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Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos

de Arroz (Oryza sativa L.) a Diferentes

Temperaturas Nocturnas

Oscar Humberto Alvarado Sanabria

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronomía

Bogotá, Colombia

2016

II Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz (Oryza sativa L.)

a Diferentes Temperaturas Nocturnas

Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos

de Arroz (Oryza sativa L.) a Diferentes

Temperaturas Nocturnas

Oscar Humberto Alvarado Sanabria

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Agrarias con Énfasis en Fisiología de Cultivos

Director:

Ph.D. Hermann Restrepo Díaz

Codirector:

Msc. Gabriel Garcés Varón

Fisiología de Cultivos.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronomía

Bogotá, Colombia

2016

Resumen y Abstract III

Resumen

La temperatura es uno de los principales factores que determina la distribución y el potencial

desarrollo de una especie. En los últimos años la temperatura promedio ha aumentado en

todo el mundo y Colombia no ha sido la excepción con un aumento de aproximadamente

2°C en los últimos 20 años. Este aumento de la temperatura perjudica el crecimiento,

desarrollo y reproducción de varias especies cultivables, dentro de ellas el arroz. Esta

especie es una de las principales fuentes de energía para la especie humana, por lo que

cualquier disminución en sus rendimientos afecta la seguridad alimentaria del mundo. La

alta temperatura nocturna (ATN) ha mostrado ser uno de los factores más perjudiciales para

el rendimiento del arroz. En el presente estudio se caracterizó la respuesta de siete genotipos

de arroz a una alta temperatura nocturna (30°C) en estado de macollamiento y durante la

maduración. Para esto se evaluaron variables de crecimiento, fotosíntesis, variables

relacionadas con estrés oxidativo, y algunos componentes de rendimiento. Los resultados

indicaron que i) la alta temperatura nocturna afecta los procesos fisiológicos (en estado

vegetativo) desde el cuarto día de exposición ii) la alta temperatura nocturna disminuye el

crecimiento vegetativo debido a una menor asimilación de CO2 y mayor respiración iii) la

alta temperatura nocturna disminuye el rendimiento por panícula del genotipo F50 y lo

aumenta en CT19021 debido a una mayor y menor producción de granos vanos,

respectivamente. Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, el uso de

variables fisiológicas y bioquímicas como posibles indicadores de tolerancia o

susceptibilidad a un estrés por alta temperatura podrían ser: En estado vegetativo la

asimilación de CO2, el contenido de clorofila y carotenoides, el contenido de MDA y la

respiración; en estado reproductivo el número de granos producidos y el porcentaje de

fertilidad, mientras variables como, conductancia estomática, contenido de prolina y

fluorescencia de la clorofila a varían en el tiempo o no presentan cambios al aumentar la

temperatura nocturna, por lo que no serían buenos indicadores del estrés provocado por una

alta temperatura nocturna.

Palabras clave: fotosíntesis, estrés abiótico, estrés oxidativo, fluorescencia, genotipo,

clorofila.

IV Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz (Oryza sativa L.)

a Diferentes Temperaturas Nocturnas

Abstract

Temperature is one of the main factors that determine the distribution and the potential

development of a species. In recent years the average temperature has increased worldwide,

and Colombia is no exception with an increase of about 2 °C in the last 20 years. This

increase in temperature impairs growth, development and reproduction of several crop

species within them rice. This species is one of the main sources of energy for the human

species, so any decline in yields affects food security in the world. The high night

temperature has proved one of the most damaging rice yield factors. In this study the

response of seven lines of rice at high night temperature (30 °C) and tillering state during

grain filling was characterized. For this growth variables, photosynthesis, oxidative stress-

related variables, and some yield components were evaluated. The results indicated that i)

the high night temperature affects physiological processes (vegetative state) from four days

of exposure and these vary over time ii) the high night temperature decreases vegetative

growth due to lower CO2 assimilation and greater respiration iii) high night temperature

decreases production / panicle genotype F50 and CT19021 increases due to a higher

production and lower openings, respectively grains. Because of its stability over time and

that regardless of genotype tends to exhibit the same behavior, the following variables as

potential indicators of stress are suggested for high temperature CO2 assimilation, number

and percentage of grain produced vaneamiento, while variables such as, stomatal

conductance, MDA and proline content are variable in time or are unchanged by increasing

the night temperature, so they would not be good indicators of this stress.

Keywords: Photosynthesis, Abiotic stress, oxidative stress, fluorescence, genotype,

chlorophyll

Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz

(Oryza sativa L.) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

V

CONTENIDO

Pág.

Resumen .............................................................................................................................. III

Abstract ............................................................................................................................... IV

Lista de figuras ................................................................................................................. VIII

Lista de tablas ...................................................................................................................... X

Lista de Símbolos y Abreviaturas ....................................................................................... XI

INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 13

1. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 15

1.1 FISIOLOGÍA DE LAS PLANTAS BAJO UNA ALTA TEMPERATURA ....15

1.2 RESPUESTA DEL CULTIVO DEL ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA

NOCTURNA ................................................................................................................16

1.3 LAS ALTAS TEMPERATURAS Y LA FENOLOGÍA DEL ARROZ............19

1.4 EL USO DE VARIABLES FISIOLÓGICAS EN EL FITOMEJORAMIENTO

DE ARROZ ..................................................................................................................20

1.4.1 La fotosíntesis y sus componentes ..........................................................22

1.4.2 Reproducción y Rendimiento .................................................................27

1.4.3 Peroxidación Lipídica de membranas .....................................................28

1.4.4 Osmolitos compatibles (Prolina) ............................................................29

2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 31

2.1 Objetivo General ................................................................................................31

2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................31

3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 33

3.1 RESPUESTA FISIOLÓGICA DE PLANTULAS DE ARROZ F60

SOMETIDAS A PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA. ..............33

3.1.1 Condiciones generales del experimento .................................................33

3.1.2 Tratamientos ...........................................................................................34

3.1.3 Fotosíntesis, conductancia estomática, y transpiración ..........................34

3.1.4 Uso eficiente del agua y eficiencia de carboxilación .............................35

3.1.5 Eficiencia máxima del PSII (Fv/Fm) ......................................................35

3.1.6 Contenido de clorofila a, clorofila b y carotenoides ...............................35

3.1.7 Respiración oscura de la hoja .................................................................36

3.1.8 Contenido de Prolina ..............................................................................36

3.1.9 Peroxidación Lipídica .............................................................................36

3.1.10 Análisis Estadístico.................................................................................37

3.2 RESPUESTA FISIOLÓGICA DE SEIS GENOTIPOS DE ARROZ EN

ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA .............38

VI Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz


3.2.1 Tratamientos ...........................................................................................38

3.2.2 Condiciones generales de crecimiento ...................................................38

3.2.3 Fotosíntesis .............................................................................................39

3.2.4 Eficiencia de Carboxilación y Uso eficiente del agua ............................39

3.2.5 Respiración oscura ..................................................................................39

3.2.6 Parámetros de Fluorescencia de la clorofila a ........................................40

3.2.7 Parámetros de Crecimiento .....................................................................40

3.2.8 Pérdida de electrolitos ............................................................................40

3.2.9 Clorofila y Carotenoides .........................................................................41

3.2.10 Prolina y Malondialdehído (MDA) ........................................................41

3.2.11 Diseño experimental y análisis estadístico .............................................41

3.3 CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ...............................42

3.3.1 Condiciones generales de crecimiento ...................................................42

3.3.2 Genotipos y tratamientos ........................................................................42

3.3.3 Componentes de rendimiento .................................................................43

3.3.4 Parámetros de Fluorescencia de la Clorofila a .......................................43

3.3.5 Contenido de Clorofila y Carotenoides ..................................................43

3.3.6 Prolina y Malondialdehído (MDA) ........................................................43

3.3.7 Análisis Estadístico.................................................................................44

4. RESULTADOS ........................................................................................................... 45

4.1 RESPUESTA FISIOLÓGICA DE PLANTULAS DE ARROZ SOMETIDAS A

PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA. ..........................................45

