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parte da tese de doutorado de Ivani T Oliveira
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2.4.2 Avaliação de genótipos Os genótipos estudados apresentaram diferentes respostas de resistência
quando inoculados com ambas as estirpes de R. solanacearum (Tab. 4). A estirpe
CNPH152 provocou a perda de massa seca da parte aérea (AMS negativo) para
todos os genótipos, enquanto a estirpe CNPH19 provocou perda ou aumento de
massa seca da parte aérea (AMS negativo ou positivo), destacando-se a reação do
genótipo CNPH785 que alcançou 74% de aumento médio de AMS.
A análise de agrupamento multivariada (IMB10, IMB21 e AMS),
considerando-se 50% de dissimilaridade da distância de Mahalanobis
(ALBUQUERQUE, 2005; ARAMENDIZ-TATIS et al., 2011; CARGNELUTTI FILHO et
al., 2008), separou três grupos de reação de resistência à estirpe CNPH19, que
tiveram uma classificação de resistência apontada neste trabalho por esta
separação: Grupo 1 (suscetíveis) - PROVS75, CIÇA, CNPH777, CNPH006,
CNPH130, CNPH658, CNPH779, CNPH780, CNPH783, CNPH784, CNPH786,
CNPH781, CNPH782, CNPH171 e CNPH407; Grupo 2 (medianamente resistentes) -
CNPH788, CNPH778, CNPH787, CNPH785 e PROVTS3; Grupo 3 (resistentes) -
CNPH776, e dois grupos para a estirpe CNPH152: Grupo 1 (suscetíveis) -
CNPH658, CNPH777 e PROVS75; Grupo 2 (resistentes) - CNPH407, CNPH171,
CNPH781, CNPH784, CNPH785, CNPH006, PROVTS3, CNPH779, CNPH788,
CNPH783, CNPH782, CNPH778, CNPH780, CNPH786, CNPH776 e CNPH787
(Fig. 1). A classificação de resistência dos grupos separados para as duas estirpes
bacterianas não são correspondentes, uma vez que as respostas obtidas para a
estirpe CNPH19 permitiu a separação de maior número de grupos do que aquelas
obtidas para a estirpe CNPH152. As faixas de variação de IMB10, IMB21 e AMS dos
grupos separados para as estirpes CNPH19 e CNPH152 são apresentadas na
Tab. 5.
O genótipo CNPH7776, que apresentou resistência muito destacada em
relação à estirpe CNPH19, foi também resistente à estirpe CNPH152, podendo ser
considerado o mais resistente entre os genótipos testados. Os genótipos CNPH788,
CNPH778, CNPH787, CNPH785 e PROVTS3 também apresentaram bom nível de
resistência, uma vez que não apresentaram perda de AMS.
b
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Tabela 4 – Severidade de murcha bacteriana em plantas de 21 genótipos de berinjela, expressa pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (IMB10 e IMB21, respectivamente) com as estirpes CNPH19 e CNPH152 de Ralstonia solanacearum (raça 1, biovar I) e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) aos 21 dias após a inoculação
Genótipos
Estirpes
CNPH19 CNPH152
IMB10* IMB21* AMS*+c IMB10** IMB21** AMS**
+c
CIÇA 4,7 a 4,9 a 946,3 b ND ND ND CNPH006 4,9 a 5,0 a 934,9 b 2,3 c 2,5 c 984,3 a CNPH130 4,4 a 4,8 a 964,6 b ND ND ND CNPH171 3,9 b 4,2 b 948,3 b 2,0 c 2,7 c 965,3 a CNPH407 3,7 b 4,1 b 969,1 b 2,4 b 2,1 b 919,1 b CNPH658 4,6 a 4,2 b 945,9 b 4,5 a 4,6 a 915,7 b CNPH776 2,8 c 1,6 e 1024,2 a 1,5 d 1,6 d 995,3 a CNPH777 4,9 a 5,0 a 950,0 b 4,5 a 4,7 a 912,0 b CNPH778 2,2 d 2,2 d 1024,4 a 1,1 d 1,1 d 995,5 a CNPH779 3,8 b 3,6 c 979,4 b 1,4 d 1,4 d 976,5 a CNPH780 3,0 c 3,2 c 1023,9 a 1,3 d 1,3 d 990,8 a CNPH781 3,9 b 4,3 b 990,2 b 2,0 c 2,5 c 968,3 a CNPH782 3,6 b 3,9 b 993,1 b 1,0 d 1,2 d 988,5 a CNPH783 3,3 c 3,3 c 1025,1 a 1,0 d 1,0 d 967,6 a CNPH784 3,4 c 3,6 c 1010,3 a 2,1 c 2,3 c 957,3 a CNPH785 1,3 e 1,3 e 1074,0 a 2,5 c 2,6 c 959,7 a CNPH786 3,2 c 3,6 c 1025,2 a 1,4 d 1,3 d 996,8 a CNPH787 2,8 c 2,6 d 1032,3 a 1,8 c 1,9 d 993,1 a CNPH788 2,2 d 2,1 d 1050,1 a 1,5 d 1,9 d 978,0 a PROVTS3 2,8 c 2,6 d 971,1 b 1,2 d 1,3 d 975,0 a PROVS75 4,7 a 4,9 a 957,1 b 4,5 a 4,3 a 924,8 b
Média 3,51 3,55 992,35 2,11 2,21 966,5
CV(%) 16,46 17,47 3,15 33,10 31,31 1,86 *Médias de cinco repetições para a estirpe CNPH19. ** Médias de três repetições para a estirpe CNPH152. Valores seguidos de mesma letra na coluna não se diferenciam entre si, segundo o teste de agrupamento de Scott-Knott (P<0,05). ND: não determinado. +c Valores adicionados da constante 1000. CV: coeficiente de variação.
28 30
33
CNPH658 CNPH777 PROVS75 CNPH407 PROVTS3 CNPH779 CNPH780 CNPH778 CNPH782 CNPH786 CNPH783 CNPH171 CNPH781 CNPH788 CNPH784 CNPH785 CNPH776 CNPH787 CNPH006
Grupo 2
B
Distância de Mahalanobis
Grupo 1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 3,16 6,33 9,5 12,67 15,84 19,01 22,18 25,34 28,51 31,68
A PROVS75
CIÇA CNPH777 CNPH006 CNPH130 CNPH658 CNPH779 CNPH780 CNPH783 CNPH784 CNPH786 CNPH781 CNPH782 CNPH171 CNPH407 CNPH788 CNPH778 CNPH787 CNPH785 PROVTS3 CNPH776
Grupo 2
Grupo 1
Grupo 3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1,63 3,26 4,89 6,52 8,15 9,78 11,41 13,04 14,67 16,31
Figura 1 – Dendrogramas de dissimilaridade das distâncias de Malahanobis das
reações de genótipos de berinjela inoculados com as estirpes CNPH19 (A) e CNPH152 (B) de Ralstonia solanacearum, expressas pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (DAI) e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada aos 21dias após a inoculação.
