Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz … · eficiente del agua intrínseco (D) de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y * representan no significativo

Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos

de Arroz (Oryza sativa L.) a Diferentes

Temperaturas Nocturnas

Oscar Humberto Alvarado Sanabria

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronoma

Bogot, Colombia

2016

II Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz (Oryza sativa L.)

a Diferentes Temperaturas Nocturnas

Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos

de Arroz (Oryza sativa L.) a Diferentes

Temperaturas Nocturnas

Oscar Humberto Alvarado Sanabria

Trabajo de investigacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de:

Magister en Ciencias Agrarias con nfasis en Fisiologa de Cultivos

Director:

Ph.D. Hermann Restrepo Daz

Codirector:

Msc. Gabriel Garcs Varn

Fisiologa de Cultivos.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronoma

Bogot, Colombia

2016

Resumen y Abstract III

Resumen

La temperatura es uno de los principales factores que determina la distribucin y el potencial

desarrollo de una especie. En los ltimos aos la temperatura promedio ha aumentado en

todo el mundo y Colombia no ha sido la excepcin con un aumento de aproximadamente

2C en los ltimos 20 aos. Este aumento de la temperatura perjudica el crecimiento,

desarrollo y reproduccin de varias especies cultivables, dentro de ellas el arroz. Esta

especie es una de las principales fuentes de energa para la especie humana, por lo que

cualquier disminucin en sus rendimientos afecta la seguridad alimentaria del mundo. La

alta temperatura nocturna (ATN) ha mostrado ser uno de los factores ms perjudiciales para

el rendimiento del arroz. En el presente estudio se caracteriz la respuesta de siete genotipos

de arroz a una alta temperatura nocturna (30C) en estado de macollamiento y durante la

maduracin. Para esto se evaluaron variables de crecimiento, fotosntesis, variables

relacionadas con estrs oxidativo, y algunos componentes de rendimiento. Los resultados

indicaron que i) la alta temperatura nocturna afecta los procesos fisiolgicos (en estado

vegetativo) desde el cuarto da de exposicin ii) la alta temperatura nocturna disminuye el

crecimiento vegetativo debido a una menor asimilacin de CO2 y mayor respiracin iii) la

alta temperatura nocturna disminuye el rendimiento por pancula del genotipo F50 y lo

aumenta en CT19021 debido a una mayor y menor produccin de granos vanos,

respectivamente. Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, el uso de

variables fisiolgicas y bioqumicas como posibles indicadores de tolerancia o

susceptibilidad a un estrs por alta temperatura podran ser: En estado vegetativo la

asimilacin de CO2, el contenido de clorofila y carotenoides, el contenido de MDA y la

respiracin; en estado reproductivo el nmero de granos producidos y el porcentaje de

fertilidad, mientras variables como, conductancia estomtica, contenido de prolina y

fluorescencia de la clorofila a varan en el tiempo o no presentan cambios al aumentar la

temperatura nocturna, por lo que no seran buenos indicadores del estrs provocado por una

alta temperatura nocturna.

Palabras clave: fotosntesis, estrs abitico, estrs oxidativo, fluorescencia, genotipo,

clorofila.

IV Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz (Oryza sativa L.)

a Diferentes Temperaturas Nocturnas

Abstract

Temperature is one of the main factors that determine the distribution and the potential

development of a species. In recent years the average temperature has increased worldwide,

and Colombia is no exception with an increase of about 2 C in the last 20 years. This

increase in temperature impairs growth, development and reproduction of several crop

species within them rice. This species is one of the main sources of energy for the human

species, so any decline in yields affects food security in the world. The high night

temperature has proved one of the most damaging rice yield factors. In this study the

response of seven lines of rice at high night temperature (30 C) and tillering state during

grain filling was characterized. For this growth variables, photosynthesis, oxidative stress-

related variables, and some yield components were evaluated. The results indicated that i)

the high night temperature affects physiological processes (vegetative state) from four days

of exposure and these vary over time ii) the high night temperature decreases vegetative

growth due to lower CO2 assimilation and greater respiration iii) high night temperature

decreases production / panicle genotype F50 and CT19021 increases due to a higher

production and lower openings, respectively grains. Because of its stability over time and

that regardless of genotype tends to exhibit the same behavior, the following variables as

potential indicators of stress are suggested for high temperature CO2 assimilation, number

and percentage of grain produced vaneamiento, while variables such as, stomatal

conductance, MDA and proline content are variable in time or are unchanged by increasing

the night temperature, so they would not be good indicators of this stress.

Keywords: Photosynthesis, Abiotic stress, oxidative stress, fluorescence, genotype,

chlorophyll

Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

(Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

V

CONTENIDO

Pg.

Resumen .............................................................................................................................. III

Abstract ............................................................................................................................... IV

Lista de figuras ................................................................................................................. VIII

Lista de tablas ...................................................................................................................... X

Lista de Smbolos y Abreviaturas ....................................................................................... XI

INTRODUCCIN .............................................................................................................. 13

1. MARCO TERICO .................................................................................................... 15

1.1 FISIOLOGA DE LAS PLANTAS BAJO UNA ALTA TEMPERATURA ....15

1.2 RESPUESTA DEL CULTIVO DEL ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA

NOCTURNA ................................................................................................................16

1.3 LAS ALTAS TEMPERATURAS Y LA FENOLOGA DEL ARROZ............19

1.4 EL USO DE VARIABLES FISIOLGICAS EN EL FITOMEJORAMIENTO

DE ARROZ ..................................................................................................................20

1.4.1 La fotosntesis y sus componentes ..........................................................22

1.4.2 Reproduccin y Rendimiento .................................................................27

1.4.3 Peroxidacin Lipdica de membranas .....................................................28

1.4.4 Osmolitos compatibles (Prolina) ............................................................29

2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 31

2.1 Objetivo General ................................................................................................31

2.2 Objetivos Especficos ........................................................................................31

3. MATERIALES Y MTODOS .................................................................................... 33

3.1 RESPUESTA FISIOLGICA DE PLANTULAS DE ARROZ F60

SOMETIDAS A PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA. ..............33

3.1.1 Condiciones generales del experimento .................................................33

3.1.2 Tratamientos ...........................................................................................34

3.1.3 Fotosntesis, conductancia estomtica, y transpiracin ..........................34

3.1.4 Uso eficiente del agua y eficiencia de carboxilacin .............................35

3.1.5 Eficiencia mxima del PSII (Fv/Fm) ......................................................35

3.1.6 Contenido de clorofila a, clorofila b y carotenoides ...............................35

3.1.7 Respiracin oscura de la hoja .................................................................36

3.1.8 Contenido de Prolina ..............................................................................36

3.1.9 Peroxidacin Lipdica .............................................................................36

3.1.10 Anlisis Estadstico.................................................................................37

3.2 RESPUESTA FISIOLGICA DE SEIS GENOTIPOS DE ARROZ EN

ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA .............38

VI Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz


3.2.1 Tratamientos ...........................................................................................38

3.2.2 Condiciones generales de crecimiento ...................................................38

3.2.3 Fotosntesis .............................................................................................39

3.2.4 Eficiencia de Carboxilacin y Uso eficiente del agua ............................39

3.2.5 Respiracin oscura ..................................................................................39

3.2.6 Parmetros de Fluorescencia de la clorofila a ........................................40

3.2.7 Parmetros de Crecimiento .....................................................................40

3.2.8 Prdida de electrolitos ............................................................................40

3.2.9 Clorofila y Carotenoides .........................................................................41

3.2.10 Prolina y Malondialdehdo (MDA) ........................................................41

3.2.11 Diseo experimental y anlisis estadstico .............................................41

3.3 CARACTERIZACIN FISIOLGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ...............................42

3.3.1 Condiciones generales de crecimiento ...................................................42

3.3.2 Genotipos y tratamientos ........................................................................42

3.3.3 Componentes de rendimiento .................................................................43

3.3.4 Parmetros de Fluorescencia de la Clorofila a .......................................43

3.3.5 Contenido de Clorofila y Carotenoides ..................................................43

3.3.6 Prolina y Malondialdehdo (MDA) ........................................................43

3.3.7 Anlisis Estadstico.................................................................................44

4. RESULTADOS ........................................................................................................... 45

4.1 RESPUESTA FISIOLGICA DE PLANTULAS DE ARROZ SOMETIDAS A

PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA. ..........................................45

4.1.1 Fotosntesis, conductancia estomtica, transpiracin y concentracin

interna de CO2 .......................................................................................................45

4.1.2 Eficiencia de la carboxilacin y uso eficiente del agua ..........................46

4.1.3 Respiracin oscura y balance de carbono ...............................................47

4.1.4 Eficiencia del fotosistema II y contenido de pigmentos fotosintticos. .49

4.1.5 Peroxidacin lipdica y contenido de prolina .........................................50


ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA .............51

4.2.1 Fotosntesis, Eficiencia de la Carboxilacin y Uso eficiente del Agua ..51

4.2.2 Respiracin .............................................................................................52

4.2.3 Variables de Crecimiento .......................................................................53

4.2.4 Fluorescencia de la clorofila a ................................................................54

4.2.5 Fuga de electrolitos, MDA, Prolina y pigmentos fotosintticos.............55

4.3 CARACTERIZACIN FISIOLOGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ................................58

Contenido VII

4.3.1 Componentes de rendimiento (Nmero de granos vanos, Nmero de

granos llenos, Porcentaje de fertilidad y masa de granos llenos por pancula) .....58

4.3.2 Fluorescencia de la Clorofila a ...............................................................60

4.3.3 Pruebas bioqumicas (Pigmentos fotosintticos, MDA y Prolina) .........61

5. DISCUSIN ................................................................................................................ 63

5.1 PRIMER EXPERIMENTO: PERIODOS DE ESTRS ....................................63

5.2 SEGUNDO Y TERCER EXPERIMENTO: RESPUESTA DE SIETE

GENOTIPOS DE ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ............65

6. MODELO TERICO DEL EFECTO DE LA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

69

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 71

7.1 Conclusiones ......................................................................................................71

7.2 Recomendaciones ..............................................................................................71

Bibliografa ......................................................................................................................... 73

Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz


VIII

Lista de figuras

Figura 1. Efectos del fenmeno del nio (2009-2010) en los rendimientos de la zona de

Espinal (Tolima). Fuente: FEDEARROZ (2015). .............................................................. 19

Figura 2. Fotosntesis(A), Conductancia estomtica(B), transpiracin(C) y Concentracin

intercelular de CO2(D) de plntulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs

30C). Las ecuaciones representan el comportamiento cbico en el tiempo. n.s,*, ** y ***

representa no significativo y significancia con P0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente. Cada

punto representa el promedio de 12 valores. ...................................................................... 46

Figura 3. Eficiencia de carboxilacin(A) y Uso eficiente del agua(B) de plntulas de arroz

sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C). n.s y * representan no significativo y

significancia con P0,05 segn la prueba de Tukey, entre temperaturas para un mismo da.