4.1.1 Fotosíntesis, conductancia estomática, transpiración y concentración

interna de CO2 .......................................................................................................45

4.1.2 Eficiencia de la carboxilación y uso eficiente del agua ..........................46

4.1.3 Respiración oscura y balance de carbono ...............................................47

4.1.4 Eficiencia del fotosistema II y contenido de pigmentos fotosintéticos. .49

4.1.5 Peroxidación lipídica y contenido de prolina .........................................50


ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA .............51

4.2.1 Fotosíntesis, Eficiencia de la Carboxilación y Uso eficiente del Agua ..51

4.2.2 Respiración .............................................................................................52

4.2.3 Variables de Crecimiento .......................................................................53

4.2.4 Fluorescencia de la clorofila a ................................................................54

4.2.5 Fuga de electrolitos, MDA, Prolina y pigmentos fotosintéticos.............55

4.3 CARACTERIZACIÓN FISIOLOGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ................................58

Contenido VII

4.3.1 Componentes de rendimiento (Número de granos vanos, Número de

granos llenos, Porcentaje de fertilidad y masa de granos llenos por panícula) .....58

4.3.2 Fluorescencia de la Clorofila a ...............................................................60

4.3.3 Pruebas bioquímicas (Pigmentos fotosintéticos, MDA y Prolina) .........61

5. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 63

5.1 PRIMER EXPERIMENTO: PERIODOS DE ESTRÉS ....................................63

5.2 SEGUNDO Y TERCER EXPERIMENTO: RESPUESTA DE SIETE

GENOTIPOS DE ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA ............65

6. MODELO TEÓRICO DEL EFECTO DE LA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

69

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 71

7.1 Conclusiones ......................................................................................................71

7.2 Recomendaciones ..............................................................................................71

Bibliografía ......................................................................................................................... 73

Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz


VIII

Lista de figuras

Figura 1. Efectos del fenómeno del niño (2009-2010) en los rendimientos de la zona de

Espinal (Tolima). Fuente: FEDEARROZ (2015). .............................................................. 19

Figura 2. Fotosíntesis(A), Conductancia estomática(B), transpiración(C) y Concentración

intercelular de CO2(D) de plántulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs

30°C). Las ecuaciones representan el comportamiento cúbico en el tiempo. n.s,*, ** y ***

representa no significativo y significancia con P≤0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente. Cada

punto representa el promedio de 12 valores. ...................................................................... 46

Figura 3. Eficiencia de carboxilación(A) y Uso eficiente del agua(B) de plántulas de arroz

sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). n.s y * representan no significativo y

significancia con P≤0,05 según la prueba de Tukey, entre temperaturas para un mismo día.

Cada barra de gráfico representa la medía de doce valores+Error estándar. ..................... 47

Figura 4. Respiración oscura de plántulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas

(24 vs 30°C). Las ecuaciones presentan un comportamiento cúbico en el tiempo. * y ***

representan significancia con P≤0,05 y 0,001, respectivamente. Cada punto representa el

promedio de 12 valores. ...................................................................................................... 48

Figura 5. Balance de CO2 de plántulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24

vs 30°C). n.s y * representan no significativo y significancia con P≤0,05, entre temperaturas

para un mismo día, según la prueba de Tukey. Cada barra de gráfico representa la medía de

doce valores+Error estándar. .............................................................................................. 48

Figura 6. Eficiencia máxima potencial del PSII (Fv/Fm) de plántulas de arroz sometidas a

dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). n.s y * representan no significativo y significancia

con P≤0,05, entre temperaturas para un mismo día según la prueba de Tukey. Cada barra de

gráfico representa la medía de doce valores+Error estándar. ............................................ 49

Figura 7. Contenido de clorofila y carotenoides de plántulas de sometidas a dos

temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). Líneas con la letra L presentan un comportamiento

lineal (P≤0,001). Cada punto representa el promedio de 12 valores. ................................. 50

Figura 8. MDA(A) y contenido de Prolina (B) de plántulas de arroz sometidas a dos

temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). n.s y * representan no significativo y significancia con

Contenido IX

P≤0,05, entre temperaturas para un mismo día, según la prueba de Tukey. Cada barra del

gráfico representa la medía de doce valores+Error estándar. ............................................ 51

Figura 9. Fotosíntesis (A), Eficiencia de la carboxilación (B), CO2 intercelular (C), y Uso

eficiente del agua intrínseco (D) de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y *

representan no significativo y significancia con P≤0,05, entre temperaturas para un mismo

día, según la prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticiones±Error

estandar. .............................................................................................................................. 52

Figura 10. Respiración de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y * representan

no significativo y significancia con P≤0,05, entre temperaturas para un mismo día, según la

prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticiones±Error estándar.... 53

Figura 11. Perdida de electrolitos (A) y Producción de MDA (B) de hojas de plantas de seis

genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 8 repeticiones±Error. Asteriscos

significan diferencias significativas en la interacción de Temperatura (T) x Genotipo (G) a

P≤0,05 de acuerdo con el ANOVA. .................................................................................... 56

Figura 12. Efecto de dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C) sobre el número total de

granos (A), de granos llenos (B), de granos vanos (C) y porcentaje de fertilidad (D) en siete

genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticiones±Error. Barras con

letras distintas indican diferencias significativas a P≤0,05 según la prueba de Tukey. ..... 59

Figura 13. Masa de granos llenos de panículas de arroz bajo dos temperaturas nocturnas

(A) y en siete genotipos (B). Los datos representan el promedio de 6 repeticiones±Error

estándar. Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P≤0,05 según la

prueba de Tukey. ................................................................................................................. 60

Figura 14. Rendimiento cuántico real del fotosistema II (Y(II))(A), Disipación no

fotoquímica controlada (Y(NPQ))(B), Disipación no fotoquímica no controlada (Y(NO))(C)

y Rendimiento cuántico potencial del PSII (Fv/Fm)(D) de la hoja bandera de siete genotipos

de plantas de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticiones±Error estándar.

Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P≤0,05 según la prueba de

Tukey. ................................................................................................................................. 61

Figura 15. Modelo conceptual de los efectos y las características de tolerancia y

susceptibilidad de arroz sometido a altas temperaturas nocturnas (30°C). Los símbolos

dentro de cada recuadro indican aumento (↑), disminución (↓) o sin cambios (=) del proceso

dentro del recuadro. El origen de la flecha roja indica las posibles causas de un proceso y el

final de la flecha roja indica el proceso afectado. ............................................................... 70

X Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz


Lista de tablas

Tabla 1. Efecto de la alta temperatura nocturna en procesos fisiológicos del arroz .......... 18

Tabla 2. Rangos óptimos de temperatura diaria para el desarrollo del arroz según su etapa

fenológica. Información adaptada de Yoshida (1981). ....................................................... 19

Tabla 3. Parámetros de la fluorescencia derivados de la fluorescencia de la clorofila a ... 24

Tabla 4. Variables de crecimiento de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos

diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30°C) ................................................................. 54

Tabla 5. Eficiencia máxima real y eficiencia máxima potencial y formas de disipación de la

energía del PSII en hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos diferentes temperaturas

nocturnas (24 vs 30°C) ....................................................................................................... 55

Tabla 6. Pigmentos fotosintéticos y Prolina de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a

dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C) ........................................................................... 57

Tabla 7. Contenido de Pigmentos fotosínteticos (Clorofilas y Carotenoides),

Malondialdehído (MDA) y prolina en hojas banderas de siete genotipos de arroz expuestos

a dos diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). ....................................................... 62

Lista de Símbolos y Abreviaturas XI

Lista de Símbolos y Abreviaturas

ANOVA = Análisis de varianza.

ATP = Adenosin Trifosfato.

CAR (x+c) = carotenoides.

CE = Eficiencia de carboxilación.

Chl = Clorofila.

Chl a = Clorofila a.

Chl b = Clorofila b.

Ci= CO2 subestomático.

DDE = Días de Exposición.

DE = Días después de emergencia.

E = Transpiración.

Fm = Fluorescencia Máxima de hojas adaptadas a la Oscuridad.