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Tabela 5 – Grupos de classificação de genótipos de berinjela obtidos por análise de agrupamento multivariada para as estirpes CNPH19 e CNPH152 e suas respectivas faixas de índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (IMB10 e IMB21) e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS)
Estirpe Grupo Classificação IMB10 IMB21 AMS
CNPH19
1 Suscetível 4,9 a 3,0 5,0 a 3,2 -65,1 a 25,2
2 Medianamente resistente 2,8 a 1,3 2,6 a 1,3 -28,9 a 24,4
3 Resistente 2,8 1,6 24,2
CNPH152 1 Suscetível 4,5 a 2,4 4,7 a 2,1 -88 a -75,2
2 Resistente 2,5 a 1,0 2,7 a 1,0 -42,7 a - 3,2
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2.4.3 Estudo da interação entre genótipos e estirpes
Houve interação entre estirpes de R. solanacearum e genótipos de S. melongena
para os índices de murcha bacteriana aos 10 e 21 DAI (P≤0,05) e para a alteração
de massa seca da parte aérea (P≤0,01) (Tab. 6).
Apesar de haver sido observada interação entre estirpes e genótipos, o
genótipo CNPH778 foi o que apresentou maior resistência às distintas estirpes.
Observou-se que para este genótipo as estirpes testadas tiveram o mesmo
comportamento de virulência.
A estirpe CNPH19 apresentou-se como a mais virulenta para quatro dos
genótipos estudados (CNPH006, CNPH171, CNPH407 e CNPH658). Observou-se
que esta estirpe provocou baixa severidade de murcha bacteriana para as plantas
do genótipo CNPH785, tendo permitido aumento na massa seca da parte aérea
(AMS) para os genótipos CNPH785 e CNPH778. Esta estirpe proporcionou maior
distinção entre os genótipos estudados.
Como já ocorrido nos ensaios anteriores, além do sintoma típico de murcha,
foram observados: menor crescimento de plantas, amarelecimento,
encarquilhamento (Apêndice 1) e queda prematura de folhas.
Os resultados observados neste ensaio também são apresentados no
Apêndice 2. Os valores de índice de murcha bacteriana (IMB) em todos os genótipos
(com exceção do genótipo CNPH658, aos 10 e 21 DAI, e o genótipo CNPH006, aos
21 DAI) foram abaixo de 2,0 para cinco das seis estirpes estudadas (CNPH13,
CANPH47, CNPH56, CNPH71 e CNPH152). Para os genótipos CNPH785 e
CNPH778 para todas as estirpes inoculadas o IMB10 e IMB21, inclusive para a
estirpe CNPH19.
A análise de agrupamento multivariada, considerando-se como linha de
corte 50% da distância de Mahalanobis (Fig. 2), separou dois grupos: Grupo 1
(resistentes) CNPH782, CNPH783, CNPH785, CNPH778, CNPH171, CNPH407 e
CNPH006; e Grupo 2 (suscetíveis): CNPH658. Se fosse considerada a linha de corte
em 40% haveria a separação de três grupos: Grupo 1 (resistentes) CNPH782,
CNPH783, CNPH785 e CNPH778; Grupo 2 (medianamente resistentes) CNPH171,
CNPH407 e CNPH006; e Grupo 3: CNPH658 (suscetíveis).
36
Foi feito também o agrupamento por análise multivariada da virulência das
estirpes de Ralstonia solanacearum, com a separação de dois grupos com linha de corte
de 50% de dissimilaridade e três grupos, se fosse considerada a dissimilaridade de
40% (Fig. 3). A estirpe CNPH19 ficaria classificada como componente único em
qualquer das duas situações, dado o elevado nível de virulência apresentado por
esta estirpe, enquanto as outras cinco estirpes seriam agrupadas em um único
grupo (50% de dissimilaridade) ou haveria a separação das estirpes CNPH13 e
CNPH152, com nível de virulência inferior à estirpe CNPH19, porém mais elevado
que as estirpes CNPH47, CNPH71 e CNPH56 (40% de dissimilaridade).
37
Tabela 6 – Virulência de seis estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1, em oito genótipos de berinjela, expressa em logaritmo do índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (IMB10 e 21), e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) aos 21 dias após a inoculação
Genótipo Log(IMB10) * Genótipo Log(IMB21) * Genótipo AMS*+c
Est
irpe
CN
PH
13 CNPH006 0,164 b c CNPH006 0,243 b CNPH006 989,4 a b
CNPH171 0,156 b c d CNPH171 0,180 b c CNPH171 984,2 a b CNPH407 0,130 b c d CNPH407 0,117 b c CNPH407 1000,3 a CNPH658 0,372 a CNPH658 0,454 a CNPH658 965,2 b CNPH778 0,030 c d CNPH778 0,058 c CNPH778 999,3 a CNPH782 0,093 b c d CNPH782 0,083 c CNPH782 979,5 a b CNPH783 0,049 c d CNPH783 0,083 c CNPH783 988,6 a b CNPH785 0,180 b CNPH785 0,136 b c CNPH785 988,5 a b
Est
irpe
CN
PH
19 CNPH006 0,642 a CNPH006 0,698 a CNPH006 907,8 c
CNPH171 0,587 a CNPH171 0,661 a CNPH171 917,5 c CNPH407 0,604 a CNPH407 0,617 a CNPH407 910,6 c CNPH658 0,589 a CNPH658 0,670 a CNPH658 918,3 c CNPH778 0,121 c CNPH778 0,161 c CNPH778 1002,1 a CNPH782 0,345 b CNPH782 0,371 b CNPH782 966,2 b CNPH783 0,483 b CNPH783 0,463 b CNPH783 960,4 b CNPH785 0,097 c CNPH785 0,091 c CNPH785 1005,3 a
Est
irpe
CN
PH
47 CNPH006 0,175 b CNPH006 0,247 b CNPH006 992,3 a
CNPH171 0,060 b c CNPH171 0,089 c CNPH171 994,4 a CNPH407 0,050 b c CNPH407 0,042 c CNPH407 994,6 a CNPH658 0,410 a CNPH658 0,571 a CNPH658 948,4 b CNPH778 0,019 c CNPH778 0,067 c CNPH778 999,8 a CNPH782 0,019 c CNPH782 0,090 c CNPH782 980,7 a CNPH783 0,053 b c CNPH783 0,012 c CNPH783 986,6 a CNPH785 0,048 b c CNPH785 0,063 c CNPH785 988,0 a
Est
irpe
CN
PH
56 CNPH006 0,291 b CNPH006 0,379 b CNPH006 964,9 a b
CNPH171 0,163 b c CNPH171 0,169 c d CNPH171 989,6 a CNPH407 0,146 c d CNPH407 0,180 c CNPH407 993,6 a CNPH658 0,556 a CNPH658 0,644 a CNPH658 930,6 b CNPH778 0,030 d CNPH778 0,050 d CNPH778 995,2 a CNPH782 0,077 c d CNPH782 0,091 c d CNPH782 993,5 a CNPH783 0,096 c d CNPH783 0,111 c d CNPH783 986,6 a CNPH785 0,127 c d CNPH785 0,127 c d CNPH785 973,7 a
Est
irpe
CN
PH
71 CNPH006 0,287 b CNPH006 0,398 b CNPH006 975,3 a b
CNPH171 0,076 c d CNPH171 0,051 c d CNPH171 992,6 a CNPH407 0,160 c CNPH407 0,149 c CNPH407 986,7 a CNPH658 0,443 a CNPH658 0,561 a CNPH658 948,7 b CNPH778 0,013 d CNPH778 0,019 d CNPH778 1001,3 a CNPH782 0,012 d CNPH782 0,029 c d CNPH782 1000,0 a CNPH783 0,029 d CNPH783 0,031 c d CNPH783 993,3 a CNPH785 0,037 c d CNPH785 0,044 c d CNPH785 997,7 a
Est
irpe
CN
PH
152 CNPH006 0,266 b CNPH006 0,327 b CNPH006 981,4 a b
CNPH171 0,222 b c CNPH171 0,223 b c CNPH171 985,4 a b CNPH407 0,169 b c d CNPH407 0,159 c d CNPH407 1002,8 a CNPH658 0,472 a CNPH658 0,504 a CNPH658 959,8 b CNPH778 0,092 d CNPH778 0,069 d CNPH778 994,3 a CNPH782 0,123 c d CNPH782 0,111 c d CNPH782 977,8 a b CNPH783 0,104 c d CNPH783 0,105 c d CNPH783 998,4 a CNPH785 0,210 b c d CNPH785 0,194 c d CNPH785 977,1 a b
Média 0,20 0,23 978,51 CV(%) 28,89 25,36 1,47 * Médias de quatro repetições. Valores seguidos de mesma letra em cada combinação estirpe-genótipo não diferem entre si, pelo teste Tukey (P<0,05). +c Valores adicionados da constante 1000. CV: coeficiente de variação. 28
38
Figura 2 – Dendrograma de dissimilaridade das distâncias de Mahalanobis das
reações de oito genótipos de berinjela causadas pela inoculação de seis estirpes de Ralstonia solanacearum (CNPH13, CNPH19, CNPH47, CNPH56, CNPH71 e CNPH152) e expressas pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada aos 21 dias após a inoculação.
