 179 4 Upr avljačke stanice Ø22 XAL upravljačke stanice za Harmony ® stil 5 Ø22 signalno upravljački

Kemijski sastav stanice

Documents

Sadržaj - andragog.hr · Stranica 5 | proteinske Ag. U limfnim se čvorovima zbiva imunološka reakcija na Ag iz limfne cirkulacije. HEMATOPOEZNE MATIČNE STANICE Stanice koje cirkuliraju

Text of Sadržaj - andragog.hr · Stranica 5 | proteinske Ag. U limfnim se čvorovima zbiva imunološka...