RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2211846

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 28.11.2008 08854467.1 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 27.02.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/09 EP 2211846 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. A61K 31/047 (2006.01) A61K 31/197 (2006.01) A61K 31/27 (2006.01) A61K 31/4164 (2006.01) A61K 31/4178 (2006.01) A61K 31/485 (2006.01) A61K 31/567 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Nowe podejścia terapeutyczne do leczenia CMT i pokrewnych zaburzeń

PL/E

P 22

1184

6 T3

(30) Pierwszeństwo:

30.11.2007 EP 07301614 03.12.2007 US 991800 P

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

04.08.2010 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/31

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.09.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/09

(73) Uprawniony z patentu:

Pharnext, Issy les Moulineaux, FR

(72) Twórca(y) wynalazku:

DANIEL COHEN, Le Vésinet, FR ILYA CHUMAKOV, Vaux Le Penil, FR OXANA GUERASSIMENKO, Milly-la-Foret, FR SERGUEI NABIROCHKIN, Chatenay Malabry, FR

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Tykarski

SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SPÓŁKA JAWNA skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

SGS-3632/VAL EP 2 211 846 B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji do stosowania w leczeniu choroby Char-cota-Mariego-Tootha i pokrewnych zaburzeń. [0002] Choroba Charcota-Mariego-Tootha („CMT”) jest genetyczną sierocą polineuropatią obwodową. Choroba ta, dotykająca w przybliŜeniu 1 na 2500 osobników, jest najczęstszą dziedziczną chorobą obwodowego układu nerwowego. Pojawia się zwykle w pierwszej lub 5 drugiej dekadzie Ŝycia, chociaŜ moŜna ją wykryć w okresie niemowlęcym. Przebieg cho-roby jest przewlekły ze stopniowym zwyrodnieniem nerwów i mięśni. Choroba prowadzi do kalectwa z przypadkami towarzyszącego bólu neurologicznego i skrajnej niesprawności mięśni. CMT jest jedną z najlepiej zbadanych patologii genetycznych z około 30000 przy-padków we Francji. Podczas gdy większość pacjentów z CMT zawiera duplikację frag-10 mentu chromosomu 17 zawierającego gen mieliny: PMP22 (postać CMT1A), dwadzieścia genów jest zaangaŜowanych w róŜne postacie CMT. Zgodnie z tym, mimo iŜ jest pocho-dzenia jednogenowego, ten stan patologiczny wykazuje kliniczną niejednorodność ze względu na moŜliwe geny modulatorowe. Zmutowane geny u pacjentów z CMT skupiają się wokół ściśle połączonych szlaków molekularnych wpływających na róŜnicowanie ko-15 mórek Schwanna lub neuronów albo zmieniających wzajemne oddziaływania między tymi komórkami w nerwach obwodowych. [0003] PMP22 jest głównym składnikiem mieliny eksprymowanym w zbitym fragmencie zasadniczo wszystkich mielinowanych włókien w obwodowym układzie nerwowym i jest wytwarzane głównie przez komórki Schwanna. Niewielką, 1,5-krotną nadekspresję prawi-20 dłowego białka PMP22 obserwuje się takŜe w komórkach Schwanna heterozygotycznych pod względem duplikacji u pacjentów z CMT (w niektórych rzadkich przypadkach, feno-typ podobny do CMT1A moŜe być takŜe związany ze strukturalnymi mutacjami w białku PMP22) (Lupski i in., 1992; Suter i in., 1992; Roa i in., 1993; Thomas i in., 1997; Suter i Scherer, 2003; Nave i Sereda, 2007). Bezpośrednie dowody na to, Ŝe nieprawidłowa dawka 25 genu PMP22 wywołuje fenotyp podobny do CMT1A dostarczono na podstawie ekspery-mentów transgenicznych w modelach gryzoni z nadekspresją białka PMP22 (Niemann i in., 1999; Perea i in., 2001; Robaglia-Schlupp i in., 2002; Meyer i in., 2006; Sereda i Nave, 2006). Grandis i in., 2005 podsumowują pojawiające się terapie róŜnych typów choroby Charcota-Mariego-Tootha, takie jak zastosowanie onapristonu, specyficznego inhibitora 30 receptora progesteronu (Sereda i in., 2003; Meyer zu Horste i in., 2007), oraz zastosowanie kwasu askorbinowego (Passage i in., 2004), które mogą obniŜyć ekspresję PMP22 u trans-genicznych zwierząt łagodząc lub spowalniając rozwój fenotypu chorobowego. Dla pa-cjentów z CMT nie ma jednak dostępnych Ŝadnych skutecznych terapii farmakologicznych i istnieje duŜe zapotrzebowanie na leki do leczenia CMT i pokrewnych zaburzeń. 35 [0004] Istniejące dane eksperymentalne wskazują na to, Ŝe białko PMP22 jest nie tylko strukturalnym składnikiem otoczek mielinowych, ale takŜe waŜnym białkiem regulatoro-wym, wpływającym na liczne cechy fenotypowe w komórkach Schwanna. Dokładny me-chanizm łączący nieprawidłowy poziom białka z modyfikacją jego funkcji w komórce gle-jowej z mutacją CMT1A nie jest w pełni zrozumiany, ale zaczynają wyłaniać się pewne 40 mechanizmy komórkowe potencjalnie wyjaśniające jego szkodliwy wpływ na biologię komórek Schwanna. [0005] Przeszukiwanie publicznie dostępnych danych, opisujących molekularne mechani-zmy i patologiczne objawy choroby CMT1A, umoŜliwiło uszeregowanie pod względem waŜności kilku funkcjonalnych modułów komórkowych – transkrypcyjnej regulacji genu 45 PMP22, zwijania/rozkładu PMP22, proliferacji i apoptozy komórek Schwanna, odkładania i przebudowy substancji międzykomórkowej, odpowiedzi immunologicznej – jako poten-cjalnych słusznych celów do interwencji terapeutycznych stosownych dla CMT. Połączony

2

wpływ tych rozregulowanych modułów funkcjonalnych na początku i podczas rozwoju patologicznych objawów choroby Charcota-Mariego-Tootha tłumaczy potencjalną sku-teczność kombinatorycznego leczenia CMT. [0006] Po wstępnym zbudowaniu dynamicznego modelu stanu patologicznego CMT, wy-selekcjonowano dostępne w handlu leki generyczne ukierunkowane na funkcjonalną regu-5 lację szlaków komórkowych stosownych dla choroby CMT1A.

Streszczenie wynalazku

[0007] Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych podejść terapeutycznych do leczenia CMT i pokrewnych zaburzeń. Kompozycje według niniejszego wynalazku są uŜy-teczne do modulacji ekspresji PMP22 u osobnika. 10 [0008] Twórcy wynalazku zidentyfikowali róŜne szlaki, które moŜna regulować u osobni-ka, aby złagodzić CMT i pokrewne zaburzenia. Twórcy wynalazku zidentyfikowali takŜe kilka leków, które, w połączeniu(-ach), mogą skutecznie wpływać na takie szlaki prowa-dzące do CMT i zaburzeń pokrewnych, i stanowią nową terapię do leczenia tych zaburzeń. [0009] Wynalazek dostarcza zatem nowe kompozycje i sposoby leczenia choroby CMT i 15 zaburzeń pokrewnych. [0010] Przedmiot tego wynalazku dotyczy kompozycji zdefiniowanej w zastrzeŜeniach. [0011] Ten wynalazek ujawnia takŜe zastosowanie połączenia związków do (wytwarzania leku do) leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, przy czym te związki są wybrane spo-śród agonisty receptora GABA-B, agonisty receptora muskarynowego, antagonisty recep-20 tora hormonu steroidowego, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji D-sorbitolu, anta-gonisty lub częściowego antagonisty receptora opioidowego, inhibitora sygnalizacji hor-monów tarczycy, aktywatora ERK (kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym) i inhibitora kinazy pAkt, inhibitora COX, oraz dowolnego(-ych) ich połączenia(-eń). Ten związek moŜe być lekiem lub przeciwciałem (lub jego fragmentem lub pochodną), biał-25 kiem lub peptydem. [0012] Inny przedmiot wynalazku dotyczy zastosowania połączeń związków wybranych spośród: związku A: D-Sorbitolu (CAS 50-70-4) i jego moŜliwych soli; związku B: Baklo-fenu (CAS 1134-47-0 i CAS 63701-56-4 dla chlorowodorku baklofenu) i jego moŜliwych soli; związku C: Pilokarpiny (CAS 92-13-7 i CAS 54-71-7 dla chlorowodorku polikarpiny) 30 i jej moŜliwych soli; związku D: Naltreksonu (CAS 16590-41-3 i CAS 16676-29-2 dla chlorowodorku naltreksonu) i jego moŜliwych soli; związku E: Metimazolu (CAS 60-56-0) i jego moŜliwych soli; związku F: Mifepristonu (CAS 84371-65-3) i jego moŜliwych soli; Montelukastu (CAS 158966-92-8) i jego moŜliwych soli; Ketoprofenu (CAS 22071-15-4 i CAS 57495-14-4 dla soli sodowej Ketoprofenu) i jego moŜliwych soli; związku G, do (wy-35 twarzania leku do) leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia. [0013] Wynalazek ujawnia zastosowanie związku wybranego spośród Acetazolamidu (CAS59-66-5 i CAS 1424-27-7 dla postaci soli sodowej) i jego moŜliwych soli; Aminoglu-tetimidu (CAS 125-84-8) i jego moŜliwych soli; Aztreonamu (CAS78110-38-0 i CAS80581-86-8 istnieje dla soli disodowej Aztreonamu) i jego moŜliwych soli; Baklofenu 40 (CAS 1134-47-0 i CAS 63701-56-4 dla chlorowodorku baklofenu) i jego moŜliwych soli; Balsalazydu (CAS 80573-04-2, 150399-21-6 (postać soli disodowej), 213594-60-6 (postać soli disodowej) i 82101-18-6) i jego moŜliwych soli; Bikalutamidu (CAS 90357-06-5) i jego moŜliwych soli; Bromokryptyny (CAS 25614-03-3 i CAS 22260-51-1 dla postaci me-sylanu) i jej moŜliwych soli; Bumetanidu (CAS 28395-03-1) i jego moŜliwych soli; Buspi-45 ronu (CAS 36505-84-7 i CAS 33386-08-2 dla postaci chlorowodorku) i jego moŜliwych soli; Cyprofloksacyny (CAS 85721-33-1 i CAS 86393-32-0 dla postaci chlorowodorku) i jej moŜliwych soli; Klonidyny (CAS 4205-90-7 i CAS 4205-91-8 dla postaci chlorowo-dorku) i jej moŜliwych soli; Cyklosporyny A (CAS 59865-13-3) i jej moŜliwych soli; Di-sulfiramu (CAS 97-77-8) i jego moŜliwych soli; Eksemestanu (CAS 107868-30-4) i jego 50 moŜliwych soli; Felbamatu (CAS 25451-15-4) i jego moŜliwych soli; Fenofibratu (CAS

3

49562-28-9) i jego moŜliwych soli; Finasterydu (CAS 98319-26-7) i jego moŜliwych soli; Flumazenilu (CAS 78755-81-4) i jego moŜliwych soli; Flunitrazepamu (CAS 1622-62-4) i jego moŜliwych soli; Furosemidu (CAS 54-31-9) i jego moŜliwych soli; Gabapentyny (CAS 60142-96-3) i jej moŜliwych soli; Galantaminy (CAS 357-70-0 i CAS 1953-04-4 dla postaci bromowodorku) i jej moŜliwych soli; Haloperidolu (CAS 52-86-8) i jego moŜli-5 wych soli; Ibuprofenu (CAS 15687-27-1 i CAS 31121-93-4 dla soli sodowej) i jego moŜ-liwych soli; Izoproterenolu (CAS 7683-59-2, CAS 51-30-9 dla postaci chlorowodorku, CAS 5984-95-2 (Chlorowodorek (-) Izoproterenolu)) i jego moŜliwych soli; L-karnityny (CAS 541-15-1 i CAS 6645-46-1 dla postaci chlorowodorku) i jej moŜliwych soli; Lioty-roniny (T3) (CAS 6893-02-3 i CAS 55-06-1 dla soli sodowej) i jej moŜliwych soli; Losar-10 tanu (CAS 114798-26-4 i CAS 124750-99-8 dla soli potasowej) i jego moŜliwych soli; Loksapiny (CAS 1977-10-2 oraz CAS 27833-64-3 i CAS 54810-23-0 odpowiednio dla po-staci bursztynianu i chlorowodorku) i jej moŜliwych soli; Metaproterenolu (CAS 586-06-1 i CAS 5874-97-5 dla postaci siarczanu) i jego moŜliwych soli; Metaraminolu (CAS 54-49-9 i CAS 33402-03-8 dla postaci dwuwinianu) i jego moŜliwych soli; Metforminy (CAS 15 657-24-9 i CAS 1115-70-4 dla postaci chlorowodorku) i jej moŜliwych soli; Metimazolu (CAS 60-56-0) i jego moŜliwych soli; Metyloergonowiny (CAS 113-42-8 i CAS 57432-61-8 odpowiadający soli maleinianowej) i jej moŜliwych soli; Metopironu (CAS 54-36-4) i jego moŜliwych soli; Metoprololu (CAS 37350-58-6, CAS 51384-51-1 i CAS 56392-17-7 (postaci winianu)) i jego moŜliwych soli; Mifepristonu (CAS 84371-65-3) i jego moŜli-20 wych soli; Nadololu (CAS 42200-33-9) i jego moŜliwych soli; Naloksonu (CAS 465-65-6 i CAS 51481-60-8 dla dwuwodnego chlorowodorku) i jego moŜliwych soli; Naltreksonu (CAS 16590-41-3 i CAS 16676-29-2 dla chlorowodorku naltreksonu) i jego moŜliwych soli; Norfloksacyny (CAS 70458-96-7) i jej moŜliwych soli; Pentazocyny (CAS 359-83-1, CAS 7361-76-4 dla postaci Pentazocyny (+), CAS 17146-95-1 dla postaci mleczanu, CAS 25 64024-15-3 dla postaci chlorowodorku) i jej moŜliwych soli; Fenoksybenzaminy (CAS 59-96-1, CAS 63-92-3 dla postaci chlorowodorku) i jej moŜliwych soli; Fenylomaślanu (CAS 1716-12-7, który odpowiada postaci soli sodowej; CAS 1821-12-1 który odpowiada kwa-sowi 4-fenylomasłowemu) i jego moŜliwych soli; Pilokarpiny (CAS 92-13-7 i CAS 54-71-7 dla chlorowodorku pilokarpiny) i jej moŜliwych soli; Pioglitazonu (CAS 111025-46-8, 30 CAS 112529-15-4 dla postaci chlorowodorku) i jego moŜliwych soli; Prazosyny (CAS 19216-56-9, CAS 19237-84-4 dla postaci chlorowodorku) i jej moŜliwych soli; Raloksyfe-nu (CAS 84449-90-1, CAS 82640-04-8 dla postaci chlorowodorku) i jego moŜliwych soli; Rifampiny (CAS 13292-46-1) i jej moŜliwych soli; Symwastatyny (CAS 79902-63-9) i jej moŜliwych soli; D-Sorbitolu (CAS 50-70-4) i jego moŜliwych soli; Spironolaktonu (CAS 35 52-01-7) i jego moŜliwych soli; Tamoksyfenu (CAS 10540-29-1, CAS 54965-24-1 dla po-staci cytrynianu) i jego moŜliwych soli; Trilostanu (CAS 13647-35-3) i jego moŜliwych soli; Kwasu walproinowego (CAS 99-66-1, CAS 1069-66-5 i CAS 76584-70-8 odpowied-nio dla postaci soli sodowej i diwalproeksu sodu) i jego moŜliwych soli; Karbamazepiny (CAS 298-46-4, CAS 85756-57-6 dla postaci dihydratu) i jej moŜliwych soli; Ketoprofenu 40 (CAS 22071-15-4 i CAS 57495-14-4 dla soli sodowej Ketoprofenu) i jego moŜliwych soli; Flurbiprofenu (CAS 5104-49-4, CAS 51543-39-6 i CAS 51543-40-9 odpowiadające enan-cjomerom S i R); CAS 56767-76-1 odpowiadający postaci soli sodowej) i jego moŜliwych soli; Diklofenaku (CAS 15307-86-5, CAS 15307-79-6 dla postaci soli sodowej; CAS 15307-81-0 dla postaci soli potasowej) i jego moŜliwych soli; Meloksykamu (CAS 71125-45 38-7) i jego moŜliwych soli; Takrolimusu (CAS 104987-11-3, CAS 109581-93-3 dla mo-nohydratu w postaci substancji stałej) i jego moŜliwych soli; Diazepamu (CAS 439-14-5) i jego moŜliwych soli; Dutasterydu (CAS 164656-23-9) i jego moŜliwych soli; Indometacy-ny (CAS 53-86-1, CAS 74252-25-8 i 7681-54-1 dla 2 postaci soli sodowych) i jej moŜli-wych soli; Dinoprostonu (CAS 363-24-6) i jego moŜliwych soli; Karbacholu (CAS 51-83-50 2, CAS 462-58-8, który odpowiada węglanowi choliny (ester)) i jego moŜliwych soli; Es-tradiolu (CAS 50-28-2 i 57-91-0 odpowiednio dla postaci beta i alfa) i jego moŜliwych so-

4

li; Kurkuminy (CAS 458-37-7) i jej moŜliwych soli; Litu (CAS 7439-93-2, CAS 554-13-2 i 919-16-4 dla bezwodnych postaci węglanu i cytrynianu; CAS 7447-41-8 dla postaci chlorku) i jego moŜliwych soli; Rapamycyny (CAS 53123-88-9) i jej moŜliwych soli; Be-tainy (CAS 2218-68-0, dla chloralu betainy; CAS 107-43-7, 17146-86-0, 590-46-5, 590-47-6 odpowiadają odpowiednio postaciom betainy, monohydratu betainy, chlorowodorku 5 betainy i monohydratu betainy) i jej moŜliwych soli; Trehalozy (CAS 4484-88-2) i jej moŜliwych soli; Amilorydu (CAS 2016-88-8, odpowiadający bezwodnemu chlorowodor-kowi; CAS 2609-46-3 odpowiadający amilorydowi (zidentyfikowanemu w IPA)) i jego moŜliwych soli; Albuterolu (CAS 18559-94-9, CAS 51022-70-9 dla postaci siarczanu) i jego moŜliwych soli, lub ich połączenia(-eń), do (wytwarzania leku do) leczenia CMT lub 10 pokrewnego zaburzenia. [0014] Dalszy przedmiot tego wynalazku dotyczy zastosowania połączenia co najmniej dwóch związków wybranych spośród D-Sorbitolu (związek A); Baklofenu (związek B); Pilokarpiny (związek C); Naltreksonu (związek D); Metimazolu (związek E); Mifepristonu (związek F) i Ketoprofenu (związek G), lub ich soli, do stosowania w leczeniu CMT lub 15 pokrewnego zaburzenia. [0015] Ten wynalazek ujawnia takŜe zastosowanie związku wybranego spośród D-Sorbito-lu (związek A); Baklofenu (związek B); Pilokarpiny (związek C); Naltreksonu (związek D); Metimazolu (związek E); Mifepristonu (związek F) i Ketoprofenu (związek G) lub ich soli, proleków lub agonistów, do wytwarzania leku do leczenia CMT lub pokrewnego za-20 burzenia. Ten wynalazek ujawnia takŜe zastosowanie połączenia co najmniej dwóch związków wybranych spośród Acetazolamidu; Aminoglutetimidu; Aztreonamu; Baklofenu Balsalazydu; Bikalutamidu; Bromokryptyny; Bumetanidu; Buspironu; Cyprofloksacyny; Klonidyny; Cyklosporyny A; Disulfiramu; Eksemestanu; Felbamatu; Fenofibratu; Finaste-rydu; Flumazenilu; Flunitrazepamu; Furosemidu; Gabapentyny; Galantaminy; Haloperido-25 lu; Ibuprofenu; Izoproterenolu; L-Karnityny; Liotyroniny (T3); Losartanu; Loksapiny; Me-taproterenolu; Metaraminolu; Metforminy; Metimazolu; Metyloergonowiny; Metopironu; Metoprololu; Mifepristonu; Montelukastu; Nadololu; Naltreksonu; Naloksonu; Norfloksa-cyny; Pentazocyny; Fenoksybenzaminy; Fenylomaślanu; Pilokarpiny; Pioglitazonu; Prazo-syny; Raloksyfenu; Rifampiny; Symwastatyny; Spironolaktonu; Tamoksyfenu; Trilostanu; 30 Kwasu walproinowego; Karbamazepiny; Ketoprofenu; Flurbiprofenu; Diklofenaku; Me-loksykamu; D-Sorbitolu; Takrolimusu; Diazepamu; Dutasterydu; Indometacyny; Dinopro-stonu; Karbacholu; Estradiolu; Kurkuminy; Litu; Rapamycyny; Betainy; Trehalozy; Ami-loridu; Albuterolu lub ich soli do (wytwarzania leku do) leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia. 35 [0016] Wynalazek ujawnia zastosowanie co najmniej dwóch związków wybranych spośród D-Sorbitolu (związek A); Baklofenu (związek B); Pilokarpiny (związek C); Naltreksonu (związek D); Metimazolu (związek E); Mifepristonu (związek F), Ketoprofenu (związek G) lub ich soli, do (wytwarzania leku do) obniŜania ekspresji PMP22 u osobnika z CMT lub pokrewnym zaburzeniem. 40 [0017] Wynalazek ujawnia zastosowanie połączenia co najmniej dwóch związków wybra-nych spośród Acetazolamidu; Aminoglutetimidu; Aztreonamu; Baklofenu Balsalazydu; Bikalutamidu; Bromokryptyny; Bumetanidu; Buspironu; Cyprofloksacyny; Klonidyny; Cyklosporyny A; Disulfiramu; Eksemestanu; Felbamatu; Fenofibratu; Finasterydu; Fluma-zenilu; Flunitrazepamu; Furosemidu; Gabapentyny; Galantaminy; Haloperidolu; Ibuprofe-45 nu; Izoproterenolu; L-Karnityny; Liotyroniny (T3); Losartanu; Loksapiny; Metaprotereno-lu; Metaraminolu; Metforminy; Metimazolu; Metyloergonowiny; Metopironu; Metoprolo-lu; Mifepristonu; Montelukastu; Nadololu; Naltreksonu; Naloksonu; Norfloksacyny; Pen-tazocyny; Fenoksybenzaminy; Fenylomaślanu; Pilokarpiny; Pioglitazonu; Prazosyny; Ra-loksyfenu; Rifampiny; Symwastatyny; Spironolaktonu; Tamoksyfenu; Trilostanu; Kwasu 50 walproinowego; Karbamazepiny; Ketoprofenu; Flurbiprofenu; Diklofenaku; Meloksyka-mu; D-Sorbitolu; Takrolimusu; Diazepamu; Dutasterydu; Indometacyny; Dinoprostonu;

