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Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz (Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas Oscar Humberto Alvarado Sanabria Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronomía Bogotá, Colombia 2016

Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz … · eficiente del agua intrínseco (D) de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y * representan no significativo

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  • Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos

    de Arroz (Oryza sativa L.) a Diferentes

    Temperaturas Nocturnas

    Oscar Humberto Alvarado Sanabria

    Universidad Nacional de Colombia

    Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronoma

    Bogot, Colombia

    2016

  • II Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz (Oryza sativa L.)

    a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos

    de Arroz (Oryza sativa L.) a Diferentes

    Temperaturas Nocturnas

    Oscar Humberto Alvarado Sanabria

    Trabajo de investigacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de:

    Magister en Ciencias Agrarias con nfasis en Fisiologa de Cultivos

    Director:

    Ph.D. Hermann Restrepo Daz

    Codirector:

    Msc. Gabriel Garcs Varn

    Fisiologa de Cultivos.

    Universidad Nacional de Colombia

    Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronoma

    Bogot, Colombia

    2016

  • Resumen y Abstract III

    Resumen

    La temperatura es uno de los principales factores que determina la distribucin y el potencial

    desarrollo de una especie. En los ltimos aos la temperatura promedio ha aumentado en

    todo el mundo y Colombia no ha sido la excepcin con un aumento de aproximadamente

    2C en los ltimos 20 aos. Este aumento de la temperatura perjudica el crecimiento,

    desarrollo y reproduccin de varias especies cultivables, dentro de ellas el arroz. Esta

    especie es una de las principales fuentes de energa para la especie humana, por lo que

    cualquier disminucin en sus rendimientos afecta la seguridad alimentaria del mundo. La

    alta temperatura nocturna (ATN) ha mostrado ser uno de los factores ms perjudiciales para

    el rendimiento del arroz. En el presente estudio se caracteriz la respuesta de siete genotipos

    de arroz a una alta temperatura nocturna (30C) en estado de macollamiento y durante la

    maduracin. Para esto se evaluaron variables de crecimiento, fotosntesis, variables

    relacionadas con estrs oxidativo, y algunos componentes de rendimiento. Los resultados

    indicaron que i) la alta temperatura nocturna afecta los procesos fisiolgicos (en estado

    vegetativo) desde el cuarto da de exposicin ii) la alta temperatura nocturna disminuye el

    crecimiento vegetativo debido a una menor asimilacin de CO2 y mayor respiracin iii) la

    alta temperatura nocturna disminuye el rendimiento por pancula del genotipo F50 y lo

    aumenta en CT19021 debido a una mayor y menor produccin de granos vanos,

    respectivamente. Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, el uso de

    variables fisiolgicas y bioqumicas como posibles indicadores de tolerancia o

    susceptibilidad a un estrs por alta temperatura podran ser: En estado vegetativo la

    asimilacin de CO2, el contenido de clorofila y carotenoides, el contenido de MDA y la

    respiracin; en estado reproductivo el nmero de granos producidos y el porcentaje de

    fertilidad, mientras variables como, conductancia estomtica, contenido de prolina y

    fluorescencia de la clorofila a varan en el tiempo o no presentan cambios al aumentar la

    temperatura nocturna, por lo que no seran buenos indicadores del estrs provocado por una

    alta temperatura nocturna.

    Palabras clave: fotosntesis, estrs abitico, estrs oxidativo, fluorescencia, genotipo,

    clorofila.

  • IV Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz (Oryza sativa L.)

    a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Abstract

    Temperature is one of the main factors that determine the distribution and the potential

    development of a species. In recent years the average temperature has increased worldwide,

    and Colombia is no exception with an increase of about 2 C in the last 20 years. This

    increase in temperature impairs growth, development and reproduction of several crop

    species within them rice. This species is one of the main sources of energy for the human

    species, so any decline in yields affects food security in the world. The high night

    temperature has proved one of the most damaging rice yield factors. In this study the

    response of seven lines of rice at high night temperature (30 C) and tillering state during

    grain filling was characterized. For this growth variables, photosynthesis, oxidative stress-

    related variables, and some yield components were evaluated. The results indicated that i)

    the high night temperature affects physiological processes (vegetative state) from four days

    of exposure and these vary over time ii) the high night temperature decreases vegetative

    growth due to lower CO2 assimilation and greater respiration iii) high night temperature

    decreases production / panicle genotype F50 and CT19021 increases due to a higher

    production and lower openings, respectively grains. Because of its stability over time and

    that regardless of genotype tends to exhibit the same behavior, the following variables as

    potential indicators of stress are suggested for high temperature CO2 assimilation, number

    and percentage of grain produced vaneamiento, while variables such as, stomatal

    conductance, MDA and proline content are variable in time or are unchanged by increasing

    the night temperature, so they would not be good indicators of this stress.

    Keywords: Photosynthesis, Abiotic stress, oxidative stress, fluorescence, genotype,

    chlorophyll

  • Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    V

    CONTENIDO

    Pg.

    Resumen .............................................................................................................................. III

    Abstract ............................................................................................................................... IV

    Lista de figuras ................................................................................................................. VIII

    Lista de tablas ...................................................................................................................... X

    Lista de Smbolos y Abreviaturas ....................................................................................... XI

    INTRODUCCIN .............................................................................................................. 13

    1. MARCO TERICO .................................................................................................... 15

    1.1 FISIOLOGA DE LAS PLANTAS BAJO UNA ALTA TEMPERATURA ....15

    1.2 RESPUESTA DEL CULTIVO DEL ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA

    NOCTURNA ................................................................................................................16

    1.3 LAS ALTAS TEMPERATURAS Y LA FENOLOGA DEL ARROZ............19

    1.4 EL USO DE VARIABLES FISIOLGICAS EN EL FITOMEJORAMIENTO

    DE ARROZ ..................................................................................................................20

    1.4.1 La fotosntesis y sus componentes ..........................................................22

    1.4.2 Reproduccin y Rendimiento .................................................................27

    1.4.3 Peroxidacin Lipdica de membranas .....................................................28

    1.4.4 Osmolitos compatibles (Prolina) ............................................................29

    2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 31

    2.1 Objetivo General ................................................................................................31

    2.2 Objetivos Especficos ........................................................................................31

    3. MATERIALES Y MTODOS .................................................................................... 33

    3.1 RESPUESTA FISIOLGICA DE PLANTULAS DE ARROZ F60

    SOMETIDAS A PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA. ..............33

    3.1.1 Condiciones generales del experimento .................................................33

    3.1.2 Tratamientos ...........................................................................................34

    3.1.3 Fotosntesis, conductancia estomtica, y transpiracin ..........................34

    3.1.4 Uso eficiente del agua y eficiencia de carboxilacin .............................35

    3.1.5 Eficiencia mxima del PSII (Fv/Fm) ......................................................35

    3.1.6 Contenido de clorofila a, clorofila b y carotenoides ...............................35

    3.1.7 Respiracin oscura de la hoja .................................................................36

    3.1.8 Contenido de Prolina ..............................................................................36

    3.1.9 Peroxidacin Lipdica .............................................................................36

    3.1.10 Anlisis Estadstico.................................................................................37

    3.2 RESPUESTA FISIOLGICA DE SEIS GENOTIPOS DE ARROZ EN

    ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA .............38

  • VI Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    3.2.1 Tratamientos ...........................................................................................38

    3.2.2 Condiciones generales de crecimiento ...................................................38

    3.2.3 Fotosntesis .............................................................................................39

    3.2.4 Eficiencia de Carboxilacin y Uso eficiente del agua ............................39

    3.2.5 Respiracin oscura ..................................................................................39

    3.2.6 Parmetros de Fluorescencia de la clorofila a ........................................40

    3.2.7 Parmetros de Crecimiento .....................................................................40

    3.2.8 Prdida de electrolitos ............................................................................40

    3.2.9 Clorofila y Carotenoides .........................................................................41

    3.2.10 Prolina y Malondialdehdo (MDA) ........................................................41

    3.2.11 Diseo experimental y anlisis estadstico .............................................41

    3.3 CARACTERIZACIN FISIOLGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

    SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ...............................42

    3.3.1 Condiciones generales de crecimiento ...................................................42

    3.3.2 Genotipos y tratamientos ........................................................................42

    3.3.3 Componentes de rendimiento .................................................................43

    3.3.4 Parmetros de Fluorescencia de la Clorofila a .......................................43

    3.3.5 Contenido de Clorofila y Carotenoides ..................................................43

    3.3.6 Prolina y Malondialdehdo (MDA) ........................................................43

    3.3.7 Anlisis Estadstico.................................................................................44

    4. RESULTADOS ........................................................................................................... 45

    4.1 RESPUESTA FISIOLGICA DE PLANTULAS DE ARROZ SOMETIDAS A

    PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA. ..........................................45

    4.1.1 Fotosntesis, conductancia estomtica, transpiracin y concentracin

    interna de CO2 .......................................................................................................45

    4.1.2 Eficiencia de la carboxilacin y uso eficiente del agua ..........................46

    4.1.3 Respiracin oscura y balance de carbono ...............................................47

    4.1.4 Eficiencia del fotosistema II y contenido de pigmentos fotosintticos. .49

    4.1.5 Peroxidacin lipdica y contenido de prolina .........................................50

    4.2 RESPUESTA FISIOLGICA DE SEIS GENOTIPOS DE ARROZ EN

    ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA .............51

    4.2.1 Fotosntesis, Eficiencia de la Carboxilacin y Uso eficiente del Agua ..51

    4.2.2 Respiracin .............................................................................................52

    4.2.3 Variables de Crecimiento .......................................................................53

    4.2.4 Fluorescencia de la clorofila a ................................................................54

    4.2.5 Fuga de electrolitos, MDA, Prolina y pigmentos fotosintticos.............55

    4.3 CARACTERIZACIN FISIOLOGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

    SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ................................58

  • Contenido VII

    4.3.1 Componentes de rendimiento (Nmero de granos vanos, Nmero de

    granos llenos, Porcentaje de fertilidad y masa de granos llenos por pancula) .....58

    4.3.2 Fluorescencia de la Clorofila a ...............................................................60

    4.3.3 Pruebas bioqumicas (Pigmentos fotosintticos, MDA y Prolina) .........61

    5. DISCUSIN ................................................................................................................ 63

    5.1 PRIMER EXPERIMENTO: PERIODOS DE ESTRS ....................................63

    5.2 SEGUNDO Y TERCER EXPERIMENTO: RESPUESTA DE SIETE

    GENOTIPOS DE ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ............65

    6. MODELO TERICO DEL EFECTO DE LA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

    69

    7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 71

    7.1 Conclusiones ......................................................................................................71

    7.2 Recomendaciones ..............................................................................................71

    Bibliografa ......................................................................................................................... 73

  • Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    VIII

    Lista de figuras

    Figura 1. Efectos del fenmeno del nio (2009-2010) en los rendimientos de la zona de

    Espinal (Tolima). Fuente: FEDEARROZ (2015). .............................................................. 19

    Figura 2. Fotosntesis(A), Conductancia estomtica(B), transpiracin(C) y Concentracin

    intercelular de CO2(D) de plntulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs

    30C). Las ecuaciones representan el comportamiento cbico en el tiempo. n.s,*, ** y ***

    representa no significativo y significancia con P0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente. Cada

    punto representa el promedio de 12 valores. ...................................................................... 46

    Figura 3. Eficiencia de carboxilacin(A) y Uso eficiente del agua(B) de plntulas de arroz

    sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C). n.s y * representan no significativo y

    significancia con P0,05 segn la prueba de Tukey, entre temperaturas para un mismo da.