Figura 3 – Dendrograma de dissimilaridade das distâncias de Mahalanobis da
severidade de murcha bacteriana causada por seis estirpes de Ralstonia solanacearum em oito genótipos de berinjela (CNPH006, CNPH171, CNPH407, CNPH658, CNPH778, CNPH782, CNPH783 e CNPH785), expressa pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 .23 .47 .3 .94 1.17 1.41 1.64 1.91 2.15 2.38
Distância de Mahalanobis
CNPH782 CNPH783 CNPH785 CNPH778 CNPH171 CNPH407 CNPH006 CNPH658 Grupo 2
Grupo 1
CNPH47 CNPH71 CNPH56 CNPH13 CNPH152 CNPH19
Grupo 2
Grupo 1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 .22 .43 .64 .86 1.07 1.29 1.51 1.72 1.94 2.15
Distância de Malahanobis
39
2.5 Discussão
A diversidade de virulência das estirpes estudadas neste trabalho é
concordante com os dados observados em quase a totalidade de estudos com R.
solanacearum. Foi possível verificar que estirpes de biovares I, II e III, procedentes de
diferentes hospedeiros em diferentes regiões do Brasil, foram capazes de causar
murcha bacteriana em berinjela, não sendo apresentada relação entre virulência e a
procedência de local ou hospedeiro, ou ainda, com a biovar, em concordância com
os dados de Morgado; Lopes; Takatsu (1992b). Pode-se observar perda de
virulência para as estirpes CNPH104 e CNPH105, associada à capacidade de
aumento de AMS. Alguns trabalhos relatam a possibilidade de estirpes avirulentas
de R. solanacearum serem utilizados para controle biológico da murcha bacteriana
(TRIGALET; TRIGALET-DEMERY, 1990; FREY et al.,1994; ETCHEBAR et al.,
1998; TRIGALET; TRIGALET-DEMERY; FEUILLADE, 1998). As estirpes CNPH104
e CNPH105 poderiam ser mais estudadas para avaliar sua capacidade de
colonização, variação de AMS e estabilidade quanto às suas características de
avirulência em outras variedades de berinjela e também em outras espécies
vegetais.
É importante observar que na avaliação de resistência dos genótipos
também houve resposta de aumento de AMS em plantas dos genótipos CNPH776,
CNPH778, CNPH780, CNPH783, CNPH784, CNPH785, CNPH786, CNPH787 e
CNPH788 quando inoculados com a estirpe CNPH19, porém, com a apresentação
de sintoma de murcha em todos os genótipos avaliados, o que descarta qualquer
possibilidade de estudo para a finalidade de controle biológico.
A informação dada pela avaliação de alteração de massa seca da parte
aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) foi útil para complementar a
comparação feita entre estirpes e genótipos quando não ocorreram diferenças nas
notas de murcha (IMB).
Na avaliação de resistência, os resultados foram diferentes daqueles
descritos anteriormente (CHEN; LI; WANG, 1997; MORGADO, 1991), evidenciando
que a grande variabilidade do patógeno é sempre um dos fatores que dificultarão a
eficiência de resistência de variedades desenvolvidas para este fim em diferentes
locais (regionais ou mesmo em termos de propriedade). Isto reforça a necessidade
de serem utilizadas diferentes estirpes no desenvolvimento de novas variedades que
40
visem resistência à murcha bacteriana, principalmente aquelas prevalecentes em
locais específicos para utilização das variedades a serem desenvolvidas (LOPES;
GIORDANO, 1983; LOPES; BOITEUX, 2004). Os resultados de Morgado; Lopes;
Takatsu (1992a) indicaram os genótipos CNPH171 e CNPH407, como resistentes
segundo a severidade de murcha alcançada, e de fato, estes genótipos apresentam
maior resistência quando comparados ao padrão suscetível (CNPH658), porém, no
presente trabalho estes genótipos se equipararam ao genótipo CNPH006, que se
apresentou com um nível de suscetibilidade próximo ao do padrão suscetível
(CNPH658). Neste trabalho, estes genótipos tiveram classificação de resistência
mediana ou baixa, e isso se deve à comparação com genótipos provenientes do
AVRDC – Taiwan, que apresentam resistência muito elevada e também à utilização
da avaliação de AMS. Com base nos dados apresentados no Apêndice 2, houve um
padrão onde poderia se reconhecer comportamento de resistência quantitativa ou
não específica (horizontal), segundo Vanderplank (1963, 1982), para os genótipos
CNPH778 e CNPH785. Os genótipos CNPH171, CNPH407, CNPH782 e CNPH783
também teriam apresentado padrão de resistência horizontal, se não fosse a reação
à estirpe CNPH19, que poderia ser reconhecida como deficiência da resistência a
uma variante do patógeno específica, evidenciando instabilidade na resistência.
Portanto, mais estudos são necessários para concluir sobre o comportamento de
resistência dos genótipos estudados neste trabalho.
Entre os genótipos estudados neste trabalho foi possível observar que
CNPH776, CNPH778, CNPH787, CNPH788, CNPH785 e PROVTS3, provenientes
do AVRDC apresentaram nível de resistência elevado, com potencial para sua
utilização para um programa de melhoramento. Uma característica negativa
apresentadas por genótipos é o fato de produzirem frutos claros (Apêndice 3),
característica diferente daquela desejada no mercado brasileiro, que é a de frutos
escuros (RIBEIRO; BRUNE; REIFSCHNEIDER, 1998), porém, esta é uma
característica que poderia ser incorporada em um trabalho de melhoramento para
obtenção de material comercial resistente à murcha bacteriana, que viesse a utilizar
estes genótipos.
41
2.6 Conclusões
As estirpes CNPH152 e CNPH19 são as mais virulentas para os genótipos
CNPH110 (suscetível) e CNPH171 (resistente), respectivamente.
Entre as estirpes estudadas existe elevada diversidade de virulência, que
não se correlaciona com a origem ou biovar da estirpe.