5

Karbacholu; Estradiolu; Kurkuminy; Litu; Rapamycyny; Betainy; Trehalozy; Amiloridu; Albuterolu lub ich soli do (wytwarzania leku do) obniŜania ekspresji PMP22 u osobnika z CMT lub pokrewnym zaburzeniem. [0018] Kolejnym przedmiotem tego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawiera-jąca połączenie co najmniej dwóch związków wybranych z grupy obejmującej D-Sorbitol, 5 Baklofen, Pilokarpinę, Naltrekson, Metimazol, Mifepriston i Ketoprofen, lub ich sole, oraz farmaceutycznie odpowiednią zaróbkę, zgodnie z zastrzeŜeniami. [0019] PowyŜsze leki stosuje się w połączeniu(-ach), aby zapewnić jak najskuteczniejsze dzialanie. W związku z tym, kolejny przedmiot tego wynalazku polega na zastosowaniu połączenia leków do leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, przy czym połączenie jest 10 wybrane spośród:

- antagonisty receptora hormonu steroidowego i związku wybranego spośród agonisty receptora muskarynowego, agonisty receptora GABA-B, aktywatora ERK, inhibitora kinazy pAkt, leku wpływającego na sygnalizację hormonów tarczycy, leku wpływają-cego na szlaki sygnalizacji D-sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora 15 COX;

- agonisty receptora muskarynowego i związku wybranego spośród agonisty receptora GABA-B, aktywatora ERK, inhibitora kinazy pAkt, leku wpływającego na sygnaliza-cję hormonów tarczycy, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji D-sorbitolu, anta-gonisty receptora opioidowego, inhibitora Cox; 20

- agonisty receptora GABA-B i związku wybranego spośród aktywatora ERK, inhibito-ra kinazy pAkt, leku wpływającego na sygnalizację hormonów tarczycy, leku wpływa-jącego na szlaki sygnalizacji D-sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego i inhibi-tora Cox;

- aktywatora ERK i związku wybranego spośród inhibitora kinazy pAkt, leku wpływa-25 jącego na sygnalizację hormonów tarczycy, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora Cox;

- inhibitora kinazy pAkt i leku wpływającego na sygnalizację hormonów tarczycy; związku wybranego spośród leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, anta-gonisty receptora opioidowego i inhibitora Cox; 30

- leku wpływającego na sygnalizację hormonów tarczycy; i leku wpływającego na szla-ki sygnalizacji sorbitolu i antagonisty receptora opioidowego lub inhibitora Cox;

- leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu oraz antagonisty receptora opio-idowego lub inhibitora Cox;

- antagonisty receptora opioidowego i inhibitora Cox; 35

[0020] Wynalazek ujawnia zastosowanie powyŜszych związków lub kompozycji albo po-łączenia do leczenia CMT. [0021] Wynalazek ujawnia ponadto sposób leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, zwłaszcza CMT, obejmujący podawanie potrzebującemu jej osobnikowi skutecznej ilości któregokolwiek z połączeń związków ujawnionych wyŜej. Korzystny sposób obejmuje po-40 dawanie połączenia co najmniej dwóch związków wybranych spośród związku A, związku B, związku C, związku D, związku E, związku F i związku G lub ich soli. [0022] W związku z tym, wynalazek opisuje sposób leczenia CMT1a u osobnika, obejmu-jący podawanie osobnikowi skutecznej ilości połączenia związków ujawnionego powyŜej. [0023] Dowolne z róŜnych ujawnionych tu zastosowań lub sposobów mogą takŜe obej-45 mować dodatkowy etap diagnozowania występowania u pacjenta CMT lub pokrewnego zaburzenia, zwłaszcza CMT1A albo identyfikacji osobnika jako będącego w grupie ryzyka wykształcenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, zwłaszcza CMT1A. [0024] W związku z tym, ten wynalazek ujawnia sposób leczenia CMT, zwłaszcza CMT1a, który to sposób obejmuje (1) ocenianie, czy osobnik ma CMT, zwłaszcza CMT1a, 50 oraz (2) leczenie osobnika z CMT, zwłaszcza CMT1a, skuteczną ilością połączenia związ-

6

ków opisanego powyŜej. Określanie, czy osobnik ma CMT, zwłaszcza CMT1a, moŜna osiągnąć z uŜyciem róŜnych testów znanych jako takie w dziedzinie, takich jak testy DNA. Takiej diagnozy moŜna dokonać oceniając na przykład ekspresję lub czynność PMP22 u (lub w próbce od) pacjenta przed lub w trakcie terapii. [0025] Ten wynalazek ujawnia takŜe kompozycję zawierającą PMP22 lub fragment 5 PMP22 jako immunogen do szczepienia pacjentów. [0026] Ten wynalazek ujawnia takŜe szczepionkę zawierającą przeciwciało anty-PMP22 lub fragment lub pochodną takiego przeciwciała. [0027] Ten wynalazek moŜna stosować do leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia u dowolnego osobnika będącego ssakiem, zwłaszcza osobników będących ludźmi, korzyst-10 niej CMT1a.

Legenda do figur

[0028]

Figura 1. Wpływ wybranych leków na poziom ekspresji mRNA PMP22. Figura 2. Wpływ wybranych leków na poziom ekspresji mRNA PMP22. 15 Figura 3. Wpływ wybranych leków w róŜnych dawkach na poziom ekspresji mRNA PMP22. Figura 4. Wpływ wybranych leków na poziom ekspresji białka PMP22. Figura 5. Wpływ połączenia Pilokarpiny i Naltreksonu na poziom ekspresji białka PMP22. 20 Figura 6: Wyniki oceny motorycznej samic szczurów w teście z poprzeczką przez cały okres badania przedstawione w postaci trendów. A: Metimazol; B: Pilokarpina. Figura 7: Średnia sprawność w teście z poprzeczką oceniona w tym teście po 16 tygo-dniach leczenia. A: Metimazol; B: Pilokarpina. Figura 8: Ocena elektrofizjologiczna amplitudy potencjałów wraŜliwych nerwów u 25 szczurów z CMT leczonych lekami przez 20 tygodni. A: Metimazol; B: Pilokarpina.

Szczegółowy opis wynalazku

[0029] Niniejszy wynalazek dostarcza nowe podejścia terapeutyczne do leczenia CMT lub zaburzeń pokrewnych. Wynalazek ujawnia nowe zastosowanie leków lub połączeń leków, które umoŜliwiają skuteczną poprawę w przypadku takich chorób i mogą być stosowane u 30 dowolnego osobnika będącego ssakiem. [0030] W kontekście niniejszego wynalazku określenie „zaburzenie pokrewne do CMT” oznacza inne choroby związane z nieprawidłową ekspresją białek mieliny, w tym PMP22. RóŜnorodność tych chorób wynika z róŜnorodności funkcji PMP22. [0031] PMP22 jest przede wszystkim głównym składnikiem mieliny eksprymowanym w 35 zbitym fragmencie zasadniczo wszystkich mielinowanych włókien w obwodowym ukła-dzie nerwowym. Białko PMP22 oddziałuje z innym strukturalnym białkiem mieliny P0, a zatem zmieniony stosunek białek PMP22/P0 moŜe wpływać na upakowanie otoczek mieli-nowych (Vallat i in., 1996; D'Urso i in., 1999). Jak wykazano w badaniach in vitro, białko PMP22 jest takŜe zaangaŜowane w regulację rozpłaszczania się komórek w sposób zaleŜny 40 od Rho, a zatem moŜe wpływać na proces powstawania otoczek aksonów (Brancolini i in., 1999). Ponadto, PMP22 tworzy kompleksy z α6β4 integrynami i moŜe pośredniczyć w od-działywaniu komórek Schwanna z substancją międzykomórkową (Amici i in., 2006; Amici i in., 2007). Ponadto, podwyŜszony poziom białka PMP22 moŜe zmieniać endosomalny szlak recyklingu błon komórkowych regulowany przez Arf6 i prowadzić do gromadzenia 45 się PMP22 w późnych endosomach (Chies i in., 2003). Wykazano takŜe, Ŝe eksprymowane w nadmiarze białko PMP22 zakłóca wenątrzkomórkowe sortowanie białek i przeciąŜa me-chanizm rozkładu białek w komórkach Schwanna (Notterpek i in., 1997; Tobler i in., 2002; Fortun i in., 2003; Fortun i in., 2006; Fortun i in., 2007; Khajavi i in., 2007). Wreszcie, PMP22 jest bezpośrednio zaangaŜowany w kontrolę proliferacji komórek i zaprogramo-50

7

wanej śmierci komórek (Sancho i in., 2001; Atanasoski i in., 2002), oraz wykazano, Ŝe zmutowane białko PMP22 wywołuje głęboką reorganizację i nieprawidłową ekspresję ak-sonalnych kanałów jonowych (Ulzheimer i in., 2004; Devaux i Scherer, 2005). PMP22 ulega takŜe ekspresji w niektórych częściach ludzkiego mózgu (Ohsawa Y i in., 2006). Ist-nieją dowody na jego udział w zaburzeniach nastroju (Le-Niculescu H i in, 2008) oraz w 5 schizofrenii (Dracheva S i in., 2006). PMP22 odgrywa rolę w tworzeniu bariery krew/mózg (Roux KJ i in., 2004), która jest często uszkodzona w stwardnieniu rozsianym i chorobach neurodegeneracyjnych. [0032] Konsekwentnie, określenie „zaburzenie pokrewne do CMT” oznacza chorobę Alzheimera (AD), otępienie starcze typu AD (SDAT), chorobę Parkinsona, otępienie z cia-10 łami Lewy'ego, otępienie naczyniowe, autyzm, łagodne zaburzenia poznawcze (MCI), za-burzenia pamięci związane z wiekiem (AAMI) i problemy związane z wiekiem, Parkinso-nizm po zapaleniu mózgu, schizofrenię, depresję, chorobę dwubiegunową i inne zaburze-nia nastroju, chorobę Huntingtona, choroby neuronu ruchowego, w tym stwardnienie zani-kowe boczne (ALS), stwardnienie rozsiane, idiopatyczne neuropatie, neuropatię cukrzy-15 cową, neuropatię toksyczną, w tym neuropatię wywołaną leczeniem farmakologicznym, neuropatie wywołane przez HIV, promieniowanie, metale cięŜkie i stany niedoboru wita-min, neurodegenerację wywołaną przez priony, w tym chorobę Creutzfelda-Jakoba (CJD), gąbczastą encefalopatię bydła (BSE), GSS, FFI, Kuru i zespół Alpersa. [0033] Zaburzenie pokrewne do CMT oznacza neuropatię, taką jak neuropatie demielini-20 zacyjne, w tym HNPP (dziedziczna neuropatia z podatnością na poraŜenia uciskowe ner-wu), CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1X, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E, CMT2-P0, cięŜkie neuropatie demielinizacyjne DSS (zespół Dejerine'a-Sottasa), CHN (wrodzona neuropatia hipomielinizacyjna), CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4D, CMT4F, CMT4, AR-CMT2A, HSN1. 25 [0034] Stosowane tu określenie „leczenie” zaburzenia obejmuje terapię, zapobieganie, pro-filaktykę, opóźnianie lub zmniejszanie bólu wywołanego przez to zaburzenie. Określenie leczenie obejmuje w szczególności opanowanie postępu choroby i związanych z nią obja-wów. [0035] Ponadto określenie związek oznacza związki chemiczne konkretnie nazwane w 30 zgłoszeniu, jak równieŜ jakiekolwiek kompozycje farmaceutyczne z ich dopuszczalnymi solami, hydratami, izomerami, racematami. [0036] Określenie przeciwciało oznacza przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne. Określenie fragment oznacza, nie stanowiąc ograniczenia, łańcuch immunoglobuliny, fragment Fab lub Fab' lub region CDR. Pochodna przeciwciała obejmuje przeciwciało jed-35 nołańcuchowe, przeciwciało humanizowane, przeciwciało chimeryczne itd. Fragmenty lub pochodne przeciwciał zachowują specyficzność epitopową przeciwciała. [0037] Ponadto określenie „połączenie” oznacza leczenie, w którym co najmniej dwa leki są wspólnie podawane osobnikowi, w celu wywołania efektu biologicznego. W terapii sko-jarzonej co najmniej dwa leki mogą być podawane razem lub oddzielnie, w tym samym 40 czasie lub sekwencyjnie. Co najmniej dwa leki mogą być takŜe podawane róŜnymi droga-mi i z uŜyciem róŜnych protokołów. [0038] Wynalazek pokazuje, Ŝe funkcjonalność obwodowego(-ych) białka(-ek) mieliny moŜe być modulowana przez leki wpływające na receptor muskarynowy, receptor GABA-B, receptor hormonów steroidowych, receptor opioidowy, szlaki sygnalizacji sorbitolu lub 45 aktywację ERK (kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym), inhibitory COX, inhibitory sygnalizacji hormonów tarczycy i/lub inhibitory kinazy pAkt, umoŜliwiając tym samym zaprojektowanie nowych podejść terapeutycznych do CMT i pokrewnych zabu-rzeń. [0039] Ponadto, wynalazek ujawnia identyfikację i aktywności określonych leków, które w 50 połączeniu(-ach) lub samodzielnie modulują powyŜsze szlaki i mogą być stosowane do leczenia tych chorób.

8

[0040] W szczególności wynalazek pokazuje, Ŝe związek A, związek B, związek C, zwią-zek D, związek E, związek F i związek G w połączenia(-ach) moŜna stosować do leczenia CMT lub pokrewnych zaburzeń.

D-Sorbitol (związek A)

[0041] Ten lek, C6H14O6,, naleŜy do klasy środków do płukania pęcherza moczowego, 5 przeczyszczających i hiperosmotycznych. [0042] Został on zatwierdzony do leczenia przy i) płukaniu pęcherza moczowego (dorośli) w celu zapobiegania zakaŜeniom podczas operacji gruczołu krokowego lub innych operacji układu moczowego ii) zatruciach (dorośli) po wymieszaniu z węglem aktywnym oraz iii) zatwardzeniu (dorośli), działając jako hiperosmotyczny środek przeczyszczający: Działa 10 drogą zatrzymywania płynu w okręŜnicy, co pomaga zwiększyć ruchy mięśni w jelitach.

Docelowy szlak metaboliczny w chorobie CMT1A:

[0043] Szlaki kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) i Akt kontrolu-ją ekspresję genu PMP22 w przeciwny sposób: transkrypcja genu PMP22 jest wzmacniana przez aktywowany szlak sygnalizacji PI3K/pAkt/GSK-3β i hamowana przez kaskadę kinaz 15 Ras/MEK/ERK. Związek A jest zdolny do aktywacji kinaz ERK/JNK/p38 i prawdopodob-nie zmniejsza ekspresję genu PMP22 drogą modulowania aktywności kinazy ERK ((Bo-goyevitch i in., 1995; Galvez i in., 2003). Skupiska nieprawidłowo zwiniętego białka PMP22 wywołane przez nadekspresję genu PMP22 są integralną cechą fenotypową komó-rek Schwanna w CMT1A i mogą wpływać na dynamikę błon wewnątrzkomórkowych, sor-20 towanie i rozkład białek. Zatem D-sorbitol, jako komórkowy osmolit, który wykazuje ak-tywność chaperonu, mógłby dodatkowo obniŜać szkodliwy wpływ nadekspresji genu PMP22 podwyŜszając zdolność wewnątrzkomórkowego mechanizmu zaangaŜowanego w zwijanie i usuwanie białek (Fortun i in., 2005; Fortun i in., 2006; Welch i Brown, 1996). [0044] Związek A mógłby takŜe wywoływać wzmocniony efekt drogą stymulacji receptora 25 muskarynowego typu 2, z którym związek A wiąŜe się specyficznie. Prowadzi to do spad-ku ekspresji PMP22. [0045] Wreszcie związek A hamuje apoptozę i stres oksydacyjny przez hamowanie na za-sadzie sprzęŜenia zwrotnego szlaku reduktazy aldozowej. D-Sorbitol jest wytwarzany w szlaku metabolicznym reduktazy aldozowej. Stłumienie genu reduktazy aldozowej hamuje 30 apoptozę i stres oksydacyjny w komórkach szczurzych (Nambu H i in., 2008)

Baklofen (związek B)

[0046] Ten lek, C10H12ClNO2, został zatwierdzony do łagodzenia oznak i objawów odwra-calnej spastyczności wynikającej ze stwardnienia rozsianego, zwłaszcza do złagodzenia skurczów zginaczy i towarzyszącego im bólu, klonusu i sztywności mięśni oraz do doka-35 nałowego/dooponowego leczenia cięŜkiej spastyczności pochodzenia rdzeniowego u pa-cjentów, którzy nie odpowiadają na terapię doustną lub jej nie tolerują. [0047] Związek B jest bezpośrednim agonistą receptorów GABA-B. Dokładny mechanizm jego działania nie jest w pełni poznany. Jest on zdolny do hamowania zarówno monosy-naptycznych, jak i polisynaptycznych odruchów na poziomie rdzenia, prawdopodobnie 40 drogą hiperpolaryzacji zakończeń aferentnych, chociaŜ działania w miejscach nadrdzenio-wych mogę się równieŜ pojawić i przyczynić do jego efektu klinicznego.

Docelowy szlak metaboliczny w chorobie CMT1A:

[0048] Wykazano, Ŝe receptor GABA(B) aktywuje kinazy ERK1/2 poprzez białko ruszto-wania oddziałujące z GPCR (GISP), a tym samym moŜe ujemnie regulować szlak sygnali-45 zacji PI3K-Akt-GSK-3β i aktywność receptorów hormonów steroidowych zaangaŜowa-nych w dodatnią regulację transkrypcyjną genu PMP22 w komórkach Schwanna (Kan-tamneni i in., 2007; Lange i in., 2007; Miller i in.,2007; Tu i in., 2007). Dodatkowo, recep-tory GABAB mogą – w sposób zaleŜny od kontekstu rozwojowego – obniŜać aktywność

9

receptorów GABAA, które są takŜe rozpoznane jako dodatnie modulatory ekspresji PMP22 (Obrietan i van den Pol, 1998).