    Cada barra de grfico representa la meda de doce valores+Error estndar. ..................... 47

    Figura 4. Respiracin oscura de plntulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas

    (24 vs 30C). Las ecuaciones presentan un comportamiento cbico en el tiempo. * y ***

    representan significancia con P0,05 y 0,001, respectivamente. Cada punto representa el

    promedio de 12 valores. ...................................................................................................... 48

    Figura 5. Balance de CO2 de plntulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24

    vs 30C). n.s y * representan no significativo y significancia con P0,05, entre temperaturas

    para un mismo da, segn la prueba de Tukey. Cada barra de grfico representa la meda de

    doce valores+Error estndar. .............................................................................................. 48

    Figura 6. Eficiencia mxima potencial del PSII (Fv/Fm) de plntulas de arroz sometidas a

    dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C). n.s y * representan no significativo y significancia

    con P0,05, entre temperaturas para un mismo da segn la prueba de Tukey. Cada barra de

    grfico representa la meda de doce valores+Error estndar. ............................................ 49

    Figura 7. Contenido de clorofila y carotenoides de plntulas de sometidas a dos

    temperaturas nocturnas (24 vs 30C). Lneas con la letra L presentan un comportamiento

    lineal (P0,001). Cada punto representa el promedio de 12 valores. ................................. 50

    Figura 8. MDA(A) y contenido de Prolina (B) de plntulas de arroz sometidas a dos

    temperaturas nocturnas (24 vs 30C). n.s y * representan no significativo y significancia con

  • Contenido IX

    P0,05, entre temperaturas para un mismo da, segn la prueba de Tukey. Cada barra del

    grfico representa la meda de doce valores+Error estndar. ............................................ 51

    Figura 9. Fotosntesis (A), Eficiencia de la carboxilacin (B), CO2 intercelular (C), y Uso

    eficiente del agua intrnseco (D) de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y *

    representan no significativo y significancia con P0,05, entre temperaturas para un mismo

    da, segn la prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticionesError

    estandar. .............................................................................................................................. 52

    Figura 10. Respiracin de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y * representan

    no significativo y significancia con P0,05, entre temperaturas para un mismo da, segn la

    prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticionesError estndar.... 53

    Figura 11. Perdida de electrolitos (A) y Produccin de MDA (B) de hojas de plantas de seis

    genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 8 repeticionesError. Asteriscos

    significan diferencias significativas en la interaccin de Temperatura (T) x Genotipo (G) a

    P0,05 de acuerdo con el ANOVA. .................................................................................... 56

    Figura 12. Efecto de dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C) sobre el nmero total de

    granos (A), de granos llenos (B), de granos vanos (C) y porcentaje de fertilidad (D) en siete

    genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticionesError. Barras con

    letras distintas indican diferencias significativas a P0,05 segn la prueba de Tukey. ..... 59

    Figura 13. Masa de granos llenos de panculas de arroz bajo dos temperaturas nocturnas

    (A) y en siete genotipos (B). Los datos representan el promedio de 6 repeticionesError

    estndar. Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P0,05 segn la

    prueba de Tukey. ................................................................................................................. 60

    Figura 14. Rendimiento cuntico real del fotosistema II (Y(II))(A), Disipacin no

    fotoqumica controlada (Y(NPQ))(B), Disipacin no fotoqumica no controlada (Y(NO))(C)

    y Rendimiento cuntico potencial del PSII (Fv/Fm)(D) de la hoja bandera de siete genotipos

    de plantas de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticionesError estndar.

    Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P0,05 segn la prueba de

    Tukey. ................................................................................................................................. 61

    Figura 15. Modelo conceptual de los efectos y las caractersticas de tolerancia y

    susceptibilidad de arroz sometido a altas temperaturas nocturnas (30C). Los smbolos

    dentro de cada recuadro indican aumento (), disminucin () o sin cambios (=) del proceso

    dentro del recuadro. El origen de la flecha roja indica las posibles causas de un proceso y el

    final de la flecha roja indica el proceso afectado. ............................................................... 70

  • X Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Lista de tablas

    Tabla 1. Efecto de la alta temperatura nocturna en procesos fisiolgicos del arroz .......... 18

    Tabla 2. Rangos ptimos de temperatura diaria para el desarrollo del arroz segn su etapa

    fenolgica. Informacin adaptada de Yoshida (1981). ....................................................... 19

    Tabla 3. Parmetros de la fluorescencia derivados de la fluorescencia de la clorofila a ... 24

    Tabla 4. Variables de crecimiento de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos

    diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30C) ................................................................. 54

    Tabla 5. Eficiencia mxima real y eficiencia mxima potencial y formas de disipacin de la

    energa del PSII en hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos diferentes temperaturas

    nocturnas (24 vs 30C) ....................................................................................................... 55

    Tabla 6. Pigmentos fotosintticos y Prolina de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a

    dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C) ........................................................................... 57

    Tabla 7. Contenido de Pigmentos fotosnteticos (Clorofilas y Carotenoides),

    Malondialdehdo (MDA) y prolina en hojas banderas de siete genotipos de arroz expuestos

    a dos diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30C). ....................................................... 62

  • Lista de Smbolos y Abreviaturas XI

    Lista de Smbolos y Abreviaturas

    ANOVA = Anlisis de varianza.

    ATP = Adenosin Trifosfato.

    CAR (x+c) = carotenoides.

    CE = Eficiencia de carboxilacin.

    Chl = Clorofila.

    Chl a = Clorofila a.

    Chl b = Clorofila b.

    Ci= CO2 subestomtico.

    DDE = Das de Exposicin.

    DE = Das despus de emergencia.

    E = Transpiracin.

    Fm = Fluorescencia Mxima de hojas adaptadas a la Oscuridad.

    Fm = Fluorescencia Mxima de hojas adaptadas a la Luz.

    Fo = Fluorescencia Mnima de hojas adatadas a la Luz.

    Fo = Fluorescencia Mnima de hojas adatadas a la Oscuridad.

    Fv/Fm = Eficiencia mxima potencial del fotosistema II.

    MF= Masa Fresca.

    gS = conductancia estomtica.

    ATN = Alta temperatura nocturna.

    LHC = Complejo proteico cosechador de luz.

    MDA = Malondialdehdo

    NAD = Nicotin Adenin dinucleotido.

    NADPH = Nicotin Adenin dinucleotido reducido.

    NPQ = Disipacin no fotoqumica

    PAR = Radiacin Fotosintticamente Activa.

    Pn = tasa de asimilacin de CO2

    PS = Fotosistema

    PSI = Fotosistema I

    PSII= Fotosistema II

    Ro = Respiracin Oscura.

    ROS = Especies Reactivas de oxgeno.

    RuBisCO = Ribulosa 1,5 Bifosfato carboxilasa/oxigenasa.

    RuBP = Ribulosa-1,5-bisfosfato.

    TBA = cido Tiobarbitrico.

    WUE= Uso eficiente del agua, hallado como tasa fotosinttica/tasa transpiratoria.

    WUEi = Uso eficiente del agua intrnseco.

  • XII Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Y(II)= Eficiencia mxima real del fotosistema II.

    Y(NO) = Eficiencia de la disipacin no fotoqumica no controlada.

    Y(NPQ) = Eficiencia de la disipacin fotoqumica controlada

  • Introduccin 13

    INTRODUCCIN

    El cambio climtico ha generado condiciones adversas tales como periodos prolongados de

    sequas, inundaciones y temperaturas extremas en varias regiones del mundo (Teixeira et

    al., 2013). El cultivo del arroz es uno de los cereales con mayor importancia para la

    alimentacin humana en el mundo (FAO, 2002). Y en Colombia ocup 455,000 ha

    sembradas con una produccin de 1,925,687 toneladas durante 2013 (FEDEARROZ, 2015).

    En este sentido, periodos de altas temperaturas tanto diurnas como nocturnas han sido

    registrados en los ltimos aos en las zonas productoras de arroz en Colombia, observndose

    un impacto negativo sobre el rendimiento de este cultivo (Castilla et al., 2010; Restrepo-

    Diaz y Garces-Varon, 2013; Snchez-Reinoso et al., 2014).

    El rendimiento del cultivo del arroz es fuertemente influenciado por factores ambientales

    como luminosidad, disponibilidad de agua, nutrientes y la temperatura ambiental (Yoshida,

    1981; Fageria, 2007). En cuanto a la temperatura ambiental, los periodos de exposicin de

    cultivos de arroz a altas temperaturas diurnas como nocturnas han aumentado durante los

    ltimos aos (Restrepo-Daz y Garcs Varn, 2013; Snchez-Reinoso et al. 2014). En este

    aspecto, periodos de estrs trmico, especialmente, altas temperaturas nocturnas pueden

    afectar negativamente la fisiologa y en consecuencia el rendimiento del cultivo del arroz

    (Mohammed y Tarpley, 2014). En plntulas de arroz, altas temperaturas nocturnas (35-

    45C) disminuyeron la asimilacin de CO2, la eficiencia del fotosistema II y la actividad de

    la Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa/oxidasa (RuBisCO) (Yin et al., 2010). Adems de los

    efectos sobre las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja, una alta temperatura

    nocturna reduce el contenido de clorofila (Kumar et al., 2011; Dong et al., 2014), afectando

    la relacin entre clorofila total y carotenoides (Song et al., 2013; Dong et al., 2014). Otra

    respuesta fisiolgica, es el incremento de la respiracin nocturna expresado como perdida

    de carbono (Lee y Akita, 2000; Mohammed y Tarpley, 2009b; Mohammed et al., 2013).