Os genótipos provenientes do AVRDC - Taiwan (Asian Vegetable Research
and Development Center) apresentam elevado nível de resistência à murcha
bacteriana, destacando-se os genótipos CNPH776, CNPH778, CNPH787,
CNPH788, CNPH785 e PROVTS3.
Existe interação entre estirpes e genótipos, o que dificulta a seleção de uma
única estirpe para trabalhos de resistência e a discriminação de genótipos como
resistentes ou suscetíveis.
42
3 Capítulo II
Produção de frutos e sintomas em genótipos de berinjela cultivados em solo infestado por Ralstonia solanacearum
3.1 Resumo
A produção de frutos de berinjela e sintomas apresentados em plantas dos genótipos CNPH006, CNPH171, CNPH658, CNPH778, CNPH783 e CNPH785 foram observados em solo naturalmente infestado por Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar III, para quantificação de perdas causadas pela infecção bacteriana. Com exceção do genótipo CNPH778, todos apresentaram ao menos uma planta com murcha típica da doença. Além de murcha, foram observados os sintomas de seca e morte de plantas, nos genótipos CNPH006 e CNPH658, amarelecimento de folhas, no genótipo CNPH785; e menor crescimento de plantas, em todos os genótipos. A ocorrência de fluxo bacteriano foi constatada em todas as plantas cultivadas nos canteiros infestados inclusive as que não apresentaram sintomas. Simultaneamente, outro ensaio foi instalado em canteiros próximos, porém não infestados, com as mesmas características de solo e dimensões, para obtenção de dados de produção sem ocorrência de murcha. Foi calculada a perda percentual de produção de cada genótipo conduzido em solo infestado em relação à produção da área sem ocorrência de murcha. Os genótipos foram agrupados (Scott-Knott P≤0,05) quanto à sua capacidade de manter a produção de frutos em uma área infestada com R. solanacearum. O genótipo CNPH785 foi o mais resistente, não apresentando perda na produção em relação à média obtida na área livre do patógeno, seguido dos genótipos CNPH783, CNPH778 e CNPH171, com perdas médias em relação à média obtida na área livre do patógeno de 19,3%; 11,4%; e 10,1%, respectivamente. Os genótipos CNPH658 e CNPH006 foram os mais suscetíveis, com perdas médias de 99,53 e 99,32%, respectivamente. Palavras-chave: murcha bacteriana, Solanum melongena, perdas
43
3.2 Introdução
A ocorrência de murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum
(Smith) Yabuuchi et al., é um dos fatores limitantes para produção de berinjela
(Solanum melongena L.) em regiões de clima quente e úmido. Na região Amazônica a
doença é um sério problema para o cultivo de solanáceas, ficando a produção local
quase restrita a pequenas hortas caseiras (COELHO NETTO et al., 2004). Nos
plantios de berinjela no estado do Amazonas, constataram-se perdas de até 40%
(COELHO NETTO et al., 2004). A doença também tem grande importância nas
regiões baixas do Nordeste e do Centro-Oeste (TAKATSU; LOPES, 1997). No
agreste pernambucano foram observados 60% de plantios de tomate infectados com
a doença, com incidência média de 13% (SILVEIRA; MICHEREFF; MARIANO,
1997).
O sintoma típico da doença é a murcha da planta de cima para baixo,
resultante da interrupção parcial ou total do fluxo de água desde as raízes até o topo
da planta (LOPES, 2009). Pode ocorrer ainda epinastia foliar e formação de raízes
adventícias devido ao desequilíbrio nos níveis de auxina e etileno (BUDDENHAGEN;
KELMAN, 1964). O patógeno penetra na planta através de ferimentos causados pelo
crescimento de raízes secundárias, colonizando as células do córtex e do
parênquima vascular, de forma intercelular, com rompimento de paredes celulares
que facilitam a invasão dos vasos do xilema do hospedeiro (VASSE; FREY;
TRIGALET, 1995). Vasos xilemáticos podem abrigar concentração superior a 1010
células por centímetro em tecidos de tomate, que juntamente com polissacarídeos
extracelulares produzidos pelo patógeno aumentam a viscosidade do fluido do
xilema, dificultando seu fluxo na direção das folhas provocando a murcha e morte da
planta (GENIN; BOUCHER, 2002). Há formação de tiloses e aumento nos níveis de
etileno e ácido abscísico, que completam o quadro sintomático complexo da murcha
(KELMAN, 1953). Da planta morta, a bactéria retorna ao solo onde sobrevive
saprofiticamente até infectar uma nova planta.
A diagnose de murcha bacteriana é feita cortando-se uma seção longitudinal
contendo tecido vascular, geralmente escurecido, de plantas suspeitas de
apresentarem infecção por R. solanacearum e colocando-a em um recipiente
transparente contendo água em repouso. Em poucos minutos, finos fios
44
esbranquiçados fluem das margens do tecido, sendo esta a resposta positiva para R.
solanacearum (LOPES; QUEZADO-SOARES, 1997).
Em ensaios em casa de vegetação, genótipos de berinjela foram relatados
como resistentes à murcha bacteriana (MORGADO et al. 1992a; OLIVEIRA-
NAPOLEÃO et al., 1998; OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al., 1999). Nestes genótipos
foram observados sintomas diferentes de murcha, entre eles, subcrescimento de
mudas (OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al., 1998). Esta redução do crescimento de
plantas em casa de vegetação leva à suposição de perdas de produtividade no
campo. Neste trabalho o objetivo foi observar em campo o crescimento de plantas e
o aparecimento de murcha ou outros sintomas em genótipos classificados como
resistentes em casa de vegetação e também avaliar a capacidade produtiva, quando
cultivados em solo naturalmente infestado com R. solanacearum.
3.3 Material e Métodos 3.3.1 Área dos ensaios e genótipos avaliados
Os ensaios foram conduzidos em solo na Embrapa Hortaliças, localizada no
núcleo rural de Ponte Alta, Brasília-DF, sob precipitação mensal média de 154,7 mm
e temperatura mensal média de 23,9°C. Foram utilizados 10 canteiros delimitados
com alvenaria de 1 m de largura por 10 m de comprimento, com solo naturalmente
infestado com R. solanacearum, raça 1, biovar 3, em cinco destes canteiros e os outros
cinco, livres do patógeno. Para verificar a uniformidade de infestação bacteriana do
solo, foram transplantadas em cada canteiro três linhas de mudas de tomateiro da
cultivar Ponderosa, muito suscetível à murcha, com espaçamento de 25 x 25 cm.
Antes do plantio das mudas de tomate foram feitas análises do solo dos canteiros,
correção com calcário dolomítico e adubação com NPK (10-10-10) e composto de
esterco bovino, conforme a recomendação para tomate da 4ª aproximação da
CFSEMG (1989). No momento do transplantio das mudas, foi aplicado ao redor de
cada muda 5 g de aldicarbe granulado (Temik 150) para controle de insetos e
ácaros. Após 30 dias do transplantio, todas as plantas de tomateiro apresentavam
sintomas de murcha e foram incorporadas ao solo do canteiro.
45
Mudas de berinjela com 30 dias após o semeio foram transplantadas, com
50 cm entre linhas e 80 cm entre plantas. Em cada canteiro foram colocadas quatro
plantas (parcela experimental) de seis genótipos (Tab. 7).