Pilokarpina (związek C)

[0049] Ten lek, C11H16N2O2,, został zatwierdzony do leczenia i) objawów suchości w ustach związanych z niedoczynnością ślinianek wywołaną radioterapią nowotworu głowy i 5 szyi; oraz ii) leczenia objawów suchości w ustach u pacjentów z zespołem Sjogrena. [0050] Agonista receptorów muskarynowych, wywołuje skurcz włókien mięśni gładkich (przewód pokarmowy, oko, oskrzela), stymuluje wydzielanie potu, śliny, wydzieliny z oskrzeli i Ŝołądka. Ponadto wykazuje złoŜone działanie w układzie sercowo-naczyniowym, stymulując oba szlaki parasympatomimetyczne (rozszerzanie naczyń) pobudzające zwoje. 10

Docelowy szlak metaboliczny w chorobie CMT1A:

[0051] Wykazaliśmy, Ŝe pilokarpina, agonista receptorów muskarynowych, obniŜa ekspre-sję białka PMP22 w komórkach Schwanna in vitro. Receptory muskarynowe są zdolne do modulacji zarówno szlaków Akt jak i Erk w róŜnych lokalizacjach komórkowych, a tym samym mogą brać udział w kontrolowaniu prawidłowego przełaczania tych dwóch szla-15 ków sygnalizacji, zaangaŜowanych odpowiednio w dodatnią i ujemną regulację transkryp-cyjną białka PMP22. Sugerujemy, Ŝe stymulacja receptorów muskarynowych przez pilo-karpinę prowadzi – prawdopodobnie przez złoŜony zestaw mechanizmów molekularnych – do przesunięcia wewnątrzkomórkowej równowagi aktywności Erk/Akt w stronę bardziej wyraźnej sygnalizacji Erk, hamując ekspresję genu PMP22. Przykładowo receptory mu-20 skarynowe mogą selektywnie blokować sygnalizację przez IGF-1 pośredniczoną przez funkcjonalny moduł pAkt/GSK-3β pobudzając defosforylację tyrozyny w IRS-1, co odłą-cza IRS-1 od pobudzonego receptora IGF-1 (Batty i in., 2004; Stimweiss i in., 2006).

Naltrekson (związek D)

[0052] Ten lek, C20H23NO4, został zatwierdzony do leczenia uzaleŜnienia od alkoholu i do 25 blokowania wpływu egzogennie podawanych opioidów. [0053] Ten lek wiąŜe się antagonistycznie z receptorem opiodowym mi, zapobiegając tym samym wiązaniu się tradycyjnych leków opiatowych (heroiny, morfiny) i wywoływaniu przez nie neuronalnych odpowiedzi opioidów. Istotnie osłabia on lub całkowicie blokuje, w sposób odwracalny, działania subiektywne opioidów podanych doŜylnie. Gdy jest po-30 dawany razem z morfiną w sposób przewlekły, blokuje fizyczne uzaleŜnienie od morfiny, heroiny i innych opioidów. U osobników fizycznie uzaleŜnionych od opioidów będzie on wywoływał objawy odstawienia. [0054] Mechanizm działania w alkoholizmie nie jest poznany; jednak dane przedkliniczne wskazują na udział endogennego układu opioidowego. WiąŜe się on w sposób kompety-35 cyjny z takimi receptorami i blokuje wpływ endogennych opioidów.

Docelowy szlak metaboliczny w chorobie CMT1A:

[0055] Szlaki kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) i Akt kontrolują ekspresję genu PMP22 w przeciwny sposób: transkrypcja genu PMP22 jest podwyŜszana przez aktywowany szlak sygnalizacji PI3K/pAkt/GSK-3β i obniŜana przez kaskadę kinaz 40 Ras/MEK/ERK. Związek C, przez ujemną regulację receptora opioidowego σ, moŜe blo-kować aktywność kinazy pAkt, a tym samym obniŜać transkrypcję genu PMP22. [0056] Komórki Schwanna eksprymują, chociaŜ na niskim poziomie, wszystkie typy re-ceptorów opioidowych i sigma, oraz ich naturalne ligandy, prodynorfinę i proenkefalinę – która to obserwacja wskazuje, Ŝe autokrynna sygnalizacja opioidowa moŜe odgrywać waŜ-45 ną rolę w biologii tych komórek glejowych. [0057] Sygnalizacja przez receptory opioidowe jest niezwykle złoŜona i róŜni się w zaleŜ-ności od ostrego i przewlekłego trybu stosowania agonistów. Sugerujemy, Ŝe naltrekson moŜe osłabiać aktywację kinazy pAkt i zmniejszać sygnalizację za pośrednictwem kinazy

10

Erk, wywołane – jak to wykazano dla niektórych komórek nerwowych – przez ostre zaŜy-cie morfiny (Muller i Unterwald, 2004). [0058] Szlaki kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) i Akt kontrolują ekspresję genu PMP22 w przeciwny sposób: transkrypcja genu PMP22 jest podwyŜszana przez aktywowany szlak sygnalizacji PI3K/pAkt/GSK-3β i obniŜana przez kaskadę kinaz 5 Ras/MEK/ERK. Związek C, przez ujemną regulację receptora opioidowego σ, moŜe blo-kować aktywność kinazy pAkt i nasilać sygnalizację przez kinazę Erk, obniŜając tym sa-mym transkrypcję genu PMP22.

Metimazol (związek E)

[0059] Ten lek został zatwierdzony do leczenia nadczynności tarczycy, wola, choroby 10 Gravesa i łuszczycy. [0060] Metimazol wiąŜe się z peroksydazą tarczycową, enzymem ograniczającym szyb-kość syntezy hormonów tarczycy, który przekształca jodek w jod, i blokuje jej aktywność. Zatem metimazol skutecznie hamuje wytwarzanie nowych hormonów tarczycy.

Docelowy szlak metaboliczny w chorobie CMT1A: 15

[0061] Mimo Ŝe komórki Schwanna nie eksprymują receptorów dla hormonów tarczycy w nietkniętym nerwie kulszowym dorosłego osobnika, zaburzenie normalnego oddziaływania aksonu z glejem w uszkodzonych nerwach obwodowych szybko indukuje ekspresję tych receptorów w komórkach Schwanna, co wskazuje na waŜną rolę sygnalizacji hormonów tarczycy w indukowalnej naprawie uszkodzeń PNS (Walter, 1993). Ta sugestia jest dodat-20 kowo poparta przez obserwację, Ŝe uszkodzone nerwy kulszowe eksprymują nie tylko re-ceptory dla hormonów tarczycy, ale takŜe enzymy zaangaŜowane w metabolizm hormo-nów tarczycy – dejodynazę typu 2, przekształcającą tyroksynę (T4) w trijodotyroninę (T3), i dejodynazę typu 3 odpowiedzialną za rozkład hormonów tarczycy (Walter i in., 1995; Li i in., 2001). PoniewaŜ nadekspresja genu PMP22 w komórkach Schwanna zaburza normalne 25 oddziaływanie aksonu z glejem w uszkodzonych nerwach obwodowych u pacjentów z CMT, sygnalizacja hormonów tarczycy moŜe takŜe odgrywać waŜną rolę w postępie cho-roby Charcota-Marie'go-Tootha. [0062] Trijodotyronina T3 jest silnym aktywatorem ekspresji EGR2 w komórkach Schwanna, poniewaŜ czynnik transkrypcyjny EGR2 jest rozpoznany jako główny dodatni 30 regulator programu transkrypcji pobudzającego mielinizację w komórkach Schwanna, sy-gnalizacja poprzez receptory dla hormonów tarczycy moŜe wpływać na transkrypcję genu PMP22 (Mercier i in., 2001). Przypuszczamy, Ŝe metimazol moŜe obniŜać transkrypcję genu PMP22 przez obniŜanie sygnalizacji hormonów tarczycy w uszkodzonych komór-kach Schwanna. 35

Mifepriston (związek F)

[0063] Ten lek, C29H35NO2, został zatwierdzony do medycznego przerywania ciąŜy we-wnątrzmacicznej w ciągu 49 dni trwania ciąŜy. [0064] Przeciwprogestagenne działanie związku F wynika z kompetycyjnego oddziaływa-nia z progesteronem w miejscach receptorowych dla progesteronu. W oparciu o badania z 40 róŜnymi doustnymi dawkami u kilku gatunków zwierząt (myszy, szczura, królika i małpy), stwierdzono, Ŝe ten związek hamuje aktywność endogennego lub egzogennego progestero-nu.

Docelowy szlak metaboliczny w chorobie CMT1A:

[0065] Związek F jest antagonistą receptorów progesteronu i glukokortykoidów, które są 45 dodatnimi regulatorami transkrypcji PMP22. [0066] ChociaŜ związek F został opracowany jako antagonista receptorów progesteronu, jest on takŜe rozpoznany jako antagonista receptorów glukokortykoidów; dodatkowo wy-kazuje on takŜe słabe działanie przeciwandrogenne i nie wiąŜe się z receptorami estroge-nowymi ani z receptorami mineralokortykoidów. 50

11

[0067] Transkrypcja białka PMP22 jest dodatnio regulowana przez kilka receptorów ją-drowych, w tym przez receptory hormonów steroidowych, eksprymowane w komórkach Schwanna (Robert i in., 2001; Schumacher i in., 2001). [0068] Sugerujemy, Ŝe mifepriston, niespecyficzny antagonista obniŜający równocześnie aktywność receptorów progesteronu i glukokortykoidów, moŜe być silniejszym ujemnym 5 modulatorem transkrypcji PMP22, a tym samym bardziej obiecującym kandydatem do opracowania leków stosownych dla CMT1A niŜ badany wcześniej antagonista specyficzny dla receptora progesteronu, który wykazywał raczej marginalny efekt terapeutyczny, szczególnie w schemacie leczenia długoterminowego (Sereda i in., 2003; Meyer zu Horste i in., 2007); ten wniosek jest równieŜ poparty przez niedawno opublikowane dane, które 10 wskazują, Ŝe receptory glukokortykoidów są eksprymowane w komórkach Schwanna co najmniej 50 razy silniej niŜ receptory progesteronu (Groyer i in., 2006).

Ketoprofen (związek G)

[0069] Ketoprofen został zatwierdzony do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów i zapalenia kości i stawów. Związek G jest niesteroidowym lekiem przeciwzapalnym, który 15 blokuje aktywność zarówno cyklooksygenazy-1 (COX-1), jak i cyklooksygenazy-2 (COX-2) i ze względu na ten wpływ hamuje syntezę prostaglandyn i leukotrienów.

Docelowy szlak metaboliczny w chorobie CMT1A:

[0070] Wykazano wcześniej, Ŝe komórki Schwanna eksprymują kilka typów funkcjonal-nych receptorów prostaglandyn EP, prostacyklin IP, tromboksanu, leukotrienów cysteiny-20 lowych i leukotrienu B4, wykazują indukowalną aktywność COX-2 i są zdolne do wytwa-rzania prostaglandyny E2, tromboksanu A2 i leukotrienu LTC4 (Constable i in., 1999; Mu-ja i in., 2001; Woodhams i in., 2007). [0071] Prostaglandyny – poprzez pokrewne im receptory GPCR – mogą nasilać aktywność szlaku sygnalizacji Akt, który pobudza ekspresję białek związanych z mieliną, w tym 25 PMP22. Przykładowo, niedawne odkrycia sugerują, Ŝe prostaglandyna PGE2 jest silnie zaangaŜowana w metabolizm β-kateniny, efektora na szlaku sygnalizacji pAkt i aktywatora programu transkrypcyjnego pobudzającego mileinizację w komórkach Schwanna (Ogata i in., 2004). Wykazano, Ŝe po aktywacji receptorów EP przez PGE2, podjednostka Gαs wią-Ŝe się z kompleksem Aksyna/GSK-3β i obniŜa fosforylację i degradację β-kateniny za po-30 średnictwem GSK-3β. Równocześnie, wiązanie PGE2 z receptorami EP wywołuje uwal-nianie podjednostek Gβγ, które bezpośrednio stymulują białko Akt poprzez kinazy 3-fos-fatydyloinozytolu (PI3K) (Castellone i in., 2006). [0072] Zatem ketoprofen będący inhibitorem cox (związek G) moŜe obniŜać transkrypcję genu PMP22 przez hamowanie autokrynnej sygnalizacji poprzez receptory prostaglandyn 35 w komórkach Schwanna, które pobudzają aktywność β-kateniny. [0073] Dodatkowo, wynalazek dotyczy zastosowania następujących związków, w połącze-niu(-ach) lub pojedynczo, do leczenia CMT lub pokrewnych zaburzeń: Acetazolamid; Aminoglutetimid; Aztreonam; Baklofen Balsalazyd; Bikalutamid; Bromokryptyna; Bume-tanid; Buspiron; Cyprofloksacyna; Klonidyna; Cyklosporyna A; Disulfiram; Eksemestan; 40 Felbamat; Fenofibrat; Finasteryd; Flumazenil; Flunitrazepam; Furosemid; Gabapentyna; Galantamina; Haloperidol; Ibuprofen; Izoproterenol; L-Karnityna; Liotyronina (T3); Lo-sartan; Loksapina; Metaproterenol; Metaraminol; Metformina; Metimazol; Metyloergono-wina; Metopiron; Metoprolol; Mifepriston; Montelukast; Nadolol; Naltrekson; Nalokson; Norfloksacyna; Pentazocyna; Fenoksybenzamina; Fenylomaślan; Pilokarpina; Pioglitazon; 45 Prazosyna; Raloksyfen; Rifampina; Symwastatyna; Spironolakton; Tamoksyfen; Trilostan; Kwas walproinowy; Karbamazepina; Ketoprofen; Flurbiprofen; Diklofenak; Meloksykam; D-Sorbitol; Takrolimus; Diazepam; Dutasteryd; Indometacyna; Dinoproston; Karbachol; Estradiol; Kurkumina; Lit; Rapamycyna; Betaina; Trehaloza; Amilorid; Albuterol [0074] Jak omówiono powyŜej, wynalazek pokazuje dalej, Ŝe moŜna modulować określone 50 szlaki komórkowe, aby skutecznie leczyć CMT lub pokrewne zaburzenia. Konkretniej,

12

wynalazek pokazuje, Ŝe funkcjonalność PMP22, która obejmuje jego ekspresję, zwijanie lub transport, lub obwodowego(-ych) białka(-ek) mieliny, moŜna modulować z uŜyciem leków wpływających na receptor muskarynowy, receptor GABA-B, receptor hormonu ste-roidowego, receptor opioidowy, szlaki sygnalizacji sorbitolu, szlak sygnalizacji hormonów tarczycy lub aktywujących ERK (kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym) lub 5 hamujących kinazę pAkt i/lub inhibitorów COX, umoŜliwiając tym samym zaprojektowa-nie nowych podejść terapeutycznych do CMT i pokrewnych zaburzeń. Takie szlaki moŜna modulować niezaleŜnie lub w połączeniu, tak by zapewnić najlepszy moŜliwy efekt tera-peutyczny. [0075] Ogólnie, do terapeutycznego leczenia CMT lub pokrewnych zaburzeń proponuje się 10 typy połączenia leków, normalizujących ekspresję genu PMP22:

(I) – połączenia leków wpływających na ten sam szlak komórkowy zaangaŜowany w funkcjonowanie genu PMP22 i jego białka, (II) – połączenia leków modulujących róŜne szlaki sygnalizacji, które skupiają się na funkcjonowaniu genu PMP22 i jego białka, 15 (III) – połączenia leków modulujących róŜne szlaki sygnalizacji, które kontrolują funkcjonowanie genu PMP22 i jego produktu białkowego.

[0076] Te połączenia wywierają addytywny lub synergistyczny wpływ na transkrypcję ge-nu PMP22, a tym samym powinny pozwolić na istotne obniŜenie skutecznych terapeutycz-nie dawek wybranych leków i zminimalizowanie ich niepoŜądanych działań ubocznych. 20 [0077] Wynalazek ujawnia połączenia leków wybrane spośród:

- antagonisty receptora hormonu steroidowego i związku wybranego spośród agonisty receptora muskarynowego, agonisty receptora GABA-B, aktywatora ERK, inhibitora kinazy pAkt, leku hamującego sygnalizację hormonów tarczycy, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora COX; 25

- agonisty receptora muskarynowego i związku wybranego spośród agonisty receptora GABA-B, aktywatora ERK, inhibitora kinazy pAkt, leku hamującego sygnalizację hormonów tarczycy, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora COX;

- agonisty receptora GABA-B i związku wybranego spośród aktywatora ERK, inhibito-30 ra kinazy pAkt, leku hamującego sygnalizację hormonów tarczycy, leku wpływające-go na szlaki sygnalizacji sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego i inhibitora COX;

- aktywatora ERK i związku wybranego spośród inhibitora kinazy pAkt, leku hamują-cego sygnalizację hormonów tarczycy, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sor-35 bitolu, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora COX;

- inhibitora kinazy pAkt i związku wybranego spośród leku hamującego sygnalizację hormonów tarczycy; leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego i inhibitora COX;

- leku hamującego sygnalizację hormonów tarczycy i związku wybranego spośród leku 40 wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu i antagonisty receptora opioidowego lub inhibitora COX;

- leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu i związku wybranego spośród an-tagonisty receptora opioidowego lub inhibitora COX;

- antagonisty receptora opioidowego i inhibitora COX; 45

[0078] Wynalazek ujawnia takŜe połączenia leków wybrane spośród:

- antagonisty receptora hormonu steroidowego i agonisty receptora muskarynowego; - antagonisty receptora hormonu steroidowego i agonisty receptora GABA-B; - antagonisty receptora hormonu steroidowego i aktywatora ERK; - antagonisty receptora hormonu steroidowego i inhibitora kinazy pAkt; 50

13

- antagonisty receptora hormonu steroidowego i inhibitora sygnalizacji hormonów tar-czycy;

- antagonisty receptora hormonu steroidowego i inhibitora COX; - agonisty receptora muskarynowego i agonisty receptora GABA-B; - agonisty receptora muskarynowego i aktywatora ERK; 5 - agonisty receptora muskarynowego i inhibitora kinazy pAkt; - agonisty receptora muskarynowego i inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy; - agonisty receptora muskarynowego i inhibitora COX; - agonisty receptora GABA-B i aktywatora ERK; - agonisty receptora GABA-B i inhibitora kinazy pAkt; 10 - agonisty receptora GABA-B i inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy; - agonisty receptora GABA-B i inhibitora COX;

lub - aktywatora ERK i inhibitora kinazy pAkt; - aktywatora ERK i inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy; 15 - aktywatora ERK i inhibitora COX; - lub inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy i inhibitora COX.

[0079] W szczególnej postaci antagonistą receptora hormonu steroidowego jest związek F, agonistą receptora muskarynowego jest związek A lub związek C, agonistą receptora GA-BA-B jest związek B lub związek E, inhibitorem kinazy pAkt jest związek D, aktywatorem 20 ERK jest związek A. [0080] Wynalazek ujawnia terapię skojarzoną do leczenia CMT lub pokrewnego zaburze-nia, która to terapia skojarzona obejmuje związek A i co najmniej drugi związek wybrany spośród antagonisty receptora hormonu steroidowego, agonisty receptora muskarynowego, agonisty receptora GABA-B, aktywatora ERK, inhibitora kinazy pAkt, antagonisty recep-25 tora opioidowego, inhibitora COX i inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy. [0081] Wynalazek ujawnia terapię skojarzoną do leczenia CMT lub pokrewnego zaburze-nia, która to terapia skojarzona obejmuje związek B i co najmniej drugi związek wybrany spośród antagonisty receptora hormonu steroidowego, agonisty receptora muskarynowego, aktywatora ERK, inhibitora kinazy pAkt, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbi-30 tolu, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora COX i inhibitora sygnalizacji hormo-nów tarczycy. [0082] Wynalazek ujawnia terapię skojarzoną do leczenia CMT lub pokrewnego zaburze-nia, która to terapia skojarzona obejmuje związek C i co najmniej drugi związek wybrany spośród antagonisty receptora hormonu steroidowego, agonisty receptora GABA-B, akty-35 watora ERK, inhibitora kinazy pAkt, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora COX i inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy. [0083] Wynalazek ujawnia terapię skojarzoną do leczenia CMT lub pokrewnego zaburze-nia, która to terapia skojarzona obejmuje związek D i co najmniej drugi związek wybrany 40 spośród antagonisty receptora hormonu steroidowego, agonisty receptora muskarynowego, agonisty receptora GABA-B, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, aktywa-tora ERK, inhibitora COX i inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy. [0084] Wynalazek ujawnia terapię skojarzoną do leczenia CMT lub pokrewnego zaburze-nia, która to terapia skojarzona obejmuje związek E i co najmniej drugi związek wybrany 45 spośród antagonisty receptora hormonu steroidowego, agonisty receptora muskarynowego, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, aktywatora ERK, inhibitora kinazy pAkt, antagonisty receptora opioidowego, inhibitora COX i inhibitora sygnalizacji hormo-nów tarczycy. [0085] Wynalazek ujawnia terapię skojarzoną do leczenia CMT lub pokrewnego zaburze-50 nia, która to terapia skojarzona obejmuje związek F i co najmniej drugi związek wybrany spośród agonisty receptora muskarynowego, agonisty receptora GABA-B, aktywatora

14

ERK, inhibitora kinazy pAkt, leku wpływającego na szlaki sygnalizacji sorbitolu, antago-nisty receptora opioidowego, inhibitora COX i inhibitora sygnalizacji hormonów tarczycy. [0086] Konkretne i korzystne przykłady połączenia leków obejmują jako substancje czyn-ne co najmniej: (I) związek F i związek E; (II) związek C i związek B; (III) związek F i związek C; związek F i związek B; związek F i związek A; związek F i związek D; zwią-5 zek C i związek A; związek C i związek D; związek B i związek A; związek B i związek D; związek A i związek D; związek G i związek D. [0087] Inną szczególną postać wynalazku stanowi kompozycja farmaceutyczna obejmują-ca jedno z następujących połączeń związków: Mifepriston i Metimazol; Pilokarpina i Ba-klofen; Mifepriston i Pilokarpina; Mifepriston i Baklofen; Mifepriston i Ketoprofen; Mife-10 priston i Naltrekson; Pilokarpina i Ketoprofen; Pilokarpina i Naltrekson; Baklofen i Keto-profen; Ketoprofen i Metimazol; Sorbitol i Naltrekson; lub Sorbitol i Metimazol; lub ich sole, oraz farmaceutycznie odpowiednia zaróbkę. [0088] W kolejnej szczególnej postaci powyŜsze połączenia związków są stosowane w le-czeniu choroby Charcota-Mariego-Tootha (CMT) lub pokrewnego zaburzenia. 15 [0089] Terapię zgodnie z wynalazkiem moŜna przeprowadzić w postaci połączenia leków, i ewentualnie, w połączeniu z dowolną inną terapią. MoŜna ją dostarczać w domu, w gabi-necie lekarza, w klinice, ambulatorium przyszpitalnym lub w szpitalu, tak, aby lekarz mógł dokładnie obserwować skutki terapii i dopasowywać ją względem potrzeb. [0090] Czas trwania terapii zaleŜy od stadium leczonej choroby, wieku i stanu pacjenta 20 oraz od tego, jak pacjent odpowiada na leczenie. [0091] Dodatkowo, osoba będąca w grupie podwyŜszonego ryzyka wykształcenia dodat-kowego zaburzenia neuropatycznego (np. osoba genetycznie predysponowana do lub ma-jąca przykładowo cukrzycę lub w trakcie leczenia stanu onkologicznego itd.) moŜe otrzy-mywać leczenie profilaktyczne, aby złagodzić lub opóźnić ewentualną odpowiedź neuro-25 patyczną. [0092] Dawkowanie, częstość i droga podawania kaŜdego składnika połączenia mogą być kontrolowane niezaleŜnie. Przykładowo, jeden lek moŜna podawać doustnie, podczas gdy drugi lek moŜna podawać domięśniowo. Terapię skojarzoną moŜna podawać w cyklach z przerwami, które obejmują okresy odpoczynku, tak by organizm pacjenta miał szansę wy-30 leczyć się z jakichkolwiek nieprzewidzianych działań ubocznych. Leki moŜna takŜe for-mułować razem, tak by w jednym podaniu dostarczyć oba leki.