    Tambin, es importante mencionar que el grado de afectacin negativa por una alta

    temperatura nocturna sobre el rendimiento, est influenciada por el estado fenolgico donde

    se presente esta condicin estresante (Fageria et al., 2007). Yoshida (1981) menciona que

    las etapas de floracin y maduracin son etapas fenolgicas ms susceptibles a estreses

    ambientales.

    Una de las estrategias para afrontar los efectos negativos de las altas temperaturas sobre el

    rendimiento de los cereales es la seleccin de genotipos tolerantes a dicha condicin

    ambiental (Araus et al., 2008). En este aspecto, el mejoramiento gentico de cultivos

  • 14 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    actualmente usa caractersticas fisiolgicas con el propsito de aumentar la eficiencia en la

    seleccin de genes (Reynolds et al., 2009; Jha et al., 2014). Por ejemplo, en la seleccin de

    genotipos de trigo tolerantes a alta radiacin y temperatura se han usado parmetros de la

    fluorescencia de la clorofila y variables de intercambio gaseoso (Sayed, 2003; Monneveux

    et al., 2003). Adicionalmente, la caracterizacin de genotipos tolerantes a altas temperaturas

    nocturnas se tiene en cuenta variables bioqumicas como el contenido de pigmentos

    fotosintticos (clorofilas y carotenoides), la produccin de osmolitos compatibles (glicina

    betana, Prolina y azucares solubles) y la integridad de la membrana celular (Bita y Gerats,

    2013). En arroz, se ha reportado que los genotipos tolerantes presentan una tasa de

    fotosntesis, respiracin, transporte de electrones, contenido de clorofila y rendimiento

    cuntico del fotosistema II estables bajo condiciones de altas temperaturas nocturnas

    (Glaubitz et al., 2014; Mohammed y Tarpley, 2014). Por lo anterior, estas variables han sido

    sugeridas como herramienta para seleccionar genotipos con una posible tolerancia a

    diferentes condiciones de estrs abitico (Sayed, 2003; Araus et al., 2008).

    Actualmente, la utilizacin de algunos parmetros fisiolgicos y bioqumicos como tasa

    fotosinttica y produccin de prolina han adquirido importancia en la caracterizacin de

    genotipos a condiciones de estrs abitico especialmente estrs trmico en Colombia

    (Restrepo-Diaz y Garces-Varon, 2013; Snchez-Reinoso et al. 2014). Sin embargo, los

    trabajos donde se utilizan parmetros fisiolgicos (fluorescencia de la clorofila a,

    Peroxidacin lipdica, intercambio gaseoso) siguen siendo necesarios para un mejor

    conocimiento de la influencia del ambiente en la seleccin de genotipos con caractersticas

    de tolerancia a estreses abiticos (especialmente estrs trmico) como futuros parentales en

    los programas de fitomejoramiento. Por tal motivo, las hiptesis de trabajo en el presente

    trabajo eran: i) El uso de variables como: fotosntesis, crecimiento (acumulacin de masa

    seca y rea foliar), componentes de rendimiento (tamao de grano, nmero de granos,

    vaneamiento) y bioqumicas (malondialdehdo, contenido de prolina y contenido de

    pigmentos) sirven como herramientas en la caracterizacin de un estrs por alta temperatura

    nocturna para genotipos de arroz; ii) Los genotipos tolerantes presentan mayor crecimiento,

    rendimiento, fotosntesis, menor respiracin y mayor fertilidad.

  • Marco Terico 15

    1. MARCO TERICO

    1.1 FISIOLOGA DE LAS PLANTAS BAJO UNA ALTA TEMPERATURA

    La temperatura media del planeta ha aumentado los ltimos aos y seguir aumentando

    0,3 por dcada en comparacin al lapso 1990-2010 (Lobell y Gourdji, 2012). Este

    aumento de la temperatura afectar negativamente la produccin de los cultivos ms

    importantes en la alimentacin humana y animal como son: maz, soya, trigo y arroz (Welch

    et al., 2010b; Wassmann et al., 2009). La alta temperatura afectar de forma distinta a cada

    regin, debido a las condiciones propias de cada una, tanto climticas como de manejo de

    cultivo, por lo que son necesarias investigaciones a nivel regional.

    La alta temperatura afecta el desarrollo y rendimiento de las plantas cultivables (Jha et al.,

    2014; Lobell y Gourdji, 2012). Cada planta cultivable necesita unas condiciones climticas

    determinadas para desarrollarse ptimamente. Si estas condiciones no se presentan, el

    desarrollo y crecimiento de las plantas disminuyen (Sage et al., 2015). La temperatura es

    uno de los principales factores que afectan la supervivencia de las plantas y junto con la

    disponibilidad de agua determinan la distribucin de las plantas en el planeta (Lambers et al.,

    2008).

    La alta temperatura, tanto diurna como nocturna, afecta procesos esenciales en la fisiologa

    de la planta como la fotosntesis, la respiracin, la absorcin de agua, el crecimiento y el

    desarrollo (Mohammed y Tarpley, 2014, 2009b; Mohammed et al., 2013). A nivel de hoja,

    la fotosntesis es uno de los procesos ms sensibles a la alta temperatura (Bita y Gerats,

    2013; Sage y Kubien, 2007). En este sentido, tanto la parte fotoqumica como el ciclo de

    Calvin son afectados (Wahid et al., 2007). En el caso de la parte fotoqumica, el fotosistema

    II es la parte ms sensible, ya que se pueden afectar procesos metablicos como una la tasa

    de transporte de electrones y la produccin de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Cui

    et al., 2006; Yamasaki et al., 2002). Asimismo, El contenido y la distribucin de los

    pigmentos fotosintticos son alterados por altas temperaturas. En este aspecto, aumenta el

    contenido de carotenoides y disminuye el de clorofila con el fin de disipar el exceso de

    energa y reducir las ROS (Demmig-Adams y Adams Iii, 1996; Gill y Tuteja, 2010). En el

    caso del ciclo de Calvin, la actividad de la Rubisco puede ser inhibida por periodos de estrs

    trmico (Wang et al., 2010; Kubien y Sage, 2008)

    Otro proceso fisiolgico afectado es la respiracin (Wahid et al., 2007). El balance de

    carbono en una planta est dado por la diferencia entre la ganancia de carbono por

  • 16 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    fotosntesis y la perdida de este por respiracin (Turnbull et al., 2001; Snchez-Reinoso

    et al., 2014). Varios estudios han reportado cambios en respiracin como respuesta a la

    variacin de la temperatura ambiental (Smith y Dukes, 2013). En general, la respiracin se

    incrementa en funcin de la temperatura (Lambers et al., 2008).

    La interaccin entre estrs trmico y el estado de desarrollo de la planta tambin es

    importante en el rendimiento de los cultivos (Restrepo-Daz et al., 2010). La investigacin

    actual ha concluido que el estado de floracin es el ms susceptible a las altas temperaturas,

    pero las plantas pueden tambin sufrir alteraciones, provocados por estrs trmico, en los

    dems estados fenolgicos (Snchez et al., 2014; Wassmann et al., 2009; Sage et al., 2015;

    Wongpatsa et al., 2014). Una ATN puede causar aborto de flores y frutos, afectar la

    viabilidad y fertilidad del polen y finalmente, la calidad del producto a cosechar (Restrepo-

    Diaz et al., 2010; Sage et al., 2015). Asimismo, se ha reportado que los cultivos de cereales

    sometidos a una ATN puede presentar mayor esterilidad en comparacin a una alta

    temperatura diurna (Welch et al., 2010a). Teniendo en cuenta los efectos del estrs trmico,

    en cereales los genotipos tolerantes pueden mantener su rendimiento, fertilidad de las

    espiguillas, viabilidad del polen y capacidad fotosinttica (Poli et al., 2013).

    Las plantas tienen respuestas bioqumicas a las altas temperaturas con el propsito de

    sobrellevar esta condicin estresante (Wahid et al., 2007). En plantas de cebada bajo estrs

    trmico, se ha reportado un aumento en la relacin Carotenoides/Clorofila, ya que una

    disminucin de la clorofila permite captar menos energa y evitar el calentamiento de la hoja

    provocado por la reduccin en la transpiracin (Havaux y Tardy 1999). Otro mecanismo de

    aclimatacin a condiciones de alta temperatura, especialmente nocturna, es la menor

    peroxidacin lipdica representado en la produccin de malondialdehdo (MDA)

    (Narayanan et al., 2016; Bahuguna et al., 2015; Zhou et al., 2012). Finalmente, las plantas

    pueden presentar respuestas moleculares para tolerar episodios de estrs trmico (Jagadish

    et al., 2012; Jha et al., 2014). En este sentido, genotipos tolerantes han mostrado una mayor

    acumulacin de protenas de choque trmico que genotipos susceptibles (Jagadish et al.,

    2010).

    1.2 RESPUESTA DEL CULTIVO DEL ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA

    NOCTURNA

    La temperatura mnima (temperatura nocturna) ha presentado un mayor incremento que la

    temperatura mxima diaria durante el siglo pasado (Krishnan et al., 2011). Esta condicin

  • Marco Terico 17

    puede afectar las plantas a nivel fisiolgico, bioqumico y morfolgico (Krishnan et al.,

    2011; Mohammed y Tarpley, 2014). En este contexto, las altas temperaturas nocturnas (35-

    45C) disminuyen la asimilacin de CO2, la eficiencia del fotosistema II y la actividad de la

    Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa/oxidasa (RuBisCO) en arroz (Yin et al., 2010). Adems

    de los efectos sobre las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja, una alta temperatura

    nocturna reduce el contenido de clorofila (Kumar et al., 2011; Dong et al., 2014), afectando

    la relacin entre clorofila total y carotenoides (Song et al., 2013; Dong et al., 2014).

    Otra respuesta fisiolgica, es el incremento de la respiracin nocturna expresado como

    prdida de carbono (Lee y Akita, 2000; Mohammed y Tarpley, 2009b; Mohammed et al.,

    2013). Mohammed y Tarpley (2010a) han mencionado que esta prdida de carbono es una

    de las causas de la reduccin del rendimiento en el cultivo del arroz. A nivel bioqumico,

    altas temperaturas (40/32C da/noche) tambin provocan dao en las membranas

    (expresado como un mayor contenido de MDA), causando un incremento de la actividad

    enzimtica antioxidante (superxido dismutasa, glutatin reductasa) y produccin de

    osmolitos compatibles como la prolina (Kumar et al., 2011; Xue et al., 2012). En cuanto a

    los parmetros de rendimiento del cultivo, Peng et al., (2004) reportan que temperaturas

    nocturnas superiores a 24 C reducen la produccin de biomasa total cerca del 20%, el

    porcentaje de granos llenos y finalmente, el rendimiento de grano.