Fm’ = Fluorescencia Máxima de hojas adaptadas a la Luz.

Fo’ = Fluorescencia Mínima de hojas adatadas a la Luz.

Fo = Fluorescencia Mínima de hojas adatadas a la Oscuridad.

Fv/Fm = Eficiencia máxima potencial del fotosistema II.

MF= Masa Fresca.

gS = conductancia estomática.

ATN = Alta temperatura nocturna.

LHC = Complejo proteico cosechador de luz.

MDA = Malondialdehído

NAD = Nicotin Adenin dinucleotido.

NADPH = Nicotin Adenin dinucleotido reducido.

NPQ = Disipación no fotoquímica

PAR = Radiación Fotosintéticamente Activa.

Pn = tasa de asimilación de CO2

PS = Fotosistema

PSI = Fotosistema I

PSII= Fotosistema II

Ro = Respiración Oscura.

ROS = Especies Reactivas de oxígeno.

RuBisCO = Ribulosa 1,5 Bifosfato carboxilasa/oxigenasa.

RuBP = Ribulosa-1,5-bisfosfato.

TBA = Ácido Tiobarbitúrico.

WUE= Uso eficiente del agua, hallado como tasa fotosintética/tasa transpiratoria.

WUEi = Uso eficiente del agua intrínseco.

XII Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz


Y(II)= Eficiencia máxima real del fotosistema II.

Y(NO) = Eficiencia de la disipación no fotoquímica no controlada.

Y(NPQ) = Eficiencia de la disipación fotoquímica controlada

Introducción 13

INTRODUCCIÓN

El cambio climático ha generado condiciones adversas tales como periodos prolongados de

sequías, inundaciones y temperaturas extremas en varias regiones del mundo (Teixeira et

al., 2013). El cultivo del arroz es uno de los cereales con mayor importancia para la

alimentación humana en el mundo (FAO, 2002). Y en Colombia ocupó 455,000 ha

sembradas con una producción de 1,925,687 toneladas durante 2013 (FEDEARROZ, 2015).

En este sentido, periodos de altas temperaturas tanto diurnas como nocturnas han sido

registrados en los últimos años en las zonas productoras de arroz en Colombia, observándose

un impacto negativo sobre el rendimiento de este cultivo (Castilla et al., 2010; Restrepo-

Diaz y Garces-Varon, 2013; Sánchez-Reinoso et al., 2014).

El rendimiento del cultivo del arroz es fuertemente influenciado por factores ambientales

como luminosidad, disponibilidad de agua, nutrientes y la temperatura ambiental (Yoshida,

1981; Fageria, 2007). En cuanto a la temperatura ambiental, los periodos de exposición de

cultivos de arroz a altas temperaturas diurnas como nocturnas han aumentado durante los

últimos años (Restrepo-Díaz y Garcés Varón, 2013; Sánchez-Reinoso et al. 2014). En este

aspecto, periodos de estrés térmico, especialmente, altas temperaturas nocturnas pueden

afectar negativamente la fisiología y en consecuencia el rendimiento del cultivo del arroz

(Mohammed y Tarpley, 2014). En plántulas de arroz, altas temperaturas nocturnas (35-

45°C) disminuyeron la asimilación de CO2, la eficiencia del fotosistema II y la actividad de

la Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa/oxidasa (RuBisCO) (Yin et al., 2010). Además de los

efectos sobre las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja, una alta temperatura

nocturna reduce el contenido de clorofila (Kumar et al., 2011; Dong et al., 2014), afectando

la relación entre clorofila total y carotenoides (Song et al., 2013; Dong et al., 2014). Otra

respuesta fisiológica, es el incremento de la respiración nocturna expresado como perdida

de carbono (Lee y Akita, 2000; Mohammed y Tarpley, 2009b; Mohammed et al., 2013).

También, es importante mencionar que el grado de afectación negativa por una alta

temperatura nocturna sobre el rendimiento, está influenciada por el estado fenológico donde

se presente esta condición estresante (Fageria et al., 2007). Yoshida (1981) menciona que

las etapas de floración y maduración son etapas fenológicas más susceptibles a estreses

ambientales.

Una de las estrategias para afrontar los efectos negativos de las altas temperaturas sobre el

rendimiento de los cereales es la selección de genotipos tolerantes a dicha condición

ambiental (Araus et al., 2008). En este aspecto, el mejoramiento genético de cultivos

14 Respuestas Fisiológicas de Siete Genotipos de Arroz

(Oryza sativa L) a Diferentes Temperaturas Nocturnas

actualmente usa características fisiológicas con el propósito de aumentar la eficiencia en la

selección de genes (Reynolds et al., 2009; Jha et al., 2014). Por ejemplo, en la selección de

genotipos de trigo tolerantes a alta radiación y temperatura se han usado parámetros de la

fluorescencia de la clorofila y variables de intercambio gaseoso (Sayed, 2003; Monneveux

et al., 2003). Adicionalmente, la caracterización de genotipos tolerantes a altas temperaturas

nocturnas se tiene en cuenta variables bioquímicas como el contenido de pigmentos

fotosintéticos (clorofilas y carotenoides), la producción de osmolitos compatibles (glicina

betaína, Prolina y azucares solubles) y la integridad de la membrana celular (Bita y Gerats,

2013). En arroz, se ha reportado que los genotipos tolerantes presentan una tasa de

fotosíntesis, respiración, transporte de electrones, contenido de clorofila y rendimiento

cuántico del fotosistema II estables bajo condiciones de altas temperaturas nocturnas

(Glaubitz et al., 2014; Mohammed y Tarpley, 2014). Por lo anterior, estas variables han sido

sugeridas como herramienta para seleccionar genotipos con una posible tolerancia a

diferentes condiciones de estrés abiótico (Sayed, 2003; Araus et al., 2008).

Actualmente, la utilización de algunos parámetros fisiológicos y bioquímicos como tasa

fotosintética y producción de prolina han adquirido importancia en la caracterización de

genotipos a condiciones de estrés abiótico especialmente estrés térmico en Colombia

(Restrepo-Diaz y Garces-Varon, 2013; Sánchez-Reinoso et al. 2014). Sin embargo, los

trabajos donde se utilizan parámetros fisiológicos (fluorescencia de la clorofila a,

Peroxidación lipídica, intercambio gaseoso) siguen siendo necesarios para un mejor

conocimiento de la influencia del ambiente en la selección de genotipos con características

de tolerancia a estreses abióticos (especialmente estrés térmico) como futuros parentales en

los programas de fitomejoramiento. Por tal motivo, las hipótesis de trabajo en el presente

trabajo eran: i) El uso de variables como: fotosíntesis, crecimiento (acumulación de masa

seca y área foliar), componentes de rendimiento (tamaño de grano, número de granos,

vaneamiento) y bioquímicas (malondialdehído, contenido de prolina y contenido de

pigmentos) sirven como herramientas en la caracterización de un estrés por alta temperatura

nocturna para genotipos de arroz; ii) Los genotipos tolerantes presentan mayor crecimiento,

rendimiento, fotosíntesis, menor respiración y mayor fertilidad.

Marco Teórico 15

1. MARCO TEÓRICO

1.1 FISIOLOGÍA DE LAS PLANTAS BAJO UNA ALTA TEMPERATURA

La temperatura media del planeta ha aumentado los últimos años y seguirá aumentando

0,3℃ por década en comparación al lapso 1990-2010 (Lobell y Gourdji, 2012). Este

aumento de la temperatura afectará negativamente la producción de los cultivos más

importantes en la alimentación humana y animal como son: maíz, soya, trigo y arroz (Welch

et al., 2010b; Wassmann et al., 2009). La alta temperatura afectará de forma distinta a cada

región, debido a las condiciones propias de cada una, tanto climáticas como de manejo de

cultivo, por lo que son necesarias investigaciones a nivel regional.