Formułowanie kompozycji farmaceutycznych

[0093] Podawanie kaŜdego leku z połączenia moŜna przeprowadzić w dowolny sposób, który skutkuje stęŜeniem leku, które w połączeniu z innym składnikiem, jest zdolne do po-35 prawy wpływu podwyŜszonej ekspresji PMP22 po dotarciu do nerwów obwodowych. [0094] Podczas gdy składniki czynne połączenia mogą być podawane jako czyste związki chemiczne, korzystne jest, by dostarczać je w postaci kompozycji farmaceutycznej, nazy-wanej takŜe w tym kontekście preparatem farmaceutycznym. MoŜliwe kompozycje obej-mują te odpowiednie do podawania doustnego, doodbytnicznego, miejscowego (w tym 40 przezskórnego, dopoliczkowego i podjęzykowego) lub pozajelitowego (w tym podskórne-go, domięśniowego, doŜylnego i śródskórnego). [0095] Najczęściej te preparaty farmaceutyczne są przepisywane pacjentowi w „opakowa-niach dla pacjenta” zawierających pewną liczbę jednostek dawkowanych lub inne środki do podawania odmierzonych dawek jednostkowych do stosowania podczas oddzielnego 45 okresu terapii w pojedynczym opakowaniu, zazwyczaj w blistrze. Opakowania dla pacjen-tów mają przewagę nad tradycyjnymi receptami, w których farmaceuta oddziela porcję środka farmaceutycznego pacjenta od zapasu luzem, pod tym względem, Ŝe pacjent zawsze ma dostęp do ulotki informacyjnej zawartej w opakowaniu dla pacjenta, której zazwyczaj brakuje w tradycyjnych receptach. Wykazano, Ŝe zawarcie ulotki informacyjnej poprawia 50 przestrzeganie instrukcji lekarza przez pacjenta. Zatem wynalazek obejmuje ponadto pre-

15

parat farmaceutyczny opisany tu wcześniej, w połączeniu z materiałem opakowania odpo-wiednim dla tych preparatów. W takim opakowaniu dla pacjenta zamierzone zastosowanie preparatu w terapii skojarzonej moŜe być osiągnięty dzięki instrukcji, ułatwieniom, warun-kom, przystosowaniom i/lub innym środkom pomagającym w uŜyciu preparatu w sposób najbardziej odpowiedni dla leczenia. Takie środki czynią opakowanie dla pacjenta szcze-5 gólnie odpowiednim i przystosowanym do uŜycia do leczenia połączeniem według niniej-szego wynalazku. [0096] Leki mogą być zawarte w dowolnej właściwej ilości w jakiejkolwiek odpowiedniej substancji nośnikowej i mogą być obecne w ilości 1-99% wagowych względem całkowitej masy kompozycji. Kompozycję moŜna dostarczyć w postaci dawkowanej, która jest od-10 powiednia do podawania drogą doustną, pozajelitową (np. doŜylnie, domięśniowo), dood-bytniczą, skórną, donosową, dopochwową, wziewną, na skórę (plaster) lub do oka. Zatem kompozycja moŜe być np. w postaci tabletek, kapsułek, pigułek, proszków, granulatów, zawiesin, emulsji, roztworów, Ŝeli, w tym hydroŜeli, past, maści, kremów, plastrów, pły-nów, urządzeń do podawania osmotycznego, czopków, enem, wstrzyknięć, implantów, 15 sprejów lub aerozoli. [0097] Kompozycje farmaceutyczne moŜna formułować zgodnie z tradycyjną praktyką farmaceutyczną (patrz np. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (wydanie 20), red. A. R. Gennaro, Lippincott Williams i Wilkins, 2000 oraz Encyclopedia of Phar-maceutical Technology, red. J. Swarbrick i J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nowy 20 Jork). [0098] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku moŜna formułować tak, by uwal-niały aktywny lek zasadniczo natychmiast po podaniu lub w dowolnym z góry ustalonym momencie lub okresie po podaniu. [0099] Preparaty o kontrolowanym uwalnianiu obejmują (i) preparaty, które wytwarzają 25 zasadniczo stałe stęŜenie leku w organizmie w przedłuŜonym okresie czasu; (ii) preparaty, które po ustalonym czasie opóźnienia wytwarzają zasadniczo stałe stęŜenie leku w organi-zmie w przedłuŜonym okresie czasu; (iii) preparaty, które podtrzymują działanie leku przez z góry ustalony czas, utrzymując stosunkowo stały skuteczny poziom leku w organizmie przy równoczesnej minimalizacji niepoŜądanych działań ubocznych związanych z waha-30 niem się poziomu substancji czynnej leku w osoczu; (iv) preparaty, które lokalizują działa-nie leku np. przez przestrzenne umieszczenie kompozycji o kontrolowanym uwalnianiu w pobliŜu lub wewnątrz objętej chorobą tkanki lub narządu; oraz (v) preparaty, które kierują działanie leku przez zastosowanie nośników lub chemicznych pochodnych do dostarczania leku do określonego typu komórki docelowej. 35 [0100] Podawanie leków w postaci preparatu o kontrolowanym uwalnianiu jest szczegól-nie korzystne w przypadkach, w których lek, samodzielnie lub w połączenia, ma (i) wąski wskaźnik terapeutyczny (tj. róŜnica między stęŜeniem w osoczu prowadzącym do szko-dliwych działań ubocznych lub reakcji toksycznych oraz stęŜeniem w osoczu prowadzą-cym do efektu terapeutycznego jest mała; zazwyczaj wskaźnik terapeutyczny TI definiuje 40 się jako stosunek mediany dawki śmiertelnej (LD50) do mediany dawki skutecznej (ED50)); (ii) wąskie okienko wchłaniania w przewodzie Ŝołądkowo-jelitowym; lub (iii) bardzo krótki biologiczny okres półtrwania tak, Ŝe wymagane jest częste dawkowanie w ciągu dnia w celu podtrzymania poziomu w osoczu na poziomie terapeutycznym. [0101] W celu uzyskania kontrolowanego uwalniania, w którym szybkość uwalniania prze-45 wyŜsza szybkość metabolizmu danego leku, moŜna postępować zgodnie z wieloma strate-giami. Kontrolowane uwalnianie moŜna uzyskać przez odpowiedni wybór róŜnych parame-trów i składników preparatu, w tym np. róŜnych typów kompozycji i powłoczek o kontrolo-wanym uwalnianiu. Zatem leki są formułowane z odpowiednimi substancjami pomocniczy-mi w kompozycję farmaceutyczną, która po podaniu uwalnia lek w kontrolowany sposób 50 (kompozycje w postaci tabletek lub kapsułek z pojedynczą lub wieloma dawkami, roztwory olejowe, zawiesiny, emulsje, mikrokapsułki, mikrosfery, nanocząstki, plastry i liposomy).

16

Stałe postacie dawkowane do stosowania doustnego

[0102] Preparaty do stosowania doustnego obejmują tabletki zawierające składnik(-i) czynny(-e) w mieszaninie z nietoksycznymi farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami. Takimi zaróbkami mogą być na przykład obojętne rozcieńczalniki lub wypełniacze (np. sacharoza, celuloza mikrokrystaliczna, skrobie, w tym skrobia ziemniaczana, węglan wap-5 nia, chlorek sodu, fosforan wapnia, siarczan wapnia lub fosforan sodu); środki granulujące i rozsadzające (np. pochodne celulozy, w tym celuloza mikrokrystaliczna, skrobie, w tym skrobia ziemniaczana, sól sodowa kroskarmelozy, alginiany lub kwas alginowy); środki wiąŜące (np. guma arabska, kwas alginowy, alginian sodu, Ŝelatyna, skrobia, wstępnie zŜe-lowana skrobia, celuloza mikrokrystaliczna, sól sodowa karboksymetylocelulozy, metylo-10 celuloza, hydroksypropylometyloceluloza, etyloceluloza, poliwinylopirolidon lub glikol polietylenowy); oraz środki smarujące, poślizgowe i antyadhezyjne (np. kwas stearynowy, krzemionki lub talk). Innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami mogą być barw-niki, środki smakowo-zapachowe, plastyfikatory, środki pochłaniające wilgoć, środki bufo-rujące i tym podobne. 15 [0103] Tabletki mogą być niepowleczone lub mogą być powleczone znanymi technikami, aby ewentualnie opóźnić ich rozpad i wchłanianie w przewodzie Ŝołądkowo-jelitowym, a tym samym zapewniając utrzymywane działanie w dłuŜszym okresie. Powłoczka moŜe być przystosowana do uwalniania substancji czynnej leku według ustalonego wzorca (np. w celu uzyskania preparatu o kontrolowanym uwalnianiu) lub moŜe być przystosowana do 20 nieuwalniania substancji czynnej leku aŜ do przejścia przez Ŝołądek (powłoczka dojelito-wa). Powłoczka moŜe być powłoczką cukrową, powłoczką w postaci błony (np. na bazie hydroksypropylometylocelulozy, metylocelulozy, metylohydroksyetylocelulozy, hydroksy-propylocelulozy, karboksymetylocelulozy, kopolimerów akrylanowych, glikoli polietyle-nowych i/lub poliwinylopirolidonu) lub powłoczką dojelitową (np. na bazie kopolimeru 25 kwasu metakrylowego, octanoftalanu celulozy, ftalanu hydroksypropylometylocelulozy, octanobursztynianu hydroksypropylometylocelulozy, octanoftalanu poliwinylu, szelaku i/lub etylocelulozy). MoŜna zastosować materiał do opóźnienia czasowego, taki jak np. monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu. [0104] Stałe kompozycje w postaci tabletek mogą zawierać powłoczkę przystosowaną do 30 ochrony kompozycji przed niepoŜądanymi zmianami chemicznymi (np. rozkładem che-micznym przed uwolnieniem substancji czynnej leku). Powłoczkę moŜna nanosić na stałą postać dawkowaną w podobny sposób do tego, opisanego w Encyclopedia of Pharmaceuti-cal Technology. [0105] Dwa leki mogą być zmieszane razem w tabletce lub mogą być rozdzielone. Przy-35 kładowo, pierwszy lek jest zawarty wewnątrz tabletki, a drugi lek na zewnątrz, tak by za-sadnicza część drugiego leku była uwalniana przed uwolnieniem pierwszego leku. [0106] Preparaty do stosowania doustnego moŜna takŜe dostarczać w postaci tabletek do rozgryzania i Ŝucia, lub w postaci twardych kapsułek Ŝelatynowych, w których składnik czynny jest wymieszany z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem (np. skrobią ziemniaczaną, 40 celulozą mikrokrystaliczną, węglanem wapnia, fosforanem wapnia lub kaolinem) lub w postaci miękkich kapsułek Ŝelatynowych, w których składnik czynny jest wymieszany z wodą lub ośrodkiem oleistym, na przykład ciekłą parafiną lub olejem oliwkowym. Proszki i granulaty moŜna wytwarzać z uŜyciem składników wspomnianych powyŜej dla tabletek i kapsułek w standardowy sposób. 45 [0107] Kompozycje o kontrolowanym uwalnianiu do stosowania doustnego mogą np. być skonstruowane tak, by uwalniały aktywne leki drogą kontrolowania rozpuszczania i/lub dyfuzji substancji czynnej leku. [0108] Uwalnianie kontrolowane przez rozpuszczanie lub dyfuzję moŜna osiągnąć przez odpowiednie powleczenie preparatu leku w postaci tabletki, kapsułki, peletki lub granulatu 50 lub przez wprowadzenie leku w odpowiednią matrycę. Powłoczka o kontrolowanym uwal-nianiu moŜe obejmować jedną lub większą liczbę substancji powlekających wymienionych

17

powyŜej i/lub np. szelak, wosk pszczeli, glycowax, wosk rycynowy, wosk karnauba, alko-hol stearylowy, monostearynian glicerylu, distearynian glicerylu, palmitostearynian glice-rylu, etylocelulozę, Ŝywice akrylowe, polikwas dl-mlekowy, octanomaślan celulozy, poli-chlorek winylu, polioctan winylu, winylopirolidon, polietylen, polimetakrylan, metakrylan metylu, 2-hydroksymetakrylan, hydroŜele matakrylanowe, glikol 1,3-butylenowy, meta-5 krylan glikolu etylenowego i/lub glikole polietylenowe. W preparacie z matrycą o kontro-lowanym uwalnianiu, materiał matrycy moŜe takŜe obejmować np. uwodnioną metylocelu-lozę, wosk karnauba i alkohol stearylowy, karbopol 934, silikon, tristearynian glicerylu, akrylan metylu-metakrylan metylu, polichlorek winylu, polietylen i/lub fluorowcowaną fluoropochodną węglowodoru. 10 [0109] Kompozycja o kontrolowanym uwalnianiu zawierająca leki z zastrzeŜonych połą-czeń moŜe takŜe być w postaci pływającej tabletki lub kapsułki (tj, tabletki lub kapsułki, która po doustnym podaniu pływa po powierzchni treści Ŝołądkowej przez pewien okres czasu). Preparat leku(-ów) w postaci pływającej tabletki moŜna wytworzyć drogą granula-cji mieszaniny leku(-ów) z zaróbkami i 20-75% wag./wag. hydrokoloidów, takich jak hy-15 droksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza lub hydroksypropylometyloceluloza. Uzy-skane granulki moŜna następnie prasować w tabletki. Przy kontakcie z sokiem Ŝołądko-wym, tabletka wytwarza zasadniczo nieprzepuszczalną dla wody barierę Ŝelową wokół swojej powierzchni. Ta bariera Ŝelowa bierze udział w utrzymywaniu gęstości mniejszej niŜ jeden, umoŜliwiając tym samym utrzymanie się tabletki na powierzchni soku Ŝołądko-20 wego.

Ciecze do podawania doustnego

[0110] Proszki, proszki do dyspersji lub granulki odpowiednie do wytworzenia wodnej zawiesiny przez dodanie wody są dogodnymi postaciami dawkowanymi do podawania do-ustnego. Preparat w postaci zawiesiny dostarcza składnik czynny w mieszaninie ze środ-25 kiem dyspergującym lub zwilŜającym, środkiem suspendującym i jednym lub większą liczbą środków konserwujących. Odpowiednimi środkami suspendującymi są na przykład sól sodowa karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, alginian sodu i tym podobne.

Kompozycje pozajelitowe

[0111] Kompozycja farmaceutyczna moŜe takŜe być podawana pozajelitowo przez 30 wstrzyknięcie, wlew lub wszczepienie (doŜylnie, domięśniowo, podskórnie lub tym po-dobnie) w postaciach dawkowanych, preparatach lub przez odpowiednie urządzenia do do-starczania lub implanty, zawierające tradycyjne nietoksyczne dopuszczalne farmaceutycz-nie nośniki i środki wspomagające. Formułowanie i wytwarzanie takich kompozycji są do-brze znane specjalistom w dziedzinie preparatów farmaceutycznych. 35 [0112] Kompozycje do podawania pozajelitowego mogą być dostarczone w jednostko-wych postaciach dawkowanych (np. w ampułkach z pojedynczą dawką) lub w fiolkach zawierających kilka dawek, do których moŜna dodać odpowiedni środek konserwujący (patrz niŜej). Kompozycja moŜe być w postaci roztworu, zawiesiny, emulsji, urządzenia do wlewu, lub urządzenia do dostarczania do implantacji lub moŜe być dostarczona w postaci 40 suchego proszku, który naleŜy przed uŜyciem roztworzyć w wodzie lub innym odpowied-nim podłoŜu. Poza aktywnym(-i) lekiem(-ami) kompozycja moŜe obejmować odpowiednie dopuszczalne pozajelitowo nośniki i/lub zaróbki. Aktywny(-e) lek(-i) moŜna wprowadzić w mikrosfery, mikrokapsułki, nanocząstki, liposomy i tym podobne, do kontrolowanego uwalniania. Kompozycja moŜe zawierać środki suspendujące, rozpuszczające, stabilizują-45 ce, ustawiające pH i/lub dyspergujące. [0113] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być w postaci odpowiedniej do jałowych wstrzyknięć. W celu wytworzenia takiej kompozycji, odpowiedni(-e) czyn-ny(-e) lek(-i) rozpuszcza się lub przeprowadza w zawiesinę w dopuszczalnym pozajelito-wo ciekłym podłoŜu. Wśród dopuszczalnych podłóŜ i rozcieńczalników, które moŜna za-50 stosować, znajdują się woda, woda doprowadzona do odpowiedniego pH przez dodanie

18

odpowiedniej ilości kwasu chlorowodorowego, wodorotlenku sodu lub odpowiedniego bu-foru, 1,3-butanodiol, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Preparat wodny moŜe takŜe zawierać jeden lub większą liczbę środków konserwujących (np. hydroksyben-zoesan metylu, etylu lub n-propylu). W przypadkach, w których jeden z leków jest tylko trudno lub nieznacznie rozpuszczalny w wodzie, moŜna dodać środek poprawiający roz-5 puszczanie lub solubilizujący albo rozcieńczalnik moŜe zawierać 10-60% wag./wag. glikolu propylenowego lub temu podobnych. [0114] Kompozycje pozajelitowe o kontrolowanym uwalnianiu mogą być w postaci wod-nych zawiesin, mikrosfer, mikrokapsułek, magnetycznych mikrosfer, oleistych roztworów, oleistych zawiesin lub emulsji. Alternatywnie aktywny(-e) lek(-i) moŜna wprowadzić na 10 zgodnych biologicznie nośnikach, liposomach, nanocząstkach, implantach lub urządze-niach do wlewu. Materiały do stosowania w przygotowaniu mikrosfer i/lub mikrokapsułek to np. biodegradowalne/bioerodowalne polimery, takie jak poligalaktyna, poli(cyjanoakry-lan izobutylu), poli(2-hydroksyetylo-L-glutamina). Biokompatybilne nośniki, które moŜna zastosować przy formułowaniu pozajelitowego preparatu o kontrolowanym uwalnianiu 15 stanowią węglowodany (np. dekstrany), białka (np. albumina), lipoproteiny lub przeciw-ciała. Materiały do stosowania w implantach mogą nie być biodegradowalne (np. polidi-metylosiloksan) lub być biodegradowalne (np. poli(kaprolakton), poli(kwas glikolowy) lub poli(ortoestry)).

