RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2307000

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 17.06.2009 09765871.0 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 26.02.2014 Europejski Biuletyn Patentowy 2014/09 EP 2307000 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. A61K 31/197 (2006.01) A61K 31/4178 (2006.01) A61K 31/4164 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) A61P 25/02 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Połączenie pilokarpiny i metimazolu do leczenia choroby Charcota-Mariegotootha i pokrewnych zaburzeń

PL/E

P 23

0700

0 T3

(30) Pierwszeństwo:

18.06.2008 EP 08305280

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

13.04.2011 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/15

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.09.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/09

(73) Uprawniony z patentu:

Pharnext, Issy les Moulineaux, FR

(72) Twórca(y) wynalazku:

DANIEL COHEN, Le Vésinet, FR ILYA CHUMAKOV, Vaux Le Penil, FR SERGUEI NABIROCHKIN, Chatenay Malabry, FR OXANA GUERASSIMENKO, Milly-la-Foret, FR NATHALIE CHOLET, Meudon, FR

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Tykarski

SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

SGS-4911/VAL EP 2307000 B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji i sposobów leczenia choroby Charcota-Mariego-Tootha i pokrewnych zaburzeń. [0002] Choroba Charcota-Mariego-Tootha („CMT”) jest sierocą, genetycznie uwarunko-waną polineuropatią obwodową. Ta choroba występuje u około 1 na 2500 osób i jest naj-częstszym wrodzonym zaburzeniem obwodowego układu nerwowego. Zaczyna się zazwy-5 czaj w pierwszej lub drugiej dekadzie życia, chociaż może zostać wykryta w okresie nie-mowlęcym. Ta choroba ma przewlekły przebieg ze stopniowym zwyrodnieniem nerwowo-mięśniowym. Prowadzi do inwalidztwa i w niektórych przypadkach towarzyszy jej ból neurologiczny oraz skrajnie nasilona niepełnosprawność mięśni. CMT należy do najlepiej zbadanych patologii genetycznych z około 30 000 przypadkami we Francji. Chociaż u 10 większości pacjentów z CMT występuje duplikacja fragmentu chromosomu 17 zawierają-cego gen mieliny: PMP22 (postać CMT1A), sugerowano udział dwóch tuzinów genów w różnych postaciach CMT. Zatem, chociaż ta choroba ma jednogenowy początek, wykazuje kliniczną niejednorodność ze względu na ewentualne geny modulatorowe. Geny zmutowa-ne u pacjentów z CMT są skupione wokół ściśle powiązanych szlaków molekularnych 15 wpływających na różnicowanie komórek Schwanna lub neuronów, lub zmieniają wzajem-ne oddziaływanie tych komórek w nerwach obwodowych. [0003] PMP22 jest ważnym składnikiem mieliny eksprymowanej w części zbitej zasadniczo wszystkich włókien mielinowych w obwodowym układzie nerwowym i jest wytwarzany głównie przez komórki Schwanna. Ponadto przyjmuje się, że gen PMP22 bierze udział w 20 rozwoju nowotworu u pacjentów z nerwiakowłókniakowatością, zaburzeniem dziedziczonym w sposób autosomalny, dominujący, charakteryzującym się plamkami typu cafe-au-lait i gu-zami włókniakowatymi skóry. Umiarkowana 1,5-krotna nadekspresja prawidłowego białka PMP22 jest także stwierdzana w komórkach Schwanna heterozygotych pod względem dupli-kacji u pacjentów z CMT (w niektórych rzadkich przypadkach, fenotyp CMT1A-podobny 25 może być także powiązany z mutacjami strukturalnymi w obrębie białka PMP22) (Lupski i in., 1992; Suter i in., 1992; Roa i in., 1993; Thomas i in., 1997; Suter i Scherer, 2003; Nave i Sereda, 2007). Bezpośrednich dowodów na rzecz wywoływania fenotypu CMT1A-podobnego przez nieprawidłowy gen PMP22 dostarczyły doświadczenia transgeniczne w modelach gryzoni z nadekspresją białka PMP22 (Niemann i in., 1999; Perea i in., 2001; Ro-30 baglia-Schlupp i in., 2002; Meyer i in., 2006; Sereda i Nave, 2006). Ponadto, interwencje te-rapeutyczne z użyciem inhibitora receptora progesteronowego i kwasu askorbinowego zmniejszały tę ekspresję u zwierząt transgenicznych, łagodząc lub spowalniając postęp feno-typu choroby (Sereda i in., 2003; Passage i in., 2004; Meyer zu Horste i in., 2007). Bassi i in., 1978 dotyczy zastosowania metimazolu w leczeniu tyreotoksykozy związanej z neuropatią 35 oraz zapaleniem mózgu i rdzenia. WO 00/20024 zgłoszony przez Celtrix dotyczy zastosowa-nia metimazolu do łagodzenia objawów zaburzenia zależnego od IGF, które jest zaburzeniem tarczycy; i zastosowania IGF lub agonistów osi tarczycowej w leczeniu zaburzeń niedotyczą-cych tarczycy, które odpowiadają na IGF (takich jak CMT). WO2004/019938 dotyczy zasto-sowania pilokarpiny w leczeniu zespołów bólu neuropatycznego, takich jak jaskra i inne za-40 burzenia związane z podwyższonym ciśnieniem śródgałkowym. EP2065038 dotyczy kompo-zycji i sposobów leczenia choroby CMT przez zmniejszanie ekspresji PMP22 u osobnika. [0004] Keltner i in., 1975 sugerowali stosowanie samej pilokarpiny do leczenia mioto-nicznych zaburzeń źrenicy. Jednakże stosowanie pilokarpiny do leczenia CMT nie zostało opisane. Ponadto nie sugerowano także stosowania pilokarpiny w połączeniu z żadnym in-45 nym związkiem. [0005] W podsumowaniu, istnieje zapotrzebowanie na skuteczną i zarejestrowaną terapię do leczenia choroby CMT.

2

Streszczenie wynalazku

[0006] Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych strategii terapeutycznych do leczenia CMT i pokrewnych zaburzeń. W szczególności, wynalazcy określili nowe te-rapie skojarzone, które skutecznie wpływają na szlaki prowadzące do rozwoju CMT i po-krewnych zaburzeń, i stanowią nowe strategie leczenia tych zaburzeń. Tak więc wynalazek 5 dostarcza nowe produkty złożone i kompozycje, jak również ich zastosowanie do leczenia choroby CMT i pokrewnych zaburzeń. [0007] Przedmiot niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji określonej w zastrzeżeniach patentowych. W szczególności wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej agonistę re-ceptorów muskarynowych wybranego z grupy obejmującej pilokarpinę, cewimelinę, kar-10 bachol, metacholinę i betanechol lub ich sól oraz inhibitor syntezy hormonów tarczycy wybrany z grupy obejmującej metimazol, karbimazol, propylotiouracyl i amiodaron lub ich sól i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. [0008] Niniejszy wynalazek ujawnia także zastosowanie połączenia związków do (wytwarza-nia leku do) leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, przy czym to połączenie związków 15 jest wybrane spośród agonisty receptorów muskarynowych lub jego proleku i inhibitora synte-zy hormonów tarczycy lub jego proleku. Niniejszy wynalazek ujawnia także produkt złożony zawierający agonistę receptorów muskarynowych i inhibitor syntezy hormonów tarczycy lub ich prolek, do wspólnego lub oddzielnego podawania osobnikowi, równocześnie lub kolejno. [0009] W najkorzystniejszej postaci agonistą receptorów muskarynowych jest (3S,4R)-3-20 etylo-4-[(3-metyloimidazol-4-ilo)metylo]oksolan-2-on (CAS 92-13-7, który jest substancją czynną w leku pilokarpinie) lub jego prolek. [0010] Ponadto w najkorzystniejszej postaci, inhibitorem syntezy hormonów tarczycy jest 1-metylo-3H-imidazolo-2-tion (CAS 60-56-0, który jest substancją czynną w leku metima-zolu) lub jego prolek, taki jak karbimazol. 25 [0011] Wynalazek ujawnia także kompozycję zawierającą agonistę receptorów muskary-nowych i inhibitor syntezy hormonów tarczycy do leczenia CMT u osobnika, przy czym leczenie dodatkowo obejmuje etap określania, czy u pacjenta występuje CMT1A. [0012] W tym względzie określony przedmiot niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji zawierającej pilokarpinę lub jej prolek oraz metimazol lub jego prolek, i, ewentualnie, 30 farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Jak przedstawiono w przykładach, ta-kie połączenie pozwala na skuteczne leczenie CMT w uznanych modelach zwierzęcych. [0013] Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą dodatkowo zawierać co naj-mniej jeden dodatkowy związek czynny, korzystnie wybrany z grupy obejmującej rapamy-cynę, baklofen, sorbitol, mifepriston, naltrekson, flurbiprofen i ketoprofen. 35 [0014] W korzystnej postaci, kompozycja według wynalazku zawiera co najmniej:

- pilokarpinę, metimazol i mifepriston; - pilokarpinę, metimazol i baklofen; lub - pilokarpinę, metimazol i sorbitol.

[0015] W innej korzystnej postaci, kompozycja według wynalazku zawiera co najmniej: 40

- pilokarpinę, metimazol, mifepriston, baklofen i sorbitol; lub - pilokarpinę, metimazol, mifepriston, baklofen, sorbitol i naltrekson.

[0016] W innych postaciach, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej me-timazol, pilokarpinę i dwa dodatkowe związki czynne, korzystnie mifepriston i sorbitol. [0017] W innych postaciach, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej me-45 timazol, pilokarpinę i trzy dodatkowe związki czynne, korzystnie:

- mifepriston, baklofen i sorbitol; lub - mifepriston, sorbitol i rapamycynę; lub - mifepriston, sorbitol i ketoprofen; lub - mifepriston, sorbitol i flurbiprofen. 50

3

[0018] W innych postaciach, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej me-timazol, pilokarpinę i cztery dodatkowe związki czynne, korzystnie:

- mifepriston, sorbitol, baklofen i naltrekson; - mifepriston, sorbitol, baklofen i rapamycynę; - mifepriston, sorbitol, naltrekson i rapamycynę. 5

[0019] W innych postaciach wynalazek dotyczy kompozycji, która zawiera dowolne połą-czenie leków ujawnione w Tabeli 1. [0020] W innych szczególnych postaciach, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji za-wierającej:

- metimazol i cewimelinę. 10

[0021] W innej postaci wynalazek dotyczy także kompozycji zawierającej pilokarpinę i propylotiouracyl. [0022] Inny przedmiot wynalazku dotyczy zastosowania połączenia pilokarpiny z meti-mazolem albo tych dwóch związków samych lub w połączeniu(-ach) z innymi związkami nasilającymi ich działanie do (wytwarzania leku do) leczenia CMT lub pokrewnego zabu-15 rzenia. [0023] Inny przedmiot wynalazku dotyczy zastosowania połączenia pilokarpiny z meti-mazolem albo tych dwóch związków samych lub w połączeniu(-ach) z innymi związkami nasilającymi ich działanie do (wytwarzania leku do) leczenia neuropatii toksycznej. [0024] Inny przedmiot wynalazku dotyczy zastosowania połączenia pilokarpiny z meti-20 mazolem albo tych dwóch związków samych lub w połączeniu(-ach) z innymi związkami nasilającymi ich działanie do (wytwarzania leku do) leczenia ALS (stwardnienia zaniko-wego bocznego). [0025] Korzystnie, związki nasalające działanie połączenia pilokarpiny z metimazolem w leczeniu CMT są wybrane z grupy obejmującej mifepriston, baklofen, sorbitol, naltrekson, 25 rapamycynę, flurbiprofen i ketoprofen. [0026] W pewnej odmianie, do leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia stosowana jest mieszanina pilokarpiny i metimazolu, w połączeniu z jednym dodatkowym związkiem czynnym, korzystnie mifepristonem lub baklofenem. [0027] W innej odmianie, stosowana jest mieszanina pilokarpiny i metimazolu w połącze-30 niu z dwoma dodatkowymi związkami czynnymi, korzystnie mifepristonem i sorbitolem. [0028] W innej odmianie, stosowana jest mieszanina pilokarpiny i metimazolu w połącze-niu z trzema dodatkowymi związkami czynnymi, korzystnie mifepristonem i sorbitolem w połączeniu z trzecim związkiem wybranym spośród baklofenu, rapamycyny, ketoprofenu lub furbiprofenu. 35 [0029] W innej odmianie, stosowana jest mieszanina pilokarpiny i metimazolu w połącze-niu z czterema dodatkowymi związkami czynnymi, korzystnie mifepristonem, sorbitolem, baklofenem i naltreksonem lub rapamycyną; lub mifepristonem, sorbitolem, naltreksonem i rapamycyną. [0030] Wynalazek ujawnia także sposób leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, w 40 szczególności CMT, obejmujący podawanie potrzebującemu tego osobnikowi skutecznej ilości połączenia agonisty receptorów muskarynowych lub jego proleku i inhibitora synte-zy hormonów tarczycy lub jego proleku. [0031] Wynalazek ponadto ujawnia sposób leczenia CMT u osobnika, obejmujący poda-wanie osobnikowi skutecznej ilości połączenia pilokarpiny lub jej proleku i metimazolu 45 lub jego proleku. [0032] Wynalazek ujawnia także sposób leczenia CMT u osobnika, obejmujący podawa-nie osobnikowi skutecznej ilości połączenia pilokarpiny i metimazolu z co najmniej jed-nym dodatkowym związkiem czynnym, korzystnie wybranym z grupy obejmującej rapa-mycynę, baklofen, sorbitol, mifepriston, naltrekson, flurbiprofen i ketoprofen. 50

4

[0033] W odmianach niniejszy wynalazek ujawnia także sposób leczenia CMT u osobni-ka, obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości połączenia:

- pilokarpiny, metimazolu i co najmniej jednego dodatkowego związku czynnego, który jest wybrany spośród baklofenu, mifepristonu, sorbitolu i naltreksonu;

- pilokarpiny, metimazolu i baklofenu; 5 - pilokarpiny, metimazolu i mifepristonu; - pilokarpiny, metimazolu, mifepristonu, sorbitolu i baklofenu; - pilokarpiny, metimazolu, mifepristonu, sorbitolu i rapamycyny; - pilokarpiny, metimazolu, mifepristonu, sorbitolu i ketoprofenu; - pilokarpiny, metimazolu, mifepristonu, sorbitolu i flurbiprofenu; 10 - pilokarpiny, metimazolu, mifepristonu, sorbitolu, baklofenu i naltreksonu; - pilokarpiny, metimazolu, mifepristonu, sorbitolu, baklofenu i rapamycyny; - pilokarpiny, metimazolu, mifepristony, sorbitoly, naltreksony i rapamycyny; - metimazolu i baklofenu; - metimazolu i cewimeliny; lub 15 - pilokarpiny i propylotiouracylu.

[0034] Wynalazek może być stosowany do leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia u dowolnego osobnika będącego ssakiem, w szczególności u osobników będących ludźmi. Jest on szczególnie odpowiedni do leczenia CMT1a. [0035] Wynalazek ujawnia także sposób leczenia CMT1a u osobnika, obejmujący poda-20 wanie osobnikowi skutecznej ilości połączenia pilokarpiny lub jej proleku i metimazolu lub jego proleku. [0036] Niniejszy wynalazek ujawnia także sposób leczenia CMT1a, przy czym ten sposób obejmuje (1) ocenę, czy u osobnika występuje CMT1a i (2) leczenie osobnika mającego CMT1a skuteczną ilością połączenia pilokarpiny lub jej proleku i metimazolu lub jego pro-25 leku. To, czy u osobnika występuje CMT1a można określić różnymi badaniami znanymi jako takie w dziedzinie, takimi jak testy DNA.