Cada barra de grfico representa la meda de doce valores+Error estndar. ..................... 47

Figura 4. Respiracin oscura de plntulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas

(24 vs 30C). Las ecuaciones presentan un comportamiento cbico en el tiempo. * y ***

representan significancia con P0,05 y 0,001, respectivamente. Cada punto representa el

promedio de 12 valores. ...................................................................................................... 48

Figura 5. Balance de CO2 de plntulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24

vs 30C). n.s y * representan no significativo y significancia con P0,05, entre temperaturas

para un mismo da, segn la prueba de Tukey. Cada barra de grfico representa la meda de

doce valores+Error estndar. .............................................................................................. 48

Figura 6. Eficiencia mxima potencial del PSII (Fv/Fm) de plntulas de arroz sometidas a

dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C). n.s y * representan no significativo y significancia

con P0,05, entre temperaturas para un mismo da segn la prueba de Tukey. Cada barra de

grfico representa la meda de doce valores+Error estndar. ............................................ 49

Figura 7. Contenido de clorofila y carotenoides de plntulas de sometidas a dos

temperaturas nocturnas (24 vs 30C). Lneas con la letra L presentan un comportamiento

lineal (P0,001). Cada punto representa el promedio de 12 valores. ................................. 50

Figura 8. MDA(A) y contenido de Prolina (B) de plntulas de arroz sometidas a dos

temperaturas nocturnas (24 vs 30C). n.s y * representan no significativo y significancia con

Contenido IX

P0,05, entre temperaturas para un mismo da, segn la prueba de Tukey. Cada barra del

grfico representa la meda de doce valores+Error estndar. ............................................ 51

Figura 9. Fotosntesis (A), Eficiencia de la carboxilacin (B), CO2 intercelular (C), y Uso

eficiente del agua intrnseco (D) de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y *

representan no significativo y significancia con P0,05, entre temperaturas para un mismo

da, segn la prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticionesError

estandar. .............................................................................................................................. 52

Figura 10. Respiracin de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y * representan

no significativo y significancia con P0,05, entre temperaturas para un mismo da, segn la

prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticionesError estndar.... 53

Figura 11. Perdida de electrolitos (A) y Produccin de MDA (B) de hojas de plantas de seis

genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 8 repeticionesError. Asteriscos

significan diferencias significativas en la interaccin de Temperatura (T) x Genotipo (G) a

P0,05 de acuerdo con el ANOVA. .................................................................................... 56

Figura 12. Efecto de dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C) sobre el nmero total de

granos (A), de granos llenos (B), de granos vanos (C) y porcentaje de fertilidad (D) en siete

genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticionesError. Barras con

letras distintas indican diferencias significativas a P0,05 segn la prueba de Tukey. ..... 59

Figura 13. Masa de granos llenos de panculas de arroz bajo dos temperaturas nocturnas

(A) y en siete genotipos (B). Los datos representan el promedio de 6 repeticionesError

estndar. Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P0,05 segn la

prueba de Tukey. ................................................................................................................. 60

Figura 14. Rendimiento cuntico real del fotosistema II (Y(II))(A), Disipacin no

fotoqumica controlada (Y(NPQ))(B), Disipacin no fotoqumica no controlada (Y(NO))(C)

y Rendimiento cuntico potencial del PSII (Fv/Fm)(D) de la hoja bandera de siete genotipos

de plantas de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticionesError estndar.

Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P0,05 segn la prueba de

Tukey. ................................................................................................................................. 61

Figura 15. Modelo conceptual de los efectos y las caractersticas de tolerancia y

susceptibilidad de arroz sometido a altas temperaturas nocturnas (30C). Los smbolos

dentro de cada recuadro indican aumento (), disminucin () o sin cambios (=) del proceso

dentro del recuadro. El origen de la flecha roja indica las posibles causas de un proceso y el

final de la flecha roja indica el proceso afectado. ............................................................... 70

X Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz


Lista de tablas

Tabla 1. Efecto de la alta temperatura nocturna en procesos fisiolgicos del arroz .......... 18

Tabla 2. Rangos ptimos de temperatura diaria para el desarrollo del arroz segn su etapa

fenolgica. Informacin adaptada de Yoshida (1981). ....................................................... 19

Tabla 3. Parmetros de la fluorescencia derivados de la fluorescencia de la clorofila a ... 24

Tabla 4. Variables de crecimiento de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos

diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30C) ................................................................. 54

Tabla 5. Eficiencia mxima real y eficiencia mxima potencial y formas de disipacin de la

energa del PSII en hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos diferentes temperaturas

nocturnas (24 vs 30C) ....................................................................................................... 55

Tabla 6. Pigmentos fotosintticos y Prolina de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a

dos temperaturas nocturnas (24 vs 30C) ........................................................................... 57

Tabla 7. Contenido de Pigmentos fotosnteticos (Clorofilas y Carotenoides),

Malondialdehdo (MDA) y prolina en hojas banderas de siete genotipos de arroz expuestos

a dos diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30C). ....................................................... 62

Lista de Smbolos y Abreviaturas XI

Lista de Smbolos y Abreviaturas

ANOVA = Anlisis de varianza.

ATP = Adenosin Trifosfato.

CAR (x+c) = carotenoides.

CE = Eficiencia de carboxilacin.

Chl = Clorofila.

Chl a = Clorofila a.

Chl b = Clorofila b.

Ci= CO2 subestomtico.

DDE = Das de Exposicin.

DE = Das despus de emergencia.

E = Transpiracin.

Fm = Fluorescencia Mxima de hojas adaptadas a la Oscuridad.

Fm = Fluorescencia Mxima de hojas adaptadas a la Luz.

Fo = Fluorescencia Mnima de hojas adatadas a la Luz.

Fo = Fluorescencia Mnima de hojas adatadas a la Oscuridad.

Fv/Fm = Eficiencia mxima potencial del fotosistema II.

MF= Masa Fresca.

gS = conductancia estomtica.

ATN = Alta temperatura nocturna.

LHC = Complejo proteico cosechador de luz.

MDA = Malondialdehdo

NAD = Nicotin Adenin dinucleotido.

NADPH = Nicotin Adenin dinucleotido reducido.

NPQ = Disipacin no fotoqumica

PAR = Radiacin Fotosintticamente Activa.

Pn = tasa de asimilacin de CO2

PS = Fotosistema

PSI = Fotosistema I

PSII= Fotosistema II

Ro = Respiracin Oscura.

ROS = Especies Reactivas de oxgeno.

RuBisCO = Ribulosa 1,5 Bifosfato carboxilasa/oxigenasa.

RuBP = Ribulosa-1,5-bisfosfato.

TBA = cido Tiobarbitrico.

WUE= Uso eficiente del agua, hallado como tasa fotosinttica/tasa transpiratoria.

WUEi = Uso eficiente del agua intrnseco.

XII Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz


Y(II)= Eficiencia mxima real del fotosistema II.

Y(NO) = Eficiencia de la disipacin no fotoqumica no controlada.

Y(NPQ) = Eficiencia de la disipacin fotoqumica controlada

Introduccin 13

INTRODUCCIN

El cambio climtico ha generado condiciones adversas tales como periodos prolongados de

sequas, inundaciones y temperaturas extremas en varias regiones del mundo (Teixeira et

al., 2013). El cultivo del arroz es uno de los cereales con mayor importancia para la

alimentacin humana en el mundo (FAO, 2002). Y en Colombia ocup 455,000 ha

sembradas con una produccin de 1,925,687 toneladas durante 2013 (FEDEARROZ, 2015).

En este sentido, periodos de altas temperaturas tanto diurnas como nocturnas han sido

registrados en los ltimos aos en las zonas productoras de arroz en Colombia, observndose

un impacto negativo sobre el rendimiento de este cultivo (Castilla et al., 2010; Restrepo-

Diaz y Garces-Varon, 2013; Snchez-Reinoso et al., 2014).

El rendimiento del cultivo del arroz es fuertemente influenciado por factores ambientales

como luminosidad, disponibilidad de agua, nutrientes y la temperatura ambiental (Yoshida,

1981; Fageria, 2007). En cuanto a la temperatura ambiental, los periodos de exposicin de

cultivos de arroz a altas temperaturas diurnas como nocturnas han aumentado durante los

ltimos aos (Restrepo-Daz y Garcs Varn, 2013; Snchez-Reinoso et al. 2014). En este

aspecto, periodos de estrs trmico, especialmente, altas temperaturas nocturnas pueden

afectar negativamente la fisiologa y en consecuencia el rendimiento del cultivo del arroz

(Mohammed y Tarpley, 2014). En plntulas de arroz, altas temperaturas nocturnas (35-

45C) disminuyeron la asimilacin de CO2, la eficiencia del fotosistema II y la actividad de

la Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa/oxidasa (RuBisCO) (Yin et al., 2010). Adems de los

efectos sobre las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja, una alta temperatura

nocturna reduce el contenido de clorofila (Kumar et al., 2011; Dong et al., 2014), afectando

la relacin entre clorofila total y carotenoides (Song et al., 2013; Dong et al., 2014). Otra

respuesta fisiolgica, es el incremento de la respiracin nocturna expresado como perdida

de carbono (Lee y Akita, 2000; Mohammed y Tarpley, 2009b; Mohammed et al., 2013).