La alta temperatura afecta el desarrollo y rendimiento de las plantas cultivables (Jha et al.,

2014; Lobell y Gourdji, 2012). Cada planta cultivable necesita unas condiciones climáticas

determinadas para desarrollarse óptimamente. Si estas condiciones no se presentan, el

desarrollo y crecimiento de las plantas disminuyen (Sage et al., 2015). La temperatura es

uno de los principales factores que afectan la supervivencia de las plantas y junto con la

disponibilidad de agua determinan la distribución de las plantas en el planeta (Lambers et al.,

2008).

La alta temperatura, tanto diurna como nocturna, afecta procesos esenciales en la fisiología

de la planta como la fotosíntesis, la respiración, la absorción de agua, el crecimiento y el

desarrollo (Mohammed y Tarpley, 2014, 2009b; Mohammed et al., 2013). A nivel de hoja,

la fotosíntesis es uno de los procesos más sensibles a la alta temperatura (Bita y Gerats,

2013; Sage y Kubien, 2007). En este sentido, tanto la parte fotoquímica como el ciclo de

Calvin son afectados (Wahid et al., 2007). En el caso de la parte fotoquímica, el fotosistema

II es la parte más sensible, ya que se pueden afectar procesos metabólicos como una la tasa

de transporte de electrones y la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Cui

et al., 2006; Yamasaki et al., 2002). Asimismo, El contenido y la distribución de los

pigmentos fotosintéticos son alterados por altas temperaturas. En este aspecto, aumenta el

contenido de carotenoides y disminuye el de clorofila con el fin de disipar el exceso de

energía y reducir las ROS (Demmig-Adams y Adams Iii, 1996; Gill y Tuteja, 2010). En el

caso del ciclo de Calvin, la actividad de la Rubisco puede ser inhibida por periodos de estrés

térmico (Wang et al., 2010; Kubien y Sage, 2008)

Otro proceso fisiológico afectado es la respiración (Wahid et al., 2007). El balance de

carbono en una planta está dado por la diferencia entre la ganancia de carbono por



fotosíntesis y la perdida de este por respiración (Turnbull et al., 2001; Sánchez-Reinoso

et al., 2014). Varios estudios han reportado cambios en respiración como respuesta a la

variación de la temperatura ambiental (Smith y Dukes, 2013). En general, la respiración se

incrementa en función de la temperatura (Lambers et al., 2008).

La interacción entre estrés térmico y el estado de desarrollo de la planta también es

importante en el rendimiento de los cultivos (Restrepo-Díaz et al., 2010). La investigación

actual ha concluido que el estado de floración es el más susceptible a las altas temperaturas,

pero las plantas pueden también sufrir alteraciones, provocados por estrés térmico, en los

demás estados fenológicos (Sánchez et al., 2014; Wassmann et al., 2009; Sage et al., 2015;

Wongpatsa et al., 2014). Una ATN puede causar aborto de flores y frutos, afectar la

viabilidad y fertilidad del polen y finalmente, la calidad del producto a cosechar (Restrepo-

Diaz et al., 2010; Sage et al., 2015). Asimismo, se ha reportado que los cultivos de cereales

sometidos a una ATN puede presentar mayor esterilidad en comparación a una alta

temperatura diurna (Welch et al., 2010a). Teniendo en cuenta los efectos del estrés térmico,

en cereales los genotipos tolerantes pueden mantener su rendimiento, fertilidad de las

espiguillas, viabilidad del polen y capacidad fotosintética (Poli et al., 2013).

Las plantas tienen respuestas bioquímicas a las altas temperaturas con el propósito de

sobrellevar esta condición estresante (Wahid et al., 2007). En plantas de cebada bajo estrés

térmico, se ha reportado un aumento en la relación Carotenoides/Clorofila, ya que una

disminución de la clorofila permite captar menos energía y evitar el calentamiento de la hoja

provocado por la reducción en la transpiración (Havaux y Tardy 1999). Otro mecanismo de

aclimatación a condiciones de alta temperatura, especialmente nocturna, es la menor

peroxidación lipídica representado en la producción de malondialdehído (MDA)

(Narayanan et al., 2016; Bahuguna et al., 2015; Zhou et al., 2012). Finalmente, las plantas

pueden presentar respuestas moleculares para tolerar episodios de estrés térmico (Jagadish

et al., 2012; Jha et al., 2014). En este sentido, genotipos tolerantes han mostrado una mayor

acumulación de proteínas de choque térmico que genotipos susceptibles (Jagadish et al.,

2010).

1.2 RESPUESTA DEL CULTIVO DEL ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA

NOCTURNA

La temperatura mínima (temperatura nocturna) ha presentado un mayor incremento que la

temperatura máxima diaria durante el siglo pasado (Krishnan et al., 2011). Esta condición

Marco Teórico 17

puede afectar las plantas a nivel fisiológico, bioquímico y morfológico (Krishnan et al.,

2011; Mohammed y Tarpley, 2014). En este contexto, las altas temperaturas nocturnas (35-

45°C) disminuyen la asimilación de CO2, la eficiencia del fotosistema II y la actividad de la

Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa/oxidasa (RuBisCO) en arroz (Yin et al., 2010). Además

de los efectos sobre las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja, una alta temperatura

nocturna reduce el contenido de clorofila (Kumar et al., 2011; Dong et al., 2014), afectando

la relación entre clorofila total y carotenoides (Song et al., 2013; Dong et al., 2014).

Otra respuesta fisiológica, es el incremento de la respiración nocturna expresado como

pérdida de carbono (Lee y Akita, 2000; Mohammed y Tarpley, 2009b; Mohammed et al.,

2013). Mohammed y Tarpley (2010a) han mencionado que esta pérdida de carbono es una

de las causas de la reducción del rendimiento en el cultivo del arroz. A nivel bioquímico,

altas temperaturas (40/32°C día/noche) también provocan daño en las membranas

(expresado como un mayor contenido de MDA), causando un incremento de la actividad

enzimática antioxidante (superóxido dismutasa, glutatión reductasa) y producción de

osmolitos compatibles como la prolina (Kumar et al., 2011; Xue et al., 2012). En cuanto a

los parámetros de rendimiento del cultivo, Peng et al., (2004) reportan que temperaturas

nocturnas superiores a 24 °C reducen la producción de biomasa total cerca del 20%, el

porcentaje de granos llenos y finalmente, el rendimiento de grano.

El crecimiento y desarrollo del cultivo del arroz es influenciado por la temperatura nocturna

(Shah et al., 2011; Wahid et al., 2007; Glaubitz et al., 2014). En la tabla 1 se recopila algunos

efectos de las temperaturas nocturnas sobre parámetros fisiológicos, de crecimiento y de

rendimiento en arroz.



Tabla 1. Efecto de la alta temperatura nocturna en procesos fisiológicos del arroz

PROCESO

ALTA

TEMPERATURA

NOCTURNA (°C)

ESTADO DE

DESARROLLO EFECTO REFERENCIA

Respiración 30-32 Plántula y

reproductivo Aumento

Glaubitz et al. (2014);

Mohammed y Tarpley,

(2009b); Mohammed et al.

(2013); Mohammed y

Tarpley, (2014, 2010)

Crecimiento 30 Plántula Aumento Glaubitz et al. (2014)

Crecimiento 27 Vegetativo-Alta

dosis de N Disminución Chen et al. (2013)

Fertilidad 30-32 Reproductivo Disminución

Mohammed y Tarpley

(2011b, 2014, 2010,

2009b)

Masa del

grano 30-32 Reproductivo Disminución

Mohammed y Tarpley

(2011b, 2014, 2010,

2009b)

Número de

granos por

panícula

30 Reproductivo Disminución Mohammed y Tarpley

(2014)

Rendimiento 30-32 Reproductivo Disminución

Mohammed et al. (2013);

Mohammed y Tarpley

(2010)

Daño

membranas 30-32 Aumento

Mohammed y Tarpley

(2014, 2009a, 2010)

Viabilidad

del polen 30-32 Reproductivo Disminución

Mohammed y Tarpley

(2014, 2010); Mohammed

et al. (2013)

Fotosíntesis 30 Reproductivo Disminución Mohammed et al. (2013)

Finalmente, FEDEARROZ (2015) ha reportado que los episodios de altas temperaturas han

reducido los rendimientos en las zonas arroceras de Colombia, disminuyendo la

productividad del cultivo (Fig. 1), resaltando la importancia de caracterizar genotipos

tolerantes y desarrollar estrategias que minimicen los perjuicios provocados por esta

condición abiótica.