Legenda do figur

[0037]

Figura 1: Względne poziomy przedstawiono w postaci % ekspresji mRNA PMP22 w 30 pierwotnych szczurzych komórkach Schwanna poddanych działaniu związków A i B przez 24 godziny. Na lewym panelu przedstawiono % poziomu mRNA PMP22, 24 godziny po dodaniu 1 mM lub 1 µM związku A (metimazolu). Stwierdzono, że doszło do istotnego spadku mRNA PMP22 w pierwotnych komórkach Schwanna i że ta niż-sza dawka związku A wywołuje najsilniejszą regulację w dół PMP22. *: p<0,05; ***: 35 p<0,001; istotna różnica w porównaniu z kontrolą (sparowany test t-Studenta). Na prawym panelu, przedstawiającym 24-godzinną ekspozycję na związek B (pilokarpi-na), ekspresja mRNA PMP22 uległa istotnej regulacji w dół w pierwotnych komór-kach Schwanna nawet przy bardzo małych dawkach (10 nM i 50 nM). Podobnie, stwierdziliśmy, że związek B (1 µM) istotnie, o 38%, zmniejsza poziom ekspresji 40 białka PMP22 po 24 godzinach inkubacji w pierwotnych komórkach Schwanna. Ten efekt był w dalszym ciągu istotny po 48 godzinach inkubacji (-18%, p<0,001). Figura 2: Wpływ wybranych leków na poziom ekspresji mRNA PMP22 określany ilościowo przy użyciu RT-Q-PCR w komórkach nerwiaka osłonkowego RT4-D6P2T. ***:p<0,0001: istotna różnica w porównaniu z kontrolą (= brak leku). Wartości ∆∆Ct 45 poddano dwustronnemu testowi t-Studenta. Figura 3: Wyniki oceny ruchowej samic szczura w teście pręta w trakcie otrzymywa-nia badanego leczenia, przedstawione w postaci trendów. WTplacebo: normalne szczury, którym podawano placebo; TGplacebo: kontrolne szczury transgeniczne, któ-rym podawano placebo; TGptx25: szczury transgeniczne, którym podawano substan-50

5

cję będącą kontrolą negatywną, TGA: szczury transgeniczne, które przymusowo kar-miono podawanym raz na dobę metimazolem w dawce 0,2 mg/kg; TGB: szczury transgeniczne, którym podawano raz na dobę pilokarpinę w dawce 0,35 mg/kg. Figura 4: Ocena elektrofizjologiczna amplitudy potencjału czułego nerwu u szczurów z CMT, którym podawano leki przez 20 tygodni. TGplacebo: kontrolne szczury trans-5 geniczne, którym podawano placebo; TGptx25: szczury transgeniczne, którym poda-wano substancję będącą kontrolą negatywną, TGA: szczury transgeniczne, którym po-dawano raz na dobę metimazol w dawce 0,2 mg/kg; TGB: szczury transgeniczne, któ-rym podawano raz na dobę pilokarpinę w dawce 0,35 mg/kg. Figura 5: Analiza próbek pobranych pośmiertnie od zwierząt, którym podawano leki 10 zgodnie z legendą do Fig. 3. Szczurom podawano leki i placebo przez 20 tygodni, na-stępnie głęboko je znieczulono i ostrożnie pobrano oraz zważono całe nerwy kulszowe i mięśnie płaszczkowate. Na wykresach przedstawiono 30 wartości średnich z tych pomiarów. Figura 6: Korzystny wpływ Mieszanki 1 w teście oceny chodu (samice szczurów); 15 czarne linie przedstawiają szczury kontrolne, którym podawano placebo; czarna po-grubiona linia oznacza szczury transgeniczne, którym podawano placebo; linia krop-kowana oznacza szczury transgeniczne, którym podawano Mieszankę 1. * p<0,05; czarne * : wt placebo w porównaniu z tg placebo; szare * : tg placebo w porównaniu z tg mieszanka 1. Statystykę wykonano przy użyciu dwustronnego testu t-Studenta; 20 średnie przedstawiono w postaci ± s.e.m. Figura 7: Korzystny wpływ Mieszanki 1 na próg pobudliwości nerwu ogonowego (białe słupki przedstawiają kontrolne samce szczurów, którym podawano placebo; czarne słupki przedstawiają transgeniczne samce szczurów, którym podawano place-bo; szare słupki przedstawiają transgeniczne samce szczurów, którym podawano Mie-25 szankę 2. Statystykę wykonano przy użyciu dwustronnego testu t-Studenta; średnie przedstawiono w postaci ± s.e.m. Figura 8: Korzystny wpływ Mieszanki 1 po 4 tygodniach podawania w teście pręta (białe słupki przedstawiają kontrolne samce szczurów, którym podawano placebo; czarne słupki przedstawiają transgeniczne samce szczurów, którym podawano place-30 bo; szare słupki przedstawiają transgeniczne samce szczurów, którym podawano Mie-szankę 2. Statystykę wykonano przy użyciu dwustronnego testu t-Studenta; średnie przedstawiono w postaci ± s.e.m. Figura 9: Korzystny wpływ Mieszanki 1 na chód po 3 tygodniach podawania (białe słupki przedstawiają odsetek samców szczurów w każdej grupie chodzących w sposób 35 płynny; szare słupki przedstawiają szczury niechodzące w sposób płynny; czarne słupki przedstawiają niezdolność chodzenia). Statystykę wykonano przy użyciu dwu-stronnego testu t-Studenta. Figura 10: Efekt antyallodyniczny w przewlekłym modelu OXALPN. Kolorem nie-bieskim przedstawiono czasy reakcji w teście z acetonem dla zwierząt kontrolnych, 40 kolorem czerwonym dla zwierząt, którym podawano oksaliplatynę, kolorem zielonym dla zwierząt, którym podawano oksaliplatynę i mieszankę 2.

Szczegółowy opis wynalazku

[0038] Niniejszy wynalazek dostarcza nowe strategie terapeutyczne leczenia CMT lub pokrewnych zaburzeń. Wynalazek ujawnia nowe kompozycje uzyskane z połączeń zna-45 nych leków i ich nowe zastosowanie w skutecznej poprawie takich chorób. Mogą być one stosowane u dowolnego osobnika będącego ssakiem. [0039] W kontekście niniejszego wynalazku określenie „zaburzenie pokrewne z CMT” oznacza inne neuropatie obwodowe, zarówno wrodzone, jak i nabyte. [0040] Główna postać CMT, CMT1A, jest spowodowana duplikacją genu PMP22. 50 PMP22 jest ważnym składnikiem mieliny eksprymowanym w części zbitej zasadniczo

6

wszystkich włókien mielinowych w obwodowym układzie nerwowym. Białko PMP22 od-działuje z innym białkiem strukturalnym mieliny P0, w związku z czym zmieniony stosu-nek białek PMP22/P0 może wpływać na upakowanie osłonek mielinowych (Vallat i in., 1996; D'Urso i in., 1999). Jak wykazano w badaniach in vitro, białko PMP22 uczestniczy także w regulacji rozpłaszczania komórek w sposób zależny od Rho i w związku z tym 5 może wpływać na otaczanie aksonów osłonką (Brancolini i in., 1999). Ponadto PMP22 tworzy kompleksy z integrynami α6β4 i może pośredniczyć w oddziaływaniu komórek Schwanna z macierzą zewnątrzkomórkową (Amici i in., 2006; Amici i in., 2007). Ponadto zwiększony poziom białka PMP22 może zmieniać regulowany przez Arf6 szlak obiegu endosomów błony komórkowej i prowadzić do nagromadzenia PMP22 w endosomach 10 późnych (Chies i in., 2003). Wykazano także, że nadeksprymowane białko PMP22 zaburza wewnątrzkomórkowe sortowanie białka i przeciąża aparat rozkładu białek w komórkach Schwanna (Notterpek i in., 1997; Tobler i in., 2002; Fortun i in., 2003; Fortun i in., 2006; Fortun i in., 2007; Khajavi i in., 2007). Dodatkowo, PMP22 bezpośrednio uczestniczy w kontroli namnażania komórek i programowanej śmierci komórek (Sancho i in., 2001; Ata-15 nasoski i in., 2002), i pokazano, że zmutowane białko PMP22 wywołuje silną reorganiza-cję i nieprawidłową ekspresję aksonalnych kanałów jonowych (Ulzheimer i in., 2004; Devaux i Scherer, 2005). [0041] W efekcie określenie „zaburzenia pokrewne z CMT” obejmuje zaburzenia obwo-dowe, takie jak ALS, neuropatie toksyczne, neuropatie idiopatyczne, neuropatia cukrzy-20 cowa, neuropatie wywołane przez nowotwór i HIV, zespół Guillaina-Barrégo. [0042] W korzystnej postaci zaburzenie związane z CMT oznacza neuropatię, taką jak neuropatie demielinizacyjne, w tym HNPP (neuropatię dziedziczną z podatnością na pora-żenia uciskowe), CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1X, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E, CMT2-P0, ciężkie neuropatie demielinizacyjne DSS (zespół Dejerine’a-Sottasa), 25 CHN (wrodzoną neuropatię hipomielinizacyjną), CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4D, CMT4F, CMT4, AR-CMT2A, HSN1. [0043] Wynalazek jest szczególnie odpowiedni do leczenia CMT1A. [0044] Stosowane w opisie słowo „leczenie” zaburzenia obejmuje terapię, zapobieganie, profilaktykę, opóźnienie lub zmniejszanie bólu wywołanego przez zaburzenie. Określenie 30 leczenie obejmuje w szczególności kontrolę progresji choroby i powiązanych objawów. [0045] Dodatkowo, określenie związek oznacza związki chemiczne wymienione w zgło-szeniu, jak również każdą ich farmaceutycznie dopuszczalną sól, hydrat, ester, eter, izome-ry, mieszaniny racemiczne, koniugaty, proleki. [0046] Dodatkowo, określenie „skojarzenie” oznacza leczenie, w którym co najmniej dwa 35 leki są współpodawane osobnikowi w celu wywołania działania biologicznego. W terapii skojarzonej te co najmniej dwa leki mogą być podawane łącznie lub oddzielnie, w tym sa-mym czasie lub kolejno. Dodatkowo, te co najmniej dwa leki mogą być podawane różnymi drogami i według różnych protokołów. [0047] Wynalazek pokazuje, że CMT lub zaburzenie pokrewne z CMT może być leczone 40 konkretnym połączeniem leków. W szczególności wynalazek pokazuje, że związki meti-mazol i pilokarpina, w połączeniu(-ach), mogą być stosowane w leczeniu CMT lub po-krewnych zaburzeń. W tym względzie, wyniki doświadczalne pokazują, że połączenie me-timazolu i pilokarpiny istotnie zmniejsza poziom ekspresji RNA genu PMP22 w szczu-rzych komórkach Schwanna. Ponadto, szczury transgeniczne pod względem PMP22, sta-45 nowiące model choroby CMT u ludzi, leczono podając im codziennie połączenia zawiera-jące metimazol i pilokarpinę. Stwierdzono istotną poprawę behawioralnych punktów koń-cowych.

Pilokarpina: (3S,4R)-3-etylo-4-[(3-metyloimidazol-4-ilo)metylo]oksolan-2-on

[0048] Ten lek, C11H16N2O2,, został dopuszczony do leczenia i) objawów suchości w 50 ustach w przebiegu niedostatecznej czynności gruczołów ślinowych wywołanej przez ra-

7

dioterapię raka głowy i szyi; i ii) leczenia objawów suchości w ustach u pacjentów z ze-społem Sjogrena. [0049] Będąc agonistą receptorów muskarynowych, powoduje skurcz włókien mięśni gładkich (przewodu pokarmowego, oka, oskrzeli), pobudza wydzielanie przez gruczoły po-towe, ślinowe, oskrzelowe i żołądkowe. Dodatkowo wywiera złożony wpływ na układ ser-5 cowo-naczyniowy, pobudzając oba szlaki parasympatykomimetyczne (rozkurcz naczyń) pobudzające zwoje nerwowe. [0050] Wynalazcy wykazali, że pilokarpina, agonista receptorów muskarynowych, zmniejsza ekspresję białka PMP22 w komórkach Schwanna in vitro. Sugerujemy, że po-budzenie receptorów muskarynowych przez pilokarpinę prowadzi – prawdopodobnie przez 10 złożony zestaw mechanizmów cząsteczkowych – do przesunięcia wewnątrzkomórkowej równowagi między aktywnością Erk/Akt, które regulują ekspresję wskaźników białko-wych związanych z mieliną w przeciwstawny sposób, w kierunku bardziej nasilonego przekaźnictwa sygnałów przez Erk (Ogata i in., 2004). [0051] Bez wskazywania żadnej konkretnej teorii, postuluje się, że pobudzenie recepto-15 rów muskarynowych może modyfikować aktywność kinaz Akt i Erk w kilku jednocześnie zachodzących mechanizmach (Ma i in., 2004; Anger i in., 2007). Przykładowo receptory muskarynowe mogą w sposób wybiórczy blokować przekaźnictwo sygnałów przez IGF-1, ale nie przez receptory PDGF, sprzyjając hamującej defosforylacji tyrozyny lub hamującej fosforylacji seryny w obrębie IRS-1 przez PKC. Następnie receptory muskarynowe mogą 20 pośredniczyć w wewnątrzkomórkowej transaktywacji przekaźnictwa sygnałów przez ERK przez kinazę Fyn Src-podobną oraz przez zmniejszanie aktywności cyklazy adenylanowej, receptory muskarynowe mogą uczestniczyć w regulacji czynnościowej kinaz Akt/Gsk-3β i Erk, także w mechanizmie pośredniczonym przez PKA. Ostatecznie wykazano, że pobu-dzenie receptorów muskarynowych może – przez aktywację AMPK – przejściowo powo-25 dować defosforylację Akt i w ten sposób zmniejszać wewnątrzkomórkową pulę β-kateniny (Batty i in., 2004; King i in., 2006). [0052] W efekcie, mogą być także stosowani inni agoniści receptorów muskarynowych, jak na przykład: cewimelina (numer CAS 107233-08-9), karbachol (numer CAS 51-83-2), metacholina (numery CAS 55-92-5) i betanechol (numer CAS 674-38-4). 30

Metimazol : 1-metylo-3H-imidazolo-2-tion

[0053] Metimazol hamuje wytwarzanie nowych hormonów tarczycy, blokując aktywność peroksydazy tarczycowej, przekształcającej jodek w jod i katalizującej przyłączenie otrzymanej cząsteczki jodku do pierścieni fenolowych tyrozyn. Stąd metimazol może sku-tecznie zmniejszać aktywność transkrypcyjną receptorów hormonów tarczycy. Dodatko-35 wo, opisywano, że metimazol hamuje wytwarzanie prostaglandyn, zmniejszając aktywność syntazy prostaglandyny H (Zelman i in., 1984). Prostaglandyny – poprzez spokrewnione receptory GPCR – mogą dodatkowo nasilać aktywność szlaku przekaźnictwa sygnałów przez Akt, który sprzyja ekspresji białek związanych z mieliną (Ogata i in., 2004; Castel-lone i in., 2006). Zatem związki, które jednocześnie hamują syntezę hormonów tarczycy i 40 wpływają na wytwarzanie prostaglandyn lub przekaźnictwo sygnałów, są szczególnie ko-rzystne do stosowania w niniejszym wynalazku. [0054] Inne związki, które mają sposób działania pokrewny z metimazolem to karbimazol (prolek metimazolu - numer CAS 22232-54-8) i propylotiouracyl (numer CAS 51-52-5) oraz amiodaron (numer CAS 1951-25-3). 45 [0055] Jak ujawniono w przykładach, związki metimazol i pilokarpina wywierają skoja-rzone działanie prowadzące do polepszonego efektu terapeutycznego względem CMT, umożliwiającego zmniejszenie dawek skutecznych terapeutycznie i ograniczenie działań wtórnych. [0056] Szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia CMT lub 50 pokrewnego zaburzenia, w szczególności CMT1A, przy czym ta terapia skojarzona obej-