Tambin, es importante mencionar que el grado de afectacin negativa por una alta

temperatura nocturna sobre el rendimiento, est influenciada por el estado fenolgico donde

se presente esta condicin estresante (Fageria et al., 2007). Yoshida (1981) menciona que

las etapas de floracin y maduracin son etapas fenolgicas ms susceptibles a estreses

ambientales.

Una de las estrategias para afrontar los efectos negativos de las altas temperaturas sobre el

rendimiento de los cereales es la seleccin de genotipos tolerantes a dicha condicin

ambiental (Araus et al., 2008). En este aspecto, el mejoramiento gentico de cultivos

14 Respuestas Fisiolgicas de Siete Genotipos de Arroz

(Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

actualmente usa caractersticas fisiolgicas con el propsito de aumentar la eficiencia en la

seleccin de genes (Reynolds et al., 2009; Jha et al., 2014). Por ejemplo, en la seleccin de

genotipos de trigo tolerantes a alta radiacin y temperatura se han usado parmetros de la

fluorescencia de la clorofila y variables de intercambio gaseoso (Sayed, 2003; Monneveux

et al., 2003). Adicionalmente, la caracterizacin de genotipos tolerantes a altas temperaturas

nocturnas se tiene en cuenta variables bioqumicas como el contenido de pigmentos

fotosintticos (clorofilas y carotenoides), la produccin de osmolitos compatibles (glicina

betana, Prolina y azucares solubles) y la integridad de la membrana celular (Bita y Gerats,

2013). En arroz, se ha reportado que los genotipos tolerantes presentan una tasa de

fotosntesis, respiracin, transporte de electrones, contenido de clorofila y rendimiento

cuntico del fotosistema II estables bajo condiciones de altas temperaturas nocturnas

(Glaubitz et al., 2014; Mohammed y Tarpley, 2014). Por lo anterior, estas variables han sido

sugeridas como herramienta para seleccionar genotipos con una posible tolerancia a

diferentes condiciones de estrs abitico (Sayed, 2003; Araus et al., 2008).

Actualmente, la utilizacin de algunos parmetros fisiolgicos y bioqumicos como tasa

fotosinttica y produccin de prolina han adquirido importancia en la caracterizacin de

genotipos a condiciones de estrs abitico especialmente estrs trmico en Colombia

(Restrepo-Diaz y Garces-Varon, 2013; Snchez-Reinoso et al. 2014). Sin embargo, los

trabajos donde se utilizan parmetros fisiolgicos (fluorescencia de la clorofila a,

Peroxidacin lipdica, intercambio gaseoso) siguen siendo necesarios para un mejor

conocimiento de la influencia del ambiente en la seleccin de genotipos con caractersticas

de tolerancia a estreses abiticos (especialmente estrs trmico) como futuros parentales en

los programas de fitomejoramiento. Por tal motivo, las hiptesis de trabajo en el presente

trabajo eran: i) El uso de variables como: fotosntesis, crecimiento (acumulacin de masa

seca y rea foliar), componentes de rendimiento (tamao de grano, nmero de granos,

vaneamiento) y bioqumicas (malondialdehdo, contenido de prolina y contenido de

pigmentos) sirven como herramientas en la caracterizacin de un estrs por alta temperatura

nocturna para genotipos de arroz; ii) Los genotipos tolerantes presentan mayor crecimiento,

rendimiento, fotosntesis, menor respiracin y mayor fertilidad.

Marco Terico 15

1. MARCO TERICO

1.1 FISIOLOGA DE LAS PLANTAS BAJO UNA ALTA TEMPERATURA

La temperatura media del planeta ha aumentado los ltimos aos y seguir aumentando

0,3 por dcada en comparacin al lapso 1990-2010 (Lobell y Gourdji, 2012). Este

aumento de la temperatura afectar negativamente la produccin de los cultivos ms

importantes en la alimentacin humana y animal como son: maz, soya, trigo y arroz (Welch

et al., 2010b; Wassmann et al., 2009). La alta temperatura afectar de forma distinta a cada

regin, debido a las condiciones propias de cada una, tanto climticas como de manejo de

cultivo, por lo que son necesarias investigaciones a nivel regional.

La alta temperatura afecta el desarrollo y rendimiento de las plantas cultivables (Jha et al.,

2014; Lobell y Gourdji, 2012). Cada planta cultivable necesita unas condiciones climticas

determinadas para desarrollarse ptimamente. Si estas condiciones no se presentan, el

desarrollo y crecimiento de las plantas disminuyen (Sage et al., 2015). La temperatura es

uno de los principales factores que afectan la supervivencia de las plantas y junto con la

disponibilidad de agua determinan la distribucin de las plantas en el planeta (Lambers et al.,

2008).

La alta temperatura, tanto diurna como nocturna, afecta procesos esenciales en la fisiologa

de la planta como la fotosntesis, la respiracin, la absorcin de agua, el crecimiento y el

desarrollo (Mohammed y Tarpley, 2014, 2009b; Mohammed et al., 2013). A nivel de hoja,

la fotosntesis es uno de los procesos ms sensibles a la alta temperatura (Bita y Gerats,

2013; Sage y Kubien, 2007). En este sentido, tanto la parte fotoqumica como el ciclo de

Calvin son afectados (Wahid et al., 2007). En el caso de la parte fotoqumica, el fotosistema

II es la parte ms sensible, ya que se pueden afectar procesos metablicos como una la tasa

de transporte de electrones y la produccin de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Cui

et al., 2006; Yamasaki et al., 2002). Asimismo, El contenido y la distribucin de los

pigmentos fotosintticos son alterados por altas temperaturas. En este aspecto, aumenta el

contenido de carotenoides y disminuye el de clorofila con el fin de disipar el exceso de

energa y reducir las ROS (Demmig-Adams y Adams Iii, 1996; Gill y Tuteja, 2010). En el

caso del ciclo de Calvin, la actividad de la Rubisco puede ser inhibida por periodos de estrs

trmico (Wang et al., 2010; Kubien y Sage, 2008)

Otro proceso fisiolgico afectado es la respiracin (Wahid et al., 2007). El balance de

carbono en una planta est dado por la diferencia entre la ganancia de carbono por



fotosntesis y la perdida de este por respiracin (Turnbull et al., 2001; Snchez-Reinoso

et al., 2014). Varios estudios han reportado cambios en respiracin como respuesta a la

variacin de la temperatura ambiental (Smith y Dukes, 2013). En general, la respiracin se

incrementa en funcin de la temperatura (Lambers et al., 2008).

La interaccin entre estrs trmico y el estado de desarrollo de la planta tambin es

importante en el rendimiento de los cultivos (Restrepo-Daz et al., 2010). La investigacin

actual ha concluido que el estado de floracin es el ms susceptible a las altas temperaturas,

pero las plantas pueden tambin sufrir alteraciones, provocados por estrs trmico, en los

dems estados fenolgicos (Snchez et al., 2014; Wassmann et al., 2009; Sage et al., 2015;

Wongpatsa et al., 2014). Una ATN puede causar aborto de flores y frutos, afectar la

viabilidad y fertilidad del polen y finalmente, la calidad del producto a cosechar (Restrepo-

Diaz et al., 2010; Sage et al., 2015). Asimismo, se ha reportado que los cultivos de cereales

sometidos a una ATN puede presentar mayor esterilidad en comparacin a una alta

temperatura diurna (Welch et al., 2010a). Teniendo en cuenta los efectos del estrs trmico,

en cereales los genotipos tolerantes pueden mantener su rendimiento, fertilidad de las

espiguillas, viabilidad del polen y capacidad fotosinttica (Poli et al., 2013).

Las plantas tienen respuestas bioqumicas a las altas temperaturas con el propsito de

sobrellevar esta condicin estresante (Wahid et al., 2007). En plantas de cebada bajo estrs

trmico, se ha reportado un aumento en la relacin Carotenoides/Clorofila, ya que una

disminucin de la clorofila permite captar menos energa y evitar el calentamiento de la hoja

provocado por la reduccin en la transpiracin (Havaux y Tardy 1999). Otro mecanismo de

aclimatacin a condiciones de alta temperatura, especialmente nocturna, es la menor

peroxidacin lipdica representado en la produccin de malondialdehdo (MDA)

(Narayanan et al., 2016; Bahuguna et al., 2015; Zhou et al., 2012). Finalmente, las plantas

pueden presentar respuestas moleculares para tolerar episodios de estrs trmico (Jagadish

et al., 2012; Jha et al., 2014). En este sentido, genotipos tolerantes han mostrado una mayor

acumulacin de protenas de choque trmico que genotipos susceptibles (Jagadish et al.,

2010).

1.2 RESPUESTA DEL CULTIVO DEL ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA

NOCTURNA

La temperatura mnima (temperatura nocturna) ha presentado un mayor incremento que la

temperatura mxima diaria durante el siglo pasado (Krishnan et al., 2011). Esta condicin

Marco Terico 17

puede afectar las plantas a nivel fisiolgico, bioqumico y morfolgico (Krishnan et al.,

2011; Mohammed y Tarpley, 2014). En este contexto, las altas temperaturas nocturnas (35-

45C) disminuyen la asimilacin de CO2, la eficiencia del fotosistema II y la actividad de la

Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa/oxidasa (RuBisCO) en arroz (Yin et al., 2010). Adems

de los efectos sobre las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja, una alta temperatura

nocturna reduce el contenido de clorofila (Kumar et al., 2011; Dong et al., 2014), afectando

la relacin entre clorofila total y carotenoides (Song et al., 2013; Dong et al., 2014).

Otra respuesta fisiolgica, es el incremento de la respiracin nocturna expresado como

prdida de carbono (Lee y Akita, 2000; Mohammed y Tarpley, 2009b; Mohammed et al.,

2013). Mohammed y Tarpley (2010a) han mencionado que esta prdida de carbono es una

de las causas de la reduccin del rendimiento en el cultivo del arroz. A nivel bioqumico,

altas temperaturas (40/32C da/noche) tambin provocan dao en las membranas

(expresado como un mayor contenido de MDA), causando un incremento de la actividad

enzimtica antioxidante (superxido dismutasa, glutatin reductasa) y produccin de

osmolitos compatibles como la prolina (Kumar et al., 2011; Xue et al., 2012). En cuanto a

los parmetros de rendimiento del cultivo, Peng et al., (2004) reportan que temperaturas

nocturnas superiores a 24 C reducen la produccin de biomasa total cerca del 20%, el

porcentaje de granos llenos y finalmente, el rendimiento de grano.