Kompozycje doodbytnicze 20

[0115] Do podawania doodbytniczego, odpowiednie postacie dawkowane kompozycji obejmują czopki (typu emulsji lub zawiesiny) i doodbytnicze kapsułki Ŝelatynowe (roztwo-ry lub zawiesiny). W typowym preparacie czopka, aktywne(-y) lek(-i) łączy się z odpo-wiednim farmaceutycznie dopuszczalnym podłoŜem czopka, takim jak masło kakaowe, estryfikowane kwasy tłuszczowe, glicerynowana Ŝelatyna i róŜne rozpuszczalne lub dys-25 pergowalne w wodzie podłoŜa, takie jak glikole polietylenowe. MoŜna wprowadzić róŜne dodatki, środki wzmacniające lub środki powierzchniowo czynne.

Kompozycje przezskórne i miejscowe

[0116] Kompozycje farmaceutyczne mogą takŜe być podawane miejscowo na skórę do przezskórnego wchłonięcia w postaciach dawkowanych lub preparatach zawierających tra-30 dycyjnie nietoksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i zaróbki, w tym mikrosfery i liposomy. Takie preparaty obejmują kremy, maści, lotiony, mazidła, Ŝele, hydroŜele, roz-twory, zawiesiny, sztyfty, spreje, pasty, plastry i inne rodzaje układów przezskórnego do-starczania leków. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki lub zaróbki mogą obejmować środki emulgujące, przeciwutleniacze, środki buforujące, środki konserwujące, pochłania-35 cze wilgoci, środki zwiększające wchłanianie, środki chelatujące, środki tworzące Ŝele, podłoŜa maści, substancje zapachowe oraz środki ochronne dla skóry.

Emulgatorami mogą być naturalnie występujące Ŝywice (np. guma guar lub guma traga-kantowa)

[0117] Środkami konserwującymi, środkami pochłaniającymi wilgoć, środkami zwiększa-40 jącymi przenikanie mogą być parabeny, takie jak p-hydroksybenzoesan metylu lub propy-lu, i chlorek benzalkoniowy, gliceryna, glikol propylenowy, mocznik itd. [0118] Opisane wyŜej kompozycje farmaceutyczne do podawania miejscowego na skórę mogą być takŜe stosowane w związku z podawaniem miejscowym na lub w pobliŜu części ciała, która ma być leczona. Kompozycje mogą być przystosowane do bezpośredniego po-45 dawania lub do podawania z uŜyciem specjalnych urządzeń do dostarczania leków, takich jak opatrunki, lub alternatywnie plastry, waciki, gąbki, paski lub inne postacie odpowied-niego elastycznego materiału.

19

Preparaty o powolnym uwalnianiu

[0119] Związki mogą być stosowane w preparatach o powolnym uwalnianiu i/lub formu-łowane ze środkami, które modyfikują ich rozmieszczenie lub biodostępność w tkankach. Konkretniej, w korzystnej postaci, połączenie co najmniej 2 związków formułuje się z po-limerem wymywającym lek lub biocząsteczkami, lub lipidami tworzącymi micele albo li-5 posomy, lub emulsjami typu olej w wodzie, lub pegylowanymi, lub stałymi nanocząstkami albo mikrocząstkami do podawania doustnego, pozajelitowego lub dooponowe-go/dokanałowego w celu zmodyfikowania ich rozmieszczenia i biodostępności w tkankach. [0120] Konkretne przykłady takich środków do formulacji obejmują PGA, PLGA, cyklo-dekstryny, albuminę lub nośniki białkowe, nano- i mikrocząstki, liposomy, emulsje i PEG. 10

Koniugaty

[0121] W terapiach skojarzonych według tego wynalazku, związki mogą być połączone w kompozycjach farmaceutycznych na róŜne sposoby. Mogą być wymieszane razem jako odrębne jednostki. Mogą być formułowane oddzielnie. Mogą być takŜe związane kowalen-cyjnie lub niekowalencyjnie z uŜyciem łącznika lub bez niego. W szczególnej postaci co 15 najmniej dwa związki są związane, korzystnie poprzez łącznik rozszczepialny lub nieroz-szczepialny.

Dawki i czas trwania leczenia

[0122] NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe leki z połączenia mogą być podawane równocześnie, w tym samym lub innym preparacie farmaceutycznym albo sekwencyjnie. JeŜeli podawanie jest 20 sekwencyjne, opóźnienie w podaniu drugiego (lub dodatkowego) składnika czynnego po-winno być takie, by nie utracić korzyści związanych ze skutecznym wpływem połączenia składników czynnych. Minimalne wymaganie dla połączenia zgodnego z tym opisem jest takie, Ŝe połączenie powinno być przeznaczone do łącznego stosowania, gdzie korzyścią jest skuteczny wpływ połączenia składników czynnych. Zamierzone stosowanie połączenia 25 moŜna osiągnąć dzięki ułatwieniom, warunkom, przystosowaniom i/lub innym środkom pomagającym zastosować połączenie według wynalazku. [0123] Terapeutycznie skuteczne ilości dwóch lub większej liczby leków, które są przed-miotami tego wynalazku, mogą być stosowane razem do wytworzenia leku uŜytecznego do zmniejszenia wpływu podwyŜszonej ekspresji genu PMP22, zapobiegając lub zmniejszając 30 ryzyko wykształcenia choroby CMT1A, zatrzymując lub spowalniając postęp choroby CMT1A po ujawnieniu się jej objawów klinicznych, oraz zapobiegając lub zmniejszając ryzyko wystąpienia po raz pierwszy lub kolejny zdarzenia neuropatycznego. [0124] ChociaŜ czynne leki według niniejszego wynalazku mogą być podawane w daw-kach podzielonych, na przykład dwa lub trzy razy na dobę, pojedyncza dawka dobowa 35 kaŜdego leku z połączenia jest korzystna, gdzie najkorzystniejsza jest pojedyncza dawka dobowa wszystkich leków w jednej kompozycji farmaceutycznej (jednostkowa postać dawkowana). [0125] Podawanie moŜna prowadzić raz do kilku razy na dobę przez kilka dni do kilku lat, i moŜna je nawet prowadzić przez całe Ŝycie pacjenta. W większości przypadków wskaza-40 ne będzie przewlekłe lub co najmniej okresowo powtarzane długotrwałe podawanie.

● Określenie „jednostkowa postać dawkowana” odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek (takich jak kapsułki, tabletki lub napełnione cylindry strzykawek) odpo-wiednie jako dawki jednostkowe dla osobników będących ludźmi, gdzie kaŜda jed-nostka zawiera z góry ustaloną ilość czynnego materiału lub materiałów, obliczoną 45 tak, by wywoływała poŜądany efekt terapeutyczny, w połączeniu z wymaganym no-śnikiem farmaceutycznym.

[0126] Ilość kaŜdego leku w połączeniu korzystna do dawki jednostkowej będzie zaleŜała od kilku czynników, w tym sposobu podawania, masy ciała i wieku pacjenta, powagi

20

uszkodzeń neuropatycznych wywołanych przez chorobę CMT1A lub ryzyka potencjalnych działań ubocznych, biorąc pod uwagę ogólny stan zdrowia leczonej osoby. [0127] Dodatkowo, na stosowaną dawkę wpływ moŜe mieć informacja farmakogenomicz-na o określonym pacjencie (wpływ genotypu na farmakokinetykę, farmakodynamikę lub profil skuteczności środka terapeutycznego). 5 [0128] Poza sytuacjami, w których wymagane moŜe być odpowiadanie na przypadki szczególnie upośledzającej choroby CMT, gdy wymagane mogą być wyŜsze dawki lub przy leczeniu dzieci, gdy naleŜy wybrać niŜsze dawki, korzystna dawka kaŜdego leku w połączenia będzie zazwyczaj mieścić się w zakresie dawek nie wykraczających ponad zwykle przepisywane do długotrwałego leczenia podtrzymującego lub uznane za bez-10 pieczne w duŜych badaniach klinicznych fazy 3. [0129] Przykładowo:

● dla związku F od około 2 do około 100 mg na dobę przy przyjmowaniu doustnym. Specjalne dawki naleŜy dobrać do podawania miejscowego. ● dla związku D od około 1 do około 20 mg na dobę przy przyjmowaniu doustnym. 15 ● dla związku B od około 2 do około 20 mg na dobę przy przyjmowaniu doustnym. Inne dawki mogą być odpowiednie do podawania w postaci nanocząstek lub podob-nych preparatów. ● dla związku E od około 125 do około 500 mg na dobę przy przyjmowaniu doust-nym. 20 ● dla związku C od około 1 do około 20 mg na przy przyjmowaniu doustnym. ● dla związku A od około 1 do około 50 g na dobę przy przyjmowaniu doustnym. Specjalne dawki naleŜy dobrać do wstrzyknięć.

[0130] Najkorzystniejsza dawka będzie odpowiadać ilościom od 1% aŜ do 10% tych prze-pisywanych zwykle przy długotrwałym leczeniu podtrzymującym. 25 [0131] NaleŜy rozumieć, Ŝe podawana w rzeczywistości ilość leku będzie ustalana przez lekarza, w świetle stosownych okoliczności, obejmujących leczony stan lub stany, dokład-ną podawaną kompozycję, wiek, masę, odpowiedź poszczególnego pacjenta, uciąŜliwość objawów u pacjenta i wybraną drogę podawania. Zatem powyŜsze zakresy dawek dawek mają dostarczać ogólne wskazówki i wsparcie dla obecnych pouczeń, ale nie mają ograni-30 czać zakresu tego wynalazku. [0132] Następujące przykłady podano w celach poglądowych, a nie jako ograniczenie.

Przykłady

1. Hodowla komórek

1.1: Dostępne w handlu pierwotne szczurze komórki Schwanna 35

[0133] Fiolki z hodowlą pierwotną szczurzych komórek Schwanna (SC) (Sciencell # R1700) rozmraŜa się i wysiewa przy gęstości 10000 komórek/cm2 w „poŜywce do komó-rek Schwanna Sciencell” (podstawowa poŜywka z Sciencell # R1701) w 75 cm2 kolbach wstępnie opłaszczonych poli-L-lizyną. PoŜywka hodowlana składa się z poŜywki podsta-wowej, 5% płodowej surowicy bydlęcej (3H-Biomedical AB #1701-0025), 1% dodatku 40 wzrostowego dla komórek Schwanna (3H Biomedical AB #1701-1752), 1% Gentamycyny (Sigma #G1397) i 10 µM Forskoliny (Sigma # F6886), aby pobudzić ich proliferację. [0134] Po osiągnięciu konfluencji (4 do 10 dni, w zaleŜności od partii komórek), komórki Schwanna oczyszcza się przez delikatne wytrząsanie lub metodą thy1.1 immunopanning, która umoŜliwia odizolowanie SC od przylegających fibroblastów, aby wytworzyć hodow-45 le czyste w co najmniej 95%. SC następnie zlicza się (metoda z uŜyciem błękitu tryptano-wego) i wysiane w 75 cm2 kolbach wstępnie opłaszczonych poli-L-lizyną w tej samej po-Ŝywce dla SC. Przy konfluencji komórki przepłukuje się, poddaje trypsynizacji (trypsyna-EDTA 1x rozcieńczony z Invitrogen #1540054), rozcieńczone w PBS bez wapnia i magen-zu) zliczone i wysiane w 12-studzienkowych naczynkach (140000 komórek/studzienkę) w 50

21

poŜywce do komórek Schwanna Sciencell z 5% FBS, 1% dodatku wzrostowego dla komó-rek (CGS), 40 µg/ml gentamycy i 4 µM Forskoliny.

1.2 Pierwotne szczurze komórki Schwanna wytworzone na zamówienie

[0135] Pierwotne hodowle komórek Schwanna (SC) zakłada się z nerwów kulszowych nowonarodzonych szczurów Sprague-Dawley (między P0 i P2). Wszystkie nowonarodzo-5 ne szczury uśmierca się i izoluje na szalce Petriego. Sekcję prowadzi się w warunkach ste-rylnych. [0136] Z tylnej kończyny i dolnej części tułowia usuwa się skórę grzbietową. Nerw kul-szowy izoluje się i przenosi na szalkę do hodowli zawierającej lodowatą poŜywkę Le-ibovitza (L15, Invitogen #11415) uzupełnioną 1% roztworu penicyliny/streptomycyny 10 (odpowiednio 50 UI/ml i 50 µg/ml; Invitrogen #15070) i 1% surowiczej albuminy bydlęcej (BSA, Sigma A6003). Oba nerwy z kaŜdego szczura przenosi się do 15 ml probówki za-wierającej lodowatą L15. PoŜywkę L15 następnie usuwa się i zastępuje 2,4 ml DMEM (Invitrogen #21969035) z 10 mg/ml kolagenazy (Sigma #A6003). Nerwy inkubuje się w tej poŜywce przez 30 minut w 37°C. PoŜywkę następnie usuwa się i obydwa nerwy rozła-15 cza się z uŜyciem trypsyny (10% trypsyny EDTA 10x Invitrogen #15400054) rozcieńczo-nej w PBS bez wapnia i magnezu (Invitrogen # 2007-03) przez 20 min w 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie DMEM zawierającej DNazę I stopnia II (0,1 mg/ml Roche diagnostic #104159) i płodowej surowicy cielęcej (FCS 10%, Invitrogen #10270). Zawie-sinę komórek rozciera się z uŜyciem 10 ml pipety i przepuszcza przez filtr do 50 ml pro-20 bówki (jednostki filtracyjne Swinnex 13 mm, Millipore, z 20 µm filtrami z siateczki nylo-nowej, Fisher). Zawiesinę komórek odwirowuje się przy 350 g przez 10 min w temperatu-rze pokojowej (RT), a osady przeprowadza się w zawiesinę w DMEM z 10% FCS i 1% penicyliny/streptomycyny. Komórki zlicza się (metoda z uŜyciem błękitu tryptanowego) i wysiewa na płytkach do hodowli tkankowych Falcon 100 mm Primaria przy gęstości 5.105 25 do 106 komórek/płytkę. [0137] Po jednym dniu hodowli poŜywkę zmienia się na DMEM, 10% FCS, 1% penicyli-ny/streptomycyny i 10 µM b-D-arabinofuranozydu cytozyny (Sigma #C1768). 48 h póź-niej poŜywkę usuwa się, a komórki przemywa się trzy razy DMEM. Następnie dodaje się poŜywkę wzrostową dla SC, złoŜoną z DMEM, 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny, 30 2 µM Forskoliny (Sigma #F6886), 10 µg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (PEX, Invitro-gen #13028). PoŜywkę wymienia się co 2-3 dni. [0138] Po 8 dniach hodowli (4 do 10 dni w zaleŜności od partii komórek), komórki Schwanna osiągają konfluencję i hodowlę zawierającą duŜą ilość zanieczyszczających fi-broblastów oczyszcza się metodą thy1.1 immunopanning. Po tym oczyszczeniu komórki 35 przeprowadza się w zawiesinę w poŜywce wzrostowej przy 10000 komórek/cm2 w 75 cm2 kolbach wstępnie opłaszczonych poli-L-lizyną. Po osiągnięciu konfluencji komórki płucze się, poddaje trypsynizacji (trypsyna-EDTA), zlicza i wysiewa w 12-studzienkowych szal-kach (100000 komórek/studzienkę).

1.3: Inkubacja z lekiem 40

[0139] Po wysianiu komórek w 12-studzienkowych naczynkach, poŜywkę zastąpuje się zdefiniowaną poŜywką złoŜoną z mieszaniny DMEM-F12 (Invitrogen # 21331020) uzu-pełnioną 1% dodatku N2 (Invitrogen # 17502), 1% L-Glutaminy (Invitrogen #25030024) 2,5% FBS (Sciencell #0025), 0,02 µg/ml kortykosteronu (Sigma # C2505), 4 µM Forskoli-ny i 50 µg/ml gentamycyny. Do tej poŜywki nie dodaje się czynników wzrostu, aby pobu-45 dzić róŜnicowanie SC. [0140] 24 godziny później poŜywkę zastąpuje się zdefiniowaną poŜywką (DMEM-F12) uzupełnioną 1% Insuliny-Transferyny-Selenu - X (ITS, Invitrogen # 51300), 16 µg/ml Pu-trescyny (Sigma # P5780), 0,02 µg/ml kortykosteronu i 50 µg/ml gentamycyny. Na tym etapie w poŜywce nie jest obecny ani progesteron, ani forskolina. 50 [0141] Jeden dzień później komórki Schwanna stymuluje się połączeniami leków lub le-

22

kami samodzielnie w ciągu 24 h (3 studzienki/warunek). Wytwarzanie kaŜdego związku prowadzi się tuŜ przed jego dodaniem do poŜywki do hodowli komórek. [0142] Leki dodaje się do zdefiniowanej poŜywki złoŜonej z DMEM-F12, z 1 % Insuliny-Transferyny-Selenu - X (ITS, Invitrogen # 51300), 16 µg/ml Putrescyny, 0,02 µg/ml korty-kosteronu, 10 nM Progesteronu i 50 µg/ml gentamycyny. Brak Forskoliny podczas stymu-5 lacji lekiem zapobiega wysyceniu cyklazy adenylanowej.

2. Oczyszczanie komórek Schwanna metodą Thy1.1 immunopanning

[0143] Aby zapobiec zanieczyszczeniu hodowli fibroblastami, komórki Schwanna oczysz-cza się z uŜyciem protokołu immunopanning klonu Thy1.1 (ATCC TIB-103™). [0144] 100 mm szalki Petriego dla bakterii wstępnie opłaszczone przeciwciałem przygo-10 towuje się w następujący sposób: szalki te przemywa się trzy razy PBS i traktuje 20 ml roztworu Tris HCl 50 mM, pH 9,5, z 10 µg/ml koziego przeciwciała przeciw mysiej IgM MI (Jackson ImmunoResearch #115-005-020) przez noc w 4°C; a następnie płucze się 3 razy PBS i traktuje rotworem PBS z 0,02% BSA i supernatantem uzyskanym z hodowli hybrydom T11D7e2 (ATCC #TIB-103) zawierającym przeciwciało Thy1.1 IgM przez 2 15 godziny, w temperaturze pokojowej. Wreszcie płytki przemywa się trzy razy PBS przed dodaniem zawiesin komórek. [0145] SC rozdziela się z uŜyciem trypsyny EDTA. Gdy tylko większość komórek jest w zawiesinie, trypsynę neutralizuje się z uŜyciem DMEM-10% FBS i komórki odwirowuje się. Osad zdysocjowanych komórek ponownie przeprowadza się w zawiesinę w 15 ml po-20 Ŝywki z 0,02% BSA, przy gęstości 0,66x106 komórek na ml (maksymalnie) i przenosi na szalki Petriego (około 6,6 milionów komórek/10 ml/100 mm szalkę). [0146] Zawiesinę komórek inkubuje się na szlce Petriego opłaszczonej Thy 1.1 przez 45 min w 37°C, delikatnie wytrząsając co 15 min aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Większość komórek fibroblastów eksprymujących Thy1.1 przylega do szalki. Pod koniec 25 inkubacji, odzyskuje się zawiesinę komórek i odwirowuje. Zawiesina komórek zawiera teoretycznie tylko komórki Schwanna. Komórki odwirowuje się, a osad ponownie prze-prowadza w zawiesinę w poŜywce wzrostowej z 10 µM Forskoliny przy 16000 komó-rek/cm2 w T75 cm2 kolbie traktowanej Poli-L-Lizyną.