8

muje związki metimazol i pilokarpinę oraz co najmniej trzeci związek zdolny do zwięk-szenia aktywności tego połączenia. [0057] Inna szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia ALS, przy czym ta terapia skojarzona obejmuje związki metimazol i pilokarpinę i co najmniej trzeci związek zdolny do zwiększenia aktywności tego połączenia. 5 [0058] Inna szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia neuro-patii toksycznej, przy czym ta terapia skojarzona obejmuje związki metimazol i pilokarpi-nę i co najmniej trzeci związek zdolny do zwiększenia aktywności tego połączenia. [0059] Szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, przy czym związki metimazol i pilokarpinę stosowane są same. 10 [0060] Inna szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, przy czym metimazol i/lub pilokarpina stosowane są w połą-czeniu z co najmniej jednym dodatkowym związkiem czynnym. W korzystnej postaci ten co najmniej jeden dodatkowy związek jest wybrany z grupy związków podanych w Tabeli 1. [0061] Inna szczególna postać wynalazku polega na kompozycji, która obejmuje dowolne 15 połączenie leków ujawnione w Tabeli 1. [0062] Inna szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia CMT lub pokrewnego zaburzenia, obejmującej dowolne połączenie leków ujawnione w Tabeli 1. [0063] Inna szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia ALS, obejmującej dowolne połączenie leków ujawnione w Tabeli 1. 20 [0064] Inna szczególna postać wynalazku polega na terapii skojarzonej do leczenia neuro-patii toksycznej, obejmującej dowolne połączenie leków ujawnione w Tabeli 1. [0065] Terapia według wynalazku jest stosowana w postaci połączenia leków, ewentual-nie w połączeniu z dowolną inną terapią. Może być dostarczana w domu, w gabinecie leka-rza, w przychodni, w przychodni przyszpitalnej lub w szpitalu, tak aby lekarz mógł uważ-25 nie obserwować wyniki terapii i w razie potrzeby dokonać koniecznych modyfikacji. [0066] Czas trwania terapii zależy od stopnia zaawansowania choroby, wieku i stanu zdrowia pacjenta oraz odpowiedzi pacjenta na leczenie. [0067] Dodatkowo, osoba, u której występuje wyższe ryzyko rozwoju dodatkowego zabu-rzenia neuropatycznego (np. osoba mająca predyspozycje genetyczne lub na przykład cho-30 rująca na cukrzycę lub jest leczona z powodu stanu onkologicznego itp.), może otrzymy-wać postępowanie profilaktyczne w celu złagodzenia lub opóźnienia ewentualnej odpo-wiedzi neuropatycznej. [0068] Dawka, częstotliwość i sposób podawania każdego składnika połączenia mogą być kontrolowane w sposób niezależny. Przykładowo jeden lek może być podawany doustnie, 35 natomiast drugi lek może być podawany domięśniowo. Terapia skojarzona może być po-dawana w postaci cykli leczenia-przerw w leczeniu, które obejmują okresy bez leczenia, aby organizm pacjenta miał szansę zregenerować się po wszystkich obecnie nieprzewi-dzialnych działaniach ubocznych. Leki mogą być także formułowane razem, tak aby jedno podanie dostarczało oba leki. 40

Formułowanie kompozycji farmaceutycznych

[0069] Podawanie każdego leku wchodzącego w skład połączenia może odbywać się przy użyciu dowolnego odpowiedniego sposobu, który prowadzi do uzyskania stężenia tego le-ku, jakie, w połączeniu z drugim składnikiem, jest w stanie skorygować wpływ podwyż-szonej ekspresji PMP22 po osiągnięciu nerwów obwodowych. 45 [0070] Chociaż istnieje możliwość podawania składników czynnych wchodzących w skład połączenia w postaci chemicznie czystej, korzystne jest umieszczenie ich w kompo-zycji farmaceutycznej, w tym kontekście nazywanej także preparatem farmaceutycznym. Możliwe kompozycje obejmują kompozycje odpowiednie do podawania doustnego, dood-bytniczego, miejscowego (w tym przezskórnego, dopoliczkowego i podjęzykowego) lub 50 pozajelitowego (w tym podskórnego, domięśniowego, dożylnego i śródskórnego).

9

[0071] Częściej te preparaty farmaceutyczne są przepisywane pacjentowi w „opakowa-niach dla pacjenta” zawierających pewną liczbę jednostek dawkowanych lub innych środ-ków do podawania odmierzonych dawek jednostkowych w trakcie odrębnego okresu le-czenia w pojedynczym opakowaniu, zazwyczaj opakowaniu blistrowym. Opakowania dla pacjenta mają przewagę nad tradycyjnymi receptami, gdy farmaceuta wydziela porcję leku 5 dla pacjenta z porcji luzem, polegającą na tym, że pacjent zawsze ma dostęp do ulotki in-formacyjnej zawartej w opakowaniu dla pacjenta, a której zazwyczaj nie ma przy tradycyj-nych receptach. Wykazano, że dołączenie ulotki informacyjnej poprawia przestrzeganie zaleceń lekarza przez pacjenta. Stąd wynalazek dodatkowo obejmuje preparat farmaceu-tyczny, opisany powyżej w opisie, w połączeniu z materiałem opakowania odpowiednim 10 do takich preparatów. W takim opakowaniu dla pacjenta, przeznaczenie preparatu do le-czenia skojarzonego można wywnioskować z instrukcji, ułatwień, zaopatrzenia, przysto-sowań i/lub innych środków pomagających w zastosowaniu preparatu w sposób najbar-dziej odpowiedni do leczenia. Takie środki sprawiają, że opakowanie dla pacjenta jest szczególnie odpowiednie i przystosowane do zastosowania do leczenia połączeniem we-15 dług niniejszego wynalazku. [0072] Lek może być zawarty w dowolnej odpowiedniej ilości w dowolnej odpowiedniej substancji nośnikowej i jego masa może stanowić 1 – 99% wagowych względem całkowi-tej masy kompozycji. Kompozycja może być dostarczona w postaci dawkowanej, która jest odpowiednia do drogi podawania doustnej, pozajelitowej (np. dożylnie, domięśniowo), 20 doodbytniczej, skórnej, donosowej, dopochwowej, wziewnej, na skórę (plaster) lub śród-ocznej. Stąd kompozycja może być w postaci np. tabletek, kapsułek, pigułek, proszków, granulatów, zawiesin, emulsji, roztworów, żeli, w tym hydrożeli, past, maści, kremów, pla-strów, płynów, urządzeń do podawania osmotycznego, czopków, wlewek, wstrzykiwań, implantów, sprejów lub aerozoli. 25 [0073] Kompozycje farmaceutyczne mogą być formułowane zgodnie ze zwykłą praktyką farmaceutyczną (patrz np. Remington: The Science and Practice of pharmacy (wyd. 20.), red. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 i Encyclopedia of Pharmaceuti-cal Technology, red. J. Swarbrick i J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nowy Jork). [0074] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być formułowane do uwal-30 niania czynnego leku zasadniczo bezpośrednio po podaniu albo w dowolnym wcześniej określonym czasie lub okresie czasu po podaniu. [0075] Preparaty o kontrolowanym uwalnianiu obejmują (i) preparaty, które tworzą za-sadniczo stałe stężenie leku w organizmie w długim okresie czasu; (ii) preparaty, które po określonym okresie opóźnienia, tworzą zasadniczo stałe stężenie leku w organizmie w dłu-35 gim okresie czasu; (iii) preparaty, które utrzymują działanie leku po określonym czasie przez utrzymywanie względnie stałego, skutecznego poziomu leku w organizmie przy jed-noczesnym zmniejszeniu niepożądanych działań ubocznych związanych z wahaniem się poziomu czynnej substancji leczniczej w osoczu; (iv) preparaty, które lokalizują działanie leku w konkretnym miejscu, np. przez przestrzenne umieszczenie kompozycji o kontrolo-40 wanym uwalnianiu w pobliżu chorobowo zmienionej tkanki lub narządu lub w ich obrębie; i (v) preparaty, które ukierunkowują działanie leku przez stosowanie nośników lub po-chodnych chemicznych do dostarczania leku do danego docelowego typu komórek. [0076] Podawanie leków w postaci preparatu o kontrolowanym uwalnianiu jest szczegól-nie korzystne w przypadkach, w których lek, sam lub w połączeniu, ma (i) wąski indeks te-45 rapeutyczny (tj. różnica między stężeniem w osoczu prowadzącym do szkodliwych działań ubocznych lub reakcji toksycznych a stężeniem w osoczu prowadzącym do wystąpienia efektu terapeutycznego jest niewielka; ogólnie, indeks terapeutyczny, TI, jest definiowany jako stosunek połowicznej dawki śmiertelnej (LD50) do połowicznej dawki skutecznej (ED50)); (ii) wąskie okno wchłaniania w przewodzie pokarmowym lub (iii) bardzo krótki 50 biologiczny okres półtrwania, tak że dla utrzymania poziomu w osoczu na poziomie tera-peutycznym konieczne jest wielokrotne jego podawanie w ciągu doby.

10

[0077] W celu uzyskania kontrolowanego uwalniania, w którym szybkość uwalniania da-nego leku przewyższa szybkość jego przemiany, można użyć dowolną z licznych strategii. Kontrolowane uwalnianie można uzyskać przez odpowiedni wybór różnych parametrów i składników preparatu, np. różnych typów kompozycji i powłoczek zapewniających kontro-lowane uwalnianie. Stąd lek jest formułowany z odpowiednimi zaróbkami w kompozycję 5 farmaceutyczną, która, po podaniu, uwalnia lek w sposób kontrolowany (kompozycja ta-bletki lub kapsułki zawierająca jedną lub wiele jednostek, roztwory oleiste, zawiesiny, emulsje, mikrokapsułki, mikrokulki, nanocząstki, plastry i liposomy). Stałe postacie dawkowane do zastosowania doustnego [0078] Preparaty do zastosowania doustnego obejmują tabletki zawierające składnik(-i) 10 czynny(-e) w mieszaninie z nietoksycznymi, farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami. Tymi zaróbkami mogą być, na przykład, obojętne rozcieńczalniki lub wypełniacze (np. sa-charoza, celuloza mikrokrystaliczna, skrobie, w tym skrobia ziemniaczana, węglan wapnia, chlorek sodu, fosforan wapnia, siarczan wapnia lub fosforan sodu); środki granulujące i rozsadzające (np. pochodne celulozy, w tym celuloza mikrokrystaliczna, skrobie, w tym 15 skrobia ziemniaczana, sól sodowa kroskarmelozy, alginiany lub kwas alginowy); środki wiążące (np. guma arabska, kwas alginowy, alginian sodu, żelatyna, skrobia, wstępnie zże-lowana skrobia, celuloza mikrokrystaliczna, sól sodowa karboksymetylocelulozy, metylo-celuloza, hydroksypropylometyloceluloza, etyloceluloza, poliwinylopirolidon lub glikol polietylenowy); i środki smarujące, środki poślizgowe i środki przeciwadhezyjne (np. kwas 20 stearynowy, krzemiany lub talk). Innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami mo-gą być środki barwiące, środki smakowo/zapachowe, plastyfikatory, środki utrzymujące wilgoć, środki buforujące i tym podobne. [0079] Tabletki mogą być niepowlekane lub mogą być powlekane znanymi technikami, ewentualnie dla opóźnienia rozpadu i wchłaniania w przewodzie pokarmowym i w rezulta-25 cie zapewnienia podtrzymywanego działania w dłuższym okresie. Powłoczka może być dostosowana do uwalniania czynnej substancji leczniczej w określony sposób (np. w celu uzyskania preparatu o kontrolowanym uwalnianiu) lub może być dostosowana do nieuwal-niania czynnej substancji leczniczej do czasu przejścia leku przez żołądek (powłoczka do-jelitowa). Powłoczka może być powłoczką cukrową, powłoczką w postaci błony (np. opar-30 tą na hydroksypropylometylocelulozie, metylocelulozie, metylohydroksyetylocelulozie, hydroksypropylocelulozie, karboksymeylocelulozie, kopolimerach akrylanu, glikolach po-lietylenowych i/lub poliwinylopirolidonie) lub powłoczką dojelitową (np. opartą na kopo-limerze kwasu metakrylowego, octanoftalanie celulozy, ftalanie hydroksypropylometylo-celulozy, octanobursztynianie hydroksypropylometylocelulozy, octanoftalanie poliwinylu, 35 szelaku i/lub etylocelulozie). Stosowany może być materiał opóźniający czasowo, taki jak np. monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu. [0080] Stałe kompozycje tabletki mogą zawierać powłoczkę przystosowaną do ochrony kompozycji przed niepożądanymi zmianami chemicznymi (np. rozkładem chemicznym przed uwolnieniem czynnej substancji leczniczej). Powłoczka może być nanoszona na stałą postać 40 dawkowaną w podobny sposób, jak opisano w Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. [0081] Dwa leki mogą zostać zmieszane razem w tabletce lub mogą być rozdzielone. Przykładowo pierwszy lek jest zawarty w środku tabletki, a drugi lek na zewnątrz, tak że istotna część drugiego leku jest uwalniania przed uwolnieniem pierwszego leku. [0082] Preparaty do stosowania doustnego mogą także występować w postaci tabletek do 45 rozgryzania i żucia lub twardych kapsułek żelatynowych, w których składnik czynny jest zmieszany z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem (np. skrobią ziemniaczaną, celulozą mi-krokrystaliczną, węglanem wapnia, fosforanem wapnia lub kaolinem), lub miękkich kapsu-łek żelatynowych, w których składnik czynny jest zmieszany z wodą lub podłożem ole-istym, na przykład ciekłą parafiną lub olejem oliwkowym. Proszki i granulki mogą być 50 wytwarzane w zwykły sposób przy użyciu składników wymienionych w punkcie poświę-conym tabletkom i kapsułkom.

11

[0083] Kompozycje o kontrolowanym uwalnianiu do stosowania doustnego mogą np. być tak skonstruowane, żeby uwalniały czynny lek przez kontrolowanie rozpuszczania i/lub dyfuzji czynnej substancji leczniczej. [0084] Uwalnianie kontrolowane rozpuszczaniem lub dyfuzją można uzyskać przez od-powiednie powlekanie tabletki, kapsułki, peletki lub granulowanego preparatu leków lub 5 przez wprowadzenie leku do odpowiedniej matrycy. Powłoczka o kontrolowanym uwal-nianiu może zawierać jedną lub większą liczbę substancji powlekających wymienionych wyżej i/lub np. szelak, wosk pszczeli, glycowax, wosk rycynowy, wosk karnauba, alkohol stearylowy, monostearynian glicerylu, distearynian glicerylu, palmitostearynian glicerolu, etylocelulozę, żywice akrylowe, kwas DL-polimlekowy, octanomaślan celulozy, polichlo-10 rek winylu, polioctan winylu, winylopirolidon, polietylen, polimetakrylan, metakrylan me-tylu, 2-hydroksymetakrylan, hydrożele metakrylowe, glikol 1,3-butylenowy, metakrylan glikolu etylenowego i/lub glikole polietylenowe. W preparacie z matrycą o kontrolowanym uwalnianiu materiał matrycy może także zawierać np. uwodnioną metylocelulozę, wosk karnauba i alkohol stearynowy, karbopol 934, silikon, tristearynian glicerylu, akrylan me-15 tylu-metakrylan metylu, polichlorek winylu, polietylen i/lub chlorowcowany fluorowęglo-wodór. [0085] Kompozycja o kontrolowanym uwalnianiu zawierająca jeden lub większą liczbę leków z zastrzeżonych połączeń może także występować w postaci pływającej tabletki lub kapsułki (tj. tabletki lub kapsułki, która po podaniu doustnym pływa na powierzchni treści 20 żołądkowej przez określony czas). Preparat leku(-ów) w postaci pływającej tabletki można wytwarzać przez granulację mieszaniny leku(-ów) z zaróbkami i 20 – 75% wag./wag. hy-drokoloidami, takimi jak hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza lub hydroksy-propylometyloceluloza. Następnie otrzymane granulki mogą być prasowane w tabletki. Po zetknięciu się z sokiem żołądkowym, tabletka wokół swojej powierzchni tworzy zasadni-25 czo nieprzepuszczalną dla wody barierę żelową. Ta bariera żelowa uczestniczy w utrzyma-niu gęstości poniżej jednego, w ten sposób umożliwiając pływanie tabletki w soku żołąd-kowym.