El crecimiento y desarrollo del cultivo del arroz es influenciado por la temperatura nocturna

(Shah et al., 2011; Wahid et al., 2007; Glaubitz et al., 2014). En la tabla 1 se recopila algunos

efectos de las temperaturas nocturnas sobre parmetros fisiolgicos, de crecimiento y de

rendimiento en arroz.



Tabla 1. Efecto de la alta temperatura nocturna en procesos fisiolgicos del arroz

PROCESO

ALTA

TEMPERATURA

NOCTURNA (C)

ESTADO DE

DESARROLLO EFECTO REFERENCIA

Respiracin 30-32 Plntula y

reproductivo Aumento

Glaubitz et al. (2014);

Mohammed y Tarpley,

(2009b); Mohammed et al.

(2013); Mohammed y

Tarpley, (2014, 2010)

Crecimiento 30 Plntula Aumento Glaubitz et al. (2014)

Crecimiento 27 Vegetativo-Alta

dosis de N Disminucin Chen et al. (2013)

Fertilidad 30-32 Reproductivo Disminucin

Mohammed y Tarpley

(2011b, 2014, 2010,

2009b)

Masa del

grano 30-32 Reproductivo Disminucin

Mohammed y Tarpley

(2011b, 2014, 2010,

2009b)

Nmero de

granos por

pancula

30 Reproductivo Disminucin Mohammed y Tarpley

(2014)

Rendimiento 30-32 Reproductivo Disminucin

Mohammed et al. (2013);

Mohammed y Tarpley

(2010)

Dao

membranas 30-32 Aumento

Mohammed y Tarpley

(2014, 2009a, 2010)

Viabilidad

del polen 30-32 Reproductivo Disminucin

Mohammed y Tarpley

(2014, 2010); Mohammed

et al. (2013)

Fotosntesis 30 Reproductivo Disminucin Mohammed et al. (2013)

Finalmente, FEDEARROZ (2015) ha reportado que los episodios de altas temperaturas han

reducido los rendimientos en las zonas arroceras de Colombia, disminuyendo la

productividad del cultivo (Fig. 1), resaltando la importancia de caracterizar genotipos

tolerantes y desarrollar estrategias que minimicen los perjuicios provocados por esta

condicin abitica.

Marco Terico 19

Figura 1. Efectos del fenmeno del nio (2009-2010) en los rendimientos de la zona de

Espinal (Tolima). Fuente: FEDEARROZ (2015).

1.3 LAS ALTAS TEMPERATURAS Y LA FENOLOGA DEL ARROZ

Las respuestas fisiolgicas pueden variar segn la etapa fenolgica donde se presente la

situacin estresante en el cultivo del arroz (Fageria, 2007; Yoshida, 1981). Asimismo,

Yoshida (1981) reporta que el grado de afectacin de una alta temperatura sobre el

porcentaje de esterilidad depende de factores como la etapa fenolgica donde se presente la

condicin estresante y la duracin del periodo de estrs trmico. La tabla 2 resume los rangos

de temperaturas medias diarias ptimos para el cultivo de arroz segn su etapa fenolgica.

Tabla 2. Rangos ptimos de temperatura diaria para el desarrollo del arroz segn su etapa

fenolgica. Informacin adaptada de Yoshida (1981).

Etapa fenolgica Rango de Temperatura (C)

Germinacin

Emergencia 20-35

25-30

Macollamiento

Antesis

Maduracin

25-31

30-33

20-25



Por otro lado, la literatura existente ha reportado ampliamente la influencia de la relacin

etapa fenolgica, el genotipo y el estrs por altas temperaturas nocturnas sobre el

rendimiento del cultivo (Fageria, 2007; Jagadish et al., 2014). En este sentido, Mohammed

y Tarpley (2009b) no observaron ningn efecto de una alta temperatura nocturna sobre el

nmero de macollas, cuando las plantas se sometieron a alta temperatura nocturna desde los

20 das de emergencia hasta la cosecha, mientras Glaubitz et al. (2014) reportan que en 6 de

12 genotipos evaluados la alta temperatura nocturna reduce el macollamiento en plantas de

arroz expuestas a alta temperatura nocturna desde los 20 das despus de siembra hasta los

46 das despus de siembra.

En cereales, la formacin de polen es uno de los estados ms sensibles a la alta temperatura.

Durante esta formacin, la mitosis 1 y 2 son los estados susceptibles (Barnabs et al., 2008),

siendo el primera (estado uninucleado del polen) el ms susceptible a la alta temperatura.

En varias especies (incluida el arroz), la alta temperatura provoca aborto del polen en este

estado. La alta temperatura afecta el metabolismo de la microspora y puede disminuir la

sntesis de protenas relacionadas con la sntesis de carbohidratos, lpidos, protenas

antioxidantes y sntesis de la pared celular del polen (Sage et al., 2015). En antesis,

temperaturas nocturnas superiores a 27C tambin reducen el peso del grano y disminuyen

la emergencia de la pancula (Coast et al., 2015). En la ltima fase de desarrollo del cultivo

(Maduracin), (Krishnan et al., 2011) reportan que la alta temperatura(34C) nocturna

reduce la masa del grano en plantas de arroz.

1.4 EL USO DE VARIABLES FISIOLGICAS EN EL FITOMEJORAMIENTO

DE ARROZ

Una de las estrategias para afrontar los efectos negativos de las altas temperaturas sobre el

rendimiento de los cereales es la seleccin de genotipos tolerantes a dicha condicin

ambiental (Araus et al., 2008). En este aspecto, el mejoramiento gentico de cultivos

actualmente usa caractersticas fisiolgicas con el propsito de aumentar la eficiencia en la

seleccin de genes (Reynolds et al., 2009; Jha et al., 2014). Por ejemplo, en la seleccin de

genotipos de trigo tolerantes a alta radiacin y temperatura se han usado los parmetros de

la fluorescencia de la clorofila y variables de intercambio gaseoso (Sayed, 2003; Monneveux

et al., 2003). Adicionalmente, la caracterizacin de genotipos tolerantes a altas temperaturas

nocturnas tiene en cuenta variables bioqumicas como el contenido de pigmentos

fotosintticos (clorofilas y carotenoides), la produccin de osmolitos compatibles (glicina

betaina, Prolina y azcares solubles) y la integridad de la membrana celular (Bita y Gerats,

Marco Terico 21

2013). En arroz, se ha reportado que los genotipos tolerantes a altas temperaturas presentan

una tasa de fotosntesis, respiracin, transporte de electrones, contenido de clorofila y

rendimiento cuntico del fotosistema II estables bajo condiciones de altas temperaturas

nocturnas (Glaubitz et al., 2014; Mohammed y Tarpley, 2014). Por lo anterior, estas

variables han sido sugeridas como herramienta o marcadores para seleccionar genotipos con

una posible tolerancia a diferentes condiciones de estrs abitico (Sayed, 2003; Araus et al.,

2008).

Actualmente, la utilizacin de algunos parmetros fisiolgicos y bioqumicos como la tasa

fotosinttica y produccin de prolina han sido utilizados para en la caracterizacin de

genotipos a condiciones de estrs abiticos especialmente bajo estrs de alta temperatura

diurna en Colombia (Restrepo-Diaz y Garces-Varon, 2013; Snchez-Reinoso et al., 2014).

Teniendo en cuenta lo anterior, el comportamiento de la planta bajo condiciones de estrs

por una alta temperatura es regulado por varios procesos fisiolgicos (Mittler et al., 2012).

Sin embargo, el pobre entendimiento de los complejos mecanismos de tolerancia trmica y

la interaccin entre genotipo (G) vs ambiente (A) han sido uno de los cuellos de botella para

el progreso de los programas de mejoramiento gentico (Jha et al., 2014). En este sentido,

los estudios con plntulas de arroz han adquirido importancia con el propsito de conocer a

profundidad los mecanismos de respuesta involucrados y as caracterizar el grado de

tolerancia o susceptibilidad de los genotipos a condicin de estrs trmico durante los

ltimos aos (Xue et al., 2012; Snchez-Reinoso et al., 2014). El conocimiento de la

interaccin G x A mediante el estudio de procesos fisiolgicos y bioqumicos involucrados

han adquirido importancia porque han permitido el uso de diferentes tcnicas en el

mejoramiento clsico en Colombia con el propsito de un mejor direccionamiento y

aprovechamiento del germoplasma desarrollado hasta ahora (FEDEARROZ, 2013).

Se ha demostrado que algunos procesos fisiolgicos son ms sensibles a la alta temperatura

y que la evaluacin de estos se puede usar para diferenciar susceptibilidad o cierta tolerancia

de los genotipos estudiados. Estas variables fisiolgicas pueden aportar al mejoramiento

gentico: aumentando el conocimiento de los factores que determinan el rendimiento y

definiendo caractersticas secundarias (caractersticas diferentes al rendimiento) para

seleccionar parentales (Araus et al., 2008).

A continuacin, se enuncian los procesos tenidos en cuenta en este trabajo, algunas

definiciones importantes y su relacin con un estrs trmico.



1.4.1 La fotosntesis y sus componentes

Fluorescencia de la Clorofila a

La fluorescencia de la clorofila y el intercambio gaseoso pueden ser usados para fenotipar

poblaciones menores a 100 individuos, para detectar diferencias cuando otras variables no

las detectan (crecimiento o rendimiento) y para explicar la repuesta a estrs abiotico (Pask

et al., 2012). En estrs por calor, se prefiere el uso de fluorescencia de la clorofila cuando

se dispone de pocos recursos (principalmente tiempo) y cuando se estan estudiando muchos

individuos (Pask et al., 2012).

Fluorescencia es la re-emisin de energa en forma de fotn cuando un electrn vuelve a

su estado fundamental desde un estado excitado (Cosgrove y Borowitzka, 2010). En el caso

de la fluorescencia de la clorofila a, una molcula de la clorofila puede excitarse y alcanzar

el estado singlete despus de absorber un fotn (Bolhr-Nordenkampf y quist, 1993), y

volver a su estado fundamental luego de reemitir dicha energa en un haz de luz de menor

energa.