Marco Teórico 19

Figura 1. Efectos del fenómeno del niño (2009-2010) en los rendimientos de la zona de

Espinal (Tolima). Fuente: FEDEARROZ (2015).

1.3 LAS ALTAS TEMPERATURAS Y LA FENOLOGÍA DEL ARROZ

Las respuestas fisiológicas pueden variar según la etapa fenológica donde se presente la

situación estresante en el cultivo del arroz (Fageria, 2007; Yoshida, 1981). Asimismo,

Yoshida (1981) reporta que el grado de afectación de una alta temperatura sobre el

porcentaje de esterilidad depende de factores como la etapa fenológica donde se presente la

condición estresante y la duración del periodo de estrés térmico. La tabla 2 resume los rangos

de temperaturas medias diarias óptimos para el cultivo de arroz según su etapa fenológica.

Tabla 2. Rangos óptimos de temperatura diaria para el desarrollo del arroz según su etapa

fenológica. Información adaptada de Yoshida (1981).

Etapa fenológica Rango de Temperatura (C)

Germinación

Emergencia 20-35

25-30

Macollamiento

Antesis

Maduración

25-31

30-33

20-25



Por otro lado, la literatura existente ha reportado ampliamente la influencia de la relación

etapa fenológica, el genotipo y el estrés por altas temperaturas nocturnas sobre el

rendimiento del cultivo (Fageria, 2007; Jagadish et al., 2014). En este sentido, Mohammed

y Tarpley (2009b) no observaron ningún efecto de una alta temperatura nocturna sobre el

número de macollas, cuando las plantas se sometieron a alta temperatura nocturna desde los

20 días de emergencia hasta la cosecha, mientras Glaubitz et al. (2014) reportan que en 6 de

12 genotipos evaluados la alta temperatura nocturna reduce el macollamiento en plantas de

arroz expuestas a alta temperatura nocturna desde los 20 días después de siembra hasta los

46 días después de siembra.

En cereales, la formación de polen es uno de los estados más sensibles a la alta temperatura.

Durante esta formación, la mitosis 1 y 2 son los estados susceptibles (Barnabás et al., 2008),

siendo el primera (estado uninucleado del polen) el más susceptible a la alta temperatura.

En varias especies (incluida el arroz), la alta temperatura provoca aborto del polen en este

estado. La alta temperatura afecta el metabolismo de la microspora y puede disminuir la

síntesis de proteínas relacionadas con la síntesis de carbohidratos, lípidos, proteínas

antioxidantes y síntesis de la pared celular del polen (Sage et al., 2015). En antesis,

temperaturas nocturnas superiores a 27°C también reducen el peso del grano y disminuyen

la emergencia de la panícula (Coast et al., 2015). En la última fase de desarrollo del cultivo

(Maduración), (Krishnan et al., 2011) reportan que la alta temperatura(34°C) nocturna

reduce la masa del grano en plantas de arroz.

1.4 EL USO DE VARIABLES FISIOLÓGICAS EN EL FITOMEJORAMIENTO

DE ARROZ

Una de las estrategias para afrontar los efectos negativos de las altas temperaturas sobre el

rendimiento de los cereales es la selección de genotipos tolerantes a dicha condición

ambiental (Araus et al., 2008). En este aspecto, el mejoramiento genético de cultivos

actualmente usa características fisiológicas con el propósito de aumentar la eficiencia en la

selección de genes (Reynolds et al., 2009; Jha et al., 2014). Por ejemplo, en la selección de

genotipos de trigo tolerantes a alta radiación y temperatura se han usado los parámetros de

la fluorescencia de la clorofila y variables de intercambio gaseoso (Sayed, 2003; Monneveux

et al., 2003). Adicionalmente, la caracterización de genotipos tolerantes a altas temperaturas

nocturnas tiene en cuenta variables bioquímicas como el contenido de pigmentos

fotosintéticos (clorofilas y carotenoides), la producción de osmolitos compatibles (glicina

betaina, Prolina y azúcares solubles) y la integridad de la membrana celular (Bita y Gerats,

Marco Teórico 21

2013). En arroz, se ha reportado que los genotipos tolerantes a altas temperaturas presentan

una tasa de fotosíntesis, respiración, transporte de electrones, contenido de clorofila y

rendimiento cuántico del fotosistema II estables bajo condiciones de altas temperaturas

nocturnas (Glaubitz et al., 2014; Mohammed y Tarpley, 2014). Por lo anterior, estas

variables han sido sugeridas como herramienta o marcadores para seleccionar genotipos con

una posible tolerancia a diferentes condiciones de estrés abiótico (Sayed, 2003; Araus et al.,

2008).

Actualmente, la utilización de algunos parámetros fisiológicos y bioquímicos como la tasa

fotosintética y producción de prolina han sido utilizados para en la caracterización de

genotipos a condiciones de estrés abióticos especialmente bajo estrés de alta temperatura

diurna en Colombia (Restrepo-Diaz y Garces-Varon, 2013; Sánchez-Reinoso et al., 2014).

Teniendo en cuenta lo anterior, el comportamiento de la planta bajo condiciones de estrés

por una alta temperatura es regulado por varios procesos fisiológicos (Mittler et al., 2012).

Sin embargo, el pobre entendimiento de los complejos mecanismos de tolerancia térmica y

la interacción entre genotipo (G) vs ambiente (A) han sido uno de los cuellos de botella para

el progreso de los programas de mejoramiento genético (Jha et al., 2014). En este sentido,

los estudios con plántulas de arroz han adquirido importancia con el propósito de conocer a

profundidad los mecanismos de respuesta involucrados y así caracterizar el grado de

tolerancia o susceptibilidad de los genotipos a condición de estrés térmico durante los

últimos años (Xue et al., 2012; Sánchez-Reinoso et al., 2014). El conocimiento de la

interacción G x A mediante el estudio de procesos fisiológicos y bioquímicos involucrados

han adquirido importancia porque han permitido el uso de diferentes técnicas en el

mejoramiento clásico en Colombia con el propósito de un mejor direccionamiento y

aprovechamiento del germoplasma desarrollado hasta ahora (FEDEARROZ, 2013).

Se ha demostrado que algunos procesos fisiológicos son más sensibles a la alta temperatura

y que la evaluación de estos se puede usar para diferenciar susceptibilidad o cierta tolerancia

de los genotipos estudiados. Estas variables fisiológicas pueden aportar al mejoramiento

genético: aumentando el conocimiento de los factores que determinan el rendimiento y

definiendo características secundarias (características diferentes al rendimiento) para

seleccionar parentales (Araus et al., 2008).

A continuación, se enuncian los procesos tenidos en cuenta en este trabajo, algunas

definiciones importantes y su relación con un estrés térmico.



1.4.1 La fotosíntesis y sus componentes

Fluorescencia de la Clorofila a

La fluorescencia de la clorofila y el intercambio gaseoso pueden ser usados para fenotipar

poblaciones menores a 100 individuos, para detectar diferencias cuando otras variables no

las detectan (crecimiento o rendimiento) y para explicar la repuesta a estrés abiotico (Pask

et al., 2012). En estrés por calor, se prefiere el uso de fluorescencia de la clorofila cuando

se dispone de pocos recursos (principalmente tiempo) y cuando se estan estudiando muchos

individuos (Pask et al., 2012).

“Fluorescencia es la re-emisión de energía en forma de fotón cuando un electrón vuelve a

su estado fundamental desde un estado excitado” (Cosgrove y Borowitzka, 2010). En el caso

de la fluorescencia de la clorofila a, una molécula de la clorofila puede excitarse y alcanzar

el estado singlete después de absorber un fotón (Bolhàr-Nordenkampf y Öquist, 1993), y

volver a su estado fundamental luego de reemitir dicha energía en un haz de luz de menor

energía.