Ciecze do podawania doustnego

[0086] Dogodnymi postaciami dawkowanymi do podawania doustnego są proszki, dys-30 pergowalne proszki lub granulki odpowiednie do wytwarzania zawiesiny wodnej przez do-danie wody. Preparat w postaci zawiesiny dostarcza składnik czynny w mieszaninie ze środkiem dyspergującym lub zwilżającym, środkiem suspendującym i jednym lub większą liczbą środków konserwujących. Odpowiednimi środkami suspendującymi są, na przykład, sól sodowa karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, alginian sodu i tym podobne. 35

Kompozycje pozajelitowe

[0087] Kompozycja farmaceutyczna może być także podawana pozajelitowo w postaci wstrzyknięcia, wlewu lub implantacji (dożylnie, domięśniowo, podskórnie lub podobną drogą) w postaciach dawkowanych, preparatach lub przez odpowiednie urządzenia dostar-czające lub implanty zawierające zwykłe, nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne no-40 śniki lub zaróbki. Formułowanie i wytwarzanie takich kompozycji są dobrze znane specja-listom w dziedzinie preparatów farmaceutycznych. [0088] Kompozycje do stosowania pozajelitowego mogą być dostarczane w jednostko-wych postaciach dawkowanych (np. w ampułkach jednodawkowych) lub w fiolkach za-wierających szereg dawek i do których może być dodawany odpowiedni środek konserwu-45 jący (patrz niżej). Kompozycja może występować w postaci roztworu, zawiesiny, emulsji, urządzenia do wlewów lub urządzenia dostarczającego do implantacji lub może występo-wać w postaci suchego proszku do roztworzenia z użyciem wody lub innego odpowiednie-go podłoża przed użyciem. Poza czynnym(-i) lekiem(-ami), kompozycja może zawierać odpowiednie pozajelitowo dopuszczalne nośniki i/lub zaróbki. Czynny(-e) lek(-i) można 50

12

wprowadzać w mikrosfery, mikrokapsułki, nanocząstki, liposomy lub tym podobne do kontrolowanego uwalniania. Kompozycja może zawierać środki suspendujące, solubilizu-jące, stabilizujące, doprowadzające pH i/lub dyspergujące. [0089] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą występować w postaci od-powiedniej do jałowych wstrzykiwań. W celu wytworzenia takiej kompozycji, odpowied-5 ni(-e) czynny(-e) lek(-i) rozpuszcza się lub przeprowadza w zawiesinę w pozajelitowo do-puszczalnym ciekłym podłożu. Do dopuszczalnych podłóż i rozpuszczalników, które mogą być stosowane, należy woda, woda doprowadzona do odpowiedniego pH przez dodanie odpowiedniej ilości kwasu chlorowodorowego, wodorotlenku sodu lub odpowiedniego bu-foru, 1,3-butanediol, płyn Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Preparat wodny 10 może także zawierać jeden lub większą liczbę środków konserwujących (np. p-hydroksy-benzoesan metylu, etylu lub n-propylu). W przypadkach, w których jeden z leków jest je-dynie nieznacznie lub trudno rozpuszczalny w wodzie, można dodać środek poprawiający rozpuszczanie lub środek solubilizujący lub rozpuszczalnik może zawierać 10 – 60% wag./wag. glikolu propylenowego lub temu podobnych. 15 [0090] Kompozycje pozajelitowe o kontrolowanym uwalnianiu mogą występować w po-staci zawiesin wodnych, mikrosfer, mikrokapsułek, mikrosfer magnetycznych, roztworów oleistych, zawiesin oleistych lub emulsji. Alternatywnie, czynny(-e) lek(-i) można wpro-wadzać w biologicznie zgodne nośniki, liposomy, nanocząstki, implanty lub urządzenia do wlewów. Materiały do stosowania w wytwarzaniu mikrosfer i/lub mikrokapsułek są np. 20 biodegradowalnymi/bioerodowalnymi polimerami, takimi jak poligalaktyna, poli-(cyjano-akrylan izobutylu), poli(2-hydroksyetylo-L-glutamina). Biologicznie zgodne nośniki, które mogą być stosowane w formułowaniu preparatu pozajelitowego o kontrolowanym uwal-nianiu obejmują węglowodany (np. dekstrany), białka (np. albuminę), lipoproteiny lub przeciwciała. Materiały do zastosowania w implantach mogą być niebiodegradowalne (np. 25 polidimetylosiloksan) lub biodegradowalne (np. poli(kaprolakton), poli(kwas glikolowy) lub poli(ortoestry)).

Kompozycje doodbytnicze

[0091] Odpowiednie postacie dawkowane kompozycji do podawania doodbytniczego obejmują czopki (typu emulsji lub zawiesiny) i doodbytnicze kapsułki żelatynowe (roztwo-30 ry lub zawiesiny). W typowym preparacie czopka, czynny(-e) lek(-i) łączy się z odpowied-nim farmaceutycznie dopuszczalnym podłożem czopka, takim jak masło kakaowe, estryfi-kowane kwasy tłuszczowe, glicerynowana żelatyna i różne rozpuszczalne w wodzie lub dyspergowane podłoża, takie jak glikole polietylenowe. Preparat może zawierać różne do-datki, środki wzmacniające lub substancje powierzchniowo czynne. 35

Kompozycje przezskórne i miejscowe

[0092] Kompozycje farmaceutyczne mogą także być podawane miejscowo na skórę do wchłaniania przezskórnego w postaciach dawkowanych lub preparatach zawierających zwykłe, nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i zaróbki, w tym mikrosfery i liposomy. Preparaty obejmują kremy, maści, lotiony, mazidła, żele, hydrożele, roztwory, 40 zawiesiny, sztyfty, spreje, pasty, plastry i inne rodzaje transdermalnych systemów dostar-czania leków. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki lub zaróbki mogą obejmować środki emulgujące, przeciwutleniacze, środki buforujące, środki konserwujące, środki utrzymują-ce wilgoć, środki zwiększające przenikanie, środki chelatujące, środki tworzące żel, podło-ża maści, perfumy i środki chroniące skórę. 45

Środkami emulgującymi mogą być naturalnie występujące żywice (np. guma arabska lub guma tragakantowa)

[0093] Środkami konserwującymi, środkami utrzymującymi wilgoć, środkami zwiększa-jącymi przenikanie mogą być parabeny, takie jak p-hydroksybenzoesan metylu lub propy-lu, i chlorek bezalkoniowy, gliceryna, glikol propylenowy, mocznik itp. 50

13

[0094] Opisane wyżej kompozycje farmaceutyczne do podawania miejscowego na skórę mogą także być stosowane w powiązaniu z podawaniem miejscowym na leczoną część cia-ła lub w jej pobliżu. Kompozycje mogą być dostosowane do bezpośredniego podawania lub do podawania przy użyciu specjalnych urządzeń dostarczających leki, takich jak opa-trunki lub alternatywnie plastry, waciki, gąbki, paski lub inne postacie odpowiednio ela-5 stycznego materiału.

Dawki i czas trwania leczenia

[0095] Należy dostrzec, że leki wchodzące w skład połączenia mogą być podawane łącz-nie, w tym samym lub w innym preparacie farmaceutycznym lub kolejno. W korzystnej postaci leki są formułowane razem, w tej samej zaróbce lub nośniku. Jeśli występuje po-10 dawanie kolejne, opóźnienie w podaniu drugiego (lub dodatkowego) składnika czynnego nie powinno być takie, aby doszło do utraty korzyści wynikających z korzystnego działa-nia połączenia składników czynnych. Minimalne wymaganie stawiane połączeniu według niniejszego opisu jest takie, że połączenie powinno być przeznaczone do leczenia skoja-rzonego z korzyścią wynikającą z korzystnego działania połączenia składników czynnych. 15 Zalecane zastosowanie połączenia można wywnioskować z ułatwień, zaopatrzenia, przy-stosowań i/lub innych środków pomagających w stosowaniu połączenia według wynalaz-ku. [0096] Terapeutycznie skuteczne ilości dwóch lub większej liczby leków będących przedmiotem niniejszego wynalazku można stosować razem w wytwarzaniu leku użytecz-20 nego do zmniejszania efektów zwiększonej ekspresji genu PMP22, zapobiegania rozwojo-wi lub zmniejszania ryzyka rozwoju choroby CMT1A, zatrzymywania lub spowalniania progresji choroby CMT1A po wystąpieniu jej objawów klinicznych i zapobiegania pierw-szemu lub kolejnemu wystąpieniu zdarzenia neuropatycznego lub zmniejszania jego ryzy-ka. 25 [0097] Pomimo tego, że czynne leki według niniejszego wynalazku mogą być podawane w dawkach podzielonych, na przykład dwa lub trzy razy na dobę, korzystna jest pojedyn-cza dawka dobowa każdego leku wchodzącego w skład połączenia, a najkorzystniejsza jest pojedyncza dawka dobowa wszystkich leków wchodzących w skład pojedynczej kompo-zycji farmaceutycznej (jednostkowa postać dawkowana). 30 [0098] Podawanie może odbywać się raz do kilku razy na dobę przez kilka dni do kilku lat, a nawet do końca życia pacjenta. W większości przypadków wskazane będzie przewle-kłe lub co najmniej okresowo powtarzane, długotrwałe podawanie.

• Określenie „jednostkowa postać dawkowana” dotyczy fizycznie odrębnych jednostek (takich jak kapsułki, tabletki lub załadowane cylindry strzykawek) odpowiednich jako 35 dawki jednostkowe dla pacjentów będących ludźmi, przy czym każda jednostka za-wiera określoną ilość czynnego materiału lub materiałów, obliczoną do wywołania pożądanego działania terapeutycznego, w powiązaniu z wymaganym farmaceutycz-nym nośnikiem.

[0099] Ilość każdego leku w połączeniu korzystnym dla dawki jednostkowej będzie uza-40 leżniona od szeregu czynników, włączając sposób podawania, masę ciała i wiek pacjenta, ciężkość uszkodzenia neuropatycznego spowodowanego przez chorobę CMT1A lub ryzy-ka potencjalnych działań ubocznych w świetle ogólnego stanu zdrowia leczonej osoby. [0100] Dodatkowo, na stosowaną dawkę mogą wpływać informacje farmakogenomiczne (wpływ genotypu na profil farmakokinetyczny, farmakodynamiczny lub skuteczności leku) 45 dotyczące konkretnego pacjenta. [0101] Z wyjątkiem odpowiedzi na przypadki szczególnie osłabiającej choroby CMT, w których konieczne mogą być wyższe dawki lub leczenia dzieci, dla których należy wybrać niższe dawki, korzystna dawka każdego leku wchodzącego w skład połączenia zazwyczaj mieści się w zakresie dawek nie przekraczających zazwyczaj zlecanych dawek do długo-50

14

trwałego leczenia podtrzymującego lub których bezpieczeństwo wykazano w dużych ba-daniach klinicznych fazy 3. [0102] Przykładowo, • metimazol – od około 0,5 do około 15 mg na dobę w przypadku przyjmowania doust-

nego. W przypadku podawania miejscowego należy wybrać specjalne dawki. 5

• pilokarpina – od około 0,1 do około 20 mg na dobę w przypadku przyjmowania do-ustnego.

[0103] Najkorzystniejsza dawka odpowiada ilości od 1% do 10% zazwyczaj zlecanej do długotrwałego leczenia podtrzymującego. [0104] Należy rozumieć, że rzeczywiście podawana ilość leku zostanie określona przez 10 lekarza w świetle odpowiednich okoliczności obejmujących leczony stan lub stany, do-kładną podawaną kompozycję, wiek, masę ciała i odpowiedź danego pacjenta, ciężkość objawów występujących u pacjenta i wybraną drogę podawania. Stąd powyższe zakresy dawek mają dostarczyć ogólne wytyczne i wsparcie dla informacji podanych w opisie, ale nie mają ograniczać zakresu wynalazku. 15

Schemat terapeutyczny, dawki i drogi podawania

[0105] Niżej opisano dawki połączeń leków (które są różne dla różnych dróg podawania) u ludzi.

Metimazol i pilokarpina

[0106] 20

1 - Podawane doustnie w postaci pojedynczej kompozycji farmaceutycznej: metimazol od około 0,5 do około 15 mg i pilokarpina od około 0,1 do około 20 mg, codziennie, doustnie przez kilka miesięcy, najkorzystniejsze dawki obu leków w kompozycji mieszczą się w zakresie od 0,6 do 35 mg na jednostkę (na dobę). 2 - Podawane równocześnie doustnie przez kilka miesięcy: metimazol od około 0,1 do 25 około 15 mg i pilokarpina od około 0,02 do około 20 mg, codziennie, doustnie przez kilka miesięcy, najkorzystniejsze dawki obu leków w kompozycji mieszczą się w za-kresie od 1,02 do 35 mg na jednostkę (na dobę). 3 - Podawane równocześnie przez kilka miesięcy: metimazol od około 0,05 do około 15 mg i pilokarpina od około 0,01 do około 20 mg, codziennie, doustnie przez kilka 30 miesięcy, najkorzystniejsze dawki obu leków w kompozycji mieszczą się w zakresie od 0,06 do 35 mg na jednostkę (na dobę).

[0107] Dawkowania tego leku wchodzącego w skład któregokolwiek z połączeń ujawnio-nych w niniejszym wynalazku mogą różnić się dla preparatów proponowanych do leczenia mężczyzn lub kobiet. 35 [0108] Dodatkowe aspekty i korzyści niniejszego wynalazku zostaną ujawnione w poniż-szej części doświadczalnej, którą należy traktować wyłącznie jako ilustrację.

PRZYKŁADY

I. Doświadczenia in vitro

Dostępne w handlu szczurze pierwotne komórki Schwanna 40

[0109] Fiolki z hodowlą pierwotną szczurzych komórek Schwanna (SC) (Sciencell nr R1700) rozmrożono i wysiano z gęstością 10 000 komórek/cm2 w „pożywce do komórek Schwanna Sciencell” (pożywce podstawowej Sciencell nr R1701) w 75 cm2 kolbach wstępnie powleczonych poli-L-lizyną. Pożywka hodowlana składała się z pożywki pod-stawowej, 5% płodowej surowicy bydlęcej (3H-Biomedical AB nr 1701-0025), 1% dodat-45 ku wzrostowego dla komórek Schwanna (3H Biomedical AB nr 1701-1752), 1% gentamy-cyny (Sigma nr G1397) i 10 µM forskoliny (Sigma nr F6886) w celu pobudzenia ich nam-nażania.