El anlisis de la fluorescencia de la clorofila a es una herramienta usada para conocer el

comportamiento fotosinttico de las plantas, principalmente lo relacionado con la parte

fotoqumica de la fotosntesis (Brestic y Zivcak, 2013; Guidi y DeglInnocenti, 2012).

Cuando la energa lumnica es captada por la hoja, se puede disipar en forma de calor, en

forma de fluorescencia o a travs de la fotoqumica (Baker, 2008). Estos procesos son

competitivos, por lo que conocer el comportamiento de uno da informacin acerca de la

eficiencia y el desempeo de los otros dos (Murchie y Lawson, 2013).

Dependiendo del objetivo de la investigacin, el anlisis de la fluorescencia se puede hacer

a nivel de nanosegundos o de minutos. El primero para conocer el estado de xido-reduccin

de los primeros aceptores de electrones: la quinona A y la quinona B; y lo segundo para

determinar el uso (o disipacin(quenching)) de la energa lumnica (Kalaji et al., 2014). Con

base a lo anterior, el segundo enfoque fue utilizado en el presente trabajo de investigacin

El anlisis de disipacin de la energa usa parmetros basados en la emisin de la

fluorescencia en determinadas condiciones. As, Fm es la fluorescencia mxima emitida

luego de someter la hoja a un haz de luz saturante (generalmente mayor a 3000 mol m-2 s-

1), mientras Fo es la fluorescencia emitida luego de someter la hoja a un haz de luz no

saturante y con tan baja intensidad (alrededor de 0,1 mol m-2 s-1) que no desencadene los

mecanismos de disipacin de la energa (Baker, 2008). La diferencia entre estas dos

Marco Terico 23

fluorescencias se denomina fluorescencia variable Fv, y la nomenclatura cuando se

determinan luego de un haz de luz actnica es Fm, Fo y Fv. Con estos ndices y otros ms

se determinan parmetros que dan informacin sobre el estado y la disipacin de la energa

en los fotosistemas (Baker, 2008; Brestic y Zivcak, 2013)(Tabla 3):

En arroz, el estrs por calor induce un incremento en NPQ y en el estado de de-epoxidacin

del ciclo de las xantofilas (Yin et al., 2010). Una disminucin en la asimilacin de CO2

acompaada por una no disminucin de Fv/Fm inducido por estrs por calor puede

potencialmente exponer las plantas a un exceso de energa bajo condiciones lumnicas, lo

cual si no se disipa de forma segura, puede resultar en un dao del PSII debido a una sobre-

reduccin de los centros de reaccin (Xue et al., 2012) . Se dice que el PSII es el componente

ms sensible a la alta temperatura: el dao puede ser directo o una disminucin en los

mecanismos de reparacin (Yin et al., 2010). Esto tambin es reportado por Vani et al.

(2001) quienes argumentan que la alta temperatura desorganiza los tilacoides y los

complejos donadores y aceptores de electrones en el PSII.



Tabla 3. Parmetros de la fluorescencia derivados de la fluorescencia de la clorofila a

Parmetro Formula Descripcin

Fq, F Fm-F Disipacin fotoqumica de la

fluorescencia cuando los centros de

reaccin del PSII abiertos.

Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm Eficiencia mxima potencial de la

fotoqumica del PSII. Se considera que un

valor menor a 0,83 ndica algn tipo de

estrs en la planta (Baker, 2008; Murchie

y Lawson, 2013)

PSII, Y(II) Fq/Fm Eficiencia cuntica efectiva (operativa) de

la fotoqumica del PSII a determinada

intensidad lumnica.

Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm Eficiencia mxima potencial de la

fotoqumica del PSII a determinada

intensidad lumnica.

NPQ (Fm-Fm)/Fm disipacin no fotoqumica

qP Fq/Fv Coeficiente de la disipacin fotoqumica

basado en el puddle model (unidades del

PSII desconectadas). Proporcin de

centros de reaccin oxidados o mayor

proporcin del estado reducido de Qa.

qL (Fq/Fv)/(Fo/F) Coeficiente de la disipacin fotoqumica

basado en el lake model(unidades del

PSII conectadas).

qN (Fm-Fm)/(Fm-Fo) Coeficiente de la disipacin no

fotoqumica de la fluorescencia variable.

NO, Y(NO) 1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)) Eficiencia cuntica de la disipacin no

regulada de la energa en el PSII.

NPQ, Y(NPQ) 1-Y(II)-Y(NO) Eficiencia cuntica de la disipacin

regulada de la energa en el PSII. Asociado

con la acidificacin del lumen tilacoidal y

con el estado de de-epoxidacin del ciclo

de las xantofilas.

La misma tendencia es presentada por Song et al. (2013) quienes encontraron una

disminucin de Fv/Fm y Y(II) asociada con un dao en la protena D1. Adems de esto, la

conductancia estomtica se increment, as como la transpiracin y la concentracin

intercelular de CO2, sugiriendo que la disminucin de la fotosntesis es debida a una

limitacin no estomtica. Segn este autor un estrs leve (temperatura diurna

Marco Terico 25

regenerar dicho fotosistema. El PSII es sensible debido a que la alta temperatura aumenta la

fluidez de la membrana tilacoidal (Farooq et al., 2011).

Teniendo en cuenta lo anterior, mantener alta la tasa fotosinttica y bajo NPQ bajo altas

temperaturas puede disminuir la sobre-reduccin de la cadena transportadora de electrones

y la produccin de H2O2 a travs de la fotorespiracin (Bahuguna et al., 2015). Por esto

Krishnan et al. (2011) sugieren que una alta eficiencia del fotosistema II (Fv/Fm) y Fo se

correlacionan con la tolerancia a altas temperaturas.

Asimilacin de CO2

Muchas investigaciones en arroz han demostrado que la asimilacin de CO2 disminuye al

aumentar la temperatura diurna o nocturna (Laza et al., 2015; Mathur et al., 2014; Cui et al.,

2006). Esto generalmente va acompaado de una mayor respiracin, menor crecimiento y

menor eficiencia del fotosistema II. Sin embargo, la razn por la cual la asimilacin de CO2

disminuye bajo altas temperaturas no est del todo clara.

Las dos razones ms aceptadas son una disminucin en el estado de activacin de la Rubisco

y la baja disponibilidad de RuBP (Kubien y Sage, 2008; Scafaro et al., 2010). La

disminucin del estado activo de la Rubisco est asociado con una menor actividad de la

Rubisco activasa, debido a que es ms sensible que la Rubisco a la alta temperatura (Salvucci

y Crafts-Brandner, 2004). Por otro lado, la menor disponibilidad de RuBP est asociada con

la disponibilidad de ATP y NADPH (productos de la cadena transportadora de electrones)

y la actividad enzimtica del ciclo de Calvin (Yamori et al., 2011).

Kubien y Sage (2008) concluyeron que el aumento del estado de activacin de la Rubisco

no necesariamente aumenta la tasa de fijacin de CO2, ya que al mantener una alta relacin

de Rubisco activasa/Rubisco no se aumenta la tolerancia a la alta temperatura (Kubien y

Sage, 2008). Por otro lado, Wang et al. (2010) establecieron que un mayor estado de

activacin de la Rubisco hace ms tolerante a las plantas de arroz a una alta temperatura, y

que la isoforma grande de la Rubisco activasa es ms importante bajo una alta temperatura.

Lo anterior es soportado por quienes establecieron que O. meridionalis es ms tolerante que

O. sativa porque la asociacin Rubisco/Rubisco activasa es ms estable en O. meridionalis

sometida a altas temperaturas (Scafaro et al., 2012).

Aunque todava no est claro el mecanismo por el cual la asimilacin de CO2 disminuya por

una alta temperatura. Se ha demostrado que una tasa de asimilacin de CO2 estable bajo

condiciones estresantes puede ser un indicador de tolerancia (Ashraf y Harris, 2013; Guidi



y DeglInnocenti, 2012). En el caso de la alta temperatura en arroz sucede lo mismo y la

resistencia de los genotipos a la alta temperatura est asociada con una tasa constante de

fotosntesis y con la capacidad de almacenar carbohidratos en el tallo (Farooq et al., 2011;

Venkateswarlu et al., 2012).

Pigmentos Fotosintticos

Las clorofilas son pigmentos que absorben la luz entre los 400 y 700nm con una mayor

absorcin a los 480nm y entre los 650 y 700nm, la luz verde (entre los 480 y 550nm) no es

absorbida por estos pigmentos (Heldt, 2005; Taiz y Zeiger, 2006). Estos pigmentos captan

la luz y la energa adquirida la transportan a los centros de reaccin de los fotosistemas

donde a travs de un flujo de electrones, la luz es transformada en energa qumica (Heldt,

2005).

Los carotenoides son pigmentos isoprenoides con enlaces dobles que absorben la luz en la

regin entre 400 y 500nm (Tanaka et al., 2008; Taiz y Zeiger, 2006). Esto pigmentos

cumplen 3 funciones: captan energa y la transfieren a la clorofila (pigmentos accesorios),

protegen el aparato fotosinttico de radicales como la clorofila en estrado triplete, el oxgeno

singlete y otros ROS y participan en el ensamblaje de los LHC del PSI y en la estabilizacin

de las membranas tilacoidales (funcin estructural) (Gill y Tuteja, 2010; Havaux, 1998).

En cebada un aumento de la proporcin CAR/Chl es una adaptacin a alta temperatura y

radiacin, provocado por una disminucin de Chl, principalmente. Esto confirma la idea de

que la disminucin de la clorofila es una forma de captar menos energa y evitar el

calentamiento de la hoja, provocado por la reduccin en la transpiracin (Havaux y Tardy,

1999).

Dentro de las caractersticas deseables en el mejoramiento gentico para la tolerancia a altas

temperaturas estn la produccin de pigmentos fotoprotectores, estabilidad membranal,

vigor temprano y senescencia tarda (Cossani y Reynolds, 2012). Lo anterior es soportado

por la respuesta de NL-44, un genotipo tolerante a alta temperatura que mantiene su verdor

relativo (contenido de clorofila) y su capacidad fotosinttica, lo que le permite sobrevivir

tanto en estado vegetativo como reproductivo (Bahuguna et al., 2015).