    El crecimiento y desarrollo del cultivo del arroz es influenciado por la temperatura nocturna

    (Shah et al., 2011; Wahid et al., 2007; Glaubitz et al., 2014). En la tabla 1 se recopila algunos

    efectos de las temperaturas nocturnas sobre parmetros fisiolgicos, de crecimiento y de

    rendimiento en arroz.

  • 18 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Tabla 1. Efecto de la alta temperatura nocturna en procesos fisiolgicos del arroz

    PROCESO

    ALTA

    TEMPERATURA

    NOCTURNA (C)

    ESTADO DE

    DESARROLLO EFECTO REFERENCIA

    Respiracin 30-32 Plntula y

    reproductivo Aumento

    Glaubitz et al. (2014);

    Mohammed y Tarpley,

    (2009b); Mohammed et al.

    (2013); Mohammed y

    Tarpley, (2014, 2010)

    Crecimiento 30 Plntula Aumento Glaubitz et al. (2014)

    Crecimiento 27 Vegetativo-Alta

    dosis de N Disminucin Chen et al. (2013)

    Fertilidad 30-32 Reproductivo Disminucin

    Mohammed y Tarpley

    (2011b, 2014, 2010,

    2009b)

    Masa del

    grano 30-32 Reproductivo Disminucin

    Mohammed y Tarpley

    (2011b, 2014, 2010,

    2009b)

    Nmero de

    granos por

    pancula

    30 Reproductivo Disminucin Mohammed y Tarpley

    (2014)

    Rendimiento 30-32 Reproductivo Disminucin

    Mohammed et al. (2013);

    Mohammed y Tarpley

    (2010)

    Dao

    membranas 30-32 Aumento

    Mohammed y Tarpley

    (2014, 2009a, 2010)

    Viabilidad

    del polen 30-32 Reproductivo Disminucin

    Mohammed y Tarpley

    (2014, 2010); Mohammed

    et al. (2013)

    Fotosntesis 30 Reproductivo Disminucin Mohammed et al. (2013)

    Finalmente, FEDEARROZ (2015) ha reportado que los episodios de altas temperaturas han

    reducido los rendimientos en las zonas arroceras de Colombia, disminuyendo la

    productividad del cultivo (Fig. 1), resaltando la importancia de caracterizar genotipos

    tolerantes y desarrollar estrategias que minimicen los perjuicios provocados por esta

    condicin abitica.

  • Marco Terico 19

    Figura 1. Efectos del fenmeno del nio (2009-2010) en los rendimientos de la zona de

    Espinal (Tolima). Fuente: FEDEARROZ (2015).

    1.3 LAS ALTAS TEMPERATURAS Y LA FENOLOGA DEL ARROZ

    Las respuestas fisiolgicas pueden variar segn la etapa fenolgica donde se presente la

    situacin estresante en el cultivo del arroz (Fageria, 2007; Yoshida, 1981). Asimismo,

    Yoshida (1981) reporta que el grado de afectacin de una alta temperatura sobre el

    porcentaje de esterilidad depende de factores como la etapa fenolgica donde se presente la

    condicin estresante y la duracin del periodo de estrs trmico. La tabla 2 resume los rangos

    de temperaturas medias diarias ptimos para el cultivo de arroz segn su etapa fenolgica.

    Tabla 2. Rangos ptimos de temperatura diaria para el desarrollo del arroz segn su etapa

    fenolgica. Informacin adaptada de Yoshida (1981).

    Etapa fenolgica Rango de Temperatura (C)

    Germinacin

    Emergencia 20-35

    25-30

    Macollamiento

    Antesis

    Maduracin

    25-31

    30-33

    20-25

  • 20 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Por otro lado, la literatura existente ha reportado ampliamente la influencia de la relacin

    etapa fenolgica, el genotipo y el estrs por altas temperaturas nocturnas sobre el

    rendimiento del cultivo (Fageria, 2007; Jagadish et al., 2014). En este sentido, Mohammed

    y Tarpley (2009b) no observaron ningn efecto de una alta temperatura nocturna sobre el

    nmero de macollas, cuando las plantas se sometieron a alta temperatura nocturna desde los

    20 das de emergencia hasta la cosecha, mientras Glaubitz et al. (2014) reportan que en 6 de

    12 genotipos evaluados la alta temperatura nocturna reduce el macollamiento en plantas de

    arroz expuestas a alta temperatura nocturna desde los 20 das despus de siembra hasta los

    46 das despus de siembra.

    En cereales, la formacin de polen es uno de los estados ms sensibles a la alta temperatura.

    Durante esta formacin, la mitosis 1 y 2 son los estados susceptibles (Barnabs et al., 2008),

    siendo el primera (estado uninucleado del polen) el ms susceptible a la alta temperatura.

    En varias especies (incluida el arroz), la alta temperatura provoca aborto del polen en este

    estado. La alta temperatura afecta el metabolismo de la microspora y puede disminuir la

    sntesis de protenas relacionadas con la sntesis de carbohidratos, lpidos, protenas

    antioxidantes y sntesis de la pared celular del polen (Sage et al., 2015). En antesis,

    temperaturas nocturnas superiores a 27C tambin reducen el peso del grano y disminuyen

    la emergencia de la pancula (Coast et al., 2015). En la ltima fase de desarrollo del cultivo

    (Maduracin), (Krishnan et al., 2011) reportan que la alta temperatura(34C) nocturna

    reduce la masa del grano en plantas de arroz.

    1.4 EL USO DE VARIABLES FISIOLGICAS EN EL FITOMEJORAMIENTO

    DE ARROZ

    Una de las estrategias para afrontar los efectos negativos de las altas temperaturas sobre el

    rendimiento de los cereales es la seleccin de genotipos tolerantes a dicha condicin

    ambiental (Araus et al., 2008). En este aspecto, el mejoramiento gentico de cultivos

    actualmente usa caractersticas fisiolgicas con el propsito de aumentar la eficiencia en la

    seleccin de genes (Reynolds et al., 2009; Jha et al., 2014). Por ejemplo, en la seleccin de

    genotipos de trigo tolerantes a alta radiacin y temperatura se han usado los parmetros de

    la fluorescencia de la clorofila y variables de intercambio gaseoso (Sayed, 2003; Monneveux

    et al., 2003). Adicionalmente, la caracterizacin de genotipos tolerantes a altas temperaturas

    nocturnas tiene en cuenta variables bioqumicas como el contenido de pigmentos

    fotosintticos (clorofilas y carotenoides), la produccin de osmolitos compatibles (glicina

    betaina, Prolina y azcares solubles) y la integridad de la membrana celular (Bita y Gerats,

  • Marco Terico 21

    2013). En arroz, se ha reportado que los genotipos tolerantes a altas temperaturas presentan

    una tasa de fotosntesis, respiracin, transporte de electrones, contenido de clorofila y

    rendimiento cuntico del fotosistema II estables bajo condiciones de altas temperaturas

    nocturnas (Glaubitz et al., 2014; Mohammed y Tarpley, 2014). Por lo anterior, estas

    variables han sido sugeridas como herramienta o marcadores para seleccionar genotipos con

    una posible tolerancia a diferentes condiciones de estrs abitico (Sayed, 2003; Araus et al.,

    2008).

    Actualmente, la utilizacin de algunos parmetros fisiolgicos y bioqumicos como la tasa

    fotosinttica y produccin de prolina han sido utilizados para en la caracterizacin de

    genotipos a condiciones de estrs abiticos especialmente bajo estrs de alta temperatura

    diurna en Colombia (Restrepo-Diaz y Garces-Varon, 2013; Snchez-Reinoso et al., 2014).

    Teniendo en cuenta lo anterior, el comportamiento de la planta bajo condiciones de estrs

    por una alta temperatura es regulado por varios procesos fisiolgicos (Mittler et al., 2012).

    Sin embargo, el pobre entendimiento de los complejos mecanismos de tolerancia trmica y

    la interaccin entre genotipo (G) vs ambiente (A) han sido uno de los cuellos de botella para

    el progreso de los programas de mejoramiento gentico (Jha et al., 2014). En este sentido,

    los estudios con plntulas de arroz han adquirido importancia con el propsito de conocer a

    profundidad los mecanismos de respuesta involucrados y as caracterizar el grado de

    tolerancia o susceptibilidad de los genotipos a condicin de estrs trmico durante los

    ltimos aos (Xue et al., 2012; Snchez-Reinoso et al., 2014). El conocimiento de la

    interaccin G x A mediante el estudio de procesos fisiolgicos y bioqumicos involucrados

    han adquirido importancia porque han permitido el uso de diferentes tcnicas en el

    mejoramiento clsico en Colombia con el propsito de un mejor direccionamiento y

    aprovechamiento del germoplasma desarrollado hasta ahora (FEDEARROZ, 2013).

    Se ha demostrado que algunos procesos fisiolgicos son ms sensibles a la alta temperatura

    y que la evaluacin de estos se puede usar para diferenciar susceptibilidad o cierta tolerancia

    de los genotipos estudiados. Estas variables fisiolgicas pueden aportar al mejoramiento

    gentico: aumentando el conocimiento de los factores que determinan el rendimiento y

    definiendo caractersticas secundarias (caractersticas diferentes al rendimiento) para

    seleccionar parentales (Araus et al., 2008).

    A continuacin, se enuncian los procesos tenidos en cuenta en este trabajo, algunas

    definiciones importantes y su relacin con un estrs trmico.

  • 22 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    1.4.1 La fotosntesis y sus componentes

    Fluorescencia de la Clorofila a

    La fluorescencia de la clorofila y el intercambio gaseoso pueden ser usados para fenotipar

    poblaciones menores a 100 individuos, para detectar diferencias cuando otras variables no

    las detectan (crecimiento o rendimiento) y para explicar la repuesta a estrs abiotico (Pask

    et al., 2012). En estrs por calor, se prefiere el uso de fluorescencia de la clorofila cuando

    se dispone de pocos recursos (principalmente tiempo) y cuando se estan estudiando muchos

    individuos (Pask et al., 2012).

    Fluorescencia es la re-emisin de energa en forma de fotn cuando un electrn vuelve a

    su estado fundamental desde un estado excitado (Cosgrove y Borowitzka, 2010). En el caso

    de la fluorescencia de la clorofila a, una molcula de la clorofila puede excitarse y alcanzar

    el estado singlete despus de absorber un fotn (Bolhr-Nordenkampf y quist, 1993), y

    volver a su estado fundamental luego de reemitir dicha energa en un haz de luz de menor

    energa.