15

[0110] Po osiągnięciu konfluencji (4 do 10 dni w zależności od partii komórek), komórki Schwanna zostały oczyszczone przez delikatne wstrząsanie lub metodą immunopanningu thy1.1, która pozwala na wydzielenie SC spośród przylegających fibroblastów, w celu otrzymania hodowli, które mają co najmniej 95% czystość. Następnie zliczono SC (metodą z błękitem tryptanu) i wysiano je w 75 cm2 kolbach wstępnie powleczonych poli-L-lizyną 5 w takiej samej podżywce SC. Po osiągnięciu konfluencji, komórki przepłukano, poddano trypsynizacji (trypsyna-EDTA rozcieńczenie 1x z Invitrogen nr 1540054), rozcieńczono w PBS bez wapnia i magnezu), zliczono i wysiano w 12-studzienkowych płytkach (140 000 komórek/studzienkę) w pożywce do komórek Schwanna Sciencell z 5% FBS, 1% dodat-kiem wzrostowym dla komórek (CGS), 40 µg/ml gentamycyny i 4 µM forskoliną. 10

Szczurze pierwotne komórki Schwanna uzyskane na zamówienie [0111] Hodowle pierwotne komórek Schwanna (SC) uzyskano z nerwów kulszowych no-worodków szczurów (P0 do P2) Sprague-Dawley. Wszystkie noworodki szczurze uśmier-cono i przeprowadzano wydzielanie na szalce Petriego. Preparatykę wykonywano w wa-runkach jałowych. 15 [0112] Z tylnej łapy i dolnej części tułowia zdjęto grzbietową część skóry. Nerw kulszowy izolowano i przenoszono na szalkę hodowlaną zawierającą lodowatą pożywkę Leibovitza (L15, Invitogen nr 11415) z dodatkiem 1% roztworu penicyliny/streptomycyny (odpo-wiednio 50 UI/ml i 50 µg/ml, Invitrogen nr 15070) i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA, Sigma A6003). Oba nerwy pobrane od szczura przeniesiono do 15 ml probówki 20 zawierającej lodowatą L15. Następnie pożywkę L15 usunięto i zastąpiono 2,4 ml DMEM (Invitrogen nr 21969035) z 10 mg/ml kolagenazy (Sigma nr A6003). Nerwy inkubowano w tej pożywce przez 30 minut w temperaturze 37°C. Pożywkę usunięto i oba nerwy roz-dzielono trypsyną (10% trypsyna EDTA 10x, Invitrogen nr 15400054) rozcieńczoną w PBS bez wapnia i magnezu (Invitrogen nr 2007-03) przez 20 minut w temperaturze 37°C. 25 Reakcję zatrzymano przez dodanie DMEM zawierającego DNazę I o czystości II (0,1 mg/ml Roche Diagnostic nr 104159) i płodową surowicę bydlęcą (FCS 10%, Invitrogen nr 10270). Zawiesinę komórek roztarto 10 ml pipetą i przepuszczono przez filtr w 50 ml pro-bówce (Swinnex 13 mm filtry, Millipore, z 20 µm filtrami z siatki nylonowej, Fisher). Za-wiesinę komórek odwirowywano przy 350 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej 30 (RT) i osady przeprowadzono w stan zawiesiny w DMEM z 10% FCS i 1% penicyli-ną/streptomycyną. Komórki zliczono (metodą z błękitem tryptanu) i wysiano na płytkach do hodowli tkankowych Falcon 100 mm Primaria z gęstością 5 * 105 do 106 komórek/szalkę. [0113] Po jednym dniu hodowli pożywkę zmieniono na DMEM, 10% FCS, 1% penicyli-nę/streptomycynę i 10 µM b-D-arabinofuranozyd cytozyny (Sigma nr C1768). 48 godzin 35 później pożywkę usunięto, a komórki wypłukano trzykrotnie DMEM. Następnie dodano pożywkę wzrostową SC składającą się z DMEM, 10% FCS, 1% penicyliny/streptomy-cyny, 2 µM forskoliny (Sigma nr F6886), 10 µg/ml ekstraktu z przysadki wołowej (PEX, Invitrogen nr 13028). Pożywkę zmieniano co 2 – 3 dni. [0114] Po 8 dniach hodowli (4 do 10 dni w zależności od partii komórek), komórki 40 Schwanna osiągały konfluencję i hodowlę, zawierającą dużą ilość zanieczyszczających fi-broblastów, oczyszczono metodą immunopanningu thy1.1. Po tym oczyszczeniu komórki przeprowadzono w stan zawiesiny w pożywce wzrostowej w stężeniu 10 000 komó-rek/cm2 w 75 cm2 kolbach wstępnie powleczonych poli-L-lizyną. Po osiągnięciu konflu-encji komórki wypłukano, poddano trypsynizacji (trypsyna-EDTA), zliczono i wysiano w 45 12-studzienkowych płytkach (100 000 komórek/studzienkę).

Inkubacja z lekami:

[0115] Po wysianiu komórek w 12-studzienkowych płytkach pożywkę zastępiono zdefi-niowaną pożywką zawierającą mieszankę DMEM-F12 (Invitrogen nr 21331020) uzupeł-nioną 1% dodatkiem N2 (Invitrogen nr 17502), 1% L-glutaminą (Invitrogen nr 25030024), 50 2,5% FBS (Sciencell nr 0025), 0,02 µg/ml kortykosteronu (Sigma nr C2505), 4 µM forsko-

16

liną i 50 µg/ml gentamycyny. Do tej pożywki nie dodano czynników wzrostowych. W celu pobudzenia różnicowania SC. 24 godziny później, podłoże zastąpiono określoną pożywką (DMEM-F12) uzupełnioną 1% insuliną-transferryną-selenem - X (ITS, Invitrogen nr 51300), 16 µg/ml putrescyny (Sigma nr P5780), 0,02 µg/ml kortykosteronu i 50 µg/ml gentamycyny. Na tym etapie w pożywce nie było progesteronu ani forskoliny. 5 [0116] Jeden dzień później pierwotne komórki Schwanna pobudzano lekami przez 24 go-dziny (3 studzienki/warunki). Każdy związek przygotowywano bezpośrednio przed jego dodaniem do pożywki hodowlanej dla komórek. [0117] Pilokarpinę (SIGMA) zbadano w pierwotnych komórkach Schwanna w zakresie stężeń 10 µM do 10 nM, natomiast metimazol (SIGMA) zbadano w stężeniach 10 µM, 1 10 µM, 100 nM i 10 nM. [0118] Leki dodawano do zdefiniowanej pożywki składającej się z DMEM-F12 z 1% in-suliną-transferryną-selenem - X (ITS, Invitrogen nr 51300), 16 µg/ml putrescyny, 0,02 µg/ml kortykosteronu, 10 nM progesteronu i 50 µg/ml gentamycyny. Brak forskoliny przed i w trakcie pobudzenia przez lek pozwalał uniknąć wysycenia cyklazy adenylanowej. 15

Hodowane komórki nerwiaka osłonkowego

[0119] Linię szczurzych komórek nerwiaka osłonkowego RT4-D6-P2T (ATCC nr CRL-2468™) rozmrożono w DMEM (ATCC nr 30-2002) i 10% FCS (Invitrogen nr 10106). Komórki utrzymywano w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze w atmosferze powietrza (95%) - CO2 (5%). Po czwartym pasażu komórki rozdzielono drogą trypsyniza-20 cji (+1 ml of trypsyny-EDTA, 0,25% - 0,53 mM; Invitrogen) trwającej 5 do 15 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymano przez dodanie DMEM zawierającego 10% pło-dową surowicę bydlęcą (FBS). Komórki zliczono w cytometrze Neubauera przy użyciu te-stu wykluczenia z błękitem trypanu (Sigma). Zawiesinę roztarto 10 ml pipetą, a następnie komórki odwirowywano przy 350 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Peletę od-25 klejonych komórek ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny i wysiano w liczbie 30 000 komórek/ml w 12-studzienkowych płytkach. 48 godzin później pożywkę zastąpio-no pożywką bez surowicy (DMEM). Po 15 godzinach studzienki RT4-D6P2T pobudzono lekami dodawanymi do pożywki do hodowli komórkowej w wybranym stężeniu. Wszyst-kie poszczególne leki i połączenia leków przygotowywano bezpośrednio przed ich doda-30 niem do pożywki do hodowli komórek.

Ilościowa polimerazowa reakcja łańcuchowa poprzedzona odwrotną transkrypcją (Q-RT-PCR)

[0120] Ilościową RT-PCR użyto do porównania poziomów mRNA PMP22 po pobudzeniu lekiem, w stosunku do mRNA genu konstytutywnego RPS9 w linii komórkowej RT4-D6P2T. [0121] 8 godzin po inkubacji z lekiem komórki wypłukano zimnym, wyjałowionym PBS, 35 z każdej próbki komórek wyekstrahowano całkowite RNA i oczyszczano z SC przy użyciu mikrozestawu Qiagen RNeasy (Qiagen nr 74004). Kwasy nukleinowe oznaczono przy użyciu spektrofotometru Nanodrop z użyciem 1 µl próbki RNA. Integralność RNA okre-ślono przy użyciu analizatora BioAnalyzer (Agilent). [0122] RNA poddano odwróconej transkrypcji w cDNA, zgodnie ze standardowym proto-40 kołem. Matryce cDNA do amplifikacji PCR zsyntetyzowano z 100 ng całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy SuperScript II (Invitrogen nr 18064-014) przez 60 minut w temperaturze 42°C, w obecności oligo(dT), w końcowej objętości 20 µl. [0123] cDNA poddano amplifikacji PCR przy użyciu systemu «LightCycler® 480» (Ro-che Molecular Systems Inc.). Każde cDNA rozcieńczono pięciokrotnie przed jego użyciem 45 do amplifikacji PCR. 2 µl tego cDNA wprowadzono do roztworu reakcyjnego PCR z 5 µl zestawu Master mix (Roche nr 04-887301001) w końcowej objętości 10 µl. We wstępnych doświadczeniach stwierdzono, że oznaczenie wykonano w fazie wykładniczej procesu am-plifikacji, gdyż obie sekwencje i wydajność reakcji były podobne dla genów docelowych i konstytutywnych. 50

17

[0124] Do wykonania analizy RT-Q-PCR posłużono się technologią Taqman. Reakcję PCR wykonano przez amplifikację szczurzego PMP22 (NM_017037) przy użyciu 500 nM każdego startera (F i R) i 200 nM sondy Taq1, Sigma-Aldrich. [0125] Stosowano następujące warunki PCR: denaturacja 5 minut w temperaturze 95°C, a następnie 10 s w temperaturze 95°C, 40 s w temperaturze 60°C i 10 s w temperaturze 72°C 5 oraz 1 minutę w temperaturze 40°C (czterdzieści cykli amplifikacji). Względny poziom ekspresji genu PMP22 mierzono zgodnie z metodą � Ct, porównując ilość produktów utworzonych z docelowego genu PMP22 i analizę ekspresji PMP22 metodą cytometrii przepływowej (FACS) 8 godzin, 24 godziny i 48 godzin po inkubacji z lekami, supernatan-ty pierwotnych szczurzych komórek Schwanna pobrano, odwirowano i zamrożono. SC od-10 klejono trypsyną-EDTA. Po przejściu większości komórek w stan zawiesiny, trypsynę zneutralizowano przy użyciu DMEM z 10% FCS. [0126] Supernatanty z komórkami pobrano i odwirowano. Osady komórek przeniesiono do mikroprobówek, wypłukano w PBS jeden raz i utrwalono w swoistym roztworze (Ab-Cys nr odczynnika A BUF09B). 10 minut później komórki wypłukano w PBS jeden raz i 15 przechowywano w temperaturze 4°C. [0127] Pięć dni po utrwaleniu wszystkie preparaty komórek z różnymi czasami inkubacji znakowano przy użyciu następującego protokołu. [0128] Komórki odwirowywano przy 7000 obr./min przez 5 minut i osady przeprowadzo-no w stan zawiesiny w roztworze permeabilizującym (AbCys nr odczynnika B BUF09B) i 20 znakowano przeciwciałem pierwszorzędowym przeciw PMP22 (Abcam nr ab61220, 1/50) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie komórki odwirowywano przy 7000 obr./min przez 5 minut i osady wypłukano w PBS jeden raz. Dodano przeciwciało drugo-rzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 (kozie przeciwciało przeciw króliczej IgG, Molecu-lar Probes nr A11008, 1/100), na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie ko-25 mórki odwirowywano przy 7000 obr./min przez 5 minut i osady wypłukano w PBS jeden raz. Znakowanie zwiększano dodając przeciwciało trzeciorzędowe sprzężone z Alexa Flu-or 488 (kurze przeciwciało przeciw króliczej IgG, Molecular Probes nr A21467, 1/100) i inkubowano przez jedną godzinę, w temperaturze pokojowej. Komórki wypłukano w PBS jeden raz. Wykonano kontrolę, bez żadnego przeciwciała (komórki nieznakowane) w celu 30 określenia poziomu autofluorescencji i dostosowano czułość fotopowielaczy. Wykonano kontrolę z przeciwciałem drugorzędowym i trzeciorzędowym, ale bez przeciwciała pierw-szorzędowego w celu oceny wiązania nieswoistego przeciwciał. [0129] Dane zebrano i zanalizowano z użyciem cytometru FACS Array i oprogramowania FACS Array (Becton Dickinson) z 5000 komórek. Analizowano rozproszenie w przód 35 (FSC) skorelowane z objętością (wielkością) komórek i rozproszenie boczne (SSC) zależą-ce od wewnętrznej złożoności (ziarnistości) komórek. Do celów pomiaru ekspresji PMP22, analizę przeprowadzano dla wszystkich komórek i obliczono odsetek dodatnich komórek. Dodatnimi komórkami były te komórki, w których natężenie fluorescencji było wyższe niż w kontroli z przeciwciałem drugorzędowym. 40 [0130] W celu określenia liczby SC, komórki w pożywce kontrolnej analizowano przy użyciu przeciwciał przeciw białku S100. [0131] Komórki preparowano według następującego protokołu: komórki Schwanna wy-barwiono przeciwciałem przeciw białku S100 (Dako nr S0311, 1/100) przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. To przeciwciało znakowano zgodnie z protokołem opisanym 45 wyżej dla barwienia immunologicznego PMP22, ale bez inkubacji z przeciwciałem trze-ciorzędowym.

Wyniki

[0132] Stwierdziliśmy, że poziomy mRNA PMP22 (Fig. 1) były istotnie niższe w pier-wotnych komórkach Schwanna, i że dawka 1 µM pilokarpiny wywoływała najsilniejszą 50 regulację w dół PMP22. *: p<0,05; ***: p<0,001; istotna różnica w porównaniu z kontrolą

18

(sparowany test t-Studenta). Na prawym panelu, po 24-godzinnej ekspozycji na pilokarpi-nę, poziom ekspresji mRNA PMP22 w pierwotnych komórkach Schwanna uległ istotnej regulacji w dół nawet przy niskich dawkach (10 nM i 50 nM) pilokarpiny. Podobnie stwierdziliśmy, że pilokarpina (1 µM) istotnie, o 38%, zmniejszała poziom ekspresji białka PMP22 po 24-godzinnej inkubacji w pierwotnych komórkach Schwanna. Ten efekt był w 5 dalszym ciągu istotny po upływie 48 godzin inkubacji (-18%, p<0,001). [0133] W innym doświadczeniu, leki (podane w Tabeli 1) były inkubowane przez 8 go-dzin z linią komórkową szczurzego nerwiaka osłonkowego i oznaczono poziom ekspresji mRNA PMP22 metodą RT-Q-PCR. [0134] Wynalazcy stwierdzili (Fig. 2), że o ile metimazol (0,1 nM) i pilokarpina (0,001 10 nM) stosowane jako oddzielne leki nie wywierały istotnego wpływu na poziom ekspresji mRNA PMP22, ulegał on istotnemu zmniejszeniu pod wpływem ich połączenia. Na Figu-rze 2 przedstawiono ich synergistyczne działanie. Te dane przedstawiają, że w wybranych stężeniach połączenie pilokarpiny i metimazolu może istotnie regulować w dół ekspresję genu PMP22 w hodowli komórek nerwiaka osłonkowego, natomiast pilokarpina i metima-15 zol, wykazujące aktywność w wyższych stężeniach w pierwotnych komórkach Schwanna, nie zmniejszają poziomu ekspresji tego genu w tym układzie.