Marco Terico 27

1.4.2 Reproduccin y Rendimiento

El estado reproductivo es el ms susceptible a las altas temperaturas, tanto diurnas como

nocturnas. La alta temperatura acelera el desarrollo de la inflorescencia, disminuye la

viabilidad del polen, el crecimiento del tubo polnico y perjudica el desarrollo de los ovarios

(Jagadish et al., 2015).

En cereales, la formacin de polen es uno de los estados ms sensibles a la alta temperatura.

La mitosis 1 y 2 durante la formacin del grano de polen son muy sensibles a las altas

temperaturas (Barnabs et al., 2008). La primera, que corresponde al estado uninucleado del

polen es el ms susceptible a la alta temperatura. En varias especies (incluida el arroz), la

alta temperatura provoca aborto del polen en este estado. La alta temperatura afecta el

metabolismo de la microspora y puede disminuir la sntesis de protena relacionada con

sntesis de carbohidratos, lpidos, protenas antioxidantes y sntesis de la pared celular del

polen (Sage et al., 2015).

La meiosis, proceso previo a la mitosis durante la microsporognesis, tambin puede ser

afectada por la alta temperatura. Un efecto negativo de la alta temperatura en este proceso

disminuye el nmero de clulas madre de las microsporas, y por tanto el nmero de granos

de polen. Finalmente, aunque el polen madure, tambin puede ser inviable si se presentan

altas temperaturas (>30 por minutos u horas) o puede quedarse en las anteras debido a una

menor dehiscencia de estas ltimas. Todo esto se traduce en una menor fertilidad de la

espiguilla y menor rendimiento.

La alta temperatura diurna reduce la viabilidad del polen, el crecimiento del tubo polnico,

lo que se traduce en menor fertilidad de la espiguilla. La reciente literatura muestra los

mismos efectos bajo alta temperatura nocturna (Jagadish et al., 2015). Luego de la

polinizacin, se puede presentar una pobre geminacin del polen, (crecimiento del tubo

polnico) debido a la degradacin del tejido encargado de la nutricin del tubo polnico o a

la formacin de granos de polen inmaduros (Barnabs et al., 2008). Luego de la formacin

del polen la alta temperatura puede evitar dehiscencia de las anteras disminuyendo la

cantidad de polen disponible para la polinizacin (Bokszczanin y Fragkostefanakis, 2013).

El hecho que se afecte el nmero de granos o el tamao del grano depende del estado

fenolgico en el que se haya presentado la alta temperatura. Si fue durante la formacin de

la pancula y la antesis se afectara el nmero de granos, mientras si es durante el llenado del

grano se afectara el tamao y peso del grano (Farooq et al., 2011).



Los genotipos tolerantes tienden a mantener su rendimiento, fertilidad de las espiguillas,

viabilidad del polen y capacidad fotosinttica (Poli et al., 2013). Adems de estas

caractersticas, genotipos tolerantes como N22 acumula heat shock proteins HSP y cold

shock proteins CSP cuando es sometido a un estrs trmico, lo que podra explicar su

tolerancia y alta fertilidad bajo el estrs por alta temperatura (Jagadish et al., 2010).

1.4.3 Peroxidacin Lipdica de membranas

Cuando se presenta una condicin estresante, la capacidad fotosinttica de la planta

disminuye, lo que la hace ms susceptible a la fotoinhibicin (disminucin de la tasa

fotosinttica provocada por la luz) (Gururani et al., 2015; Murata et al., 2007). Una

condicin estresante generalmente disminuye la asimilacin de CO2 por una menor actividad

de la Rubisco, la Rubisco activasa o por una disminucin en la protena D1 del PSII, lo que

provoca fotoinhibicin (Gururani et al., 2015).

Durante este proceso los electrones procedentes de la clorofila no pueden ser disipados de

forma segura y se producen especies reactivas de oxgeno (ROS)(Gill y Tuteja, 2010). Estas

especies reactivas pueden daar lpidos, protenas y el ADN, lo que produce radicales libres

lipdicos y disminuye la funcionalidad de organelos celulares (Apel y Hirt, 2004).

Una de las formas de medir la peroxidacin lipdica es cuantificar la produccin de

malondialdehdo (MDA). El MDA es el producto de la peroxidacin del cido linolnico, el

cual es uno de los componentes principales de la membrana celular. Esta peroxidacin daa

la membrana, disminuyendo su selectividad y aumentando su fluidez (Gill y Tuteja, 2010).

Debido a que la peroxidacin lipdica es una de las principales consecuencias de la

produccin de especies reactivas de oxgeno provocado por una condicin estresante, tanto

los niveles de ROS como los de TBARS (sustancias reactivas con el cido tiobarbitrico, un

ejemplo es el MDA ) son considerados indicadores bioqumicos de la severidad del estrs

por calor (Bahuguna et al., 2015).

Teniendo en cuenta lo anterior se considera que la tolerancia a alta temperatura nocturna

(Narayanan et al., 2016; Bahuguna et al., 2015; Zhou et al., 2012), a salinidad (Lutts et al.,

1996) y a una alta temperatura diurna(Zhou et al., 2012) se manifiesta como una menor

peroxidacin lipdica (MDA). Asimismo, la prdida de electrolitos se usa como indicador

del dao membranal ya que correlaciona con la peroxidacin lipdica y en varios casos con

la senescencia y capacidad fotosinttica de la planta (Mantri et al., 2012).

Marco Terico 29

1.4.4 Osmolitos compatibles (Prolina)

La prolina es un aminocido no estructural que generalmente se acumula en plantas cuando

se presenta una condicin estresante (Ashraf y Foolad, 2007); la mayor cantidad de reportes

la asocian con salinidad, pero tambin se acumula cuando se presenta dficit hdrico, alta

radiacin, contaminacin por metales pesados, deficiencia de nutrientes, temperaturas

extremas y estrs oxidativo (Szabados y Savour, 2010; Hare y Cress, 1997).

En condiciones de estrs se ha reportado que la prolina cumple las siguientes funciones

(Szabados y Savour, 2010; Ashraf y Foolad, 2007; Wahid et al., 2007):

- Ajuste osmtico.

- Eliminacin de radicales libres.

- Mantenimiento del balance de xido-reduccin (NADPH/NADP).

- En algunos casos promueve la transcripcin de genes relacionados con la tolerancia

al estrs.

- Estabilizacin de estructuras sub-celulares.

Debido a lo anterior la prolina se ha usado para aliviar el estrs (Wahid et al., 2007) o como

un indicador de tolerancia a condiciones estresantes (Szabados y Savour, 2010). Por

ejemplo Kumar et al. (2011) determinaron que bajo una alta temperatura, plntulas de arroz

y de maz acumulan mayor cantidad de prolina como una respuesta al estrs provocado por

la alta temperatura. Otro ejemplo lo reporta Yan et al. (2012) en trigo, quienes descubrieron

que el estrs trmico daa la seccin donadora y receptora de electrones del PSII y que este

efecto es aliviado por una mayor produccin de prolina provocada por una aplicacin previa

de sal.

Como se enuncio antes, la alta temperatura puede producir ROS, disminuir la tasa de

transporte de electrones lo que afecta la relacin NADPH/NADP (Vani et al., 2001b) y

desorganiza los tilacoides (Vani et al., 2001a). Estos efectos podran ser aliviados por la

prolina, teniendo en cuenta las funciones de este aminocido (Szabados y Savour, 2010).

Aunque, la acumulacin de prolina este asociada con funciones que promueven la tolerancia

o alivian los efectos negativos del estrs. Mani et al. (2002) reportan que en mutantes que

sobre producen prolina o que no la degradan, los efectos no son positivos y pueden provocar

malformaciones en las plantas. Teniendo en cuenta esto, Szabados y Savour (2010)

enuncian que las funciones positivas de la acumulacin de prolina pueden estar asociadas a

los procesos de sntesis de prolina y no a la acumulacin de la misma.



Con base en el anterior marco terico se espera que la alta temperatura nocturna (30C)

disminuya el crecimiento y rendimiento de los genotipos a evaluar y que las variables

relacionadas con fotosntesis y componentes de rendimiento sean los mejores indicadores

de tolerancia o susceptibilidad a una alta temperatura nocturna.

Objetivos 31

2. OBJETIVOS

Con el propsito de desarrollar la hiptesis de trabajo, los siguientes objetivos fueron

planteados:

2.1 Objetivo General

Caracterizar el comportamiento fisiolgico y agronmico de siete genotipos de arroz

sometidos a una alta temperatura nocturna (30C).

2.2 Objetivos Especficos

Evaluar el efecto de cuatro diferentes periodos de dos temperaturas nocturnas (24 y

30C) sobre la fotosntesis y respiracin de un genotipo susceptible a estrs trmico

diurno.

Caracterizar la tasa fotosinttica, respiratoria, parmetros de crecimiento y de

rendimiento de siete genotipos de arroz a una alta temperatura nocturna (30C).

Identificar la utilidad de variables fisiolgicas como la fotosntesis, parmetros de la

fluorescencia de la clorofila a y pruebas bioqumicas como herramientas en la

seleccin de genotipos de arroz tolerantes a condiciones de altas temperaturas

nocturnas para programas de mejoramiento gentico.

Materiales y Mtodos 33

3. MATERIALES Y MTODOS

Con el fin de cumplir los objetivos propuestos en el presenta trabajo, se desarrollaron 3

experimentos. En el primero, se evalu el efecto de cuatro periodos de dos temperaturas

nocturnas (24 y 30C) sobre la fotosntesis y respiracin en un genotipo susceptible a estrs

trmico diurno. En el segundo, se caracteriz la tasa fotosinttica, respiratoria y parmetros

de crecimiento, de seis genotipos de arroz en fase vegetativa, a una alta temperatura nocturna

(30C). En el tercero, se evalu la eficiencia del PSII y parmetros de rendimiento de siete

genotipos de arroz sometidos a una alta temperatura nocturna (30C).