3 – Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą (Q- RT-PCR) 30

[0147] Ilościową RT-PCR stosuje się do porównania poziomów mRNA PMP22 po stymu-lacji lekiem, względem konstytutywnego rybosomalnego mRNA L13A w pierwotnej ho-dowli szczurzych komórek Schwanna. [0148] Po płukaniu zimnym wyjałowionym PBS, całe RNA z kaŜdej próbki komórek pod-daje się ekstrakcji i oczyszcza z SC z uŜyciem mikrozestawu Qiagen RNeasy (Qiagen 35 #74004). Kwasy nukleinowe oznacza się ilościowo przy uŜyciu spektrofotometru Nano-drop, stosując 1 µl próbki RNA. Integralność RNA określa się z uŜyciem aparatu BioAna-lyzer (Agilent). [0149] RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji na cDNA zgodnie ze standardowym pro-tokołem. Matryce cDNA do amplifikacji PCR są syntezowane z 200 ng całego RNA z uŜy-40 ciem odwrotnej transkryptazy SuperScript II (Invitrogen # 18064-014), przez 60 min w 42°C, w obecności oligo(dT), w końcowej objętości 20 µl. [0150] cDNA poddaje się amplifikacji PCR z uŜyciem systemu «LightCycler® 480» (Ro-che Molecular Systems Inc.). KaŜde cDNA rozcieńcza się 5-krotnie przed zastosowaniem do amplifikacji PCR. 2,5 µl tego cDNA wchodzi do roztworu do reakcji PCR (końcowa 45 objętość 10 µl). Wstępne doświadczenia pokazały, Ŝe oznaczenie ilościowe prowadzono w wykładniczej fazie procesu amplifikacji dla obu sekwencji, i Ŝe ekspresja genu odniesienia była jednolita w róŜnych warunkach hodowli. [0151] Reakcję PCR prowadzi się drogą amplifikacji 500 nM startera w przód dla szczu-rzego PMP22 (NM_017037), 5-GGAAACGCGAATGAGGC-3, i 500 nM startera w tył 5-50 GTTCTGTTTGGTTTGGCTT-3 (amplifikacja 148 pz). 152 pz fragment rybosomalnego

23

RNA RPL13A (NM_173340) amplifikuje się równolegle w oddzielnych reakcjach w celu normalizacji wyników z zastosowaniem 500 nM startera w przód 5-CTGCCCTCAAGGT-TGTG-3 i 500 nM startera w tył 5-CTTCTTCTTCCGGTAATGGAT-3. [0152] Zastosowaliśmy reakcję FRET do przeprowadzenia analizy RT-Q-PCR. Sondy FRET są złoŜone z 0,3 µM Pmp22-FL-5-GCTCTGAGCGTGCATAGGGTAC lub Rp113A-5 FL- 5-TCGGGTGGAAGTACCAGCC, wyznakowanych na końcu 3' donorowym barwni-kiem fluoroforowym (Fluoresceiną). 0,15 µM sondy Red640 są zdefiniowane w następują-cy sposób: Pmp22-red-5'-AGGGAGGGAGGAAGGAAACCAGAAA- lub Rpl13A-red-5'-TGACAGCTACTCTGGAGGAGAAACGGAA, wyznakowane na ich końcu 5' akcepto-rowym barwnikiem fluoroforowym (Czerwień Rodaminowa 640). 10 [0153] KaŜda mieszanina reakcyjna do PCR zawierała 2,5 µl matrycy cDNA w końcowej objętości 10 µl zestawu master mix (Roche #04-887301001). [0154] Zastosowano następujące warunki PCR: 10 s w 95°C, 10 s w 63°C i 12 s w 72°C i 30 s w 40°C (czterdzieści cykli amplifikacji). Względne poziomy ekspresji genu PMP22 mierzy się wyznaczając stosunek między produktami wytworzonymi z docelowego genu 15 PMP22 i endogennego wzorca wewnętrznego RPL13A.

4 – Analiza ekspresji białka PMP22 metodą cytometrii przepływowej (FACS)

[0155] 8 h, 24 h i 48 h po inkubacji z lekami supernatanty odzyskuje się, odwirowuje i za-mraŜa. SC odłącza się z uŜyciem trypsyny-EDTA. Gdy tylko większość komórek jest w zawiesinie, trypsynę neutralizuje się z uŜyciem DMEM z 10% FCS. 20 [0156] Supernatanty z komórkami odzyskuje się i odwirowuje. Osady komórek przenosi się do mikroprobówek, przemywa raz w PBS i utrwala w specyficznym roztworze (AbCys #Reagent A BUF09B). 10 minut później komórki płucze się raz PBS i przechowuje w 4°C. [0157] Pięć dni po utrwalaniu komórek, wszystkie preparaty komórek po róŜnych czasach inkubacji znakuje się z uŜyciem następującego protokołu. 25 [0158] Komórki odwirowuje się przy 7000 obr./min przez 5 minut, osady ponownie prze-prowadza się w zawiesinę w roztworze do permeabilizacji (AbCys #Reagent B BUF09B) i znakuje pierwszorzędowym przeciwciałem przeciw PMP22 (Abcam #ab61220, 1/50) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Komórki odwirowuje się następnie przy 7000 ob-r./min przez 5 minut, a osady komórek płucze się raz w PBS. Dodaje się przeciwciało dru-30 gorzędowe, sprzęŜone z Alexa Fluor 488 (kozie przeciw króliczej IgG, Molecular Probes #A11008, 1/100), na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki odwirowuje się następnie przy 7000 obr./min przez 5 minut i osady komórek płucze się raz w PBS. Zna-kowanie zwiększa się dodając przeciwciało trzeciorzędowe sprzęŜone z Alexa Fluor 488 (kurczęce przeciw koziej IgG, Molecular Probes #A21467, 1/100) na jedną godzinę inku-35 bacji w temperaturze pokojowej. Komórki następnie płucze się raz w PBS. Prowadzi się kontrolę bez Ŝadnego przeciwciała (nieznakowane komórki) w celu określenia poziomu autofluorescencji i dostosowuje się czułość fotopowielaczy. Prowadzi się kontrolę zarówno z przeciwciałem drugorzędowym, jak i trzeciorzędowym, ale bez przeciwciała pierwszo-rzędowego w celu oceny niespecyficznego wiązania przeciwciał. 40 [0159] Zbieranie i analizę danych prowadzi się z uŜyciem cytometru FACS Array i opro-gramowania FACS Array (Becton Dickinson) na 5000 komórek. Analizuje się rozproszenie w przód (FSC) skorelowane z objętością (wielkością) komórek i rozproszenie na boki (SSC) zaleŜne od wewnętrznej złoŜoności komórek (ziarnistości). Do ekspresji PMP22, prowadzi się analizę w obrębie wszystkich komórek i oblicza procent komórek pozytyw-45 nych. Komórki pozytywne to komórki z intensywnością fluorescencji wyŜszą niŜ w próbie kontrolnej z przeciwciałem drugorzędowym. [0160] W celu ilościowego oznaczenia liczby SC, analizuje się komórki w poŜywce kon-trolnej z uŜyciem przeciwciał przeciw białku S100. [0161] Komórki przygotowuje się zgodnie z następującym protokołem: Komórki Schwan-50 na wybarwia się przeciwciałem przeciw białku S100 (Dako #S0311, 1/100) przez 1 h w

24

temperaturze pokojowej. To przeciwciało znakuje się zgodnie z protokołem opisanym po-wyŜej dla barwienia immunologicznego PMP22 ale bez inkubacji z przeciwciałem trzecio-rzędowym.

5. Inkubacja i aktywność leku

[0162] Leki inkubuje się przez 24 h lub 48 h w tej samej zdefiniowanej poŜywce, którą 5 opisano powyŜej (3 studzienki/warunek) bez Forskoliny, aby zapobiec wysyceniu stymula-cji cyklazy adenylanowej, ale w obecności 10 nM progesteronu. Po inkubacji z lekiem, od-zyskuje się supernatanty, a komórki Schwanna zamraŜa się do analizy RT-Q-PCR. [0163] Określili śmy aktywność leku względem ekspresji PMP22, gdy obniŜał on istotnie poziomy PMP22 w porównaniu z próbą kontrolną. Tabela 1 poniŜej podsumowuje wyniki 10 dla 20 czynnych leków, które wywołały spadek ekspresji PMP22.

Tabela 1

Związek mRNA Białko

Baklofen +

Metimazol + +

Mifepriston +

Naltrekson +

Pilokarpina + +

Sorbitol +

Disulfiram +

Fenofibrat +

Haloperidol +

Indometacyna +

Montelukast +

Symwastatyna +

Trilostan +

Estradiol-b +

Izoproterenol +

Diklofenak + +

Flurbiprofen + +

Indometacyna + +

Ketoprofen + +

Meloksykam + + [0164] Dane dla 18 leków, które prowadzą do istotnego spadku ekspresji mRNA PMP22 po 24 h inkubacji zilustrowano na Fig. 1-3. Te dane pokazują zasadnicze zmniejszenie po-ziomów mRNA PMP22, nawet przy bardzo niskich dawkach.

6. Poziom ekspresji białka PMP22 po inkubacji przez 24 h: 15

[0165] Zbadaliśmy zdolność niektórych leków do hamowania ekspresji białka PMP22 (analiza FACS). Figura 4 opisuje wyniki dla 6 leków i pokazuje, Ŝe są one zdolne do istot-

25

nego obniŜenia ekspresji białka PMP22, 24 h po ich dodaniu do poŜywki hodowlanej. Wy-niki działania niektórych poszczególnych leków na poziom białka PMP22 są takŜe poka-zane w tabeli 1 powyŜej. [0166] Na Fig. 5 pokazano wpływ połączenia pilokarpiny i naltreksonu na ekspresję białka PMP22 po inkubacji przez 24 h. Poziomy ekspresji białek porównano z nietraktowanymi 5 kontrolami. Wykazano, Ŝe te róŜnice są istotne statystycznie. [0167] Tabela 2 poniŜej podsumowuje wyniki uzyskane z uŜyciem róŜnych połączeń le-ków w róŜnych stęŜeniach, na ekspresję białka PMP22. Te wyniki były statystycznie istot-ne i wykazują korzystny wpływ proponowanych połączeń leków.

Tabela 2

Połączenia % PMP22 FACS

% odchylenie standardowe

Zmienność Wartość p

Sorbitol 1 mM + Me-timazol 1 µM

75 8 -25% p<0,001

Sorbitol 100 µM + metimazol 10 µM

74 7 -26% p<0,001

Sorbitol 100 µM + metimazol 1 µM

74 7 -26% p<0,001

Pilokarpina 10 nM + Naltrekson 1 µM

63 6 -37% p<0,0001

Pilokarpina 10 nM + Naltrekson 100 nM

68 5 -32% p<0,0001

Sorbitol 1 mM + Nal-trekson 1 µM

67 10 -33% P<0,0001

Sorbitol 1 mM + Nal-trekson 100 nM

70 10 -30% p<0,0001

Sorbitol 100 µM + Naltrekson 1 µM

70 12 -30% p<0,001

Sorbitol 100 µM + Naltrekson 100 nM

62 14 -38% p<0,0001

7. Doświadczenia in vivo w zwierzęcym modelu CMT 10

[0168] Badaliśmy związki pod kątem efektu terapeutycznego w transgenicznym szczu-rzym modelu CMT – hemizygotycznym pod względem PMP22 transgenicznym szczurze zawierającym trzy dodatkowe kopie mysiego genu PMP22 (Sereda i in., 1996; Grandis i in., 2004). Z klinicznego punktu widzenia ten szczurzy model CMT jest dobrym przybliŜe-niem ludzkiej choroby CMT1A. Dorosłe szczury z CMT wykazują spowolnienie prędkości 15 przewodnictwa w nerwach ruchowych do wartości podobnych do tych u pacjentów z CMT1A, tj. niŜszych niŜ 50%. Po stymulacji nerwu kulszowego, złoŜone potencjały ak-tywności mięśni wykazują niŜsze amplitudy i desynchronizację. Zmiany histologiczne i elektrofizjologiczne poprzedzają widoczne objawy kliniczne zaburzeń ruchowych (Sereda i in., 1996, 2003). Utrata aksonów, potwierdzona histologiczną wyraźną atrofią mięśni, od-20 powiada ludzkim objawom CMT1A. [0169] W całym badaniu stosowano czterotygodniowe szczury transgeniczne pod wzglę-dem PMP22. Aspekty projektu badania (randomizacja, statystyki do porównań wielokrot-nych, wielkość próby itd.) zostały sprawdzone pod kątem zgodności z zaleceniami dostar-

26

czonymi w 4 numerze 43 tomu ILAR Journal (2002), który dostarcza artykuły przeglądo-we z dziedziny projektowania eksperymentów i statystyk w badaniach biomedycznych. Grupy eksperymentalne tworzą młode szczury obu płci osobno. Szczury przypisuje się do grup zgodnie ze schematem randomizacji w oparciu o masę ciała. W niektórych ekspery-mentach randomizacja opiera się na sprawności szczurów w teście z poprzeczką. 5 Obie płcie są reprezentowane przez oddzielne grupy kontrolne, które były pod względem liczebności równe lub większe niŜ grupy leczenia. Szczurom podaje się leki w sposób przewlekły – przez karmienie przymusowe lub wstrzy-kiwanie przy uŜyciu podskórnej pompy osmotycznej Alzet (DURECT Corporation Cuper-tino, CA), w zaleŜności od biodostępności kaŜdego leku w ciągu 10-20 tygodni. 10 Zwierzęta waŜy się dwa razy w tygodniu w celu dopasowania dawek do rosnącej masy cia-ła. Gdy do podawania leku wybrana jest pompa osmotyczną, dawki leku oblicza się na podstawie szacunkowej średniej masy ciała zwierząt przewidywanej dla ich wieku w cza-sie działania pompy (6 tygodni). Pompy ponownie wszczepia się, gdy jest to konieczne, przy odpowiednim protokole znieczulenia. 15

Testy behawioralne

[0170] Co kaŜde trzy lub cztery tygodnie zwierzęta poddaje się testom behawioralnym. KaŜdy test przeprowadza ten sam badacz, w tym samym pokoju i o tej samej porze dnia; tę jednorodność utrzymuje się przez całe doświadczenie. Całe leczenie było niewiadome dla badacza. „Test z poprzeczką” i „siła uchwytu” były głównie stosowane do oceny sprawno-20 ści w trakcie badania. Schemat testu z poprzeczką moŜe się zmieniać wraz ze wzrostem zwierząt (na przykład w celu uniknięcia obciąŜenia spowodowanego na przykład uczeniem się). Test siły uchwytu umoŜliwiał wykrycie subtelnych róŜnic w sprawności chwytania, która wydaje się składać z siły mięśni, stanu wraŜliwości (na przykład bolesne doznania doty-25 kowe mogą zmieniać mierzone wartości siły), składnika behawioralnego („motywacji”). Wartości róŜnią się dla kończyn przednich i tylnych, oraz w duŜym stopniu zaleŜą od wie-ku zwierząt. [0171] Test siły uchwytu mierzy siłę, z jaką zwierzę trzyma się uchwytu swoimi przednimi lub tylnymi łapami osobno. Na uchwycie jest umieszczony dynamometr do pomiaru siły 30 (Force Gauge FG-5000A). Eksperymentator trzyma szczura w taki sposób, Ŝe łapie on uchwyt swoimi kończynami przednimi albo swoimi kończynami tylnymi, i delikatnie cią-gnie szczura w tył, aŜ do momentu gdy puści uchwyt. Siła jest rejestrowana w momencie, w którym zwierzę zwalnia uchwyt. Wykonuje się dwie kolejne próby mierzące siłę kończyn przednich i dwie kolejne próby 35 mierzące siłę kończyn tylnych na zwierzę; notuje się tylko maksymalny wynik (jeden dla kończyn przednich i jeden dla kończyn tylnych) (w N). Test z poprzeczką ocenia zdolność szczurów do utrzymania się na zamocowanym pręcie. Szczury Pmp22, które cechują się osłabieniem mięśni, wykazują deficyt sprawności w tym teście (Sereda i in., 1996). Szczura umieszcza się z jego czterema łapami na środku pręta 40 (średnica: 2,5 cm; długość: 50 cm; 30 cm powyŜej stołu). Próby przeprowadza się kolejno; liczba i czas trwania prób w naszych eksperymantach zaleŜały od partii zwierząt. Tę zmienność w badaniu wprowadzono w celu wyznaczenia schematu dostosowanego do naj-lepszej detekcji zaburzeń motorycznych u szczurów z CMT w czasie trwania eksperymen-tów. 45 [0172] W kaŜdej sesji zbierano następujące wskaźniki sprawności:

- Liczba prób potrzebnych do utrzymania się przez 60 s (lub 30 s dla partii 1, sesje 1 i 2) na pręcie.

- Czas spędzony na poprzeczce (tj. zwłoka do upadku) w kaŜdej próbie oraz średnia z sesji. W procedurach doświadczalnych, w których sesja kończyła się w momencie, 50 gdy szczur utrzymał się aŜ do czasu progu odcięcia, tj. 30 lub 60 s, na poprzeczce, do

27

nieukończonych prób przypisywano czas progu odcięcia (30 s lub 60 s) (np.: dla serii 8, dla zwierzęcia, które pozostaje na poprzeczce krócej niŜ 10 s w próbach 1, 2 i 3, a następnie przez 60 s w próbach 4 i 5, dla prób 6 do 10 przypisuje się 60 s).

- Liczba upadków.

Ocena ogólnego stanu zdrowia 5

[0173] Masy ciała, widoczne objawy (wygląd sierści, postura ciała, chód, drŜenie itd.) zwierząt monitoruje się przez cały czas doświadczenia. Skala oceny stosowana do rejestra-cji danych: 0= prawidłowe, 1=nieprawidłowe.

Dalsze testy

[0174] Gdy jest to odpowiednie, szczury poddaje się ocenie elektrofizjologicznej i bada-10 niom histologicznym.

Wyniki

[0175] Metimazol poprawiał sprawność w teście z poprzeczką przez całą procedurę lecze-nia (Fig. 6), podczas gdy związek PXT25, który jest tu prezentowany tylko dla celów po-równania, prawie nie wykazał poprawy. 15 [0176] Podobnie pilokarpina poprawiała sprawność w teście z poprzeczką przez całą pro-cedurę leczenia (Fig.6). [0177] Sprawność motoryczna była średnio 3 razy słabsza u róŜnych szczurów z CMT le-czonych placebo w porównaniu z grupą typu dzikiego (WT). Leczenie metimazolem lub pilokarpiną umoŜliwiło poprawę zwierząt pod tym względem, stała się ona statystycznie 20 istotna juŜ po 8 tygodniach przymusowego karmienia. Ten efekt był dość wyraźny po 16 tygodniach leczenia (Fig. 7). Zwierzęta wykazywały znacznie lepsza sprawność w testach w porównaniu z grupą placebo i odzyskały taki poziom sprawności, który nie róŜnił się juŜ istotnie do tego z grupy WT placebo. [0178] Stwierdzono, Ŝe amplituda potencjału zmierzona w dystalnej części ogona jest 25 znacznie obniŜona w grupie TG placebo, co moŜe odzwierciedlać istotną utratę aksonów, która z kolei jest spowodowana demielinizacją. Ten parametr elektrofizjologiczny okazuje się istotnie poprawiać po leczeniu metimazolem (Fig. 8), podczas gdy prędkość przewod-nictwa nerwowego (NCV) nie była istotnie zmieniona. [0179] Ta obserwacja pozwala przypuszczać, Ŝe działanie metimazolu moŜe zapobiegać 30 utracie aksonów, nawet gdy stan mielinizacji nerwów obwodowych nie jest mierzalnie po-prawiony. Wpływ pilokarpiny wydaje się być zasadniczo taki sam, nawet jeŜeli z powodu zmienności wewnątrz grupy róŜnica z parametrem z grupy placebo nie wykazała istotności statystycznej. W CMT1A, amplituda czuciowego potencjału czynnościowego nerwów (SNAP) była bardziej obniŜona, a czas trwania SNAP bardziej wydłuŜony niŜ w CMT2. To 35 obniŜenie amplitud złoŜonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) i SNAP w CMT1A jest prawdopodobnie łącznym efektem demielinizacji i dysfunkcji aksonów. [0180] Pod koniec badania przeprowadzono analizę morfometryczną. Pomiar tkanek koń-czyny tylnej ujawnia, Ŝe nerwy kulszowe i mięśnie płaszczkowate są znacznie zmniejszone u samic szczurów z CMT leczonych placebo w porównaniu z kontrolnymi szczurami WT. 40 Okazuje się, Ŝe te róŜnice ulegają całkowitej poprawie dzięki leczeniu metimazolem: bez-względne masy mięśni i nerwów są nawet wyŜsze niŜ u szczurów kontrolnych WT, pod-czas gdy całkowita masa ciała jest raczej obniŜona w grupie metimazolu w porównaniu z grupą placebo (dane nie pokazane). [0181] Te dane pokazują, Ŝe związki według tego wynalazku pozwalają skutecznie leczyć 45 CMT in vivo. Ponadto naleŜy podkreślić, Ŝe pierwsze dawki kaŜdego z leków, które okaza-ły się aktywne to jedna czwarta (metimazol) i jedna piąta (pilokarpina) dawki równowaŜ-nej dawce stosowanej u człowieka według klasycznych wskazań.

28

8. Schemat terapeutyczny, dawki i drogi podawania

[0182] PoniŜej opisano dawki dla dwóch połączeń (które róŜnią się drogami podawania) u ludzi.

(1) Związek F i związek D

1 Podawanie doustne w postaci pojedynczej kompozycji farmaceutycznej: zwią-5 zek D od około 0,1 do około 20 mg i związek F od około 0,2 do około 50 mg co-dziennie doustnie przez kilka miesięcy, najkorzystniejsze dawki obu leków w tej kompozycji mieszczą się w zakresie od 0,1 do 5 mg na jednostkę (na dzień).

2 Równoczesne podawanie doustne przez kilka miesięcy: związek F od około 5 do około 200 mg raz w tygodniu (najkorzystniejsze dawkowanie wynosi aŜ do 50 10 mg na tydzień), związek D od około 0,1 do około 20 mg na dobę (najkorzystniej-sze dawkowanie tego leku wynosi od 0,1 do 5 mg na dobę).

3 Równoczesne podawanie przez kilka miesięcy: związek D od około 0,1 do oko-ło 20 mg codziennie doustnie (najkorzystniejsze dawkowanie tego leku wynosi od 0,1 do 5 mg na dobę) i związek F w postaci plastra skórnego uwalniającego lek 15 korzystnie z szybkością około 0,2 do około 2 na dobę.