II. Doświadczenia in vivo w modelu zwierzęcym CMT

[0135] Wynalazcy zbadali związki i połączenia w kierunku ich działania terapeutycznego w szczurzym modelu transgenicznym CMT, u hemizygotycznych szczurów transgenicz-20 nych pod względem PMP22, mających trzy dodatkowe kopie mysiego genu PMP22 i wy-kazujących oznaki demielinizacji w nerwach obwodowych i czaszkowych (Sereda i in., 1996; Grandis i in., 2004). Poziom mRNA wskazujący na średnio 1,6-krotną nadekspresję PMP22 u szczurów z CMT korelował z fenotypem klinicznym. Domniemany poziom pro-gowy nadekspresji PMP22, przy którym gen typu dzikiego zmienia się na gen chorobowy 25 stanowi oczywisty „cel” dla leczenia ukierunkowanego na zmniejszenie ekspresji genu PMP22. [0136] Ten model szczurzy CMT z klinicznego punktu widzenia stanowi dobre przybliże-nie ludzkiej choroby CMT1A. Dorosłe szczury z CMT wykazują spowolnienie szybkości przewodzenia w nerwach ruchowych, którego wartości są zbliżone do stwierdzanych u pa-30 cjentów z CMT1A, tj. poniżej 50%. Po stymulacji nerwu kulszowego, złożone mięśniowe potencjały czynnościowe wykazywały zmniejszone amplitudy i desynchronizację. Zmiany histologiczne i elektrofizjologiczne poprzedzają wystąpienie jawnych oznak klinicznych upośledzenia ruchowego (Sereda i in., 1996, 2003). Utrata aksonów, potwierdzona znacz-nym zanikiem mięśni w badaniu histologicznym, zgadza się z objawami CMT1A u ludzi. 35 Szczury z CMT służyły już jako model doświadczalnej terapii CMT1A (Meyer zu Hörste i in. 2007). W tym modelu choroby CMT1A, jawne i ukryte oznaki patologii (deficyty lo-komotoryczne, szczególne zmiany charakterystyki elektrofizjologicznej i tkankowej i osta-tecznie poziom nadekspresji PMP22 wydają się najbardziej zbliżone do stwierdzanych u pacjentów z CMT1A). 40 [0137] Wynalazcy badali związki i połączenia w kierunku ich działania terapeutycznego w modelu szczurzym. Grupy doświadczalne tworzyły młode szczury, każda płeć oddziel-nie. Szczury przydzielano do grup zgodnie ze schematem randomizacji opierającym się na masie ciała. W niektórych doświadczeniach randomizację opierano na sprawności szczu-rów w teście pręta. Dla obu płci stosowano oddzielne grupy kontrolne z tego samego mio-45 tu, o liczebności równej lub większej niż w grupach leczonych. [0138] Szczurom przewlekle podawano leki – karmiąc je przymusowo lub wstrzykując podskórną pompą osmotyczną Alzet (DURECT Corporation Cupertino, CA), w zależności od dostępności biologicznej danego leku, przez 3 lub 6 tygodni. [0139] Zwierzęta ważono dwa razy w tygodniu w celu dostosowania dawek do rosnącej 50 masy ciała. Jeśli do podawania leczenia wybierano pompę osmotyczną, dawki leków obli-

19

czano na podstawie szacunkowej średniej masy ciała zwierząt przewidywanej na podsta-wie ich wieku, w okresie stosowania pompy (6 tygodni). W razie potrzeby pompy wszcze-piano powtórnie, stosując odpowiedni protokół znieczulenia.

Testy behawioralne

[0140] Co trzy lub cztery tygodnie u zwierząt wykonywano test behawioralny. Każdy test 5 był wykonywany przez tego samego badacza, w tym samym pomieszczeniu i o tej samej godzinie każdego dnia; ten jednorodny schemat stosowano przez cały czas trwania do-świadczenia. Badacz nie znał przydziału zwierząt do grup leczniczych ani ich genotypu. Do oceny sprawności zwierząt w trakcie badania stosowano głównie „test pręta” i „siłę uchwytu”. Harmonogram testu pręta mógł być zmieniany w miarę wzrostu zwierzęcia (aby 10 uniknąć błędu systematycznego związanego na przykład z uczeniem się zwierzęcia). Oce-na siły uchwytu pozwala na wykrycie subtelnych różnic w sprawności uchwytu, który, jak się wydaje, zależy od siły mięśni, stanu czułości (na przykład, bolesne doznania dotykowe mogą zmieniać zmierzone wartości siły), składnika behawioralnego („motywacji”). Te wartości są różne dla kończyn przednich i tylnych, i silnie zależą od wieku zwierzęcia. 15 [0141] Test siły uchwytu mierzy siłę, z jaką zwierzę trzyma się rączki oddzielnie łapami przednimi i tylnymi. Do pomiaru siły uchwytu stosuje się dynamometr z rączką (Force Gauge FG-5000A). Szczur jest trzymany przez eksperymentatora w taki sposób, żeby chwytał rączkę łapami przednimi lub łapami tylnymi i delikatnie pociąga szczura do tyłu do czasu, gdy szczur puści rączkę dynamometru. Rejestrowana jest siła zmierzona w mo-20 mencie puszczenia rączki przez zwierzę. [0142] Do obliczeń stosowano dwie kolejne próby, w których mierzono siłę uchwytu łap przednich, i dwie kolejne próby, w których mierzono siłę uchwytu łap tylnych; rejestrowano wyłącznie maksymalną punktację (jedną dla łap przednich i jedną dla łap tylnych) (w N).

Test pręta 25

[0143] Test pręta ocenia zdolność szczura do trzymania się umocowanego pręta. Szczury Pmp22, które cechuje osłabienie mięśni, wykazują w tym teście deficyty sprawności (Se-reda i in, 1996). Szczura umieszczano na czterech łapach na środku pręta (o średnicy 2,5 cm; o długości 50 cm; 30 cm nad stołem). Próby wykonano jedna po drugiej; liczba (5 lub 10) i czas trwania (30 lub 60 s) prób w ramach naszego doświadczenia zależała od partii 30 zwierząt. Tę zmienność w testach wprowadzono w celu określenia harmonogramu najle-piej dostosowanego do deficytów ruchowych u szczurów z CMT w trakcie doświadcze-nia. [0144] W trakcie każdej sesji rejestrowano wskaźniki sprawności:

- Liczbę prób koniecznych do utrzymania się na pręcie przez 60 s lub 30 s. 35 - Średni czas spędzony na pręcie (tj. czas do spadnięcia) w każdej próbie i średnią dla

danej sesji. Zgodnie z procedurą doświadczalną, sesja kończyła się po tym, jak szczur przebywał na pręcie dwukrotnie przez graniczny czas, tj. 30 lub 60 s. Nieukończonym próbom przypisywano czas graniczny (30 s lub 60 s).

- Liczba spadnięć. 40

Ocena ogólnego stanu zdrowia

[0145] W trakcie doświadczenia monitorowano masę ciała, widoczne oznaki (wygląd fu-tra, pozycję ciała, drżenie) u zwierząt. Do rejestracji tych parametrów posługiwano się ska-lą ocen: 0 = prawidłowy, 1 = nieprawidłowy.

Chód 45

[0146] Każdego szczura obserwowano przez pięć minut w nowej klatce dla szczurów (o wymiarach 55 x 33 x 18 cm) bez innych osobników. Oceniono chód szczurów przy użyciu 4 parametrów:

20

- 0 punktów: chód prawidłowy (płynny) - 1 punkt: chód nieprawidłowy (niepłynny lub szczur lekko utyka) - 2 punkty: umiarkowana niepełnosprawność (szczur powłóczy jedną kończyną, ale jest

w stanie ją wyprostować i chodzić) - 3 punkty: poważna niepełnosprawność (szczur powłóczy jedną lub obiema kończyna-5

mi tylnymi i nie jest w stanie jej/ich wyprostować).

Test na płaszczyźnie pochyłej

[0147] Urządzenie ślizgowe miało płaszczyznę pleksiglasową o wymiarach 30 x 50 cm, którą można pochylać pod kątem od 0° (ustawienie poziome) do 60°. Początkowo każdego szczura umieszczano na płaszczyźnie pochylonej pod kątem 25° z głową ustawioną wyżej 10 (ustawienie z głową ustawioną wyżej); przeprowadzono dwie próby w odstępie 1 minuty. 30 minut później wykonano to samo doświadczenie z płaszczyzną pochyloną pod kątem 35°, a następnie na płaszczyźnie pochylonej pod kątem 40°. Wtedy szczura wkładano z powrotem do klatki. Po każdej próbie płaszczyznę czyszczono. [0148] Sprawność szczurów oceniono przy użyciu 4-punktowej klasyfikacji: 15

- 0 punktów: brak ześlizgiwania się - 1 punkt: niewielkie ześlizgiwanie się (jedna lub dwie łapy) - 2 punkty: umiarkowane ześlizgiwanie się (4 łapy), ale nie do końca płaszczyzny - 3 punkty: szczur ześlizguje się do samego końca płaszczyzny.

Elektrofizjologia 20

[0149] W odpowiednich przypadkach szczury poddano ocenie elektrofizjologicznej: mie-rzono szybkość przewodzenia w czułym nerwie oraz latencję i amplitudę potencjałów. [0150] Pomiar NCV i rejestrację potencjałów (podskórną) przeprowadzono z użyciem ze-stawu składającego się ze wzmacniacza (AM System 1700 i/lub EMG-UTC), stymulatora (Havard apparatus 223) i komputera wyposażonego w kartę rejestrującą i oprogramowanie 25 do rejestracji (SPATOL) i do obróbki sygnału (CALVISE). Zwierzęta znieczulono keta-miną/ksylazyną i w trakcie testu utrzymywano na termostatowanej płytce temperaturze 37°C (leki znieczulające podawano w razie potrzeby). W bliższą część ogona wprowadzo-no stymulacyjne srebrne elektrody igłowe. Elektrodę rejestracyjną wprowadzono podskór-nie, około 1 mm pod skórę dalszej części ogona (4 i 6 cm od elektrody stymulacyjnej). 30 Stosowano stymulację prądem stałym, fale kwadratowe, o czasie trwania 0,2 s, z częstotli-wością 0,3 na sekundę. Odpowiedzi, wzmocnione 5 000 – 20 000-krotnie były wyświetla-ne i zbierane w komputerowym systemie rejestracji danych. Latencję mierzono od począt-ku każdej fali (definiowaną jako pierwsze wyraźne odchylenie od linii podstawowej). Do określenia maksymalnej amplitudy obliczano szczytowe amplitudy największego odchyle-35 nia. W każdej rejestracji wykonywano pomiary uśrednionych odpowiedzi na co najmniej dziesięć identycznych bodźców. Szybkość przewodnictwa czuciowego (SNCV) obliczano, dzieląc odległość między katodami stymulacyjnymi przez różnice między odpowiednimi latencjami uzyskanymi z dwóch miejsc stymulacji.

Pomiary histologiczne 40

[0151] Po wykonaniu ostatnich testów (leczenie stosowano do ostatniego dnia), szczury uśmiercono. Odcięto tylne stopy szczurów typu dzikiego i transgenicznych, i utrwalono, zanurzając w 4% roztworze formolu na 48 godzin, a następnie przeniesiono do 10% roz-tworu formolu na 2 dodatkowe dni. Po wypłukaniu przez 15 minut w wodzie poddano je obróbce w celu ich odwapnienia przez 26 godzin (Labonord Décalcifiant rapide n°3 nr 45 DC3 _09128300). [0152] Stopy rozcięto poprzecznie na dwa kawałki i poddano obróbce do barwienia osmem. [0153] Tkanki zawieszano nad 1% roztworem czterotlenku osmu (VWR, tlenek osmu VIII 0,5 g nr 20551.076) na 24 godziny, a następnie płukano wodą demineralizowaną przez 4

21

do 6 godzin. Następnie tkanki odwodniono w automacie do zatapiania (VIP2000 Vertical, Bayer Diagnostics) i klasycznie zatopiono w parafinie. [0154] Skrawki tkankowe o grubości 4 µm odwodniono w kolejnych kąpielach w ksylenie i alkoholu, i zamocowano (klej Pertex, nr T/00811_MICROM) do dalszej analizy.

Analiza obrazów 5

[0155] Skrawki pobrane od 6 zwierząt skrupulatnie wybierano w celu zobrazowania tego samego poziomu anatomicznego (połączenia palca) i analizowano pod mikroskopem Olympus sprzęgniętym z oprogramowaniem Saisam microvision (Archimed Pro® 1997-2000 by Microvision Instruments). Zlokalizowano i analizowano nerw obwodowy w na-stępujący sposób: liczono okrężnie mielinowane włókna (w pęczku nerwowym co naj-10 mniej 150 włókien/zwierzę). Określano cylindryczno-osiowe średnice odpowiadające średnicy wewnętrznej włókien mielinowych i zewnętrzną średnicę tych włókien. Następnie porównaliśmy rozkład grubości mieliny i średnic aksonów u zwierząt typu dzikiego i transgenicznych. [0156] Ponadto zmierzyliśmy gęstość optyczną tego samego przekroju nerwu w celu okre-15 ślenia czy zawartość włókien niezmielinizowanych (niewidocznych w skrawkach barwio-nych osmem, w związku z czym nie analizowanych) była wyższa u zwierząt transgenicz-nych (co przejawiało się ogólnie bladym wyglądem przekroju nerwu). [0157] Na koniec wszystkie mięśnie stopy występujące w tym samym skrawku, który używano do analizy nerwów, ręcznie obrysowywano w celu określenia całkowitej po-20 wierzchni mięśni. Następnie obliczyliśmy stosunek „zawartość mięśni/pole powierzchni przekroju”. [0158] Nerwy kulszowe wycięto i zważono, i użyto je w oznaczeniach biologii moleku-larnej i/lub biochemicznych (RT-Q-PCR do mRNA PMP22 i Western blot do oznaczenia ilościowego białek mieliny; testy EIA Cayman – do wskaźników biochemicznych, takich 25 jak metabolity kwasu arachidonowego, HPLC do oznaczenia ilościowego steroidów i amin, ELISA do CNTF, IL-6 itd.) wykonanych zgodnie z ogólnie stosowanymi protoko-łami i do procedur analitycznych (pomiary stężenia leków). [0159] Mięśnie kończyn tylnych (płaszczkowate) pobrano, zważono, zamrożono natych-miast i przechowywano w temperaturze - 80°C do czasu ich analizy (takiej samej, jak ner-30 wów kulszowych).