A continuacin, se enuncian las metodologas usadas en cada uno de los experimentos

citados:

3.1 RESPUESTA FISIOLGICA DE PLANTULAS DE ARROZ F60 SOMETIDAS

A PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA.

3.1.1 Condiciones generales del experimento

Se sembraron semillas del cultivar Fedearroz 60 ('F60'): es una variedad con buenos

rendimientos (mayor a 6 t ha-1) en cultivos comerciales, grano largo, buena calidad de

molino pero susceptible a altas temperaturas diurnas (Snchez-Reinoso et al., 2014), en

materas plsticas con 450 mL de suelo. Las materas se dispusieron en un invernadero de

vidrio localizado en la Universidad Nacional de Colombia, Campus Bogot. El invernadero

cont con un controlador de humedad relativa y resistencias calefactoras con el fin de

mantener las siguientes condiciones de crecimiento: temperatura diurna 31C, temperatura

promedio nocturna 22C, humedad relativa promedio de 70% y fotoperiodo natural de 12 h.

Se dispusieron dos plantas por matera las cuales fueron fertirrigadas diariamente con 50 mL

de una solucin nutritiva que contena un fertilizante completo (Wuxal, Bayer

CropScience, Bogot D.C., Colombia) a una dosis de 2 mL L-1 H2O, para una concentracin

de nutrientes: Nitrgeno total 160 g L-1, (N amoniacal 38 g L-1, N ntrico 12 g L-1, N ureico

110 g L-1), Fsforo asimilable (P2O5) 160 g L-1, Potasio soluble (K2O) 120 g L

-1, Boro (B)

10 g L-1, Cobre (Cu)* 0,21 g L-1, Hierro (Fe) 0,43 g L-1, Manganeso (Mn) 0,36 g L-1,

Molibdeno (Mo) 0,07 g L-1, Zinc (Zn)*:10 g L-1. (* Quelatados con EDTA pH en solucin

al 10% 6.5, Densidad a 25C 1.40 g cm-3).



3.1.2 Tratamientos

A los 45 das despus de emergencia (DE), los tratamientos de estrs trmico fueron

establecidos y consistieron en exponer un grupo de plantas de arroz (48 plantas de las 96

que conformaban el experimento) a una temperatura nocturna de 30C y otro grupo de

plantas (las restantes 48) a una temperatura nocturna de 24C entre las 18:00 y 24:00 horas

a cuatro periodos de estrs (4, 8, 12 y 16 das). La temperatura nocturna de 30C se impuso

mediante el traslado de 48 plantas desde el invernadero a una cmara de crecimiento (MLR-

351H, Sanyo, Bensenville, Illinois, USA) a las 18:00 horas. Luego, las plantas eran

retornadas al invernadero a las 06:00. En cada periodo de muestreo (4, 8, 12 y 16 das) se

tomaron 12 plantas de cada uno de los tratamientos por temperatura (24 y 30C), para

determinar las variables de respuesta.

Las condiciones de crecimiento en la cmara eran las siguientes: un primer periodo de

temperatura nocturna de 30C entre las 18:00-24:00 horas y un segundo periodo de 20C

entre las 00:00 y 06:00 horas. La humedad relativa fue del 70% durante toda la noche. Las

plantas control eran aquellas que siempre estuvieron en el invernadero a lo largo del

experimento (48 plantas) con una temperatura promedio nocturna de 24C entre las 18 y 24

horas y 20C entre las 00:00 y 06:00. Asimismo, se seleccion una alta temperatura nocturna

de 30C porque es superior a las temperaturas ptimas para el crecimiento y desarrollo de

la planta de arroz (entre 23 y 25C segn Krishnan et al., (2011) y Mohammed y Tarpley,

2014a). Adicionalmente, los cuatro diferentes periodos de estrs trmico (4, 8, 12 y 16 das)

fueron establecidos siguiendo la frecuencia con que se han registrado estas condiciones

ambientales durante los ltimos aos en las zonas productoras de arroz en Colombia.

Finalmente, el experimento duro 61 das.

3.1.3 Fotosntesis, conductancia estomtica, y transpiracin

Estas variables fueron determinadas con un medidor de fotosntesis porttil (LSPro-SD,

ADC BioScientific Ltd.UK). Las mediciones fueron desarrolladas en la parte media de la

penltima hoja del tallo principal de cada plntula, entre las 9am y las 12m. (Mohammed

et al., 2013; Mohammed y Tarpley, 2014). Las condiciones de la cmara de medicin

fueron: flujo fotnico constante de 1200 mol m-2 s-1, temperatura promedio de 302C y

concentracin de CO2 de 36810 mol mol-1 (Temperatura y concentracin de CO2

ambientales).


3.1.4 Uso eficiente del agua y eficiencia de carboxilacin

Estas dos variables fueron calculadas mediante las ecuaciones descritas por Kumar et

al.(2001) y Sikder et al. (2015)

() =

() =

Donde Pn, E y Ci son la tasa fotosinttica, la transpiracin y la concentracin de dixido de

carbono subestomtico, respectivamente.

3.1.5 Eficiencia mxima del PSII (Fv/Fm)

La relacin se determin con un fluormetro no modulado (Handy PEA, Hansatech

Instruments, Kings Lynn, UK) en la misma hoja y a la misma hora que se realizaron las

mediciones de intercambio gaseoso. Para esto, las hojas fueron sometidas a 20 minutos de

oscuridad y luego se aplic un pulso de luz de 0,1 mol m-2s-1 para determinar la

fluorescencia mnima (Fo). Posteriormente, se aplic un pulso de saturacin de 3000 mol

m-2 s-1 y se determin la fluorescencia mxima Fm. Con estos datos se determin Fv/Fm =

(Fm/(Fm-Fo)).

3.1.6 Contenido de clorofila a, clorofila b y carotenoides

Cincuenta miligramos de hojas frescas fueron macerados en un mortero con nitrgeno

lquido. Luego, la muestra se llev a un volumen de 5mL con acetona al 80% y se centrifug

a 7000g durante 10 minutos. Despus, se determin la absorbancia a longitudes de onda de

663nm, 647nm y 470nm con un espectrofotmetro BioMate 3 UV-Vis (Wisconsin, USA).

Los contenidos de clorofila a, b y carotenoides en hojas (mg L-1) se determinaron mediante

las formulas descritas por Lichtenthaler (1987) y Solarte et al. (2010)



3.1.7 Respiracin oscura de la hoja

Esta variable fue determinada usando un equipo de fotosntesis porttil LSPro-SD (ADC

BioScientific Ltd. UK.) en la parte media de la penltima hoja de cada plntula (misma hoja

usada en fotosntesis) entre las 21:00 y las 24:00 horas, como lo describen Mohammed y

Tarpley (2009b). En ambos tratamientos, se ajust el flujo fotnico a 0 mol m-2s-1 y la

temperatura de la cmara a 30C o 24C dependiendo del tratamiento. La respiracin oscura

se asumi como la prdida de CO2 proveniente de la hoja.

3.1.8 Contenido de Prolina

El contenido de Prolina se determin siguiendo el protocolo de Bates et al. (1973)

modificado por Solarte et al. (2010) donde se tomaba 100 mg de tejido vegetal y se

homogenizaban en 5 mL de cido sulfosaliclico al 3%. Posteriormente, la muestra era

centrifugaba a 4000g durante 30 minutos. Luego, en un tubo falcon se mezcl 1 mL del

sobrenadante con 1 mL de ninhidrina en medio cido y 1 mL de cido actico glacial. La

anterior mezcla fue agitada durante 1 minuto y en seguida sometida a bao mara a 95C

por una hora. Despus de este periodo de tiempo, la reaccin fue detenida con hielo.

Finalmente, el producto de la reaccin fue extrada con 3 mL de tolueno, agitando

vigorosamente los tubos con un vrtex. La absorbancia fue medida a 520 nm usando un

espectrofotmetro (Spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Madison, WI, USA). El

contenido de Prolina se determin usando una curva de calibracin y la siguiente ecuacin:

=

[(

)

115.5

]

[

5]

3.1.9 Peroxidacin Lipdica

Para la determinacin de la peroxidacin lipdica (representada como contenido de

Malondialdehdo-MDA) se emple el mtodo del cido tiobarbitrico (TBA) descrito por

Hodges et al. (1999): Se homogenizaron 300 mg de hojas completamente desarrolladas con

nitrgeno lquido. Posteriormente, el homogenizado se mezcl con 3 mL de cido


tricloroactico al 0,1%. La mezcla se centrifug a 3000g por 10 min. Del sobrenadante se

extrajeron 2 mL para reaccionar en dos tubos de ensayo de la siguiente manera: (a) Con

TBA (+TBA); 1 mL de sobrenadante con 4 mL de cido tricloroactico al 10% ms cido

tiobarbitrico al 0,65%, (b) Sin TBA (TBA); 1 mL de sobrenadante con 4mL de cido

tricloroactico al 10%. Posteriormente, los tubos de ensayo fueron llevados a bao mara a

95C durante 25 min y la reaccin se detuvo con hielo. Las muestras fueron centrifugadas

nuevamente a 3000 g por 10 min y se leyeron las absorbancias a 440, 532 y 600 nm usando

un espectrofotmetro (BioMate 3 UV - Vis, WI, USA). Todas las variables fisiolgicas y

bioqumicas se midieron a los 4, 8, 12 y 16 das despus de iniciados los tratamientos tanto

en las plantas sometidas a 30C como a 24C. Para obtener la concentracin de MDA se us

la siguiente ecuacin, asumiendo un coeficiente de extincin del MDA de 157 M mL-1:

= [ 532+ 600+ ( 532 600)]

= [( 440+ 600+) 0,0571]

( 1) = ( 157000 ) 106

3.1.10 Anlisis Estadstico

Los datos fueron analizados mediante un diseo factorial (temperatura nocturna (24 y 30C)

vs tiempo de exposicin (4, 8, 12 y 16 das) para un total de 8 tratamientos. Cada tratamiento

estuvo compuesto por 6 unidades experimentales y cada unidad experimental correspondi

a dos plantas. A los datos obtenidos, se les realizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov

y de Levene para comprobar normalidad y homogeneidad de varianza, respectivamente.