(2) Związek A i związek F.

1 Podawanie w sposób przewlekły, doustne, dwa lub trzy razy na dobę, w postaci pojedynczej kompozycji farmaceutycznej w postaci kapsułek lub kropli, które muszą być rozpuszczone w napoju (korzystnie w mleku): korzystna całkowita 20 dawka dobowa związku F wynosi od około 0,1 do około 5 mg, a związku A od około 1 do około 50 g.

2 Równoczesne podawanie przez kilka miesięcy: związek F raz na tydzień od około 5 do około 200 mg raz na tydzień (najkorzystniejsze dawkowanie wynosi aŜ do 50 mg na tydzień), a związek A dwa razy na dobę w napoju, przy całkowitej 25 dawce dobowej związku A od około 1 do około 50 g.

3 Podawanie sekwencyjne i równoczesne w długotrwałych terapiach: początko-wo pojedynczy bolus związku F (około 200 do 600 mg) doustnie, a następnie równocześnie w połączeniu: związek F w postaci plastra na skórę uwalniającego lek** (najkorzystniej z szybkością od około 0,2 do około 2 mg na dobę) i związek 30 A dwa razy na dobę przez 7 dni w wodzie pitnej, następnie brak związku A przez 14 dni, następnie związek A przez 7 dni dwa razy na dobę w wodzie pitnej (ko-rzystne całkowite dawkowanie dobowe związku A wynosi od około 1 do około 50 g) itd. z przerwami.

* dawki tego leku w dowolnym połączeniu spośród tych ujawnionych w niniejszym wyna-35 lazku mogą znacznie się róŜnić w preparatach proponowanych do leczenia męŜczyzn i ko-biet. ** ten sam schemat terapeutyczny co dla związku F i związku A (3), ale zamiast plastra na skórę moŜna zastosować podawanie doodbytnicze/dopochwowe niskich dawek związku F.

Bibliografia 40

[0183]

Amici SA, Dunn WA Jr, Murphy AJ, Adams NC, Gale NW, Valenzuela DM, Yanco-poulos GD, Notterpek L. Peripheral myelin protein 22 is in complex with alpha6beta4 integrin, and its absence alters the Schwann cell basal lamina. J Neurosci. 2006; 26(4):1179-1189. 45

Amici SA, Dunn WA Jr, Notterpek L. Developmental abnormalities in the nerves of

29

peripheral myelin protein 22-deficient mice. J Neurosci Res. 2007; 85(2): 238-249.

Atanasoski S, Scherer SS, Nave K-A, Suter U. Proliferation of Schwann Cells and Re-gulation of Cyclin D1 Expression in an Animal Model of Charcot-Marie-Tooth Dise-ase Type 1A. J Neurosci Res. 2002; 67(4):443-449.

Basta-Kaim A, Budziszewska B, Jaworska-Feil L, Tetich M, Leśkiewicz M, Kubera 5 M, Lasoń W. Chlorpromazine inhibits the glucocorticoid receptor-mediated gene transcription in a calcium-dependent manner. Neuropharmacology. 2002;43(6):1035-1043

Batty IH, Fleming IN, Downes CP. Muscarinic-receptor-mediated inhibition of insu-lin-like growth factor-1 receptor-stimulated phosphoinositide 3-kinase signalling in 10 1321N1 astrocytoma cells. Biochem J. 2004; 379(cz. 3):641-651.

Bogoyevitch MA, Ketterman AJ, Sugden PH. Cellular stresses differentially activate c-Jun N-terminal protein kinases and extracellular signal-regulated protein kinases in cultured ventricular myocytes. J Biol Chem. 1995;270(50):29710-29717.

Brancolini C, Marzinotto S, Edomi P, Agostoni E, Fiorentini C, Müller HW, Schneider 15 C. Rho-dependent regulation of cell spreading by the tetraspan membrane protein Gas3/PMP22. Mol. Biol. Cell 1999; 10: 2441-2459.

Castellone MD, Teramoto H, Gutkind JS. Cyclooxygenase-2 and Colorectal Cancer Chemoprevention: The β-Catenin Connection. Cancer Res. 2006; 66(23):11085-11088. 20

Chen XR, Besson VC, Palmier B, Garcia Y, Plotkine M, Marchand-Leroux C. Neuro-logical recovery-promoting, anti-inflammatory, and anti-oxidative effects afforded by fenofibrate, a PPAR alpha agonist, in traumatic brain injury. J Neurotrauma 2007; 24 (7): 1119-1131.

Chies R, Nobbio L, Edomi P, Schenone A, Schneider C, Brancolini C. Alterations in 25 the Arf6-regulated plasma membrane endosomal recycling pathway in cells overe-xpressing the tetraspan protein Gas3/PMP22. J Cell Sci. 2003; 116(cz. 6): 987-999.

Constable AL, Armati PJ. DMSO induction of the leukotriene LTC4 by Lewis rat Schwann cells. J Neurol Sci 1999; 162(2): 120-126.

Devaux JJ, Scherer SS. Altered ion channels in an animal model of Charcot-Marie-30 Tooth disease type IA. J Neurosci. 2005; 25(6): 1470-1480.

Diep QN, Benkirane K, Amiri F, Cohn JS, Endemann D, Schiffrin EL. PPAR alpha ac-tivator fenofibrate inhibits myocardial inflammation and fibrosis in angiotensin II-infused rats. J Mol Cell Cardiol. 2004; 36 (2): 295-304.

Dracheva S, Davis KL, Chin B, Woo DA, Schmeidler J, Haroutunian V. Myelin-35 associated mRNA and protein expression deficits in the anterior cingulate cortex and hippocampus in elderly schizophrenia patients. Neurobiol Dis. marzec 2006;21(3):531-540.

D'Urso D, Ehrhardt P, Müller HW. Peripheral myelin protein 22 and protein zero: a novel association in peripheral nervous system myelin. J Neurosci. 1999; 19(9):3396-40 3403.

Fortun J, Dunn WA Jr, Joy S, Li J, Notterpek L. Emerging role for autophagy in the removal of aggresomes in Schwann cells. J Neurosci. 2003; 23(33): 10672-10680.

Fortun J, Li J, Go J, Fenstermaker A, Fletcher BS, Notterpek L. Impaired proteasome activity and accumulation of ubiquitinated substrates in a hereditary neuropathy mo-45 del. J Neurochem 2005; 92:1531-1541.

30

Fortun J, Go JC, Li J, Amici SA, Dunn WA Jr, Notterpek L. Alterations in degradative pathways and protein aggregation in a neuropathy model based on PMP22 overe-xpression. Neurobiol Dis. 2006; 22(1):153-164.

Fortun J, Verrier JD, Go JC, Madorsky I, Dunn WA, Notterpek L. The formation of pe-ripheral myelin protein 22 aggregates is hindered by the enhancement of autophagy 5 and expression of cytoplasmic chaperones. Neurobiol Dis. 2007; 25(2): 252-265.

Galvez AS, Ulloa JA, Chiong M, Criollo A, Eisner V, Barros LF, Lavandero S. Aldose reductase induced by hyperosmotic stress mediates cardiomyocyte apoptosis: differen-tial effects of sorbitol and mannitol. J Biol Chem. 2003;278(40):38484-38494.

Grandis M, Shy, ME. Current Therapy for Charcot-marie-Tooth Disease. Current Tre-10 atment Options in Neurology 2005; 7:23-31

Groyer G, Eychenne B, Girard C, Rajkowski K, Schumacher M, Cadepond F. Expression and functional state of the corticosteroid receptors and 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 in Schwann cells. Endocrinology. 2006; 147(9):4339-4350. 15

Kantamneni S, Corrêa SA, Hodgkinson GK, Meyer G, Vinh NN, Henley JM, Nishi-mune A. GISP: a novel brain-specific protein that promotes surface expression and function of GABA(B) receptors. J Neurochem. 2007;100(4):1003-17.

Khajavi M, Shiga K, Wiszniewski W, He F, Shaw CA, Yan J, Wensel TG, Snipes GJ, Lupski JR. Oral curcumin mitigates the clinical and neuropathologic phenotype of the 20 Trembler-J mouse: a potential therapy for inherited neuropathy. Am J Hum Genet. 2007; 81(3): 438-453.

Kobsar I, Hasenpusch-Theil K, Wessig C, Müller HW, Martini R. Evidence for Ma-crophage-Mediated Myelin Disruption in an Animal Model for Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 1A. J. Neurosci Res 2005; 81:857-864. 25

Lange CA, Shen T i in. Phosphorylation of human progesterone receptors at serine-294 by mitogen-activated protein kinase signals their degradation by the 26S prote-asome. PNAS USA. 2000; 97: 1032-1037.

Le-Niculescu H, Kurian SM, Yehyawi N, Dike C, Patel SD, Edenberg HJ, Tsuang MT, Salomon DR, Nurnberger JI Jr, Niculescu AB. Identifying blood biomarkers for mood 30 disorders using convergent functional genomics. Mol Psychiatry. 26 lutego 2008. [Epub przed wydrukiem].

Li WW, Le Goascogne C, Ramaugé M, Schumacher M, Pierre M, Courtin F. Induction of type 3 iodothyronine deiodinase by nerve injury in the rat peripheral nervous sys-tem. Endocrinology. 2001; 142(12):5190-5197. 35

Lupski JR, Wise CA, Kuwano A, Pentao L, Parke JT, Glaze DG, Ledbetter DH, Gre-enberg F, Patel PI. Gene dosage is a mechanism for Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Nat Genet. 1992 ;1(1): 29-33.

Mäurer M, Kobsar I, Berghoff M, Schmid CD, Carenini S, Martini R. Role of immune cells in animal models for inherited neuropathies: facts and visions. J Anat. 2002; 40 200(4): 405-414.

Melcangi RC, Cavarretta IT, Ballabio M, Leonelli E, Schenone A, Azcoitia I, Miguel Garcia-Segura L, Magnaghi V. Peripheral nerves: a target for the action of neuroactive steroids. Brain Res Rev. 2005; 48(2): 328-338.

Mercier G, Turque N, Schumacher M. Rapid effects of triiodothyronine on immediate-45 early gene expression in Schwann cells. Glia. 2001; 35(2):81-89.

31

Meyer Zu Horste G., Nave K-A. Animal models of inherited neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 2006; 19(5): 464-473.

Meyer zu Horste G, Prukop T, Liebetanz D, Mobius W, Nave KA, Sereda MW. Anti-progesterone therapy uncouples axonal loss from demyelination in a transgenic rat model of CMT1A neuropathy. Ann Neurol. 2007; 61 (1): 61-72. 5

Miller AL, Garza AS, Johnson BH, Thompson EB. Pathway interactions between MAPKs, mTOR, PKA, and the glucocorticoid receptor in lymphoid cells. Cancer Cell Int. 2007; 28:7:3

Muja N, Blackman SC, Le Breton GC, DeVries GH. Identification and functional cha-racterization of thromboxane A2 receptors in Schwann cells. J Neurochem. 2001; 10 78(3):446-456.

Muller DL, Unterwald EM. In Vivo Regulation of Extracellular Signal-Regulated Pro-tein Kinase (ERK) and Protein Kinase B (Akt) Phosphorylation by Acute and Chronic Morphine. JPET 2004; 310:774-782.

Nambu H, Kubo E, Takamura Y, Tsuzuki S, Tamura M, Akagi Y. Attenuation of aldose 15 reductase gene suppresses high-glucose-induced apoptosis and oxidative stress in rat lens epithelial cells. Diabetes Res Clin Pract. 2008; 82(1):18-24.

Nave KA, Sereda MW, Ehrenreich H. Mechanisms of disease: inherited demyelinating neuropathies--from basic to clinical research. Nat Clin Pract Neurol. 2007; 3(8): 453-464. 20

Niemann S., Sereda M.W., Rossner M., Stewart H., Suter U., Meinck H.M., Griffiths I.R., Nave K-A. The "CMT rat": peripheral neuropathy and dysmyelination caused by transgenic overexpression of PMP22. Ann. N.- Y. Acad. Sci. 1999; 883:254-261.

Notterpek L, Shooter EM, Snipes GJ. Upregulation of the endosomal-lysosomal pa-thway in the trembler-J neuropathy. J Neurosci. 1997;17(11): 4190-4200. 25

Obrietan K, van den Pol AN. GABAB receptor-mediated inhibition of GABAA recep-tor calcium elevations in developing hypothalamic neurons. J Neurophysiol. 1998; 79(3):1360-1370.

Ogata T, Iijima S, Hoshikawa S, Miura T, Yamamoto S, Oda H, Nakamura K, Tanaka S Opposing extracellular signal-regulated kinase and Akt pathways control Schwann 30 cell myelination. J Neurosci. 2004; 24(30):6724-6732.

Ohsawa Y, Murakami T, Miyazaki Y, Shirabe T, Sunada Y. Peripheral myelin protein 22 is expressed in human central nervous system. J Neurol Sci. 2006; 247(1):11-15.

Passage E, Norreel JC, Noack-Fraissignes P, Sanguedolce V, Pizant J, Thirion X, Ro-baglia-Schlupp A, Pellissier JF, Fontes M. Ascorbic acid treatment corrects the pheno-35 type of a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease. Nature Med. 2004; 10(4): 396-401.

Perea J, Robertson A, Tolmachova T, Muddle J, King RH, Ponsford S, Thomas PK, Huxley C. Induced myelination and demyelination in a conditional mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Hum Mol Genet. 2001; 10(10):1007-1018. 40

Roa BB, Garcia CA, Suter U, Kulpa DA, Wise CA, Mueller J, Welcher AA, Snipes GJ, Shooter EM, Patel PI, Lupski JR. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Associa-tion with a spontaneous point mutation in the PMP22 gene. N Engl J Med. 1993; 329(2): 96-101.

Robaglia-Schlupp A, Pizant J, Norreel JC, Passage E, Saberan-Djoneidi D, Ansaldi JL, 45 Vinay L, Figarella-Branger D, Levy N, Clarac F, Cau P, Pellissier JF, Fontes M.

32

PMP22 overexpression causes dysmyelination in mice. Brain 2002; 125(cz. 10): 2213-2221.

Robert F, Guennoun R, Désarnaud F, Do-Thi A, Benmessahel Y, Baulieu EE, Schuma-cher M. Synthesis of progesterone in Schwann cells: regulation by sensory neurons. Eur J Neurosci. 2001; 13(5): 916-924. 5

Roux KJ, Amici SA, Notterpek L. The temporospatial expression of peripheral myelin protein 22 at the developing blood-nerve and blood-brain barriers. J Comp Neurol. 2004; 474(4):578-588.

Sancho S, Young P, Suter U. Regulation of Schwann cell proliferation and apoptosis in PMP22-deficient mice and mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. 10 Brain 2001; 124(cz. 11): 2177-2187.

Schumacher M, Guennoun R, Mercier G, Désarnaud F, Lacor P, Bénavides J, Ferzaz B, Robert F, Baulieu EE. Progesterone synthesis and myelin formation in peripheral nerves. Brain Res Rev. 2001; 37(1-3): 343-359.

Sereda MW, Meyer zu Horste G, Suter U, i in. Therapeutic administration of progeste-15 rone antagonist in a model of Charcot-Marie-Tooth disease (CMT-1A). Nat Med 2003; 9: 1533-1537.

Sereda MW, Nave KA. Animal models of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A). Neuromol Med 2006; 8: 205-215.

Stimweiss J, Valkova C, Ziesché E, Drube S, Liebmann C. Muscarinic M2 receptors 20 mediate transactivation of EGF receptor through Fyn kinase and without matrix metal-loproteases. Cell Signal. 2006; 18(8):1338-1349.

Suter U, Scherer SS. Disease mechanisms in inherited neuropathies. Nat. Rev. Neuro-sci. 2003; 4: 714-726.

Suter U, Welcher AA, Ozcelik T, Snipes GJ, Kosaras B, Francke U, Billings-Gagliardi 25 S, Sidman RL, Shooter EM. Trembler mouse carries a point mutation in a myelin ge-ne. Nature. 1992; 356(6366): 241-244.

Thomas PK, Marques W Jr, Davis MB, Sweeney MG, King RH, Bradley JL, Muddle JR, Tyson J, Malcolm S, Harding AE. The phenotypic manifestations of chromosome 17p11.2 duplication. Brain 1997; 120 (cz. 3): 465-478. 30

Tobler AR, Liu N, Mueller L, Shooter EM. Differential aggregation of the Trembler and Trembler J mutants of peripheral myelin protein 22. PNAS U S A. 2002; 99(1):483-488.

Tu H, Rondard P, Xu C, Bertaso F, Cao F, Zhang X, Pin JP, Liu J. Dominant role of GABAB2 and Gbetagamma for GABAB receptor-mediated-ERK1/2/CREB pathway 35 in cerebellar neurons. Cell Signal. 2007; 19(9):1996-2002.

Uht RM, Anderson CM, Webb P, Kushner PJ. Transcriptional activities of estrogen and glucocorticoid receptors are functionally integrated at the AP-1 response element. Endocrinology. lipiec 1997;138(7):2900-2908.

Ulzheimer JC, Peles E, Levinson SR, Martini R. Altered expression of ion channel iso-40 forms at the node of Ranvier in P0-deficient myelin mutants. Mol Cell Neurosci. 2004; 25(1): 83-94.

Vallat JM, Sindou P, Preux PM, Tabaraud F, Milor AM, Couratier P, LeGuem E, Brice A. Ultrastructural PMP22 expression in inherited demyelinating neuropathies. Ann Neurol. 1996; 39(6): 813-817. 45

33

Walter IB. Nuclear triiodothyronine receptor expression is regulated by axon-Schwann cell contact. Neuroreport. 1993; 5(2):137-140.

Walter IB, Deruaz JP, de Tribolet N. Differential expression of triiodothyronine recep-tors in schwannoma and neurofibroma: role of Schwann cell-axon interaction. Acta Neuropathol (Berl). 1995; 90(2):142-149. 5

Welch WJ, Brown CR. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. Cell Stress Chaperones. 1996;1 (2):109-115.

Woodhams PL, MacDonald RE, Collins SD, Chessell IP, Day NC. Localisation and modulation of prostanoid receptors EP1 and EP4 in the rat chronic constriction injury model of neuropathic pain. Eur J Pain. 2007; 11(6):605-613. 10

ZastrzeŜenia patentowe 1. Kompozycja zawierająca co najmniej dwa związki wybrane spośród: D-Sorbitolu; Ba-

klofenu; Pilokarpiny; Naltreksonu; Metimazolu; Mifepristonu i Ketoprofenu lub ich soli, do równoczesnego, oddzielnego lub sekwencyjnego podawania do stosowania w leczeniu choroby Charcota-Mariego-Tootha (CMT) lub pokrewnego zaburzenia wy-branego spośród: dziedzicznej neuropatii z podatnością na poraŜenia uciskowe nerwu 15 (HNPP), zespołu Dejerine'a-Sottasa (DSS) i wrodzonej neuropatii hipomielinizacyjnej (CHN).

2. Zastosowanie połączenia co najmniej dwóch związków wybranych spośród D-Sorbito-lu; Baklofenu; Pilokarpiny; Naltreksonu; Metimazolu; Mifepristonu i Ketoprofenu lub ich soli do wytwarzania leku do leczenia choroby Charcota-Mariego-Tootha lub po-20 krewnego zaburzenia wybranego spośród HNPP, DSS i CHN.

3. Kompozycja lub zastosowanie według zastrzeŜenia 1 albo 2, gdzie chorobą jest CMT, korzystnie CMT1A.

4. Kompozycja farmaceutyczna obejmująca jedno z następujących połączeń związków:

- Mifepriston i Metimazol; 25

- Pilokarpina i Baklofen;

- Mifepriston i Pilokarpina;

- Mifepriston i Baklofen;

- Mifepriston i Ketoprofen;

- Mifepriston i Naltrekson; 30

- Pilokarpina i Ketoprofen;

- Pilokarpina i Naltrekson;

- Baklofen i Ketoprofen;

- Ketoprofen i Metimazol;

- Sorbitol i Naltrekson; lub 35

- Sorbitol i Metimazol;

lub ich soli, oraz farmaceutycznie odpowiednią zaróbkę.

5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeŜenia 4, obejmująca ponadto dodatkowy związek czynny.

6. Kompozycja lub zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeŜeń 1 do 3, gdzie to 40 połączenie obejmuje:

- Mifepriston i Metimazol;

- Pilokarpinę i Baklofen;

34

- Mifepriston i Pilokarpinę;

- Mifepriston i Baklofen;

- Mifepriston i Ketoprofen;

- Mifepriston i Naltrekson;

- Pilokarpinę i Ketoprofen; 5

- Pilokarpinę i Naltrekson;

- Baklofen i Ketoprofen;

- Baklofen i Naltrekson;

- Ketoprofen i Metimazol;

- Sorbitol i Naltrekson; lub 10

- Sorbitol i Metimazol;

lub ich sole.

7. Kompozycja według zastrzeŜenia 4 albo 5, gdzie związki są połączone do podawania łącznego lub odrębnego, równocześnie lub sekwencyjnie.