    El anlisis de la fluorescencia de la clorofila a es una herramienta usada para conocer el

    comportamiento fotosinttico de las plantas, principalmente lo relacionado con la parte

    fotoqumica de la fotosntesis (Brestic y Zivcak, 2013; Guidi y DeglInnocenti, 2012).

    Cuando la energa lumnica es captada por la hoja, se puede disipar en forma de calor, en

    forma de fluorescencia o a travs de la fotoqumica (Baker, 2008). Estos procesos son

    competitivos, por lo que conocer el comportamiento de uno da informacin acerca de la

    eficiencia y el desempeo de los otros dos (Murchie y Lawson, 2013).

    Dependiendo del objetivo de la investigacin, el anlisis de la fluorescencia se puede hacer

    a nivel de nanosegundos o de minutos. El primero para conocer el estado de xido-reduccin

    de los primeros aceptores de electrones: la quinona A y la quinona B; y lo segundo para

    determinar el uso (o disipacin(quenching)) de la energa lumnica (Kalaji et al., 2014). Con

    base a lo anterior, el segundo enfoque fue utilizado en el presente trabajo de investigacin

    El anlisis de disipacin de la energa usa parmetros basados en la emisin de la

    fluorescencia en determinadas condiciones. As, Fm es la fluorescencia mxima emitida

    luego de someter la hoja a un haz de luz saturante (generalmente mayor a 3000 mol m-2 s-

    1), mientras Fo es la fluorescencia emitida luego de someter la hoja a un haz de luz no

    saturante y con tan baja intensidad (alrededor de 0,1 mol m-2 s-1) que no desencadene los

    mecanismos de disipacin de la energa (Baker, 2008). La diferencia entre estas dos

  • Marco Terico 23

    fluorescencias se denomina fluorescencia variable Fv, y la nomenclatura cuando se

    determinan luego de un haz de luz actnica es Fm, Fo y Fv. Con estos ndices y otros ms

    se determinan parmetros que dan informacin sobre el estado y la disipacin de la energa

    en los fotosistemas (Baker, 2008; Brestic y Zivcak, 2013)(Tabla 3):

    En arroz, el estrs por calor induce un incremento en NPQ y en el estado de de-epoxidacin

    del ciclo de las xantofilas (Yin et al., 2010). Una disminucin en la asimilacin de CO2

    acompaada por una no disminucin de Fv/Fm inducido por estrs por calor puede

    potencialmente exponer las plantas a un exceso de energa bajo condiciones lumnicas, lo

    cual si no se disipa de forma segura, puede resultar en un dao del PSII debido a una sobre-

    reduccin de los centros de reaccin (Xue et al., 2012) . Se dice que el PSII es el componente

    ms sensible a la alta temperatura: el dao puede ser directo o una disminucin en los

    mecanismos de reparacin (Yin et al., 2010). Esto tambin es reportado por Vani et al.

    (2001) quienes argumentan que la alta temperatura desorganiza los tilacoides y los

    complejos donadores y aceptores de electrones en el PSII.

  • 24 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Tabla 3. Parmetros de la fluorescencia derivados de la fluorescencia de la clorofila a

    Parmetro Formula Descripcin

    Fq, F Fm-F Disipacin fotoqumica de la

    fluorescencia cuando los centros de

    reaccin del PSII abiertos.

    Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm Eficiencia mxima potencial de la

    fotoqumica del PSII. Se considera que un

    valor menor a 0,83 ndica algn tipo de

    estrs en la planta (Baker, 2008; Murchie

    y Lawson, 2013)

    PSII, Y(II) Fq/Fm Eficiencia cuntica efectiva (operativa) de

    la fotoqumica del PSII a determinada

    intensidad lumnica.

    Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm Eficiencia mxima potencial de la

    fotoqumica del PSII a determinada

    intensidad lumnica.

    NPQ (Fm-Fm)/Fm disipacin no fotoqumica

    qP Fq/Fv Coeficiente de la disipacin fotoqumica

    basado en el puddle model (unidades del

    PSII desconectadas). Proporcin de

    centros de reaccin oxidados o mayor

    proporcin del estado reducido de Qa.

    qL (Fq/Fv)/(Fo/F) Coeficiente de la disipacin fotoqumica

    basado en el lake model(unidades del

    PSII conectadas).

    qN (Fm-Fm)/(Fm-Fo) Coeficiente de la disipacin no

    fotoqumica de la fluorescencia variable.

    NO, Y(NO) 1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)) Eficiencia cuntica de la disipacin no

    regulada de la energa en el PSII.

    NPQ, Y(NPQ) 1-Y(II)-Y(NO) Eficiencia cuntica de la disipacin

    regulada de la energa en el PSII. Asociado

    con la acidificacin del lumen tilacoidal y

    con el estado de de-epoxidacin del ciclo

    de las xantofilas.

    La misma tendencia es presentada por Song et al. (2013) quienes encontraron una

    disminucin de Fv/Fm y Y(II) asociada con un dao en la protena D1. Adems de esto, la

    conductancia estomtica se increment, as como la transpiracin y la concentracin

    intercelular de CO2, sugiriendo que la disminucin de la fotosntesis es debida a una

    limitacin no estomtica. Segn este autor un estrs leve (temperatura diurna

  • Marco Terico 25

    regenerar dicho fotosistema. El PSII es sensible debido a que la alta temperatura aumenta la

    fluidez de la membrana tilacoidal (Farooq et al., 2011).

    Teniendo en cuenta lo anterior, mantener alta la tasa fotosinttica y bajo NPQ bajo altas

    temperaturas puede disminuir la sobre-reduccin de la cadena transportadora de electrones

    y la produccin de H2O2 a travs de la fotorespiracin (Bahuguna et al., 2015). Por esto

    Krishnan et al. (2011) sugieren que una alta eficiencia del fotosistema II (Fv/Fm) y Fo se

    correlacionan con la tolerancia a altas temperaturas.

    Asimilacin de CO2

    Muchas investigaciones en arroz han demostrado que la asimilacin de CO2 disminuye al

    aumentar la temperatura diurna o nocturna (Laza et al., 2015; Mathur et al., 2014; Cui et al.,

    2006). Esto generalmente va acompaado de una mayor respiracin, menor crecimiento y

    menor eficiencia del fotosistema II. Sin embargo, la razn por la cual la asimilacin de CO2

    disminuye bajo altas temperaturas no est del todo clara.

    Las dos razones ms aceptadas son una disminucin en el estado de activacin de la Rubisco

    y la baja disponibilidad de RuBP (Kubien y Sage, 2008; Scafaro et al., 2010). La

    disminucin del estado activo de la Rubisco est asociado con una menor actividad de la

    Rubisco activasa, debido a que es ms sensible que la Rubisco a la alta temperatura (Salvucci

    y Crafts-Brandner, 2004). Por otro lado, la menor disponibilidad de RuBP est asociada con

    la disponibilidad de ATP y NADPH (productos de la cadena transportadora de electrones)

    y la actividad enzimtica del ciclo de Calvin (Yamori et al., 2011).

    Kubien y Sage (2008) concluyeron que el aumento del estado de activacin de la Rubisco

    no necesariamente aumenta la tasa de fijacin de CO2, ya que al mantener una alta relacin

    de Rubisco activasa/Rubisco no se aumenta la tolerancia a la alta temperatura (Kubien y

    Sage, 2008). Por otro lado, Wang et al. (2010) establecieron que un mayor estado de

    activacin de la Rubisco hace ms tolerante a las plantas de arroz a una alta temperatura, y

    que la isoforma grande de la Rubisco activasa es ms importante bajo una alta temperatura.

    Lo anterior es soportado por quienes establecieron que O. meridionalis es ms tolerante que

    O. sativa porque la asociacin Rubisco/Rubisco activasa es ms estable en O. meridionalis

    sometida a altas temperaturas (Scafaro et al., 2012).

    Aunque todava no est claro el mecanismo por el cual la asimilacin de CO2 disminuya por

    una alta temperatura. Se ha demostrado que una tasa de asimilacin de CO2 estable bajo

    condiciones estresantes puede ser un indicador de tolerancia (Ashraf y Harris, 2013; Guidi

  • 26 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    y DeglInnocenti, 2012). En el caso de la alta temperatura en arroz sucede lo mismo y la

    resistencia de los genotipos a la alta temperatura est asociada con una tasa constante de

    fotosntesis y con la capacidad de almacenar carbohidratos en el tallo (Farooq et al., 2011;

    Venkateswarlu et al., 2012).

    Pigmentos Fotosintticos

    Las clorofilas son pigmentos que absorben la luz entre los 400 y 700nm con una mayor

    absorcin a los 480nm y entre los 650 y 700nm, la luz verde (entre los 480 y 550nm) no es

    absorbida por estos pigmentos (Heldt, 2005; Taiz y Zeiger, 2006). Estos pigmentos captan

    la luz y la energa adquirida la transportan a los centros de reaccin de los fotosistemas

    donde a travs de un flujo de electrones, la luz es transformada en energa qumica (Heldt,

    2005).

    Los carotenoides son pigmentos isoprenoides con enlaces dobles que absorben la luz en la

    regin entre 400 y 500nm (Tanaka et al., 2008; Taiz y Zeiger, 2006). Esto pigmentos

    cumplen 3 funciones: captan energa y la transfieren a la clorofila (pigmentos accesorios),

    protegen el aparato fotosinttico de radicales como la clorofila en estrado triplete, el oxgeno

    singlete y otros ROS y participan en el ensamblaje de los LHC del PSI y en la estabilizacin

    de las membranas tilacoidales (funcin estructural) (Gill y Tuteja, 2010; Havaux, 1998).

    En cebada un aumento de la proporcin CAR/Chl es una adaptacin a alta temperatura y

    radiacin, provocado por una disminucin de Chl, principalmente. Esto confirma la idea de

    que la disminucin de la clorofila es una forma de captar menos energa y evitar el

    calentamiento de la hoja, provocado por la reduccin en la transpiracin (Havaux y Tardy,

    1999).

    Dentro de las caractersticas deseables en el mejoramiento gentico para la tolerancia a altas

    temperaturas estn la produccin de pigmentos fotoprotectores, estabilidad membranal,

    vigor temprano y senescencia tarda (Cossani y Reynolds, 2012). Lo anterior es soportado

    por la respuesta de NL-44, un genotipo tolerante a alta temperatura que mantiene su verdor

    relativo (contenido de clorofila) y su capacidad fotosinttica, lo que le permite sobrevivir

    tanto en estado vegetativo como reproductivo (Bahuguna et al., 2015).