Luego, se desarroll un anlisis de varianza ANOVA. Cuando se observaron diferencias

significativas, se realiz una prueba de Tukey o contrastes polinmicos con el programa

SPSS (v20.0, IBM Company, USA).




ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

3.2.1 Tratamientos

Para el desarrollo del estudio se us un genotipo susceptible a una alta temperatura diurna

('F60) (Snchez-Reinoso et al. 2014) y cinco genotipos caracterizados por buen

comportamiento bajo condiciones de altas temperaturas tanto diurnas como nocturnas

utilizadas por la Federacin Nacional de Arroceros dentro de sus programas de

fitomejoramiento (IR 1561, FLO 2764, LV447-1, CT19021, LV1401). Cuando las plantas

alcanzaron los 32 das despus de emergencia (DE), estas fueron divididas en dos grupos de

16 plantas cada uno. El primer grupo siempre permaneci en el invernadero. Mientras el

segundo grupo fue ubicado en una cmara de crecimiento (MLR-351H, Sanyo, Bensenville,

Illinois, USA) a una temperatura de 30C entre las 18:00 y 24:00 h y de 20C entre las 00:01

y 06:00 por un periodo de 8 das. Cuando finalizaba el periodo de exposicin en la cmara

de crecimiento, las plantas de arroz siempre eran retornadas a las condiciones de

invernadero. El experimento termino a los 40 DE.

3.2.2 Condiciones generales de crecimiento

El ensayo se desarroll bajo condiciones de invernadero ubicado en la Facultad de Ciencias

Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot. Las condiciones de

crecimiento en el invernadero fueron las siguientes: temperatura diurna 30C, temperatura

nocturna 24C, humedad relativa promedio de 70% y un fotoperiodo natural de 12 h. Se

dispusieron dos plantas por matera de 450 mL de los diferentes genotipos a estudiar, las

cuales fueron fertirrigadas diariamente con 80 mL de una solucin nutritiva que contena un

fertilizante completo (Wuxal, Bayer CropScience, Bogot D.C., Colombia) a una

concentracin de 2 mL L-1 H2O, siendo la concentracin del fertilizante la siguiente:

Nitrgeno total 160 g L-1, (N amoniacal 38 g L-1, N ntrico 12 g L-1, N ureico 110 g L-1),

Fsforo asimilable (P2O5) 160 g L-1, Potasio soluble (K2O) 120 g L

-1, Boro (B) 10 g L-1,

Cobre (Cu)* 0,21 g L-1, Hierro (Fe)0,43 g L-1, Manganeso (Mn)0,36 g L-1, Molibdeno (Mo)

0,07 g L-1, Zinc (Zn)* 10 g L-1. (*Quelatados con EDTA pH de 6,5 en solucin al 10%,

Densidad a 25C 1,40 g cm-3).


3.2.3 Fotosntesis

Entre los 37 y 40 DE, La penltima hoja (de la base al pice) del tallo principal de cada

planta fue utilizada para determinar la tasa asimilacin de CO2 mediante un medidor porttil

de fotosntesis (LI-COR 6200, Lincoln, Nebraska, USA). Durante las medidas de

fotosntesis, las condiciones en la cmara de medicin fueron las siguientes: Radiacin

Fotosintticamente Activa (PAR) mayor a 800 mol m-2 s-1, temperatura de la hoja de 27

5 C y diferencia presin de vapor de agua del aire y la hoja 1,8 0,5 kPa. La medicin de

la tasa fotosinttica se realiz entre las 09:00 y las 12:00 h. Finalmente, para la

determinacin de la tasa de asimilacin de CO2 se tomaron ocho plantas por tratamiento

(doce tratamientos: 2 temperaturas x 6 genotipos).

3.2.4 Eficiencia de Carboxilacin y Uso eficiente del agua

La eficiencia de la carboxilacin se determino mediante la ecuacin de Sikder et al. (2015)

nombrada en el apartado 3.1.4, y el uso eficiente del agua as:

() =

Donde Pn corresponde a la tasa fotosinttica, gS a la conductancia estomtica y WUEi al

uso eficiente del agua Intrnseco.

3.2.5 Respiracin oscura

Para determinar esta variable se sigui la metodologa descrita por Snchez-Reinoso et al.

(2014) que consiste en introducir las plantas en cmaras hermticas plsticas de 2 L de

capacidad. Posteriormente, sensores de Gas CO2 infrarrojo (CO2-BTA, Vernier, Beaverton,

OR, USA) fueron insertados en las cmaras y conectados a una interface porttil (LabQuest,

Vernier, Beaverton, OR, USA). Antes de introducir las plantas en las cmaras hermticas,

todas las macetas fueron cubiertas con una bolsa plstica para evitar la respiracin del suelo

con el propsito de cuantificar nicamente la respiracin del tejido vegetal. Luego, las

cmaras fueron colocadas en un cuarto oscuro por 300 segundos (s). Durante este periodo,

el sensor estim cada 4 s la concentracin de CO2 (mg kg-1) en la cmara, obtenindose una

curva de tendencia lineal. Para obtener la tasa de respiracin de la planta (mmol CO2 kg PF -1 h-1) se determin la pendiente de la regresin lineal (mg kg-1/s) y se calcul sobre el peso

fresco total de la planta. Las mediciones fueron desarrolladas en las mismas fechas y el

mismo nmero de plantas donde se obtuvieron las medidas de fotosntesis.



3.2.6 Parmetros de Fluorescencia de la clorofila a

Estos parmetros se calcularon en la parte media de la penltima hoja de cada planta (las

mismas utilizadas para la estimacin de la Fotosntesis) entre las 9:00 am y las 13:00 horas

justo al finalizar el ensayo (40 DE). La fluorescencia de la clorofila fue estimada con un

fluormetro modulado MINI-PAM (Heinz Walz, Effieltrich, Germany). Las hojas se

mantuvieron en la oscuridad por 20 minutos antes de medir Fv/Fm. La fluorescencia mnima

(Fo) fue medida con un pulso de luz modulado menor a 50 mol m-2 s-1 y la mxima

fluorescencia fue inducida por un pulso de 0,8s con una intensidad de 3000 mol m-2 s-1. El

rendimiento cuntico potencial del PSII (Fv/Fm) fue determinado as: Fv/Fm = (Fm-Fo)/Fm.

Para alcanzar el estado basal de la fotosntesis (Fs) las muestras se sometieron a una luz

actnica de 900 mol m-2 s-1 y luego de esto se sometieron a un segundo pulso saturante

(3000 mol m-2 s-1 por 0,8s) para obtener la mxima fluorescencia en estado adaptado a la

luz (Fm). Se calcul Fo mediante la frmula de Oxborough y Baker (1997): Fo= 1/(1/Fo-

1/Fm+1/Fm). Con las variables anteriores y de acuerdo con Brestic y Zivcak (2013) se

estim: el rendimiento cuntico real del fotosistema II (PSII= Fm-F/Fm), Rendimiento

cuntico de la disipacin de la energa no regulada (NO = 1/ (NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)),

rendimiento cuntico de la disipacin de la energa regulada(NPQ = 1 - PSII NO),

disipacin no fotoqumica (NPQ = (Fm-Fm)/Fm), coeficiente de disipacin fotoqumica

basado en el Lake model (qL = ((Fm-Fs)/(Fm-Fo)*(Fo/Fs) y coeficiente de disipacin

no fotoqumica de la fluorescencia variable (qN = Fm-Fm/Fm-Fo).

3.2.7 Parmetros de Crecimiento

Al finalizar los tratamientos, cuatro plantas por tratamiento se sometieron a 70C por 48h

con el fin de determinar la acumulacin de masa seca por rgano (tallo+vaina foliar y lamina

foliar). Se determin el rea foliar de las lminas foliares de cada planta usando un medidor

de rea foliar LI-3000C (LI-COR Lincoln, Nebraska, USA). Con las anteriores variables se

determin masa foliar especifica (relacin masa foliar/rea foliar de cada planta) y la

relacin hojas/tallo (masa de hojas/masa de tallo+vaina foliar por planta)

3.2.8 Prdida de electrolitos

Esta variable fue determinada mediante el protocolo del porcentaje de fuga de electrolitos

descrito por Sanchez-Reinoso et al. (2014). Despus del perodo de estrs a los 40 DE,

aproximadamente 300 mg de hojas frescas fueron cortados en trozos de 1 cm de longitud y


colocadas en tubos de ensayo con 30 mL de agua desionizada. Posteriormente, los tubos

fueron incubados en bao mara a 30C por 2 h y se determin la conductividad elctrica

inicial (CE1). Posteriormente, las muestras fueron sometidas a 100C en bao mara por 15

min para liberar todos los electrolitos. Finalmente, se enfri la muestra en cama de hielo y

se determin la conductividad elctrica final (CE2). El porcentaje de electrolitos se calcul

as:

% = (12

) 100

3.2.9 Clorofila y Carotenoides

A los 40 DE, trozos de lmina foliar de 1 cm de longitud (50 mg de peso fresco) de una hoja

completamente desarrollada fueron macerados usando nitrgeno lquido y almacenados a -

80 C hasta que se realizaron los respectivos anlisis (descrito en el apartado 3.1.6).

3.2.10 Prolina y Malondialdehdo (MDA)

Despus de los ocho das del periodo de estrs (40 DE), se maceraron 300 mg de hojas

completamente desarrolladas del tallo principal con nitrgeno lquido y se conservaron a

una temperatura de -80C hasta su anlisis: el cual corresponde al del apartado 3.1.8.

Para la determinacin de la peroxidacin lipdica (representada como contenido de MDA)

se emple el mtodo del cido tiobarbitrico (TBA) descrito por Hodges et al. (1999), el

cual tambin es descrito en el apartado 3.1.9.

3.2.11 Diseo experimental y anlisis estadstico

Se realiz un diseo en arreglo factorial con ocho plantas por tratamiento, donde el factor

principal fueron los genotipos (F60, LV447, FLO2764, LV1401, CT19021, IR1561) y el

factor secundario fue la temperatura nocturna (24 vs 30 C). Cuando se presentaron

diferencias significativas, se us el test de Tukey como prueba de comparacin de medias.

Los datos se analizaron usando el programa SPSS (v20.0, IBM Company, USA).



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