8. Kompozycja do stosowania w leczeniu choroby Charcota-Mariego-Tootha lub po-15 krewnego zaburzenia wybranego spośród HNPP, DSS i CHN, obejmująca co najmniej dwa związki wybrane spośród D-Sorbitolu; Baklofenu; Pilokarpiny; Naltreksonu; Me-timazolu; Mifepristonu i Ketoprofenu lub ich soli, gdzie te co najmniej dwa związki są związane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie, z uŜyciem łącznika lub bez niego.

9. Kompozycja do stosowania według zastrzeŜenia 8, w której związki są związane przez 20 łącznik rozszczepialny lub nierozszczepialny.

10. Kompozycja do stosowania według któregokolwiek z zastrzeŜeń 1 do 9, w której te co najmniej dwa związki są formułowane z uŜyciem polimeru do wymywania leku, bio-cząsteczki, lipidów tworzących liposomy lub micele, lub emulsji typu olej w wodzie, lub pegylowanych albo stałych nanocząstek lub mikrocząstek do podawania doustne-25 go lub pozajelitowego, lub dooponowego/dokanałowego, w celu modyfikacji roz-mieszczenia lub biodostępności w tkankach.

Uprawniony: Pharnext Pełnomocnik:

dr inŜ. Wojciech Tykarski Rzecznik patentowy

35

36

37

38

39

DOKUMENTY CYTOWANE W OPISIE

Ta lista dokumentów cytowanych przez Zgłaszającego została przyjęta jedynie dla informacji czytającego i nie jest częścią składową europejskiego opisu patentowego. Została ona utworzona z duŜą starannością; Europejski Urząd Patentowy nie ponosi jednak Ŝadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy i braki.

Dokumenty niepatentowe cytowane w opisie

• Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins, 2000 [0097]

• Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. Marcel Dekker, 1988 [0097]

• ILAR Journal, 2002 [0169] • AMICI SA; DUNN WA JR; MURPHY AJ;

ADAMS NC; GALE NW; VALENZUELA DM; YANCOPOULOS GD; NOTTERPEK L. Peripheral myelin protein 22 is in complex with alpha6beta4 integrin, and its absence alters the Schwann cell basal lamina. J Neurosci., 2006, tom 26 (4), 1179-1189 [0183]

• AMICI SA; DUNN WA JR; NOTTERPEK L. Developmental abnormalities in the nerves of peripheral myelin protein 22-deficient mice. J Neurosci Res., 2007, tom 85 (2), 238-249 [0183]

• ATANASOSKI S; SCHERER SS; NAVE K-A; SUTER U. Proliferation of Schwann Cells and Regulation of Cyclin D1 Expression in an Animal Model of Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A. J Neurosci Res., 2002, tom 67 (4), 443-449 [0183]

• BASTA-KAIM A; BUDZISZEWSKA B; JA-WORSKA- FEIL L; TETICH M; LESKIE-WICZ M; KUBERA M; LASON W. Chlor-promazine inhibits the glucocorticoid receptor-mediated gene transcription in a calcium- de-pendent manner. Neuropharmacology, 2002, tom 43 (6), 1035-1043 [0183]

• BATTY IH; FLEMING IN; DOWNES CP. Muscarinic- receptor-mediated inhibition of in-sulin-like growth factor-1 receptor-stimulated phosphoinositide 3-kinase signalling in 1321N1 astrocytoma cells. Biochem J., 2004, tom 379 (cz. 3), 641-651 [0183]

• BOGOYEVITCH MA; KETTERMAN AJ; SUGDEN PH. Cellular stresses differentially activate c-Jun N-terminal protein kinases and extracellular signal- regulated protein kinases in cultured ventricular myocytes. J Biol Chem., 1995, tom 270 (50), 29710-29717 [0183]

• BRANCOLINI C; MARZINOTTO S; EDO-MI P; AGOSTONI E; FIORENTINI C; MÜLLER HW; SCHNEIDER C. Rho-dependent regulation of cell spreading by the te-traspan membrane protein Gas3/PMP22. Mol. Biol. Cell, 1999, tom 10, 2441-2459 [0183]

• CASTELLONE MD; TERAMOTO H; GUT-KIND JS. Cyclooxygenase-2 and Colorectal Cancer Chemoprevention: The β-Catenin Con-nection. Cancer Res., 2006, tom 66 (23), 11085-11088 [0183]

• CHEN XR; BESSON VC; PALMIER B; GARCIA Y; PLOTKINE M; MARCHAND-LEROUX C. Neurological recovery-promoting, anti-inflammatory, and anti-oxidative effects afforded by fenofibrate, a PPAR alpha agonist, in traumatic brain injury. J Neurotrauma, 2007, tom 24 (7), 1119-1131 [0183]

• CHIES R; NOBBIO L; EDOMI P; SCHE-NONE A; SCHNEIDER C; BRANCOLINI C. Alterations in the Arf6-regulated plasma mem-brane endosomal recycling pathway in cells ove-rexpressing the tetraspan protein Gas3/PMP22. J Cell Sci., 2003, tom 116 (cz. 6), 987-999 [0183]

• CONSTABLE AL; ARMATI PJ. DMSO in-duction of the leukotriene LTC4 by Lewis rat Schwann cells. J Neurol Sci, 1999, tom 162 (2), 120-126 [0183]

• DEVAUX JJ; SCHERER SS. Altered ion chan-nels in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease type IA. J Neurosci., 2005, tom 25 (6), 1470-1480 [0183]

• DIEP QN; BENKIRANE K; AMIRI F; COHN JS; ENDEMANN D; SCHIFFRIN EL. PPAR al-pha activator fenofibrate inhibits myocardial inflam-mation and fibrosis in angiotensin II-infused rats. J Mol Cell Cardiol., 2004, tom 36 (2), 295-304 [0183]

• DRACHEVA S; DAVIS KL; CHIN B; WOO DA; SCHMEIDLER J; HAROUTUNIAN V. Myelin-associated mRNA and protein expression deficits in the anterior cingulate cortex and hippo-campus in elderly schizophrenia patients. Neuro-biol Dis., marzec 2006, tom 21 (3), 531-540 [0183]

• D’URSO D; EHRHARDT P; MÜLLER HW. Peripheral myelin protein 22 and protein zero: a novel association in peripheral nervous system my-elin. J Neurosci., 1999, tom 19 (9), 3396-3403 [0183]

• FORTUN J; DUNN WA JR; JOY S; LI J; NOTTERPEK L. Emerging role for autophagy in the removal of aggresomes in Schwann cells. J Neurosci., 2003, tom 23 (33), 10672-10680 [0183]

• FORTUN J; LI J; GO J; FENSTERMAKER A; FLETCHER BS; NOTTERPEK L. Impa-ired proteasome activity and accumulation of ubiquitinated substrates in a hereditary neuropa-thy model. J Neurochem, 2005, tom 92, 1531-1541 [0183]

• FORTUN J; GO JC; LI J; AMICI SA; DUNN WA JR; NOTTERPEK L. Alterations in degra-dative pathways and protein aggregation in a neu-ropathy model based on PMP22 overexpression. Neurobiol Dis., 2006, tom 22 (1), 153-164 [0183]

40

• FORTUN J; VERRIER JD; GO JC; MA-DORSKY I; DUNN WA; NOTTERPEK L. The formation of peripheral myelin protein 22 aggregates is hindered by the enhancement of autophagy and expression of cytoplasmic chape-rones. Neurobiol Dis., 2007, tom 25 (2), 252-265 [0183]

• GALVEZ AS; ULLOA JA; CHIONG M; CR-IOLLO A; EISNER V; BARROS LF; LAVANDERO S. Aldose reductase induced by hyperosmotic stress mediates cardiomyocyte apoptosis: differential effects of sorbitol and mannitol. J Biol Chem., 2003, tom 278 (40), 38484-38494 [0183]

• GRANDIS M; SHY, ME. Current Therapy for Charcot- marie-Tooth Disease. Current Treat-ment Options in Neurology, 2005, tom 7, 23-31 [0183]

• GROYER G; EYCHENNE B; GIRARD C; RAJKOWSKI K; SCHUMACHER M; CA-DEPOND F. Expression and functional state of the corticosteroid receptors and 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 in Schwann cells. Endocrinology, 2006, tom 147 (9), 4339-4350 [0183]

• KANTAMNENI S; CORR ĘA SA; HODGKINSON GK; MEYER G; VINH NN; HENLEY JM; NISHIMUNE A. GISP: a novel brain-specific protein that promotes surface expression and function of GABA(B) receptors. J Neurochem., 2007, tom 100 (4), 1003-17 [0183]

• KHAJAVI M; SHIGA K; WISZNIEWSKI W; HE F; SHAW CA; YAN J; WENSEL TG; SNIPES GJ; LUPSKI JR. Oral curcumin miti-gates the clinical and neuropathologic phenotype of the Trembler-J mouse: a potential therapy for inherited neuropathy. Am J Hum Genet, 2007, tom 81 (3), 438-453 [0183]

• KOBSAR I; HASENPUSCH-THEIL K; W E-SSIG C; MÜLLER HW; MARTINI R. Evi-dence for Macrophage- Mediated Myelin Di-sruption in an Animal Model for Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 1A. J. Neurosci Res, 2005, tom 81, 857-864 [0183]

• LANGE CA; SHEN T i in. Phosphorylation of human progesterone receptors at serine-294 by mitogen- activated protein kinase signals their degradation by the 26S proteasome. PNAS USA, 2000, tom 97, 1032-1037 [0183]

• LE-NICULESCU H; KURIAN SM; YEHY-AWI N; DIKE C; PATEL SD; EDENBERG HJ; TSUANG MT; SALOMON DR; NURN-BERGER JI JR; NICULESCU AB. Identify-ing blood biomarkers for mood disorders using convergent functional genomics. Mol Psychia-try, 26 lutego 2008 [0183]

• LI WW; LE GOASCOGNE C; RAMAUGÉ M; SCHUMACHER M; PIERRE M; CO-URTIN F. Induction of type 3 iodothyronine de-iodinase by nerve injury in the rat peripheral ne-rvous system. Endocrinology, 2001, tom 142 (12), 5190-5197 [0183]

• LUPSKI JR; WISE CA; KUWANO A; PEN-TAO L; PARKE JT; GLAZE DG; LE-DBETTER DH; GREENBERG F; PATEL PI. Gene dosage is a mechanism for Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Nat Genet., 1992, tom 1 (1), 29-33 [0183]

• MÄURER M; KOBSAR I; BERGHOFF M; SCHMID CD; CARENINI S; MARTINI R. Role of immune cells in animal models for inhe-rited neuropathies: facts and visions. J Anat., 2002, tom 200 (4), 405-414 [0183]

• MELCANGI RC; CAVARRETTA IT; BAL-LABIO M; LEONELLI E; SCHENONE A; AZCOITIA I; MIGUEL GARCIA-SEGURA L; MAGNAGHI V. Peripheral nerves: a target for the action of neuroactive steroids. Brain Res Rev., 2005, tom 48 (2), 328-338 [0183]

• MERCIER G; TURQUE N; SCHUMACHER M. Rapid effects of triiodothyronine on immedia-te-early gene expression in Schwann cells. Glia., 2001, tom 35 (2), 81-89 [0183]

• MEYER ZU HORSTE G.; NAVE K-A. Ani-mal models of inherited neuropathies. Curr. Opin. Neurol., 2006, tom 19 (5), 464-473 [0183]

• MEYER ZU HORSTE G; PRUKOP T; LIE-BETANZ D; MOBIUS W; NAVE KA; SE-REDA MW. Antiprogesterone therapy uncouples axonal loss from demyelination in a transgenic rat model of CMT1A neuropathy. Ann Neurol., 2007, tom 61 (1), 61-72 [0183]

• MILLER AL; GARZA AS; JOHNSON BH; THOMPSON EB. Pathway interactions between MAPKs, mTOR, PKA, and the glucocorticoid re-ceptor in lymphoid cells. Cancer Cell Int., 2007, tom 28 (7), 3 [0183]

• MUJA N; BLACKMAN SC; LE BRETON GC; DEVRIES GH. Identification and functio-nal characterization of thromboxane A2 receptors in Schwann cells. J Neurochem., 2001, tom 78 (3), 446-456 [0183]

• MULLER DL; UNTERWALD EM. In Vivo Regulation of Extracellular Signal-Regulated Protein Kinase (ERK) and Protein Kinase B (Akt) Phosphorylation by Acute and Chronic Morphi-ne. JPET, 2004, tom 310, 774-782 [0183]

• NAMBU H; KUBO E; TAKAMURA Y; TSU-ZUKI S; TAMURA M; AKAGI Y. Attenuation of aldose reductase gene suppresses high-glucose-induced apoptosis and oxidative stress in rat lens epithelial cells. Diabetes Res Clin Pract., 2008, tom 82 (1), 18-24 [0183]

• NAVE KA; SEREDA MW; EHRENREICH H. Mechanisms of disease: inherited demyelina-ting neuropathies-- from basic to clinical rese-arch. Nat Clin Pract Neurol., 2007, tom 3 (8), 453-464 [0183]

• NIEMANN S.; SEREDA M.W.; ROSSNER M.; STEWART H.; SUTER U.; MEINCK H.M.; GRIFFITHS I.R.; NAVE K-A. The ’’CMT rat’’: peripheral neuropathy and dysmy-elination caused by transgenic overexpression of PMP22. Ann. N.- Y. Acad. Sci., 1999, tom 883, 254-261 [0183]

41

• NOTTERPEK L; SHOOTER EM; SNIPES GJ. Upregulation of the endosomal-lysosomal pathway in the trembler-J neuropathy. J Neuro-sci., 1997, tom 17 (11), 4190-4200 [0183]

• OBRIETAN K. van den Pol AN. GABAB re-ceptor-mediated inhibition of GABAA receptor calcium elevations in developing hypothalamic neurons. J Neurophysiol., 1998, tom 79 (3), 1360-1370 [0183]

• OGATA T; IIJIMA S; HOSHIKAWA S; MIURA T; YAMAMOTO S; ODA H; NA-KAMURA K; TANAKA S. Opposing extracel-lular signal-regulated kinase and Akt pathways control Schwann cell myelination. J Neurosci., 2004, tom 24 (30), 6724-6732 [0183]

• OHSAWA Y; MURAKAMI T; MIYAZAKI Y; SHIRABE T; SUNADA Y. Peripheral my-elin protein 22 is expressed in human central ne-rvous system. J Neurol Sci., 2006, tom 247 (1), 11-15 [0183]

• PASSAGE E; NORREEL JC; NOACK-FRAI-SSIGNES P; SANGUEDOLCE V; PIZANT J; THIRION X; ROBAGLIA-SCHLUPP A; PELLISSIER JF; FONTES M. Ascorbic acid treatment corrects the phenotype of a mouse mo-del of Charcot-Marie-Tooth disease. Nature Med., 2004, tom 10 (4), 396-401 [0183]

• PEREA J; ROBERTSON A; TOLMACHOVA T; MUDDLE J; KING RH; PONSFORD S; THOMAS PK; HUXLEY C. Induced myelination and demyelination in a conditional mouse model of Charcot- Marie-Tooth disease type 1A. Hum Mol Genet., 2001, tom 10 (10), 1007-1018 [0183]

• ROA BB; GARCIA CA; SUTER U; KULPA DA; WISE CA; MUELLER J; WELCHER AA; SNIPES GJ; SHOOTER EM; PATEL PI. Charcot- Marie-Tooth disease type 1A. As-sociation with a spontaneous point mutation in the PMP22 gene. N Engl J Med., 1993, tom 329 (2), 96-101 [0183]

• ROBAGLIA-SCHLUPP A; PIZANT J; NORREEL JC; PASSAGE E; SABERAN-DJONEIDI D; ANSALDI JL; VINAY L; FI-GARELLA-BRANGER D; LEVY N; CLA-RAC F. PMP22 overexpression causes dysmy-elination in mice. Brain, tom 125 (cz. 10), 2213-2221 [0183]

• ROBERT F; GUENNOUN R; DÉSARNAUD F; DO-THI A; BENMESSAHEL Y; BAU-LIEU EE; SCHUMACHER M. Synthesis of progesterone in Schwann cells: regulation by sensory neurons. Eur J Neurosci., 2001, tom 13 (5), 916-924 [0183]

• ROUX KJ; AMICI SA; NOTTERPEK L. The temporospatial expression of peripheral myelin protein 22 at the developing blood-nerve and blood-brain barriers. J Comp Neurol., 2004, tom 474 (4), 578-588 [0183]

• SANCHO S; YOUNG P; SUTER U. Regula-tion of Schwann cell proliferation and apoptosis in PMP22-deficient mice and mouse models of Charcot- Marie-Tooth disease type 1A. Brain, 2001, tom 124 (cz. 11), 2177-2187 [0183]

• SCHUMACHER M; GUENNOUN R; MER-CIER G; DÉSARNAUD F; LACOR P; BÉ-NAVIDES J; FERZAZ B; ROBERT F; BAU-LIEU EE. Progesterone synthesis and myelin formation in peripheral nerves. Brain Res Rev., 2001, tom 37 (1-3), 343-359 [0183]

• SEREDA MW; MEYER ZU HORSTE G; SUTER U i in. Therapeutic administration of progesterone antagonist in a model of Charcot-Marie-Tooth disease (CMT-1A. Nat Med, 2003, tom 9, 1533-1537 [0183]

• SEREDA MW; NAVE KA. Animal models of Charcot- Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A. Neuromol Med, 2006, tom 8, 205-215 [0183]

• STIMWEISS J; VALKOVA C; ZIESCHÉ E; DRUBE S; LIEBMANN C. Muscarinic M2 recep-tors mediate transactivation of EGF receptor through Fyn kinase and without matrix metalloproteases. Cell Signal, 2006, tom 18 (8), 1338-1349 [0183]

• SUTER U; SCHERER SS. Disease mechanisms in inherited neuropathies. Nat. Rev. Neurosci., 2003, tom 4, 714-726 [0183]

• SUTER U; WELCHER AA; OZCELIK T; SNIPES GJ; KOSARAS B; FRANCKE U; BILLINGS- GAGLIARDI S; SIDMAN RL; SHOOTER EM. Trembler mouse carries a point mutation in a myelin gene. Nature, 1992, tom 356 (6366), 241-244 [0183]

• THOMAS PK; MARQUES W JR; DAVIS MB; SWEENEY MG; KING RH; BRADLEY JL; MUDDLE JR; TYSON J; MALCOLM S; HARDING AE. The phenotypic manifestations of chromosome 17p11.2 duplication. Brain, 1997, tom 120 (cz. 3), 465-478 [0183]

• TOBLER AR; LIU N; MUELLER L; SHOO-TER EM. Differential aggregation of the Trem-bler and Trembler J mutants of peripheral myelin protein 22. PNAS U S A, 2002, tom 99 (1), 483-488 [0183]

• TU H; RONDARD P; XU C; BERTASO F; CAO F; ZHANG X; PIN JP; LIU J. Dominant role of GABAB2 and Gbetagamma for GABAB receptor-mediated- ERK1/2/CREB pathway in cerebellar neurons. Cell Signal, 2007, tom 19 (9), 1996-2002 [0183]

• UHT RM; ANDERSON CM; WEBB P; KUSH-NER PJ. Transcriptional activities of estrogen and glucocorticoid receptors are functionally integrated at the AP-1 response element. Endocrinology, li-piec 1997, tom 138 (7), 2900-2908 [0183]

• ULZHEIMER JC; PELES E; LEVINSON SR; MARTINI R. Altered expression of ion channel isoforms at the node of Ranvier in P0-deficient myelin mutants. Mol Cell Neurosci., 2004, tom 25 (1), 83-94 [0183]

• VALLAT JM; SINDOU P; PREUX PM; TA-BARAUD F; MILOR AM; COURATIER P; LEGUEM E; BRICE A. Ultrastructural PMP22 expression in inherited demyelinating neuropathies. Ann Neurol., 1996, tom 39 (6), 813-817 [0183]

• WALTER IB. Nuclear triiodothyronine receptor expression is regulated by axon-Schwann cell con-tact. Neuroreport, 1993, tom 5 (2), 137-140 [0183]

42

• WALTER IB; DERUAZ JP; DE TRIBOLET N. Differential expression of triiodothyronine receptors in schwannoma and neurofibroma: role of Schwann cell-axon interaction. Acta Neuropa-thol (Berl, 1995, tom 90 (2), 142-149 [0183]

• WELCH WJ; BROWN CR. Influence of mo-lecular and chemical chaperones on protein fol-ding. Cell Stress Chaperones, 1996, tom 1 (2), 109-115 [0183]

• WOODHAMS PL; MACDONALD RE; COLLINS SD; CHESSELL IP; DAY NC. Lo-calisation and modulation of prostanoid receptors EP1 and EP4 in the rat chronic constriction injury model of neuropathic pain. Eur J Pain., 2007, tom 11 (6), 605-613 [0183]