El análisis de la fluorescencia de la clorofila a es una herramienta usada para conocer el

comportamiento fotosintético de las plantas, principalmente lo relacionado con la parte

fotoquímica de la fotosíntesis (Brestic y Zivcak, 2013; Guidi y Degl’Innocenti, 2012).

Cuando la energía lumínica es captada por la hoja, se puede disipar en forma de calor, en

forma de fluorescencia o a través de la fotoquímica (Baker, 2008). Estos procesos son

competitivos, por lo que conocer el comportamiento de uno da información acerca de la

eficiencia y el desempeño de los otros dos (Murchie y Lawson, 2013).

Dependiendo del objetivo de la investigación, el análisis de la fluorescencia se puede hacer

a nivel de nanosegundos o de minutos. El primero para conocer el estado de óxido-reducción

de los primeros aceptores de electrones: la quinona A y la quinona B; y lo segundo para

determinar el uso (o disipación(quenching)) de la energía lumínica (Kalaji et al., 2014). Con

base a lo anterior, el segundo enfoque fue utilizado en el presente trabajo de investigación

El análisis de disipación de la energía usa parámetros basados en la emisión de la

fluorescencia en determinadas condiciones. Así, Fm es la fluorescencia máxima emitida

luego de someter la hoja a un haz de luz saturante (generalmente mayor a 3000 µmol m-2 s-

1), mientras Fo es la fluorescencia emitida luego de someter la hoja a un haz de luz no

saturante y con tan baja intensidad (alrededor de 0,1 µmol m-2 s-1) que no desencadene los

mecanismos de disipación de la energía (Baker, 2008). La diferencia entre estas dos

Marco Teórico 23

fluorescencias se denomina fluorescencia variable Fv, y la nomenclatura cuando se

determinan luego de un haz de luz actínica es Fm’, Fo’ y Fv’. Con estos índices y otros más

se determinan parámetros que dan información sobre el estado y la disipación de la energía

en los fotosistemas (Baker, 2008; Brestic y Zivcak, 2013)(Tabla 3):

En arroz, el estrés por calor induce un incremento en NPQ y en el estado de de-epoxidación

del ciclo de las xantofilas (Yin et al., 2010). Una disminución en la asimilación de CO2

acompañada por una no disminución de Fv/Fm inducido por estrés por calor puede

potencialmente exponer las plantas a un exceso de energía bajo condiciones lumínicas, lo

cual si no se disipa de forma segura, puede resultar en un daño del PSII debido a una sobre-

reducción de los centros de reacción (Xue et al., 2012) . Se dice que el PSII es el componente

más sensible a la alta temperatura: el daño puede ser directo o una disminución en los

mecanismos de reparación (Yin et al., 2010). Esto también es reportado por Vani et al.

(2001) quienes argumentan que la alta temperatura desorganiza los tilacoides y los

complejos donadores y aceptores de electrones en el PSII.



Tabla 3. Parámetros de la fluorescencia derivados de la fluorescencia de la clorofila a

Parámetro Formula Descripción

Fq’, ΔF’ Fm’-F’ Disipación fotoquímica de la

fluorescencia cuando los centros de

reacción del PSII abiertos.

Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm Eficiencia máxima potencial de la

fotoquímica del PSII. Se considera que un

valor menor a 0,83 índica algún tipo de

estrés en la planta (Baker, 2008; Murchie

y Lawson, 2013)

ΦPSII, Y(II) Fq’/Fm’ Eficiencia cuántica efectiva (operativa) de

la fotoquímica del PSII a determinada

intensidad lumínica.

Fv’/Fm’ (Fm’-Fo’)/Fm’ Eficiencia máxima potencial de la

fotoquímica del PSII a determinada

intensidad lumínica.

NPQ (Fm-Fm’)/Fm’ disipación no fotoquímica

qP Fq’/Fv’ Coeficiente de la disipación fotoquímica

basado en el “puddle model” (unidades del

PSII desconectadas). Proporción de

centros de reacción oxidados o mayor

proporción del estado reducido de Qa.

qL (Fq’/Fv’)/(Fo’/F’) Coeficiente de la disipación fotoquímica

basado en el “lake model”(unidades del

PSII conectadas).

qN (Fm-Fm’)/(Fm-Fo’) Coeficiente de la disipación no

fotoquímica de la fluorescencia variable.

ΦNO, Y(NO) 1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)) Eficiencia cuántica de la disipación no

regulada de la energía en el PSII.

ΦNPQ, Y(NPQ) 1-Y(II)-Y(NO) Eficiencia cuántica de la disipación

regulada de la energía en el PSII. Asociado

con la acidificación del lumen tilacoidal y

con el estado de de-epoxidación del ciclo

de las xantofilas.

La misma tendencia es presentada por Song et al. (2013) quienes encontraron una

disminución de Fv/Fm y Y(II) asociada con un daño en la proteína D1. Además de esto, la

conductancia estomática se incrementó, así como la transpiración y la concentración

intercelular de CO2, sugiriendo que la disminución de la fotosíntesis es debida a una

limitación no estomática. Según este autor un estrés leve (temperatura diurna<40°C) no daña

el PSII. Sin embargo, a dichas temperaturas leves se dañan las proteínas encargadas de

Marco Teórico 25

regenerar dicho fotosistema. El PSII es sensible debido a que la alta temperatura aumenta la

fluidez de la membrana tilacoidal (Farooq et al., 2011).

Teniendo en cuenta lo anterior, mantener alta la tasa fotosintética y bajo NPQ bajo altas

temperaturas puede disminuir la sobre-reducción de la cadena transportadora de electrones

y la producción de H2O2 a través de la fotorespiración (Bahuguna et al., 2015). Por esto

Krishnan et al. (2011) sugieren que una alta eficiencia del fotosistema II (Fv/Fm) y Fo se

correlacionan con la tolerancia a altas temperaturas.

Asimilación de CO2

Muchas investigaciones en arroz han demostrado que la asimilación de CO2 disminuye al

aumentar la temperatura diurna o nocturna (Laza et al., 2015; Mathur et al., 2014; Cui et al.,

2006). Esto generalmente va acompañado de una mayor respiración, menor crecimiento y

menor eficiencia del fotosistema II. Sin embargo, la razón por la cual la asimilación de CO2

disminuye bajo altas temperaturas no está del todo clara.

Las dos razones más aceptadas son una disminución en el estado de activación de la Rubisco

y la baja disponibilidad de RuBP (Kubien y Sage, 2008; Scafaro et al., 2010). La

disminución del estado activo de la Rubisco está asociado con una menor actividad de la

Rubisco activasa, debido a que es más sensible que la Rubisco a la alta temperatura (Salvucci

y Crafts-Brandner, 2004). Por otro lado, la menor disponibilidad de RuBP está asociada con

la disponibilidad de ATP y NADPH (productos de la cadena transportadora de electrones)

y la actividad enzimática del ciclo de Calvin (Yamori et al., 2011).

Kubien y Sage (2008) concluyeron que el aumento del estado de activación de la Rubisco

no necesariamente aumenta la tasa de fijación de CO2, ya que al mantener una alta relación

de Rubisco activasa/Rubisco no se aumenta la tolerancia a la alta temperatura (Kubien y

Sage, 2008). Por otro lado, Wang et al. (2010) establecieron que un mayor estado de

activación de la Rubisco hace más tolerante a las plantas de arroz a una alta temperatura, y

que la isoforma grande de la Rubisco activasa es más importante bajo una alta temperatura.

Lo anterior es soportado por quienes establecieron que O. meridionalis es más tolerante que

O. sativa porque la asociación Rubisco/Rubisco activasa es más estable en O. meridionalis

sometida a altas temperaturas (Scafaro et al., 2012).

Aunque todavía no esté claro el mecanismo por el cual la asimilación de CO2 disminuya por

una alta temperatura. Se ha demostrado que una tasa de asimilación de CO2 estable bajo

condiciones estresantes puede ser un indicador de tolerancia (Ashraf y Harris, 2013; Guidi



y Degl’Innocenti, 2012). En el caso de la alta temperatura en arroz sucede lo mismo y la

resistencia de los genotipos a la alta temperatura está asociada con una tasa constante de

fotosíntesis y con la capacidad de almacenar carbohidratos en el tallo (Farooq et al., 2011;

Venkateswarlu et al., 2012).