Wyniki

[0160] Metimazol (dawka dobowa 0,35 mg/kg) i pilokarpina (dawka dobowa 0,2 mg/kg), podawane przez przymusowe karmienie, poprawiały wyniki w teście pręta w trakcie pro-cedury leczenia (Fig. 3), natomiast związek PXT25 (przedstawiono w opisie wyłącznie do 35 celów porównania) prawie nie prowadził do jakiejkolwiek poprawy. [0161] Szczury TG z CMT otrzymujące placebo miały średnio 3-krotnie gorszą sprawność ruchową od szczurów typu dzikiego (WT). Leczenie metimazolem i pilokarpiną prowadzi-ło do poprawy u zwierząt TG w tym doświadczeniu, a efekt stał się istotny statystycznie już po 8 tygodniach przymusowego podawania. Dane pokazują, że szczury z CMT leczone 40 metimazolem i pilokarpiną w takich względnie dużych dawkach osiągnęły istotnie wyższą sprawność od grupy placebo. Grupa leczona pilokarpiną nawet odzyskała poziom spraw-ności, który nie różnił się istotnie od sprawności w grupie WT placebo. [0162] Stwierdzono, że SNAP mierzony w dalszej części ogona był istotnie zmniejszony w grupie TG placebo, co może odzwierciedlać istotną utratę aksonów spowodowaną z ko-45 lei demielinizacją. Okazało się, że ten parametr elektrofizjologiczny uległ istotnej popra-wie po leczeniu związkiem A (Fig. 4), natomiast SNAP u szczurów transgenicznych le-czonych związkiem B zbliżył się do nominalnego 5% progu istotności. [0163] Ta obserwacja pozwoliła nam przypuszczać, że metimazol może zapobiec utracie aksonów, nawet jeśli nie dojdzie do mierzalnej poprawy stanu mielinizacji nerwów obwo-50

22

dowych. Wydaje się, że wpływ pilokarpiny jest zasadniczo taki sam, nawet jeśli ze wzglę-du na zmienność wewnątrzgrupową, różnica w stosunku do grupy placebo nie osiągnęła istotności statystycznej. W CMT1A amplituda SNAP (potencjału czynnościowego nerwu czuciowego) była bardziej zmniejszona, a czas trwania SNAP bardziej wydłużony niż w CMT2. Zmniejszenie amplitud złożonego mięśniowego potencjału czynnościowego i 5 SNAP w CMT1A jest prawdopodobnie łącznym wynikiem demielinizacji i zaburzeń czyn-ności aksonów (Bienfait i in., 2006). [0164] Na zakończenie badania wykonano analizę morfometryczną. Pomiar tkanek koń-czyny tylnej wykazał, że doszło do istotnego zmniejszenia nerwów kulszowych i mięśni płaszczkowatych u samic szczurów CMT otrzymujących placebo w porównaniu z kontrol-10 nymi szczurami WT (Fig. 5). [0165] Wydaje się, że leczenie związkiem A prowadziło do całkowitego skorygowania tych deficytów: bezwzględna masa mięśni i nerwów była nawet wyższa niż u kontrolnych szczurów WT, a całkowita masa ciała wykazywała raczej spadek w grupie związku A, w porównaniu z grupą placebo (danych nie przedstawiono). Wpływ leczenia pilokarpiną na 15 mięśnie i nerwy kończyny tylnej wydawał się mniejszy od wpływu metimazolu. [0166] Mieszanka 1 (Tabela 1) zawierająca 50-krotnie mniejsze dawki metimazolu (4 mg/kg) i pilokarpiny (7 mg/kg) prowadziła do poprawy punktacji chodu u samic szczurów po 10 tygodniach przymusowego podawania, co przedstawiono na Figurze 6. Stwierdzili-śmy pozytywny trend po 6 tygodniach leczenia. 20 [0167] Na poniższych Figurach przedstawiono korzystny wpływ mieszanki 2 (Tabela 2) zawierającej pilokarpinę (7 mg/kg); metimazol (4 mg/kg), miferpriston (40 mg/kg), nal-trekson (4 mg/kg), baklofen (60 mg/kg) i sorbitol (2 mg/kg) na samce szczurów w 3 róż-nych testach behawioralnych i elektrofizjologicznych. [0168] Figura 7 ujawnia, że Mieszanka 2 w stosowanych dawkach zmniejsza wzrost progu 25 pobudliwości, stwierdzany u szczurów CMT placebo, po stymulacji elektrycznej nerwu ogonowego. Figura 8 przedstawia korzystny wpływ Mieszanki 2 na sprawność samców w teście pręta; po 4 tygodniach leczenia liczba spadnięć uległa zmniejszeniu, a czas pobytu na pręcie uległ wydłużeniu. [0169] Figura ilustruje fakt, że Mieszanka 2 poprawia także sprawność chodu u samców 30 szczurów po 3 tygodniach leczenia; odsetek szczurów chodzących płynnie uległ zwiększe-niu o 35% w grupie leczonych szczurów w porównaniu ze szczurami CMT placebo. [0170] Podobne wyniki uzyskano w przypadku innych połączeń. W Tabeli 1 przedstawio-no podsumowanie wyników.

23

Tabela 1 POS: cofnięcie objawów choroby in vivo

Efekt in vivo POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS POS

połączenie miesz. 1

miesz. 2

miesz. 3

miesz. 4

miesz. 5

miesz. 6

miesz. 7

miesz. 8

miesz. 9

miesz. 10

miesz. 11

miesz. 12

miesz. 13

miesz. 14

miesz. 15

miesz. 16

miesz. 17

miesz. 18

mifepriston * * * * * * * * *

pilokarpina * * * * * * * * * * * * * * * * *

metimazol * * * * * * * * * * * * * * * * *

sorbitol * * * * * * * * *

naltrekson * * *

baklofen * * * *

rapamycyna * * * *

ketoprofen * *

flurbiprofen * *

cewimelina *

propylotio-uracyl

*

24

[0171] Te dane pokazują, że w warunkach in vivo połączenia i schematy według niniej-szego wynalazku mogą zapewnić skuteczne leczenie CMT.

III. Wpływ in vivo w modelu neuropatii toksycznej

[0172] Leczenie farmakologiczne lub schematy podawano doustnie od dnia poprzedzają-cego pierwsze dootrzewnowe wstrzyknięcie oksaliplatyny w dawce 3 mg/kg (D -1) do dnia 5 przed dniem ostatniego badania (D16). Zwierzętom z grupy otrzymującej oksaliplatynę codziennie podawano wodę destylowaną (10 ml/kg). Zwierzętom podawano sprawdzane leczenie i wodę destylowaną codziennie rano, natomiast oksaliplatynę podawano po połu-dniu. [0173] W dniach badania (tj. D1, D4, D10), leczenie i wodę destylowaną podawano po 10 wykonaniu testu. W dniu badania (D4), w którym podawano związki i podłoże oraz wstrzyknięcie oksaliplatyny, leczenie i wodę destylowaną podawano przed wstrzyknięciem oksaliplatyny po wykonaniu testu. Zwierzęta z grupy otrzymującej leczenie referencyjne otrzymywały odpowiednie związki tylko w dniach badania (tj. D1, D4, D10 i D17). Allo-dynię wyzwalaną przez zimno oceniano mierząc odpowiedzi na stymulację cieplną nie 15 wyzwalającą bólu (test z acetonem) w D1 (mniej więcej 24 godziny po pierwszym wstrzyknięciu oksaliplatyny w dawce 3 mg/kg (natychmiastowy efekt oksaliplatyny), w D4, D10 i (przewlekły efekt oksaliplatyny), w D17 (resztkowy efekt oksaliplatyny jeden tydzień po zakończeniu leczenia). [0174] Badanie wykonywano przy użyciu testu z acetonem, 2 godziny po podaniu związ-20 ku referencyjnego. [0175] Substancją referencyjną była gabapentyna, podawana w dawce 100 mg/kg, doust-nie (raz na dobę x 4 dni badania).

Test z acetonem

[0176] Allodynię wyzwalaną przez zimno oceniono przy użyciu testu z acetonem. W tym 25 teście zmierzono latencję wycofania tylnej łapy po podaniu kropli acetonu na powierzchnię dłoniową obu łap tylnych (czas reakcji) i oceniano nasilenie odpowiedzi (punktacja reakcji na zimno). [0177] Czas reakcji na chłodzące działanie acetonu mierzono w ciągu 20 s (czas odcięcia) po podaniu acetonu. Odpowiedzi na aceton także oceniano według następującej 4-punkto-30 wej skali: 0 (brak odpowiedzi); 1 (szybkie wycofanie, szarpnięcie łapy); 2 (długotrwałe wycofywanie lub znaczne szarpnięcie łapy); 3 (wielokrotne szarpnięcie łapy z jej lizaniem lub gryzieniem). [0178] Przeprowadzano sześć prób u każdego szczura. W każdej grupie doświadczalnej wyniki wyrażono w postaci łącznej punktacji reakcji na zimno, definiowanej jako suma 6 35

punktacji u każdego szczura ± SEM. Minimalna punktacja wynosiła 0 (brak odpowiedzi w żadnej z 6 prób), a maksymalna możliwa punktacja wynosiła 18 (wielokrotne szarpnięcie i lizanie lub gryzienie łapy w trakcie każdej z sześciu prób). Gabapentyna: źródło: Zhejiang Chiral Medicine Chemicals, Chiny. Oksaliplatyna: źródło: Sigma, Francja 40

Wyniki

[0179] Na Figurze 10 przedstawiono wyniki badania mieszanki 2 w modelu z oksaliplaty-ną. Wyraźnie widać, że mieszanka 2 chroni zwierzęta przed neuropatią wywołaną poda-waniem toksycznego leku.

IV. Wpływ in vivo w modelu ALS 45

Model zwierzęcy

[0180] Wybraliśmy model szczura SOD1G93A (opracowany przez Howland DS i in, 2002), aby naśladować patologię stwardnienia zanikowego bocznego. W tym modelu występuje

25

nadekspresja zmutowanego genu SOD1 w rdzeniu kręgowym, wielu regionach mózgu, jak również w tkankach obwodowych (Howland DS i in, 2002). Choroba neuronu ruchowego w tym modelu zaczyna się w wieku około 115 dni (Howland DS i in, 2002); objawia się nieprawidłowym ruchem kończyn tylnych w trakcie chodu. Po kilku dniach dochodzi do porażenia kończyn tylnych. 5

Procedury doświadczalne

[0181] Uzyskaliśmy kolonie krzyżując rozpłodowe szczury SOD1G93A z samicami szczu-rów Sprague Dawley. Heterozygotyczne szczury SOD1G93A zidentyfikowano przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla DNA pobranego z ogona, przy użyciu starterów swoistych dla hSOD1 (Howland DS i in., 2002). Zwierzęta utrzymywano w pomieszczeniu 10 z kontrolowanym oświetleniem (światło zapalone w godzinach 05:00 – 19:00) i temperatu-rą (23±1°C), zapewniając im swobodny dostęp do karmy i wody. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt wykonane w niniejszym badaniu przeprowadzono zgodnie z wytycz-nymi określającymi standardy opieki nad zwierzętami. [0182] Pomiary masy ciała wykonywano co tydzień, a testy behawioralne rozpoczęto w 15 wieku 60 dni i kontynuowano je do punktu końcowego. Leczenie podawano codziennie, doustnie lub podskórnie, od wieku 5 tygodni.

Test obserwacyjny: scharakteryzowanie ogólnego wyglądu

[0183] Każdego szczura obserwowano przez pięć minut w nowej klatce dla szczurów (o wymiarach 55 x 33 x 18 cm), bez innych osobników. Rejestrowano 5 różnych parametrów: 20

Chód

[0184]

- 0 punktów: chód prawidłowy (płynny) - 1 punkt: chód nieprawidłowy (niepłynny lub szczur lekko utyka) - 2 punkty: umiarkowana niepełnosprawność (szczur powłóczy jedną kończyną, ale jest 25

w stanie ją wyprostować i chodzić) - 3 punkty: poważna niepełnosprawność (szczur powłóczy jedną lub obiema kończyna-

mi tylnymi i nie jest w stanie jej/ich wyprostować).

Wygląd futra

[0185] 30

- 0 punktów: czyste i gładkie futro - 1 punkt: nastroszone włosy lub brudne futro

Drżenie

[0186]

- 0 punktów: brak drżenia 35 - 1 punkt: drżenie

Ułożenie ciała

[0187]

- 0 punktów: prawidłowe - 1 punkt: nieprawidłowe (spłaszczenie lub wygięcie grzbietu) 40

Ustawienie tylnych łap

[0188]

- 0 punktów: prawidłowe - 1 punkt: rozstawione łapy tylne

26

Punktacja w teście ruchowym: scharakteryzowanie deficytów ruchowych

[0189] Ten test ocenia zdolność szczurów do podnoszenia się w ciągu 30 s od ich prze-wrócenia na jeden z boków (odruch prostowania się) (Gale K. i in, 1985). [0190] Zgodnie z poniższymi kryteriami zastosowano nieparametryczny system oceny (Matsumoto A. i in, 2006; Thonhoff JR i in, 2007): 5

- 0 punktów: szczur nie jest w stanie podnieść się z żadnego z boków w ciągu 30 s; - 1 punkt: szczur nie jest w stanie podnieść się tylko z jednego z boków w ciągu 30 s; - 2 punkty: szczur jest w stanie podnieść się z obu boków w ciągu 30 s, ale nie jest w

stanie stać w klatce; zawsze wlecze za sobą jakąś część ciała; - 3 punkty: szczur jest w stanie podnieść się z obu boków w ciągu 30 s, nie jest w stanie 10

stać w klatce; ale nie wlecze za sobą części ciała; - 4 punkty: szczur jest w stanie podnieść się z obu boków w ciągu 30 s, jest w stanie

stać w klatce, ale wykazuje widoczne deficyty czynnościowe; - 5 punktów: szczur jest w stanie podnieść się z obu boków w ciągu 30 s, jest w stanie

stać w klatce i nie wykazuje widocznych deficytów czynnościowych. 15

[0191] Punktem końcowym choroby była ustalona punktacja 0, wtedy szczura uśmiercano.

Test na płaszczyźnie pochyłej

[0192] Urządzenie ślizgowe miało płaszczyznę pleksiglasową o wymiarach 30 x 50 cm, którą można pochylać pod kątem od 0° (ustawienie poziome) do 60°. Początkowo każdego szczura umieszczano na płaszczyźnie pochylonej pod kątem 25° z głową ustawioną wyżej 20 (ustawienie z głową ustawioną wyżej); przeprowadzono dwie próby w odstępie 1 minuty. 30 minut później wykonano to samo doświadczenie z płaszczyzną pochyloną pod kątem 35°, a następnie na płaszczyźnie pochylonej pod kątem 40°. Wtedy szczura wkładano z powrotem do klatki. Po każdej próbie płaszczyznę czyszczono. [0193] Sprawność szczurów oceniano przy użyciu 4-punktowej klasyfikacji: 25

- 0 punktów: brak ześlizgiwania się - 1 punkt: niewielkie ześlizgiwanie się (jedna lub dwie łapy) - 2 punkty: umiarkowane ześlizgiwanie się (4 łapy), ale nie do końca płaszczyzny - 3 punkty: szczur ześlizguje się do samego końca płaszczyzny.

Test z drucianą siatką: scharakteryzowanie sprawności ruchowej w trudnej sytuacji 30

[0194] Drucianą siatkę umieszczano tak, aby jej górna część stykała się z pudełkiem (pod kątem 70°), a dolna z krawędzią stołu (Thonhoff JR i in, 2007). Każdego szczura umiesz-czano na dole drucianej siatki i motywowano do wspinania się przez umieszczenie zwierząt z miotu w pudełku na jej szczycie. Każdego szczura trenowano raz w tygodniu (3 próby). [0195] Rejestrowanym parametrem był czas latencji dotarcia do szczytu drucianej siatki. 35

Test otwartego pola: scharakteryzowanie aktywności lokomotorycznej

[0196] Aktywność lokomotoryczną mierzono w pudełku pleksiglasowym (45 x 45 x 30 cm, Acti-Track BIOSEB, Lyon, Francja) wyposażonym w 16 fotokomórek w dwóch rzę-dach, 1 i 5 cm nad podłogą. [0197] Aktywność spontaniczną i zwiadowczą każdego szczura oceniano przez 3 godziny. 40 Rejestrowano 4 parametry (całkowitą przebytą odległość, liczbę stanięć na tylnych łapach, odsetek przebytej odległości i czas spędzony w środku otwartego pola).