Tabela 7 – Genótipos de Solanum melongena avaliados em campo: procedência e
reações1 a três estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1
Genótipo Procedência Estirpe
CNPH562 CNPH193 CNPH1523
CNPH006 Agroflora (Brasil/SP) MR S MR CNPH171 INRA (França) R S MR CNPH658 Topseed (EUA) S S S CNPH778 AVRDC (Índia) - R R CNPH783 AVRDC (Indonésia) - MS R CNPH785 AVRDC (Índia) - R MR
1 R: resistente; MR: medianamente resistente; MS: medianamente suscetível ; S: suscetível 2 Biovar III. Fonte: MORGADO, 1991 3 Biovar I. Fonte: OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al. (1998); OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al. (1999)
3.3.2 Registro de plantas sintomáticas, fluxo bacteriano e produção de frutos
Foram observados o sintoma de murcha e a morte de plantas aos 10, 50, 90
e 130 dias após o transplantio. A produção de frutos (kg/planta) de cada parcela foi
avaliada em cinco colheitas, iniciadas 70 dias após o transplantio das mudas e com
intervalo de 15 dias entre elas. Ao final da última colheita todas as plantas das duas
áreas foram cortadas e fragmentos do caule de cada planta retirados a 5 cm acima
do colo para observação de fluxo bacteriano em copo (LOPES; QUEZADO-
SOARES, 1997).
3.3.3 Procedimento estatístico
O delineamento utilizado foi o de blocos casualizados, com cinco repetições
(cada canteiro constituiu um bloco). As análises de variância foram feitas utilizando o
programa estatístico Winstat 1.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2002), sendo feita
neste mesmo aplicativo a análise de resíduos para verificação das pressuposições
da análise de variância: gráfico de caixa, distribuição normal e dispersão do erro. As
médias de produção dos genótipos foram comparadas pelo teste de Tukey (p≤0,05).
Foi calculada a redução percentual da produção dos genótipos estudados em
46
relação à média de produção dos respectivos genótipos nos cinco canteiros livres do
patógeno e feito testes de agrupamento de Scott-Knott (p≤0,05), com auxílio do
programa GENES (CRUZ, 2006).
3.4 Resultados 3.4.1 Descrição sintomatológica e diagnose
Os primeiros sintomas de murcha foram observados 10 dias após a
transplantio, em plantas dos genótipos CNPH006 e CNPH658. No decorrer do
período de avaliação foi observado sintoma de murcha em pelo menos uma planta
em todos os genótipos, com exceção de CNPH778 (Tab. 8). Além de murcha,
observou-se: seca e morte de plantas, nos genótipos CNPH006, CNPH171,
CNPH783 e CNPH658, amarelecimento de folhas, em CNPH785, e menor
crescimento de plantas em todos os genótipos estudados (Apêndice 2).
O teste de exsudação em copo permitiu constatar a presença de
R. solanacearum em todas as plantas restantes dos canteiros infestados, sem exceção,
embora algumas delas não tenham apresentado murcha ou outros sintomas. De
fragmentos de plantas que apresentaram exsudação, foram feitos isolamentos de
R. solanacearum, dos quais um isolado ficou depositado na coleção da Embrapa
Hortaliças com a identificação CNPH182.
Na área livre do patógeno, nenhuma planta apresentou sintoma de murcha
ou fluxo bacteriano em copo, o que confirmou a ausência de R. solanacearum nestas
plantas.
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Tabela 8 – Incidência de sintoma de murcha (S) e morte (M) em plantas de genótipos de berinjela, em percentagem, aos 10, 50, 90 e 130 dias após transplantio em área infestada naturalmente com Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar 3.
Genótipos
Dias após transplantio
10 50 90 130 S M S M S M S M
CNPH658 5 0 55 5 100 90 100 100 CNPH006 10 0 85 0 100 90 100 95 CNPH171 0 0 0 0 5 5 15 5 CNPH778 0 0 0 0 0 0 0 0 CNPH783 0 0 0 0 15 10 10 10 CNPH785 0 0 5 5 10 5 10 10
3.4.2 Produção de frutos Os genótipos CNPH006 e CNPH778 foram o mais produtivos na área com
solo livre de R. solanacearum. Na área com solo infestado pela bactéria o genótipo
mais produtivo foi CNPH778 (Tab. 9), porém o genótipo CNPH785 foi o que
apresentou a menor redução de produção entre a área livre da bactéria e aquela
infestada (Fig.4). Foi possível agrupar os seis genótipos em três grupos: suscetíveis
(CNPH 006 e CNPH 658), medianamente resistentes (CNPH 171, CNPH783 e
CNPH778) e resistentes (CNPH785), segundo o teste de Scott-Knott (Fig. 4).
Tabela 9 - Produção (kg de frutos/planta sobrevivente) de seis genótipos de berinjela
em área livre e em área infestada por Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar 3
Genótipos Produção1
Área livre Área infestada CNPH658 3,66 b c 0,17 d CNPH006 6,16 a 0,41 d CNPH171 3,14 c 2,82 b CNPH778 5,28 a b 4,68 a CNPH783 2,70 c 2,18 c CNPH785 1,98 c 2,08 c
CV(%) 22,12 15,80 1 Médias de 5 repetições. Valores na coluna seguidos pelas mesmas letras não diferem pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05). CV: coeficiente de variação.
48
Figura 4 – Manutenção na produção (peso) de frutos por genótipos de berinjela em
plantas cultivadas em solo naturalmente infestado por Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar 3, em relação à média de produção em uma área livre do patógeno. Os valores das colunas com mesmas letras formam grupos que não se diferenciam entre si, segundo o teste de agrupamento de Scott-Knott (P≤ 0,05).
49
3.5 Discussão
O resultado de baixa perda na produção de frutos apresentado pelo genótipo
CNPH171 foram concordantes com aqueles observados em casa de vegetação por
Morgado (1991), onde este genótipo foi apontado como o mais promissor entre os
avaliados, ainda que a estirpe encontrada no solo dos canteiros fosse da biovar 3,
enquanto que aquelas utilizadas na casa de vegetação eram da biovar 1. Entretanto,
este genótipo apresentou-se suscetível em ensaio em casa de vegetação quando
inoculado com a estirpe CNPH19, pertencente ao biovar I (OLIVEIRA-NAPOLEÃO
et al., 1998). Este comportamento é justificado em função de interação já observada
entre genótipos e estirpes de berinjela (OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al., 1999). Este
fato é reforçado por trabalhos onde foi avaliada a resistência de tomate à murcha
bacteriana que também relatam as reações de resistência alteradas em função da
variabilidade do patógeno (GRIMAULT; PRIOR, 1994).
O genótipo CNPH658 (Flórida Market) confirmou-se um bom padrão de
suscetibilidade à murcha bacteriana (MORGADO et al., 1991). O genótipo CNPH006
que nos ensaios de casa de vegetação (MORGADO et al., 1991; OLIVEIRA-
NAPOLEÃO et al., 1998; 1999), teve resposta variável, dependendo da estirpe, no
presente ensaio apresentou-se tão suscetível quanto o genótipo CNPH658. Porém,
sua característica de alta produtividade e característica de cor (escuro) e formato de
fruto (alongado), que são as características demandadas pelo mercado brasileiro,
pode levar a considerá-lo como um progenitor recorrente em um futuro trabalho de
melhoramento.
O genótipo CNPH778, que em casa de vegetação foi o mais resistente,
apresentou pouca redução na produção em relação à área livre de murcha e por ser
um dos genótipos mais produtivos nestes ensaios, foi aquele que alcançou produção
mais elevada que os demais (Tab. 8).