  • Marco Terico 27

    1.4.2 Reproduccin y Rendimiento

    El estado reproductivo es el ms susceptible a las altas temperaturas, tanto diurnas como

    nocturnas. La alta temperatura acelera el desarrollo de la inflorescencia, disminuye la

    viabilidad del polen, el crecimiento del tubo polnico y perjudica el desarrollo de los ovarios

    (Jagadish et al., 2015).

    En cereales, la formacin de polen es uno de los estados ms sensibles a la alta temperatura.

    La mitosis 1 y 2 durante la formacin del grano de polen son muy sensibles a las altas

    temperaturas (Barnabs et al., 2008). La primera, que corresponde al estado uninucleado del

    polen es el ms susceptible a la alta temperatura. En varias especies (incluida el arroz), la

    alta temperatura provoca aborto del polen en este estado. La alta temperatura afecta el

    metabolismo de la microspora y puede disminuir la sntesis de protena relacionada con

    sntesis de carbohidratos, lpidos, protenas antioxidantes y sntesis de la pared celular del

    polen (Sage et al., 2015).

    La meiosis, proceso previo a la mitosis durante la microsporognesis, tambin puede ser

    afectada por la alta temperatura. Un efecto negativo de la alta temperatura en este proceso

    disminuye el nmero de clulas madre de las microsporas, y por tanto el nmero de granos

    de polen. Finalmente, aunque el polen madure, tambin puede ser inviable si se presentan

    altas temperaturas (>30 por minutos u horas) o puede quedarse en las anteras debido a una

    menor dehiscencia de estas ltimas. Todo esto se traduce en una menor fertilidad de la

    espiguilla y menor rendimiento.

    La alta temperatura diurna reduce la viabilidad del polen, el crecimiento del tubo polnico,

    lo que se traduce en menor fertilidad de la espiguilla. La reciente literatura muestra los

    mismos efectos bajo alta temperatura nocturna (Jagadish et al., 2015). Luego de la

    polinizacin, se puede presentar una pobre geminacin del polen, (crecimiento del tubo

    polnico) debido a la degradacin del tejido encargado de la nutricin del tubo polnico o a

    la formacin de granos de polen inmaduros (Barnabs et al., 2008). Luego de la formacin

    del polen la alta temperatura puede evitar dehiscencia de las anteras disminuyendo la

    cantidad de polen disponible para la polinizacin (Bokszczanin y Fragkostefanakis, 2013).

    El hecho que se afecte el nmero de granos o el tamao del grano depende del estado

    fenolgico en el que se haya presentado la alta temperatura. Si fue durante la formacin de

    la pancula y la antesis se afectara el nmero de granos, mientras si es durante el llenado del

    grano se afectara el tamao y peso del grano (Farooq et al., 2011).

  • 28 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Los genotipos tolerantes tienden a mantener su rendimiento, fertilidad de las espiguillas,

    viabilidad del polen y capacidad fotosinttica (Poli et al., 2013). Adems de estas

    caractersticas, genotipos tolerantes como N22 acumula heat shock proteins HSP y cold

    shock proteins CSP cuando es sometido a un estrs trmico, lo que podra explicar su

    tolerancia y alta fertilidad bajo el estrs por alta temperatura (Jagadish et al., 2010).

    1.4.3 Peroxidacin Lipdica de membranas

    Cuando se presenta una condicin estresante, la capacidad fotosinttica de la planta

    disminuye, lo que la hace ms susceptible a la fotoinhibicin (disminucin de la tasa

    fotosinttica provocada por la luz) (Gururani et al., 2015; Murata et al., 2007). Una

    condicin estresante generalmente disminuye la asimilacin de CO2 por una menor actividad

    de la Rubisco, la Rubisco activasa o por una disminucin en la protena D1 del PSII, lo que

    provoca fotoinhibicin (Gururani et al., 2015).

    Durante este proceso los electrones procedentes de la clorofila no pueden ser disipados de

    forma segura y se producen especies reactivas de oxgeno (ROS)(Gill y Tuteja, 2010). Estas

    especies reactivas pueden daar lpidos, protenas y el ADN, lo que produce radicales libres

    lipdicos y disminuye la funcionalidad de organelos celulares (Apel y Hirt, 2004).

    Una de las formas de medir la peroxidacin lipdica es cuantificar la produccin de

    malondialdehdo (MDA). El MDA es el producto de la peroxidacin del cido linolnico, el

    cual es uno de los componentes principales de la membrana celular. Esta peroxidacin daa

    la membrana, disminuyendo su selectividad y aumentando su fluidez (Gill y Tuteja, 2010).

    Debido a que la peroxidacin lipdica es una de las principales consecuencias de la

    produccin de especies reactivas de oxgeno provocado por una condicin estresante, tanto

    los niveles de ROS como los de TBARS (sustancias reactivas con el cido tiobarbitrico, un

    ejemplo es el MDA ) son considerados indicadores bioqumicos de la severidad del estrs

    por calor (Bahuguna et al., 2015).

    Teniendo en cuenta lo anterior se considera que la tolerancia a alta temperatura nocturna

    (Narayanan et al., 2016; Bahuguna et al., 2015; Zhou et al., 2012), a salinidad (Lutts et al.,

    1996) y a una alta temperatura diurna(Zhou et al., 2012) se manifiesta como una menor

    peroxidacin lipdica (MDA). Asimismo, la prdida de electrolitos se usa como indicador

    del dao membranal ya que correlaciona con la peroxidacin lipdica y en varios casos con

    la senescencia y capacidad fotosinttica de la planta (Mantri et al., 2012).

  • Marco Terico 29

    1.4.4 Osmolitos compatibles (Prolina)

    La prolina es un aminocido no estructural que generalmente se acumula en plantas cuando

    se presenta una condicin estresante (Ashraf y Foolad, 2007); la mayor cantidad de reportes

    la asocian con salinidad, pero tambin se acumula cuando se presenta dficit hdrico, alta

    radiacin, contaminacin por metales pesados, deficiencia de nutrientes, temperaturas

    extremas y estrs oxidativo (Szabados y Savour, 2010; Hare y Cress, 1997).

    En condiciones de estrs se ha reportado que la prolina cumple las siguientes funciones

    (Szabados y Savour, 2010; Ashraf y Foolad, 2007; Wahid et al., 2007):

    - Ajuste osmtico.

    - Eliminacin de radicales libres.

    - Mantenimiento del balance de xido-reduccin (NADPH/NADP).

    - En algunos casos promueve la transcripcin de genes relacionados con la tolerancia

    al estrs.

    - Estabilizacin de estructuras sub-celulares.

    Debido a lo anterior la prolina se ha usado para aliviar el estrs (Wahid et al., 2007) o como

    un indicador de tolerancia a condiciones estresantes (Szabados y Savour, 2010). Por

    ejemplo Kumar et al. (2011) determinaron que bajo una alta temperatura, plntulas de arroz

    y de maz acumulan mayor cantidad de prolina como una respuesta al estrs provocado por

    la alta temperatura. Otro ejemplo lo reporta Yan et al. (2012) en trigo, quienes descubrieron

    que el estrs trmico daa la seccin donadora y receptora de electrones del PSII y que este

    efecto es aliviado por una mayor produccin de prolina provocada por una aplicacin previa

    de sal.

    Como se enuncio antes, la alta temperatura puede producir ROS, disminuir la tasa de

    transporte de electrones lo que afecta la relacin NADPH/NADP (Vani et al., 2001b) y

    desorganiza los tilacoides (Vani et al., 2001a). Estos efectos podran ser aliviados por la

    prolina, teniendo en cuenta las funciones de este aminocido (Szabados y Savour, 2010).

    Aunque, la acumulacin de prolina este asociada con funciones que promueven la tolerancia

    o alivian los efectos negativos del estrs. Mani et al. (2002) reportan que en mutantes que

    sobre producen prolina o que no la degradan, los efectos no son positivos y pueden provocar

    malformaciones en las plantas. Teniendo en cuenta esto, Szabados y Savour (2010)

    enuncian que las funciones positivas de la acumulacin de prolina pueden estar asociadas a

    los procesos de sntesis de prolina y no a la acumulacin de la misma.

  • 30 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    Con base en el anterior marco terico se espera que la alta temperatura nocturna (30C)

    disminuya el crecimiento y rendimiento de los genotipos a evaluar y que las variables

    relacionadas con fotosntesis y componentes de rendimiento sean los mejores indicadores

    de tolerancia o susceptibilidad a una alta temperatura nocturna.

  • Objetivos 31

    2. OBJETIVOS

    Con el propsito de desarrollar la hiptesis de trabajo, los siguientes objetivos fueron

    planteados:

    2.1 Objetivo General

    Caracterizar el comportamiento fisiolgico y agronmico de siete genotipos de arroz

    sometidos a una alta temperatura nocturna (30C).

    2.2 Objetivos Especficos

    Evaluar el efecto de cuatro diferentes periodos de dos temperaturas nocturnas (24 y

    30C) sobre la fotosntesis y respiracin de un genotipo susceptible a estrs trmico

    diurno.

    Caracterizar la tasa fotosinttica, respiratoria, parmetros de crecimiento y de

    rendimiento de siete genotipos de arroz a una alta temperatura nocturna (30C).

    Identificar la utilidad de variables fisiolgicas como la fotosntesis, parmetros de la

    fluorescencia de la clorofila a y pruebas bioqumicas como herramientas en la

    seleccin de genotipos de arroz tolerantes a condiciones de altas temperaturas

    nocturnas para programas de mejoramiento gentico.

  • Materiales y Mtodos 33

    3. MATERIALES Y MTODOS

    Con el fin de cumplir los objetivos propuestos en el presenta trabajo, se desarrollaron 3

    experimentos. En el primero, se evalu el efecto de cuatro periodos de dos temperaturas

    nocturnas (24 y 30C) sobre la fotosntesis y respiracin en un genotipo susceptible a estrs

    trmico diurno. En el segundo, se caracteriz la tasa fotosinttica, respiratoria y parmetros

    de crecimiento, de seis genotipos de arroz en fase vegetativa, a una alta temperatura nocturna

    (30C). En el tercero, se evalu la eficiencia del PSII y parmetros de rendimiento de siete

    genotipos de arroz sometidos a una alta temperatura nocturna (30C).

    A continuacin, se enuncian las metodologas usadas en cada uno de los experimentos

    citados:

    3.1 RESPUESTA FISIOLGICA DE PLANTULAS DE ARROZ F60 SOMETIDAS

    A PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA.