Bibliografia

[0198]

Amici SA, Dunn WA Jr, Murphy AJ, Adams NC, Gale NW, Valenzuela DM, Yanco-45 poulos GD, Notterpek L. Peripheral myelin protein 22 is in complex with alpha6beta4

27

integrin, and its absence alters the Schwann cell basal lamina. J Neurosci. 2006; 26(4):1179-1189. Amici SA, Dunn WA Jr, Notterpek L. Developmental abnormalities in the nerves of peripheral myelin protein 22-deficient mice. J Neur Res. 2007; 85(2):238-249. Anger T, Klintworth N, Stumpf C, Daniel WG, Mende U, Garlichs CD. RGS protein 5 specificity towards Gq- and Gi/o-mediated ERK 1/2 and Akt activation in vitro. J Bio-chem Mol Biol. 2007; 40(6):899-910. Atanasoski S, Scherer SS, Nave K-A, Suter U. Proliferation of Schwann Cells and Re-gulation of Cyclin D1 Expression in an Animal Model of Charcot-Marie-Tooth Dise-ase Type 1A. J Neurosci Res. 2002; 67(4):443-449. 10 Bassi S, i in., Encephalo myelitis with thyro toxicosis. J Neur. 1978; 218(4): 293-296. Batty IH, Fleming IN, Downes CP. Muscarinic-receptor-mediated inhibition of insu-lin-like growth factor-1 receptor-stimulated phosphoinositide 3-kinase signalling in 1321N1 astrocytoma cells. Biochem J. 2004; 379(Cz. 3):641-651. Bienfait HM, Verhamme C, van Schaik IN, Koelman JH, de Visser BW, de Haan RJ, 15 Baas F, van Engelen BG, de Visser M. Comparison of CMT1A and CMT2: similari-ties and differences. J. Neurol. grudzień 2006; 253(12):1572-80. Brancolini C, Marzinotto S, Edomi P, Agostoni E, Fiorentini C, Müller HW, Schne-ider C. Rho-dependent regulation of cell spreading by the tetraspan membrane protein Gas3/PMP22. Mol. Biol. Cell. 1999; 10: 2441-2459. 20 Castellone MD, Teramoto H, Gutkind JS. Cyclooxygenase-2 and Colorectal Cancer Chemoprevention: The B-Catenin Connection. Cancer Res. 2006; 66(23):11085-11088. Chies R, Nobbio L, Edomi P, Schenone A, Schneider C, Brancolini C. Alterations in the Arf6-regulated plasma membrane endosomal recycling pathway in cells overe-25 xpressing the tetraspan protein Gas3/PMP22. J Cell Sci. 2003; 116(Cz. 6): 987-999. Cosgaya J. M., Chan J. R., Shooter E. M. 2002. The Neurotrophin Receptor p75NTR as a Positive Modulator of Myelination Science 298; 1245-1248. Devaux JJ, Scherer SS. Altered ion channels in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease type IA. J Neurosci. 2005; 25(6): 1470-1480. 30 D'Urso D, Ehrhardt P, Müller HW. PMP 22 and protein zero: a novel association in peripheral nervous system myelin. J Neurosci. 1999; 19(9):3396-3403. Fortun J, Dunn WA Jr, Joy S, Li J, Notterpek L. Emerging role for autophagy in the removal of aggresomes in Schwann cells. J Neurosci. 2003; 23(33): 10672-10680. Fortun J, Go JC, Li J, Amici SA, Dunn WA Jr, Notterpek L. Alterations in degradative 35 pathways and protein aggregation in a neuropathy model based on PMP22 overe-xpression. Neurobiol Dis. 2006; 22(1):153-164. Fortun J, Verrier JD, Go JC, Madorsky I, Dunn WA, Notterpek L. The formation of peripheral myelin protein 22 aggregates is hindered by the enhancement of autophagy and expression of cytoplasmic chaperones. Neur.Dis. 2007; 25(2): 252-265. 40 Keltner J. i in.Myotonic pupils in Charcot-Marie-Tooth disease. Archives of ophtal-mogy, 1975; 93(11):1141-1148. Khajavi M, Shiga K, Wiszniewski W, He F, Shaw CA, Yan J, Wensel TG, Snipes GJ, Lupski JR. Oral curcumin mitigates the clinical and neuropathologic phenotype of the Trembler-J mouse: a potential therapy for inherited neuropathy. Am J Hum Genet. 45 2007; 81(3): 438-453. King TD, Song L, Jope RS. AMP-activated protein kinase (AMPK) activating agents cause dephosphorylation of Akt and glycogen synthase kinase-3. Biochem Pharmacol. 2006; 71(11):1637-1647. Lupski JR, Wise CA, Kuwano A, Pentao L, Parke JT, Glaze DG, Ledbetter DH, Gre-50 enberg F, Patel PI. Gene dosage is a mechanism for Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Nat Genet. 1992; 1(1): 29-33.

28

Ma W, Li BS, Zhang L, Pant HC. Signaling cascades implicated in muscarinic regula-tion of proliferation of neural stem and progenitor cells. Drug News Perspect. 2004; 17(4):258-266. Meyer Zu Horste G., Nave K-A. Animal models of inherited neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 2006; 19(5): 464-473. 5 Meyer zu Horste G, Prukop T, Liebetanz D, Mobius W, Nave KA, Sereda MW. Anti-progesterone therapy uncouples axonal loss from demyelination in a transgenic rat model of CMT1A neuropathy. Ann Neurol. 2007; 61 (1): 61-72. Nave KA, Sereda MW, Ehrenreich H. Mechanisms of disease: inherited demyelinating neuropathies. Nat Clin Pract Neurol. 2007; 3(8): 453-464. 10 Niemann S, Sereda MW, Rossner M, Stewart H, Suter U, Meinck HM, Griffiths I.R., Nave K-A. The "CMT rat": peripheral neuropathy and dysmyelination caused by transgenic overexpression of PMP22. Ann. N.- Y. Acad. Sci. 1999; 883:254-261. Notterpek L, Shooter EM, Snipes GJ. Upregulation of the endosomal-lysosomal pa-thway in the trembler-J neuropathy. J Neurosci. 1997;17(11): 4190-4200. 15 Ogata T, Iijima S, Hoshikawa S, Miura T, Yamamoto S, Oda H, Nakamura K, Tanaka S. Opposing extracellular signal-regulated kinase and Akt pathways control Schwann cell myelination. J Neurosci. 2004; 24(30):6724-6732. Passage E, Norreel JC, Noack-Fraissignes P, Sanguedolce V, Pizant J, Thirion X, Ro-baglia-Schlupp A, Pellissier JF, Fontes M. Ascorbic acid treatment corrects the pheno-20 type of a mouse model of CMT disease. Nature Med. 2004; 10(4): 396-401. Perea J, Robertson A, Tolmachova T, Muddle J, King RH, Ponsford S, Thomas PK, Huxley C. Induced myelination and demyelination in a conditional mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Hum Mol Genet. 2001; 10(10):1007-1018. Rangaraju S., Madorsky I., Go Pileggi J., Kamal A., Notterpek L. 2008. Pharmacolo-25 gical induction of the heat shock response improves myelination in a neuropathic mo-del Neurobiology of Disease 32; 105-115. Roa BB, i in.. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Association with a spontaneous point mutation in the PMP22 gene. N Engl J Med. 1993; 329(2): 96-101. Robaglia-Schlupp A, Pizant J, Norreel JC, Passage E, Saberan-Djoneidi D, Ansaldi 30 JL, Vinay L, Figarella-Branger D, Levy N, Clarac F, Cau P, Pellissier JF, Fontes M. PMP22 overexpression causes dysmyelination in mice. Brain 2002; 125(Cz. 10): 2213-2221. Sancho S, Young P, Suter U. Regulation of Schwann cell proliferation and apoptosis in PMP22-deficient mice and mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. 35 Brain 2001; 124(Cz. 11): 2177-2187. Sereda M. i in. A transgenic rat model of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuron. 1996;16(5):1049-60. Sereda MW, Meyer zu Horste G, Suter U, i in. Therapeutic administration of progeste-rone antagonist in a model of Charcot-Marie-Tooth disease (CMT-1A). Nat Med 40 2003; 9: 1533-1537. Sereda MW, Nave KA. Animal models of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A). Neuromol Med 2006; 8: 205-215. Suter U, Scherer SS. Disease mechanisms in inherited neuropathies. Nat. Rev. Neuro-sci. 2003; 4: 714-726. 45 Suter U, Welcher AA, Ozcelik T, Snipes GJ, Kosaras B, Francke U, Billings-Gagliardi S, Sidman RL, Shooter EM. Trembler mouse carries a point mutation in a myelin ge-ne. Nature. 1992; 356(6366): 241-244. Tashiro H, Fukuda Y, Hoshino S, Furukawa M, Shintaku S, Ohdan H, Dohi K. As-sessment of microchimerism following rat liver transplantation. Transplant Proc. 50 czerwiec 1996;28(3):1279-80

29

Thomas PK, Marques W Jr, Davis MB, Sweeney MG, King RH, Bradley JL, Muddle JR, Tyson J, Malcolm S, Harding AE. The phenotypic manifestations of chromosome 17p11.2 duplication. Brain 1997; 120 (Cz. 3): 465-478. Tobler AR, Liu N, Mueller L, Shooter EM. Differential aggregation of the Trembler and Trembler J mutants of peripheral myelin protein 22. PNAS U S A. 2002; 5 99(1):483-488. Ulzheimer JC, Peles E, Levinson SR, Martini R. Altered expression of ion channel isoforms at the node of Ranvier in PO-deficient myelin mutants. Mol Cell Neurosci. 2004; 25(1): 83-94. Vallat JM, Sindou P, Preux PM, Tabaraud F, Milor AM, Couratier P, LeGuern E, Bri-10 ce A. Ultrastructural PMP22 expression in inherited demyelinating neuropathies. Ann Neurol. 1996; 39(6): 813-817. Zelman SJ, Rapp NS, Zenser TV, Mattammal MB, Davis BB. Antithyroid drugs inte-ract with renal medullary prostaglandin H synthase. J Lab Clin Med. 1984; 104(2):185-192. 15

WYKAZ SEKWENCJI

[0199]

<110> Pharnext

<120> Połączenia drobnocząsteczkowych leków do leczenia CMT i pokrewnych za-burzeń 20

<130> B738PC00

<160> 16

<170> PatentIn wersja 3.3

<210> 1 <211> 1816 25 <212> DNA <213> Rattus norvegicus

<220> <221> CDS <222> (208)..(690) 30

<400> 1

30

<210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Rattus norvegicus

<400> 2 5

31

<210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> 5 <223> Starter w przód szczurzego PMP22

<400> 3 ggaaacgcga atgaggc 17

<210> 4 <211> 19 10 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Starter w tył szczurzego PMP22

<400> 4 15 gttctgtttg gtttggctt 19

<210> 5 <211> 690 <212> DNA <213> Rattus norvegicus 20

<220> <221> CDS

32

<222> (15)..(626)

<400> 5

<210> 6 <211> 203 <212> PRT 5 <213> Rattus norvegicus

<400> 6

33

<210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> 5 <223> Starter w przód RPL13A

<400> 7 ctgccctcaa ggttgtg 17

<210> 8 <211> 21 10 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Starter w tył RPL13A

<400> 8 15 cttcttcttc cggtaatgga t 21

34

<210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> 5 <223> Sonda FRET Pmp22 znakowana fluoresceiną

<400> 9 gctctgagcg tgcatagggt ac 22

<210> 10 <211> 19 10 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Sonda FRET Rpl13A znakowana fluoresceiną

<400> 10 15 tcgggtggaa gtaccagcc 19

<210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 20

<220> <223> Sonda FRET Pmp22 znakowana rodaminą

<400> 11 agggagggag gaaggaaacc agaaa 25

<210> 12 25 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Sonda FRET Rpl13A znakowana rodaminą 30

<400> 12 tgacagctac tctggaggag aaacggaa 28

<210> 13 <211> 19 <212> DNA 35 <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Starter 1 swoisty dla Sry

<400> 13 gagagaggca caagttggc 19 40

<210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> 45

35

<223> Starter 2 swoisty dla sry

<400> 14 gcctcctgga aaaagggcc 19

<210> 15 <211> 19 5 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220> <223> Starter w przód transgenu PMP22

<400> 15 10 gacaaacccc agacagttg 19

<210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 15

<220> <223> Starter w tył transgenu PMP22

<400> 16 ccagaaagcc agggaactc 19

Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja zawierająca agonistę receptorów muskarynowych wybranego z grupy 20

obejmującej pilokarpinę, cewimelinę, karbachol, metacholinę i betanechol lub ich sól oraz inhibitor syntezy hormonów tarczycy wybrany z grupy obejmującej metimazol, karbimazol, propylotiouracyl i amiodaron lub ich sól, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.

2. Kompozycja według zastrzeżenia 1, w której agonistą receptorów muskarynowych jest 25 pilokarpina.

3. Kompozycja według zastrzeżenia 1, w której inhibitorem syntezy hormonów tarczycy jest metimazol lub karbimazol.

4. Kompozycja według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, zawierająca pilokarpi-nę i metimazol lub pilokarpinę i karbimazol lub ich sole i, ewentualnie, farmaceutycz-30 nie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.

5. Kompozycja według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, do zastosowania w le-czeniu choroby Charcota-Mariego-Tootha lub zaburzenia pokrewnego z CMT.

6. Kompozycja do zastosowania w leczeniu choroby Charcota-Mariego-Tootha według zastrzeżenia 5, w której chorobą Charcota-Mariego-Tootha jest CMT1A. 35

7. Kompozycja według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, dodatkowo zawierają-ca co najmniej jeden dodatkowy związek czynny.

8. Kompozycja według zastrzeżenia 7, w której ten co najmniej jeden dodatkowy zwią-zek czynny jest wybrany spośród baklofenu, mifepristonu, sorbitolu, naltreksonu, ra-pamycyny, ketoprofenu i flurbiprofenu. 40

9. Kompozycja według zastrzeżenia 7 albo 8, w której tym co najmniej jednym dodat-kowym związkiem jest mifepriston.

36

10. Kompozycja według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 9, która zawiera metimazol, pi-lokarpinę, baklofen, mifepriston i sorbitol.

11. Kompozycja według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 9, która zawiera metimazol, pi-lokarpinę, baklofen, mifepriston, sorbitol i naltrekson.

12. Kompozycja według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 9, która zawiera dowolne z na-5 stępujących połączeń leków:

- pilokarpinę, metimazol, mifepriston i sorbitol; - pilokarpinę, metimazol, mifepriston, sorbitol i rapamycynę; - pilokarpinę, metimazol, mifepriston, sorbitol i ketoprofen; - pilokarpinę, metimazol, mifepriston, sorbitol i flurbiprofen; 10 - metimazol i cewimelinę; - pilokarpinę i propylotiouracyl; - pilokarpinę, metimazol i baklofen; - pilokarpinę, metimazol i mifepriston, - pilokarpinę, metimazol i sorbitol; 15 - pilokarpinę, metimazol i naltrekson; - pilokarpinę, metimazol i rapamycynę; - pilokarpinę, metimazol i ketoprofen; - pilokarpinę, metimazol i flurbiprofen; - pilokarpinę, metimazol, mifepriston, sorbitol, baklofen i rapamycynę; lub 20 - pilokarpinę, metimazol, mifepriston, sorbitol, naltrekson i rapamycynę.

13. Kompozycja według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 12, w której związki są połą-czone do podawania wspólnego lub oddzielnego, równocześnie lub kolejno.

14. Kompozycja do stosowania według zastrzeżenia 5, gdzie leczenie dodatkowo obejmu-je etap określenia, czy pacjent ma CMT1A. 25

Uprawniony: Pharnext Pełnomocnik: dr inż. Wojciech Tykarski Rzecznik patentowy

37

38

39

40

41

42