O genótipo CNPH785, apesar de apresentar diversos sintomas de
colonização pelo patógeno (murcha, amarelecimento de folhas e menor crescimento
das plantas), conseguiu manter a mesma média de produtividade que na área livre
da bactéria, o que indica alta tolerância à colonização do patógeno. Este mesmo
genótipo apresentou aumento de massa seca da parte aérea quando inoculado com
a estirpe CNPH19 (OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al., 1998). Estes dados podem levar a
considerar que este genótipo tenha alguma reação de estímulo de crescimento
50
quando em contato com algumas estirpes de R. solanacearum, semelhante à resposta
de promoção de crescimento proporcionada por rizobactérias, como a observada em
tomate em resposta a inoculação de rizobactérias do gênero Serratia, Pseudomonas e
Bacillus (GAO et al., 2004).
Dois aspectos foram observados na resistência dos genótipos CNPH778 e
CNPH785: o número de plantas sobreviventes e manutenção da produção de frutos
por planta. O genótipo CNPH778 não apresentou perda de plantas, mas teve a
produção por planta reduzida na área infestada. Apesar desta redução, ainda foi o
genótipo mais produtivo na área com solo infestado. Já o genótipo CNPH785
apresentou perda no número de plantas, mas manteve na área infestada a produção
apresentada na área livre do patógeno.
Estas características dos genótipos CNPH778 e CNPH785 evidenciaram
diferenças na resistência que poderiam contribuir de forma distinta em um trabalho
de melhoramento de berinjela visando resistência à murcha bacteriana.
3.6 Conclusões Os genótipos CNPH171, CNPH778, CNPH783 e CNPH785 apresentaram
diferenças na manifestação de sintomas entre si, porém, a redução de crescimento
das plantas, foi um sintoma apresentado por todos;
Houve diferenças quanto à produção de frutos entre os genótipos estudados
sem murcha bacteriana, assim como na manutenção do nível de produção de frutos
quando em solo infestado por R. solanacearum;
O genótipo CNPH778 não apresentou sintomas de murcha bacteriana
quando cultivado em solo naturalmente infestado pelo patógeno, mesmo
apresentando colonização pela bactéria;
O genótipo CNPH785 apesar de ter apresentado colonização pelo patógeno e
morte de plantas ocasionada pela murcha, foi capaz de manter sua média de
produção de frutos por planta, comparado à produção média em solo não infestado.
51
4 Capítulo III
Titulação de resistência e colonização de tecidos por duas estirpes de Ralstonia solanacearum em genótipos de berinjela com diferentes níveis de
resistência 4.1 Resumo A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, é considerada a principal doença vascular de etiologia bacteriana no mundo, sendo patogênica a centenas de espécies vegetais, incluindo berinjela. O melhoramento incorporando resistência genética às cultivares tem sido a medida que tem apresentado resultados mais satisfatórios como componente no manejo integrado desta doença. Porém, a resistência apresenta variações em diferentes regiões de cultivo. Titulação de resistência e estudo da colonização de tecidos em tomateiro, berinjela e pimentão indicam que a resistência não é apenas devida à restrição da penetração da bactéria na raiz, mas também à tolerância dos tecidos vasculares a altas populações do patógeno. Para adicionar informações a caracterização de resistência dos genótipos CNPH778 e CNPH785, foram avaliadas curvas de titulação de resistência utilizando-se suspensões bacterianas das estirpes CNPH19 e CNPH182, com concentrações de 104 a 109. Foi avaliada também a capacidade de colonização do patógeno dos tecidos destes genótipos com as mesmas estirpes bacterianas, em período de 0 a 48h. O genótipo CNPH778 foi o mais resistente à estirpe CNPH182, mas não manteve sua posição como genótipo resistente à estirpe CNPH19, previamente observada, quando avaliado pela titulação de resistência. O genótipo CNPH785 apresentou menor resistência quando comparado ao genótipo CNPH778, destacando-se em relação à estirpe CNPH19. Os genótipos CNPH778 e CNPH785 apresentaram o mesmo desempenho quanto à colonização de tecidos do caule, alcançando valores de log(ufc/g) de 7,83 e 7,95, respectivamente, segundo análise de regressão, e valores de 8,63 e 8,36 para os genótipos CNPH171 e CNPH658, respectivamente, para o período estudado. Palavras-chave: murcha bacteriana, Solanum melongena.
52
4.2 Introdução
A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum (Smith)
Yabuuchi et al., é considerada a principal doença vascular de etiologia bacteriana no
mundo, sendo patogênica a centenas de espécies vegetais, incluindo berinjela,
tomate, batata, fumo, pimenta, banana, gengibre, caupi e amendoim, sendo mais
grave em regiões quentes e úmidas (HAYWARD, 1991). Esta doença é considerada
grave para a maioria das culturas hospedeiras pela dificuldade do seu controle.
A berinjela, Solanum melongena L., por ser nativa dos trópicos requer
temperaturas elevadas para seu crescimento e maturação de frutos, mesmas
condições que são favoráveis à bactéria, o que limita mais ainda o seu controle
nesta espécie hospedeira. A utilização de estratégias de manejo como rotação de
culturas, ajuste da época de plantio e tratamento do solo, que são eficientes para
controle da murcha em batata (FRENCH, 1994) são inviáveis no cultivo de berinjela.
O uso de cultivares resistentes para produção ou para porta enxerto são as
estratégias mais bem sucedidas em relação à cultura da berinjela
(BI-HAO et al., 2009). O melhoramento incorporando resistência genética às
cultivares tem sido a medida que tem apresentado resultados mais satisfatórios,
sendo considerado um dos componentes mais importantes dentro do manejo
integrado dessa doença (PRIOR; GRIMAULT; SCHMIT., 1994). No estado do
Amazonas, onde o controle da murcha é difícil por suas características climáticas, a
utilização de híbridos de tomate com resistência à murcha bacteriana, resultaram em
apresentação de poucas plantas com sintomas da doença (REIS; MADEIRA, 2009).
Embora muitas cultivares resistentes tenham sido desenvolvidas, a resistência
frequentemente tem sido quebrada em diferentes regiões de cultivo. Isto acontece
devido à variabilidade do patógeno e, ou, à inadequação da resistência sob
condições ambientais favoráveis ao patógeno (HAYWARD, 1991; PRIOR;
GRIMAULT; SCHMIT, 1994). Por estas razões, a identificação de fontes de
resistência à murcha-bacteriana tem sido efetuada utilizando-se estirpes do
patógeno presentes nas regiões onde a doença é fator limitante, levando-se em
consideração as condições ambientais, especialmente a temperatura e a umidade.
Observações de infecções latentes em tomateiro, berinjela e pimentão
indicam que a resistência não é apenas devida à restrição da penetração da bactéria
na raiz, mas também à tolerância dos tecidos vasculares a altas populações do
53
patógeno (GRIMAULT; PRIOR, 1994). Em tomate, a colonização do caule pela
bactéria foi considerada mais rápida em cultivares suscetíveis do que em resistentes
(GRIMAULT; PRIOR, 1993; GRIMAULT; ANAIS; PRIOR, 1994; GRIMAULT et al.
1994), levando Prior et al. (1996) a sugerirem um índice de colonização que refletiria
a tolerância das plantas a R. solanacearum. Em experimentos com tomateiro entre
cultivares resistentes e suscetíveis de tomate foi observado que a resistência
correlacionou-se com a limitação da propagação bacteriana na parte inferior da
haste (GRIMAULT; PRIOR, 1994). Por outro lado, foi verificado por Oliveira-
Napoleão et al. (1999) que genótipos resistentes de berinjela mantiveram seu nível
de produção, apesar de apresentar colonização vascular.