Pigmentos Fotosintéticos

Las clorofilas son pigmentos que absorben la luz entre los 400 y 700nm con una mayor

absorción a los 480nm y entre los 650 y 700nm, la luz verde (entre los 480 y 550nm) no es

absorbida por estos pigmentos (Heldt, 2005; Taiz y Zeiger, 2006). Estos pigmentos captan

la luz y la energía adquirida la transportan a los centros de reacción de los fotosistemas

donde a través de un flujo de electrones, la luz es transformada en energía química (Heldt,

2005).

Los carotenoides son pigmentos isoprenoides con enlaces dobles que absorben la luz en la

región entre 400 y 500nm (Tanaka et al., 2008; Taiz y Zeiger, 2006). Esto pigmentos

cumplen 3 funciones: captan energía y la transfieren a la clorofila (pigmentos accesorios),

protegen el aparato fotosintético de radicales como la clorofila en estrado triplete, el oxígeno

singlete y otros ROS y participan en el ensamblaje de los LHC del PSI y en la estabilización

de las membranas tilacoidales (función estructural) (Gill y Tuteja, 2010; Havaux, 1998).

En cebada un aumento de la proporción CAR/Chl es una adaptación a alta temperatura y

radiación, provocado por una disminución de Chl, principalmente. Esto confirma la idea de

que la disminución de la clorofila es una forma de captar menos energía y evitar el

calentamiento de la hoja, provocado por la reducción en la transpiración (Havaux y Tardy,

1999).

Dentro de las características deseables en el mejoramiento genético para la tolerancia a altas

temperaturas están la producción de pigmentos fotoprotectores, estabilidad membranal,

vigor temprano y senescencia tardía (Cossani y Reynolds, 2012). Lo anterior es soportado

por la respuesta de NL-44, un genotipo tolerante a alta temperatura que mantiene su verdor

relativo (contenido de clorofila) y su capacidad fotosintética, lo que le permite sobrevivir

tanto en estado vegetativo como reproductivo (Bahuguna et al., 2015).

Marco Teórico 27

1.4.2 Reproducción y Rendimiento

El estado reproductivo es el más susceptible a las altas temperaturas, tanto diurnas como

nocturnas. La alta temperatura acelera el desarrollo de la inflorescencia, disminuye la

viabilidad del polen, el crecimiento del tubo polínico y perjudica el desarrollo de los ovarios

(Jagadish et al., 2015).

En cereales, la formación de polen es uno de los estados más sensibles a la alta temperatura.

La mitosis 1 y 2 durante la formación del grano de polen son muy sensibles a las altas

temperaturas (Barnabás et al., 2008). La primera, que corresponde al estado uninucleado del

polen es el más susceptible a la alta temperatura. En varias especies (incluida el arroz), la

alta temperatura provoca aborto del polen en este estado. La alta temperatura afecta el

metabolismo de la microspora y puede disminuir la síntesis de proteína relacionada con

síntesis de carbohidratos, lípidos, proteínas antioxidantes y síntesis de la pared celular del

polen (Sage et al., 2015).

La meiosis, proceso previo a la mitosis durante la microsporogénesis, también puede ser

afectada por la alta temperatura. Un efecto negativo de la alta temperatura en este proceso

disminuye el número de células madre de las microsporas, y por tanto el número de granos

de polen. Finalmente, aunque el polen madure, también puede ser inviable si se presentan

altas temperaturas (>30℃ por minutos u horas) o puede quedarse en las anteras debido a una

menor dehiscencia de estas últimas. Todo esto se traduce en una menor fertilidad de la

espiguilla y menor rendimiento.

La alta temperatura diurna reduce la viabilidad del polen, el crecimiento del tubo polínico,

lo que se traduce en menor fertilidad de la espiguilla. La reciente literatura muestra los

mismos efectos bajo alta temperatura nocturna (Jagadish et al., 2015). Luego de la

polinización, se puede presentar una pobre geminación del polen, (crecimiento del tubo

polínico) debido a la degradación del tejido encargado de la nutrición del tubo polínico o a

la formación de granos de polen inmaduros (Barnabás et al., 2008). Luego de la formación

del polen la alta temperatura puede evitar dehiscencia de las anteras disminuyendo la

cantidad de polen disponible para la polinización (Bokszczanin y Fragkostefanakis, 2013).

El hecho que se afecte el número de granos o el tamaño del grano depende del estado

fenológico en el que se haya presentado la alta temperatura. Si fue durante la formación de

la panícula y la antesis se afectara el número de granos, mientras si es durante el llenado del

grano se afectara el tamaño y peso del grano (Farooq et al., 2011).



Los genotipos tolerantes tienden a mantener su rendimiento, fertilidad de las espiguillas,

viabilidad del polen y capacidad fotosintética (Poli et al., 2013). Además de estas

características, genotipos tolerantes como N22 acumula heat shock proteins HSP y cold

shock proteins CSP cuando es sometido a un estrés térmico, lo que podría explicar su

tolerancia y alta fertilidad bajo el estrés por alta temperatura (Jagadish et al., 2010).

1.4.3 Peroxidación Lipídica de membranas

Cuando se presenta una condición estresante, la capacidad fotosintética de la planta

disminuye, lo que la hace más susceptible a la fotoinhibición (disminución de la tasa

fotosintética provocada por la luz) (Gururani et al., 2015; Murata et al., 2007). Una

condición estresante generalmente disminuye la asimilación de CO2 por una menor actividad

de la Rubisco, la Rubisco activasa o por una disminución en la proteína D1 del PSII, lo que

provoca fotoinhibición (Gururani et al., 2015).

Durante este proceso los electrones procedentes de la clorofila no pueden ser disipados de

forma segura y se producen especies reactivas de oxígeno (ROS)(Gill y Tuteja, 2010). Estas

especies reactivas pueden dañar lípidos, proteínas y el ADN, lo que produce radicales libres

lipídicos y disminuye la funcionalidad de organelos celulares (Apel y Hirt, 2004).

Una de las formas de medir la peroxidación lipídica es cuantificar la producción de

malondialdehído (MDA). El MDA es el producto de la peroxidación del ácido linolénico, el

cual es uno de los componentes principales de la membrana celular. Esta peroxidación daña

la membrana, disminuyendo su selectividad y aumentando su fluidez (Gill y Tuteja, 2010).

Debido a que la peroxidación lipídica es una de las principales consecuencias de la

producción de especies reactivas de oxígeno provocado por una condición estresante, tanto

los niveles de ROS como los de TBARS (sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico, un

ejemplo es el MDA ) son considerados indicadores bioquímicos de la severidad del estrés

por calor (Bahuguna et al., 2015).

Teniendo en cuenta lo anterior se considera que la tolerancia a alta temperatura nocturna

(Narayanan et al., 2016; Bahuguna et al., 2015; Zhou et al., 2012), a salinidad (Lutts et al.,

1996) y a una alta temperatura diurna(Zhou et al., 2012) se manifiesta como una menor

peroxidación lipídica (MDA). Asimismo, la pérdida de electrolitos se usa como indicador

del daño membranal ya que correlaciona con la peroxidación lipídica y en varios casos con

la senescencia y capacidad fotosintética de la planta (Mantri et al., 2012).

Marco Teórico 29

1.4.4 Osmolitos compatibles (Prolina)

La prolina es un aminoácido no estructural que generalmente se acumula en plantas cuando

se presenta una condición estresante (Ashraf y Foolad, 2007); la mayor cantidad de reportes

la asocian con salinidad, pero también se acumula cuando se presenta déficit hídrico, alta

radiación, contaminación por metales pesados, deficiencia de nutrientes, temperaturas

extremas y estrés oxidativo (Szabados y Savouré, 2010; Hare y Cress, 1997).