    3.1.1 Condiciones generales del experimento

    Se sembraron semillas del cultivar Fedearroz 60 ('F60'): es una variedad con buenos

    rendimientos (mayor a 6 t ha-1) en cultivos comerciales, grano largo, buena calidad de

    molino pero susceptible a altas temperaturas diurnas (Snchez-Reinoso et al., 2014), en

    materas plsticas con 450 mL de suelo. Las materas se dispusieron en un invernadero de

    vidrio localizado en la Universidad Nacional de Colombia, Campus Bogot. El invernadero

    cont con un controlador de humedad relativa y resistencias calefactoras con el fin de

    mantener las siguientes condiciones de crecimiento: temperatura diurna 31C, temperatura

    promedio nocturna 22C, humedad relativa promedio de 70% y fotoperiodo natural de 12 h.

    Se dispusieron dos plantas por matera las cuales fueron fertirrigadas diariamente con 50 mL

    de una solucin nutritiva que contena un fertilizante completo (Wuxal, Bayer

    CropScience, Bogot D.C., Colombia) a una dosis de 2 mL L-1 H2O, para una concentracin

    de nutrientes: Nitrgeno total 160 g L-1, (N amoniacal 38 g L-1, N ntrico 12 g L-1, N ureico

    110 g L-1), Fsforo asimilable (P2O5) 160 g L-1, Potasio soluble (K2O) 120 g L

    -1, Boro (B)

    10 g L-1, Cobre (Cu)* 0,21 g L-1, Hierro (Fe) 0,43 g L-1, Manganeso (Mn) 0,36 g L-1,

    Molibdeno (Mo) 0,07 g L-1, Zinc (Zn)*:10 g L-1. (* Quelatados con EDTA pH en solucin

    al 10% 6.5, Densidad a 25C 1.40 g cm-3).

  • 34 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    3.1.2 Tratamientos

    A los 45 das despus de emergencia (DE), los tratamientos de estrs trmico fueron

    establecidos y consistieron en exponer un grupo de plantas de arroz (48 plantas de las 96

    que conformaban el experimento) a una temperatura nocturna de 30C y otro grupo de

    plantas (las restantes 48) a una temperatura nocturna de 24C entre las 18:00 y 24:00 horas

    a cuatro periodos de estrs (4, 8, 12 y 16 das). La temperatura nocturna de 30C se impuso

    mediante el traslado de 48 plantas desde el invernadero a una cmara de crecimiento (MLR-

    351H, Sanyo, Bensenville, Illinois, USA) a las 18:00 horas. Luego, las plantas eran

    retornadas al invernadero a las 06:00. En cada periodo de muestreo (4, 8, 12 y 16 das) se

    tomaron 12 plantas de cada uno de los tratamientos por temperatura (24 y 30C), para

    determinar las variables de respuesta.

    Las condiciones de crecimiento en la cmara eran las siguientes: un primer periodo de

    temperatura nocturna de 30C entre las 18:00-24:00 horas y un segundo periodo de 20C

    entre las 00:00 y 06:00 horas. La humedad relativa fue del 70% durante toda la noche. Las

    plantas control eran aquellas que siempre estuvieron en el invernadero a lo largo del

    experimento (48 plantas) con una temperatura promedio nocturna de 24C entre las 18 y 24

    horas y 20C entre las 00:00 y 06:00. Asimismo, se seleccion una alta temperatura nocturna

    de 30C porque es superior a las temperaturas ptimas para el crecimiento y desarrollo de

    la planta de arroz (entre 23 y 25C segn Krishnan et al., (2011) y Mohammed y Tarpley,

    2014a). Adicionalmente, los cuatro diferentes periodos de estrs trmico (4, 8, 12 y 16 das)

    fueron establecidos siguiendo la frecuencia con que se han registrado estas condiciones

    ambientales durante los ltimos aos en las zonas productoras de arroz en Colombia.

    Finalmente, el experimento duro 61 das.

    3.1.3 Fotosntesis, conductancia estomtica, y transpiracin

    Estas variables fueron determinadas con un medidor de fotosntesis porttil (LSPro-SD,

    ADC BioScientific Ltd.UK). Las mediciones fueron desarrolladas en la parte media de la

    penltima hoja del tallo principal de cada plntula, entre las 9am y las 12m. (Mohammed

    et al., 2013; Mohammed y Tarpley, 2014). Las condiciones de la cmara de medicin

    fueron: flujo fotnico constante de 1200 mol m-2 s-1, temperatura promedio de 302C y

    concentracin de CO2 de 36810 mol mol-1 (Temperatura y concentracin de CO2

    ambientales).

  • Materiales y Mtodos 35

    3.1.4 Uso eficiente del agua y eficiencia de carboxilacin

    Estas dos variables fueron calculadas mediante las ecuaciones descritas por Kumar et

    al.(2001) y Sikder et al. (2015)

    () =

    () =

    Donde Pn, E y Ci son la tasa fotosinttica, la transpiracin y la concentracin de dixido de

    carbono subestomtico, respectivamente.

    3.1.5 Eficiencia mxima del PSII (Fv/Fm)

    La relacin se determin con un fluormetro no modulado (Handy PEA, Hansatech

    Instruments, Kings Lynn, UK) en la misma hoja y a la misma hora que se realizaron las

    mediciones de intercambio gaseoso. Para esto, las hojas fueron sometidas a 20 minutos de

    oscuridad y luego se aplic un pulso de luz de 0,1 mol m-2s-1 para determinar la

    fluorescencia mnima (Fo). Posteriormente, se aplic un pulso de saturacin de 3000 mol

    m-2 s-1 y se determin la fluorescencia mxima Fm. Con estos datos se determin Fv/Fm =

    (Fm/(Fm-Fo)).

    3.1.6 Contenido de clorofila a, clorofila b y carotenoides

    Cincuenta miligramos de hojas frescas fueron macerados en un mortero con nitrgeno

    lquido. Luego, la muestra se llev a un volumen de 5mL con acetona al 80% y se centrifug

    a 7000g durante 10 minutos. Despus, se determin la absorbancia a longitudes de onda de

    663nm, 647nm y 470nm con un espectrofotmetro BioMate 3 UV-Vis (Wisconsin, USA).

    Los contenidos de clorofila a, b y carotenoides en hojas (mg L-1) se determinaron mediante

    las formulas descritas por Lichtenthaler (1987) y Solarte et al. (2010)

  • 36 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    3.1.7 Respiracin oscura de la hoja

    Esta variable fue determinada usando un equipo de fotosntesis porttil LSPro-SD (ADC

    BioScientific Ltd. UK.) en la parte media de la penltima hoja de cada plntula (misma hoja

    usada en fotosntesis) entre las 21:00 y las 24:00 horas, como lo describen Mohammed y

    Tarpley (2009b). En ambos tratamientos, se ajust el flujo fotnico a 0 mol m-2s-1 y la

    temperatura de la cmara a 30C o 24C dependiendo del tratamiento. La respiracin oscura

    se asumi como la prdida de CO2 proveniente de la hoja.

    3.1.8 Contenido de Prolina

    El contenido de Prolina se determin siguiendo el protocolo de Bates et al. (1973)

    modificado por Solarte et al. (2010) donde se tomaba 100 mg de tejido vegetal y se

    homogenizaban en 5 mL de cido sulfosaliclico al 3%. Posteriormente, la muestra era

    centrifugaba a 4000g durante 30 minutos. Luego, en un tubo falcon se mezcl 1 mL del

    sobrenadante con 1 mL de ninhidrina en medio cido y 1 mL de cido actico glacial. La

    anterior mezcla fue agitada durante 1 minuto y en seguida sometida a bao mara a 95C

    por una hora. Despus de este periodo de tiempo, la reaccin fue detenida con hielo.

    Finalmente, el producto de la reaccin fue extrada con 3 mL de tolueno, agitando

    vigorosamente los tubos con un vrtex. La absorbancia fue medida a 520 nm usando un

    espectrofotmetro (Spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Madison, WI, USA). El

    contenido de Prolina se determin usando una curva de calibracin y la siguiente ecuacin:

    =

    [(

    )

    115.5

    ]

    [

    5]

    3.1.9 Peroxidacin Lipdica

    Para la determinacin de la peroxidacin lipdica (representada como contenido de

    Malondialdehdo-MDA) se emple el mtodo del cido tiobarbitrico (TBA) descrito por

    Hodges et al. (1999): Se homogenizaron 300 mg de hojas completamente desarrolladas con

    nitrgeno lquido. Posteriormente, el homogenizado se mezcl con 3 mL de cido

  • Materiales y Mtodos 37

    tricloroactico al 0,1%. La mezcla se centrifug a 3000g por 10 min. Del sobrenadante se

    extrajeron 2 mL para reaccionar en dos tubos de ensayo de la siguiente manera: (a) Con

    TBA (+TBA); 1 mL de sobrenadante con 4 mL de cido tricloroactico al 10% ms cido

    tiobarbitrico al 0,65%, (b) Sin TBA (TBA); 1 mL de sobrenadante con 4mL de cido

    tricloroactico al 10%. Posteriormente, los tubos de ensayo fueron llevados a bao mara a

    95C durante 25 min y la reaccin se detuvo con hielo. Las muestras fueron centrifugadas

    nuevamente a 3000 g por 10 min y se leyeron las absorbancias a 440, 532 y 600 nm usando

    un espectrofotmetro (BioMate 3 UV - Vis, WI, USA). Todas las variables fisiolgicas y

    bioqumicas se midieron a los 4, 8, 12 y 16 das despus de iniciados los tratamientos tanto

    en las plantas sometidas a 30C como a 24C. Para obtener la concentracin de MDA se us

    la siguiente ecuacin, asumiendo un coeficiente de extincin del MDA de 157 M mL-1:

    = [ 532+ 600+ ( 532 600)]

    = [( 440+ 600+) 0,0571]

    ( 1) = ( 157000 ) 106

    3.1.10 Anlisis Estadstico

    Los datos fueron analizados mediante un diseo factorial (temperatura nocturna (24 y 30C)

    vs tiempo de exposicin (4, 8, 12 y 16 das) para un total de 8 tratamientos. Cada tratamiento

    estuvo compuesto por 6 unidades experimentales y cada unidad experimental correspondi

    a dos plantas. A los datos obtenidos, se les realizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov

    y de Levene para comprobar normalidad y homogeneidad de varianza, respectivamente.

    Luego, se desarroll un anlisis de varianza ANOVA. Cuando se observaron diferencias

    significativas, se realiz una prueba de Tukey o contrastes polinmicos con el programa

    SPSS (v20.0, IBM Company, USA).