Dentre os métodos já descritos para avaliação de resistência encontra-se a
titulação de resistência (ERCOLANI, 1984; KNOCHE; CLAYTON; FULTON, 1987,
1987). É realizada com concentrações crescentes de suspensões bacterianas, para
elaboração de uma curva de resposta que é posteriormente linearizada, com o uso
de transformação do tipo “probit”. A transformação probit é utilizada para linearizar
curvas dose-resposta que podem então ser analisadas por regressão. Este
procedimento, em geral, é utilizado para variáveis de resposta binomial, porém
Ercolani (1984) relata a possibilidade de sua utilização com variáveis contínuas.
Alguns exemplos do uso da titulação de infectividade foram apresentados em
avaliações de resistência (VUDHIVANICH, 1997; LOPES et al., 2001), em estudo de
resposta de diferentes hospedeiros a um patógeno (ROBINSON, et al., 2006) e em
comparação de virulência de isolados (YOSSEN et al., 1998).
A concentração de inóculo utilizada para testar a resistência em berinjela
varia, normalmente, entre 106 a 109 unidades formadoras de colônias (ufc) por
mililitro de suspensão bacteriana (AKIBA et al., 1972; MORGADO et al., 1994). É
importante se determinar uma concentração correta de inóculo nas avaliações de
resistência à murcha bacteriana por já ter sido evidenciado por Bowman e Sequeira
(1982) e Ercolani (1984) que concentrações abaixo do ideal podem permitir escapes
de plantas suscetíveis, ao passo que concentrações muito altas podem subestimar a
resistência (WINSTED; KELMAN, 1952). Deste modo, a titulação de infectividade é
uma ferramenta que pode ser usada para verificar a adequação de concentrações
de inóculo para diversas finalidades.
O objetivo deste trabalho foi avaliar curvas de titulação de resistência para
caracterização de genótipos de berinjela e verificar se existem diferenças na
54
capacidade de colonização de duas estirpes de R. solanacearum dos tecidos de
genótipos de berinjela com diferentes níveis de resistência.
4.3 Material e Métodos
Os ensaios foram conduzidos em casa de vegetação sob temperaturas sob
temperaturas médias diárias de 30,8 a 33,2°C. Foi utilizado aquecimento noturno
para garantir temperatura mínima de 20°C nos períodos noturnos.
4.3.1 Titulação de resistência 4.3.1.1 Genótipos de berinjela e estirpes do patógeno
Foram utilizados seis genótipos de S. melongena, previamente selecionados
por suas respostas diferenciadas de resistência à murcha bacteriana para duas
estirpes em ensaios em casa de vegetação e em campo (Tab. 10), e duas estirpes
de R. solanacearum da coleção da Embrapa Hortaliças: CNPH19, biovar I, e CNPH182,
biovar III, ambas pertencentes à raça 1. Foram escolhidas estas duas estirpes por
apresentarem alto nível de virulência, ser de biovares diferentes e induzirem
respostas diferenciadas de resistência em genótipos de berinjela (OLIVEIRA-
NAPOLEÃO et al., 1998; 1999). O genótipo CNPH658 (seleção da variedade
comercial ‘Florida Market’) foi utilizado como padrão de suscetibilidade.
Tabela 10 - Genótipos de Solanum melongena avaliados em casa de vegetação e a campo: procedência e reações1 a duas estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1
Genótipo Procedência Estirpe
CNPH192 CNPH1522 Campo3
CNPH006 Agroflora (Brasil) S R S CNPH171 INRA (França) S MR MR CNPH407 China S R ND CNPH658 Topseed (EUA) S S S CNPH778 AVRDC (Índia) R R MR CNPH785 AVRDC (Índia) R MR R
1 R: resistente; MR: medianamente resistente ; S: suscetível; ND: não determinado 2 Biovar I. em casa de vegetação. Fonte: OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al. (1998) 3 Estirpe CNPH182 da biovar III. Fonte: OLIVEIRA-NAPOLEÃO et al. (1999)
55
4.3.1.2 Inoculação
Para este estudo, plantas no estádio de três pares de folhas dos genótipos
CNPH171, CNPH658, CNPH785 e CNPH778 foram inoculadas de duas formas: a)
por ferimento no caule, colocando-se uma gota de 10 µL da suspensão bacteriana
na axila da primeira folha e traspassando-se a gota e o caule com um alfinete
entomológico n°. 3 (MORGADO et al., 1994); b) por ferimentos nas raízes. O solo de
vasos (capacidade de 0,5 L) foi infestado por deposição de 75 mL de suspensão
bacteriana, após 18h foi realizado o transplantio de plantas com as raízes cortadas
(Apêndice 4), a fim de garantir ferimentos que facilitassem a entrada do patógeno.
Para as inoculações foram utilizadas suspensões bacterianas de cada um
das estirpes, separadamente. No caule as concentrações foram: 104, 106, 108, 109 e
1010 ufc/mL e para as raízes: 105, 106, 107, 108 e 109 ufc/mL. O ajuste da
concentração foi feito por espectrofotometria (A600) e diluições proporcionais.
4.3.1.3 Avaliação
Aos 3, 18, 24 e 30 (inoculação no caule) ou 3, 18, 24 e 50 (inoculação pelas
raízes) dias após a inoculação (DAI) foram feitas leituras utilizando-se uma escala
de notas de 1 a 5, de acordo com as seguintes classes de sintomas: 1 – ausência de
sintoma; 2 – planta com um terço das folhas murchas; 3 – planta com dois terços
das folhas murchas; 4 – planta totalmente murcha; 5 – planta morta (adaptado de
NIELSEN; HAYNES, 1960). As leituras foram transformadas em índice de murcha
bacteriana, utilizando-se a equação:
N
PCIMB ∑ ×
=)(
onde IMB é o índice de murcha bacteriana; C é a nota atribuída a cada classe de
sintoma; P é o número de plantas em cada classe de sintoma e N é o número total
de plantas infectadas (EMPIG et al., 1962).
A avaliação da redução de peso seco aos 30 ou 50 DAI em relação às
testemunhas não inoculadas. Para tanto, cortou-se a parte aérea de todas as
plantas rente ao solo, levando-as à estufa a 60°C por 72 h e fazendo as medidas de
massa, em gramas, em balança digital com três casas decimais, das quais foram
56
registradas duas. A alteração percentual de massa seca da parte aérea (AMS) foi
calculada segundo a equação:
100×−
=PTPTPIAMS
onde: AMS: alteração percentual de massa seca da parte aérea na parcela
inoculada em relação à testemunha não inoculada; PI: massa seca da parte aérea
na parcela inoculada; e PT: massa seca da parte aérea na parcela não inoculada.
Ao final das avaliações de severidade e antes do corte da parte aérea foi
feita a contagem de plantas mortas (NPM) em cada parcela.
4.3.1.4 Procedimentos estatísticos
O delineamento utilizado foi o de blocos inteiramente casualizados, com três
repetições. O transplantio das mudas foi feito em blocos para garantir maior
uniformidade das mudas em cada um deles. A ordem da inoculação em gota seguiu
aos blocos já constituídos no transplantio para manter o mais uniforme possível o
tempo decorrido após a preparação da suspensão bacteriana em cada bloco. As
parcelas foram constituídas de 12 plantas em seis vasos de 0,5 litros. O controle foi
constituído de uma parcela de 12 plantas não inoculadas de cada genótipo em cada
bloco experimental.
As análises de variância foram feitas utilizando o programa estatístico
Winstat 1.0 (Machado; Conceição, 2002), sendo feita neste mesmo aplicativo a
análise de resíduos para verificação das pressuposições da análise de variância:
gráfico de caixa, distribuição normal e dispersão do erro.
Com os resultados de IMB obtidos das reações aos 3, 18, 24 e 30
(inoculação por ferimento) ou 50 (inoculação pelas raízes) dias após a inoculação
(DAI) foi calculada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD),
utilizando-se o programa GBASIC (MAFFIA, 1986).
Curvas de resposta de AACPD, AMS e número de plantas mortas foram
construídas em função do logaritmo da concentração bacteriana inoculada em
ufc/mL. Estas curvas foram linearizadas por transformação probit, utilizando-se o
57
programa “R”, versão 2.9.0 (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2009). A comparação
entre elas foi realizada pelo programa estatístico Winstat 1.0.
4.3.2 Estudo da colonização de tecidos 4.3.2.1 Genótipos de berinjela e estirpes do patógeno
Para este estudo, plantas de genótipos CNPH006, CNPH171, CNPH407,
CNPH658, CNPH778 e CNPH785 foram inoculadas individualmente com isolados
mutantes espontâneos de R. solanacearum selecionados das estirpes CNPH19 e
CNPH182, raça 1, biovares I e III, respectivamente, com resistência a estreptomicina
(200 µg/mL) e rifampicina (50 µg/mL), denominados de R19 e R182. O uso de
mutantes espontâneos resistentes a antibióticos visaram diminuir a possibilidade de
contagem de contaminantes (GRIMAULT; PRIOR, 1993).
4.3.2.2 Inoculação
A inoculação das plantas para este estudo foi feita por ferimento de caule
como descrito no item 4.3.1.2, sendo utilizada suspensão bacteriana com 108
ufc/mL, ajustada por espectrofotometria (A600=0,5).
4.3.2.3 Avaliação
Após intervalos de 0, 6, 24, 48 h da inoculação das plantas pelos isolados
bacterianos, foi cortado um fragmento de 2 cm de cada planta (a partir de 1 cm de
distância acima do ponto de inserção da primeira folha) e determinada sua massa
fresca, em gramas, com balança de três casas decimais. Logo após a pesagem, os
fragmentos foram macerados, individualmente, e feitas diluições seqüenciais (10,
102, 103, 104 e 105, até o tempo 24 h, e 102, 103, 104, 105 e 106, no tempo 48 h).
Alíquotas de 10 µL dos macerados foram plaqueadas em meio de Kelman (1954)
adicionado de estreptomicina (200 µg/mL) e rifampicina (50 µg/mL). As contagens
das colônias obtidas foram feitas após 24h de crescimento, a 28°C, em observação
sob lupa estereoscópica. Os valores estimados de unidades formadoras de colônias
(ufc) nos tecidos foram divididos pela massa fresca do fragmento retirado da planta
avaliada.
58
4.3.2.4 Procedimentos estatísticos
Um delineamento fatorial 2 (isolados) x 4 (genótipos) x 4 (tempo após a
inoculação) totalmente casualizado, com três repetições, foi utilizado. Cada
repetição foi constituída da média de colônias obtidas em quatro microgotas do
macerado.
As análises de variância e análises de regressão foram feitas utilizando o
programa estatístico Winstat 1.0 (Machado; Conceição, 2002), sendo feita neste
mesmo aplicativo a análise de resíduos para verificação das pressuposições da
análise de variância: gráfico de caixa, distribuição normal e dispersão do erro. Foi
necessária transformação logarítmica decimal dos dados para atendimento das
pressuposições da análise.
4.4 Resultados 4.4.1 Titulação de resistência
Diferenças de resistência entre os genótipos estudados foram possíveis
caracterizar pela observação das curvas de respostas das três variáveis estudadas:
AACPD, AMS e NPM aos 30 DAI (inoculação no caule) ou 50 DAI (inoculação pelo
sistema radicular). As reações dos genótipos às duas formas de inoculação e às
duas estirpes estudadas foram apresentadas na Fig. 5 e nas tab. 11, 12 e 13, onde
foram listados: o valor de intersecção, inclinação e coeficiente de determinação das
retas obtidas com a linearização das curvas de resposta pela transformação probit.
Também foi apresentado o valor de DL50, que corresponde à concentração estimada
para que ocorresse a morte de 50% das plantas inoculadas.
O genótipo CNPH778 foi o mais resistente à estirpe CNPH182 para todas as
variáveis avaliadas nas duas formas de inoculação, quando foi observado o
coeficiente de inclinação da reta transformada, com exceção da variável AMS por
inoculação no caule na qual o coeficiente do genótipo CNPH778 foi o mais
resistente, mas juntamente com o genótipo CNPH171.
O genótipo CNPH785 apresentou-se mais resistente à estirpe CNPH19 na
inoculação feita pelo caule para a variável AACPD e para NPM quando a inoculação
foi feita pelas raízes. Com a inoculação desta estirpe, as variáveis observadas neste
59
genótipo quase sempre apresentaram valores mais elevados do que nos outros
genótipos, porém a diferença entre estes valores não foi significativa.
O genótipo CNPH171 não apresentou resistência destacada para nenhuma
das estirpes ou formas de inoculação estudadas.
Observou-se que a inoculação com a estirpe CNPH182 ocasionou maior
diferenciação entre os genótipos estudados (Tab. 11, 12 e 13) e também níveis mais
altos de agressividade, observados pelos valores alcançados de AACPD, AMS e
NPM (Fig. 5).
A variável AACPD foi a que apresentou coeficientes de variação
relativamente mais baixos em comparação às outras variáveis e permitiu a
diferenciação entre genótipos previamente considerados resistentes (CNPH778 e
785) do padrão suscetível (CNPH658). A variável AMS foi a que apresentou os
coeficientes de variação mais elevados, o que dificultou a diferenciação entre os
genótipos, mas ainda assim permitindo a discriminação do genótipo CNPH778 como
mais resistente que CNPH658 (suscetível).
Os coeficientes de variação foram maiores para a inoculação pelas raízes do
que pelo caule, com exceção daqueles apresentados pela variável NPM, onde o
coeficiente foi maior para a inoculação do caule.
60
Inoculação no caule Inoculação pelas raízes
Figura 5 - Reações dos genótipos CNPH171, CNPH658, CNPH778 e CNPH785 de
berinjela à inoculação no caule e nas raízes com as estirpes CNPH19 e CNPH182 de Ralstonia solanacearum, expressas na forma de área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), alteração percentual de massa seca da parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) e número de plantas mortas (NPM) aos 30 (inoculação no caule) e 50 (inoculação nas raízes) dias após a inoculação com concentrações crescentes de suspensões bacterianas.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10
Núm
ero
de p
lant
as m
orta
s
Log (concentração em ufc/mL) Log (concentração em ufc/mL)
0.000
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
140.000
AACPD
0.000
40.000
80.000
120.000
160.000
200.000
240.000
AACPD
-20
0
20
40
60
80
100
AM
S (%
)
-20
0
20
40
60
80
100
AM
S (%
)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12
Núm
ero
de p
lant
as m
orta
sN
PM
NP
M