  • 38 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    3.2 RESPUESTA FISIOLGICA DE SEIS GENOTIPOS DE ARROZ EN

    ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

    3.2.1 Tratamientos

    Para el desarrollo del estudio se us un genotipo susceptible a una alta temperatura diurna

    ('F60) (Snchez-Reinoso et al. 2014) y cinco genotipos caracterizados por buen

    comportamiento bajo condiciones de altas temperaturas tanto diurnas como nocturnas

    utilizadas por la Federacin Nacional de Arroceros dentro de sus programas de

    fitomejoramiento (IR 1561, FLO 2764, LV447-1, CT19021, LV1401). Cuando las plantas

    alcanzaron los 32 das despus de emergencia (DE), estas fueron divididas en dos grupos de

    16 plantas cada uno. El primer grupo siempre permaneci en el invernadero. Mientras el

    segundo grupo fue ubicado en una cmara de crecimiento (MLR-351H, Sanyo, Bensenville,

    Illinois, USA) a una temperatura de 30C entre las 18:00 y 24:00 h y de 20C entre las 00:01

    y 06:00 por un periodo de 8 das. Cuando finalizaba el periodo de exposicin en la cmara

    de crecimiento, las plantas de arroz siempre eran retornadas a las condiciones de

    invernadero. El experimento termino a los 40 DE.

    3.2.2 Condiciones generales de crecimiento

    El ensayo se desarroll bajo condiciones de invernadero ubicado en la Facultad de Ciencias

    Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot. Las condiciones de

    crecimiento en el invernadero fueron las siguientes: temperatura diurna 30C, temperatura

    nocturna 24C, humedad relativa promedio de 70% y un fotoperiodo natural de 12 h. Se

    dispusieron dos plantas por matera de 450 mL de los diferentes genotipos a estudiar, las

    cuales fueron fertirrigadas diariamente con 80 mL de una solucin nutritiva que contena un

    fertilizante completo (Wuxal, Bayer CropScience, Bogot D.C., Colombia) a una

    concentracin de 2 mL L-1 H2O, siendo la concentracin del fertilizante la siguiente:

    Nitrgeno total 160 g L-1, (N amoniacal 38 g L-1, N ntrico 12 g L-1, N ureico 110 g L-1),

    Fsforo asimilable (P2O5) 160 g L-1, Potasio soluble (K2O) 120 g L

    -1, Boro (B) 10 g L-1,

    Cobre (Cu)* 0,21 g L-1, Hierro (Fe)0,43 g L-1, Manganeso (Mn)0,36 g L-1, Molibdeno (Mo)

    0,07 g L-1, Zinc (Zn)* 10 g L-1. (*Quelatados con EDTA pH de 6,5 en solucin al 10%,

    Densidad a 25C 1,40 g cm-3).

  • Materiales y Mtodos 39

    3.2.3 Fotosntesis

    Entre los 37 y 40 DE, La penltima hoja (de la base al pice) del tallo principal de cada

    planta fue utilizada para determinar la tasa asimilacin de CO2 mediante un medidor porttil

    de fotosntesis (LI-COR 6200, Lincoln, Nebraska, USA). Durante las medidas de

    fotosntesis, las condiciones en la cmara de medicin fueron las siguientes: Radiacin

    Fotosintticamente Activa (PAR) mayor a 800 mol m-2 s-1, temperatura de la hoja de 27

    5 C y diferencia presin de vapor de agua del aire y la hoja 1,8 0,5 kPa. La medicin de

    la tasa fotosinttica se realiz entre las 09:00 y las 12:00 h. Finalmente, para la

    determinacin de la tasa de asimilacin de CO2 se tomaron ocho plantas por tratamiento

    (doce tratamientos: 2 temperaturas x 6 genotipos).

    3.2.4 Eficiencia de Carboxilacin y Uso eficiente del agua

    La eficiencia de la carboxilacin se determino mediante la ecuacin de Sikder et al. (2015)

    nombrada en el apartado 3.1.4, y el uso eficiente del agua as:

    () =

    Donde Pn corresponde a la tasa fotosinttica, gS a la conductancia estomtica y WUEi al

    uso eficiente del agua Intrnseco.

    3.2.5 Respiracin oscura

    Para determinar esta variable se sigui la metodologa descrita por Snchez-Reinoso et al.

    (2014) que consiste en introducir las plantas en cmaras hermticas plsticas de 2 L de

    capacidad. Posteriormente, sensores de Gas CO2 infrarrojo (CO2-BTA, Vernier, Beaverton,

    OR, USA) fueron insertados en las cmaras y conectados a una interface porttil (LabQuest,

    Vernier, Beaverton, OR, USA). Antes de introducir las plantas en las cmaras hermticas,

    todas las macetas fueron cubiertas con una bolsa plstica para evitar la respiracin del suelo

    con el propsito de cuantificar nicamente la respiracin del tejido vegetal. Luego, las

    cmaras fueron colocadas en un cuarto oscuro por 300 segundos (s). Durante este periodo,

    el sensor estim cada 4 s la concentracin de CO2 (mg kg-1) en la cmara, obtenindose una

    curva de tendencia lineal. Para obtener la tasa de respiracin de la planta (mmol CO2 kg PF -1 h-1) se determin la pendiente de la regresin lineal (mg kg-1/s) y se calcul sobre el peso

    fresco total de la planta. Las mediciones fueron desarrolladas en las mismas fechas y el

    mismo nmero de plantas donde se obtuvieron las medidas de fotosntesis.

  • 40 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    3.2.6 Parmetros de Fluorescencia de la clorofila a

    Estos parmetros se calcularon en la parte media de la penltima hoja de cada planta (las

    mismas utilizadas para la estimacin de la Fotosntesis) entre las 9:00 am y las 13:00 horas

    justo al finalizar el ensayo (40 DE). La fluorescencia de la clorofila fue estimada con un

    fluormetro modulado MINI-PAM (Heinz Walz, Effieltrich, Germany). Las hojas se

    mantuvieron en la oscuridad por 20 minutos antes de medir Fv/Fm. La fluorescencia mnima

    (Fo) fue medida con un pulso de luz modulado menor a 50 mol m-2 s-1 y la mxima

    fluorescencia fue inducida por un pulso de 0,8s con una intensidad de 3000 mol m-2 s-1. El

    rendimiento cuntico potencial del PSII (Fv/Fm) fue determinado as: Fv/Fm = (Fm-Fo)/Fm.

    Para alcanzar el estado basal de la fotosntesis (Fs) las muestras se sometieron a una luz

    actnica de 900 mol m-2 s-1 y luego de esto se sometieron a un segundo pulso saturante

    (3000 mol m-2 s-1 por 0,8s) para obtener la mxima fluorescencia en estado adaptado a la

    luz (Fm). Se calcul Fo mediante la frmula de Oxborough y Baker (1997): Fo= 1/(1/Fo-

    1/Fm+1/Fm). Con las variables anteriores y de acuerdo con Brestic y Zivcak (2013) se

    estim: el rendimiento cuntico real del fotosistema II (PSII= Fm-F/Fm), Rendimiento

    cuntico de la disipacin de la energa no regulada (NO = 1/ (NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)),

    rendimiento cuntico de la disipacin de la energa regulada(NPQ = 1 - PSII NO),

    disipacin no fotoqumica (NPQ = (Fm-Fm)/Fm), coeficiente de disipacin fotoqumica

    basado en el Lake model (qL = ((Fm-Fs)/(Fm-Fo)*(Fo/Fs) y coeficiente de disipacin

    no fotoqumica de la fluorescencia variable (qN = Fm-Fm/Fm-Fo).

    3.2.7 Parmetros de Crecimiento

    Al finalizar los tratamientos, cuatro plantas por tratamiento se sometieron a 70C por 48h

    con el fin de determinar la acumulacin de masa seca por rgano (tallo+vaina foliar y lamina

    foliar). Se determin el rea foliar de las lminas foliares de cada planta usando un medidor

    de rea foliar LI-3000C (LI-COR Lincoln, Nebraska, USA). Con las anteriores variables se

    determin masa foliar especifica (relacin masa foliar/rea foliar de cada planta) y la

    relacin hojas/tallo (masa de hojas/masa de tallo+vaina foliar por planta)

    3.2.8 Prdida de electrolitos

    Esta variable fue determinada mediante el protocolo del porcentaje de fuga de electrolitos

    descrito por Sanchez-Reinoso et al. (2014). Despus del perodo de estrs a los 40 DE,

    aproximadamente 300 mg de hojas frescas fueron cortados en trozos de 1 cm de longitud y

  • Materiales y Mtodos 41

    colocadas en tubos de ensayo con 30 mL de agua desionizada. Posteriormente, los tubos

    fueron incubados en bao mara a 30C por 2 h y se determin la conductividad elctrica

    inicial (CE1). Posteriormente, las muestras fueron sometidas a 100C en bao mara por 15

    min para liberar todos los electrolitos. Finalmente, se enfri la muestra en cama de hielo y

    se determin la conductividad elctrica final (CE2). El porcentaje de electrolitos se calcul

    as:

    % = (12

    ) 100

    3.2.9 Clorofila y Carotenoides

    A los 40 DE, trozos de lmina foliar de 1 cm de longitud (50 mg de peso fresco) de una hoja

    completamente desarrollada fueron macerados usando nitrgeno lquido y almacenados a -

    80 C hasta que se realizaron los respectivos anlisis (descrito en el apartado 3.1.6).

    3.2.10 Prolina y Malondialdehdo (MDA)

    Despus de los ocho das del periodo de estrs (40 DE), se maceraron 300 mg de hojas

    completamente desarrolladas del tallo principal con nitrgeno lquido y se conservaron a

    una temperatura de -80C hasta su anlisis: el cual corresponde al del apartado 3.1.8.

    Para la determinacin de la peroxidacin lipdica (representada como contenido de MDA)

    se emple el mtodo del cido tiobarbitrico (TBA) descrito por Hodges et al. (1999), el

    cual tambin es descrito en el apartado 3.1.9.

    3.2.11 Diseo experimental y anlisis estadstico

    Se realiz un diseo en arreglo factorial con ocho plantas por tratamiento, donde el factor

    principal fueron los genotipos (F60, LV447, FLO2764, LV1401, CT19021, IR1561) y el

    factor secundario fue la temperatura nocturna (24 vs 30 C). Cuando se presentaron

    diferencias significativas, se us el test de Tukey como prueba de comparacin de medias.

    Los datos se analizaron usando el programa SPSS (v20.0, IBM Company, USA).

  • 42 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

    (Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

    3.3 CARACTERIZACIN FISIOLGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

    SOMETIDOS A UNA