En condiciones de estrés se ha reportado que la prolina cumple las siguientes funciones

(Szabados y Savouré, 2010; Ashraf y Foolad, 2007; Wahid et al., 2007):

- Ajuste osmótico.

- Eliminación de radicales libres.

- Mantenimiento del balance de óxido-reducción (NADPH/NADP).

- En algunos casos promueve la transcripción de genes relacionados con la tolerancia

al estrés.

- Estabilización de estructuras sub-celulares.

Debido a lo anterior la prolina se ha usado para aliviar el estrés (Wahid et al., 2007) o como

un indicador de tolerancia a condiciones estresantes (Szabados y Savouré, 2010). Por

ejemplo Kumar et al. (2011) determinaron que bajo una alta temperatura, plántulas de arroz

y de maíz acumulan mayor cantidad de prolina como una respuesta al estrés provocado por

la alta temperatura. Otro ejemplo lo reporta Yan et al. (2012) en trigo, quienes descubrieron

que el estrés térmico daña la sección donadora y receptora de electrones del PSII y que este

efecto es aliviado por una mayor producción de prolina provocada por una aplicación previa

de sal.

Como se enuncio antes, la alta temperatura puede producir ROS, disminuir la tasa de

transporte de electrones lo que afecta la relación NADPH/NADP (Vani et al., 2001b) y

desorganiza los tilacoides (Vani et al., 2001a). Estos efectos podrían ser aliviados por la

prolina, teniendo en cuenta las funciones de este aminoácido (Szabados y Savouré, 2010).

Aunque, la acumulación de prolina este asociada con funciones que promueven la tolerancia

o alivian los efectos negativos del estrés. Mani et al. (2002) reportan que en mutantes que

sobre producen prolina o que no la degradan, los efectos no son positivos y pueden provocar

malformaciones en las plantas. Teniendo en cuenta esto, Szabados y Savouré (2010)

enuncian que las funciones positivas de la acumulación de prolina pueden estar asociadas a

los procesos de síntesis de prolina y no a la acumulación de la misma.



Con base en el anterior marco teórico se espera que la alta temperatura nocturna (30°C)

disminuya el crecimiento y rendimiento de los genotipos a evaluar y que las variables

relacionadas con fotosíntesis y componentes de rendimiento sean los mejores indicadores

de tolerancia o susceptibilidad a una alta temperatura nocturna.

Objetivos 31

2. OBJETIVOS

Con el propósito de desarrollar la hipótesis de trabajo, los siguientes objetivos fueron

planteados:

2.1 Objetivo General

Caracterizar el comportamiento fisiológico y agronómico de siete genotipos de arroz

sometidos a una alta temperatura nocturna (30°C).

2.2 Objetivos Específicos

Evaluar el efecto de cuatro diferentes periodos de dos temperaturas nocturnas (24 y

30°C) sobre la fotosíntesis y respiración de un genotipo susceptible a estrés térmico

diurno.

Caracterizar la tasa fotosintética, respiratoria, parámetros de crecimiento y de

rendimiento de siete genotipos de arroz a una alta temperatura nocturna (30°C).

Identificar la utilidad de variables fisiológicas como la fotosíntesis, parámetros de la

fluorescencia de la clorofila a y pruebas bioquímicas como herramientas en la

selección de genotipos de arroz tolerantes a condiciones de altas temperaturas

nocturnas para programas de mejoramiento genético.

Materiales y Métodos 33

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Con el fin de cumplir los objetivos propuestos en el presenta trabajo, se desarrollaron 3

experimentos. En el primero, se evaluó el efecto de cuatro periodos de dos temperaturas

nocturnas (24 y 30°C) sobre la fotosíntesis y respiración en un genotipo susceptible a estrés

térmico diurno. En el segundo, se caracterizó la tasa fotosintética, respiratoria y parámetros

de crecimiento, de seis genotipos de arroz en fase vegetativa, a una alta temperatura nocturna

(30°C). En el tercero, se evaluó la eficiencia del PSII y parámetros de rendimiento de siete

genotipos de arroz sometidos a una alta temperatura nocturna (30°C).

A continuación, se enuncian las metodologías usadas en cada uno de los experimentos

citados:

3.1 RESPUESTA FISIOLÓGICA DE PLANTULAS DE ARROZ F60 SOMETIDAS

A PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA.

3.1.1 Condiciones generales del experimento

Se sembraron semillas del cultivar Fedearroz 60 ('F60'): es una variedad con buenos

rendimientos (mayor a 6 t ha-1) en cultivos comerciales, grano largo, buena calidad de

molino pero susceptible a altas temperaturas diurnas (Sánchez-Reinoso et al., 2014), en

materas plásticas con 450 mL de suelo. Las materas se dispusieron en un invernadero de

vidrio localizado en la Universidad Nacional de Colombia, Campus Bogotá. El invernadero

contó con un controlador de humedad relativa y resistencias calefactoras con el fin de

mantener las siguientes condiciones de crecimiento: temperatura diurna 31°C, temperatura

promedio nocturna 22°C, humedad relativa promedio de 70% y fotoperiodo natural de 12 h.

Se dispusieron dos plantas por matera las cuales fueron fertirrigadas diariamente con 50 mL

de una solución nutritiva que contenía un fertilizante completo (Wuxal®, Bayer

CropScience, Bogotá D.C., Colombia) a una dosis de 2 mL L-1 H2O, para una concentración

de nutrientes: Nitrógeno total 160 g L-1, (N amoniacal 38 g L-1, N nítrico 12 g L-1, N ureico

110 g L-1), Fósforo asimilable (P2O5) 160 g L-1, Potasio soluble (K2O) 120 g L-1, Boro (B)

10 g L-1, Cobre (Cu)* 0,21 g L-1, Hierro (Fe) 0,43 g L-1, Manganeso (Mn) 0,36 g L-1,

Molibdeno (Mo) 0,07 g L-1, Zinc (Zn)*:10 g L-1. (* Quelatados con EDTA pH en solución

al 10% 6.5, Densidad a 25°C 1.40 g cm-3).



3.1.2 Tratamientos

A los 45 días después de emergencia (DE), los tratamientos de estrés térmico fueron

establecidos y consistieron en exponer un grupo de plantas de arroz (48 plantas de las 96

que conformaban el experimento) a una temperatura nocturna de 30°C y otro grupo de

plantas (las restantes 48) a una temperatura nocturna de 24°C entre las 18:00 y 24:00 horas

a cuatro periodos de estrés (4, 8, 12 y 16 días). La temperatura nocturna de 30°C se impuso

mediante el traslado de 48 plantas desde el invernadero a una cámara de crecimiento (MLR-

351H, Sanyo, Bensenville, Illinois, USA) a las 18:00 horas. Luego, las plantas eran

retornadas al invernadero a las 06:00. En cada periodo de muestreo (4, 8, 12 y 16 días) se

tomaron 12 plantas de cada uno de los tratamientos por temperatura (24 y 30°C), para

determinar las variables de respuesta.

Las condiciones de crecimiento en la cámara eran las siguientes: un primer periodo de

temperatura nocturna de 30°C entre las 18:00-24:00 horas y un segundo periodo de 20°C

entre las 00:00 y 06:00 horas. La humedad relativa fue del 70% durante toda la noche. Las

plantas control eran aquellas que siempre estuvieron en el invernadero a lo largo del

experimento (48 plantas) con una temperatura promedio nocturna de 24°C entre las 18 y 24

horas y 20°C entre las 00:00 y 06:00. Asimismo, se seleccionó una alta temperatura nocturna

de 30°C porque es superior a las temperaturas óptimas para el crecimiento y desarrollo de

la planta de arroz (entre 23 y 25°C según Krishnan et al., (2011) y Mohammed y Tarpley,

2014a). Adicionalmente, los cuatro diferentes periodos de estrés térmico (4, 8, 12 y 16 días)

fueron establecidos siguiendo la frecuencia con que se han registrado estas condiciones

ambientales durante los últimos años en las zonas productoras de arroz en Colombia.

Finalmente, el experimento duro 61 días.

3.1.3 Fotosíntesis, conductancia estomática, y transpiración

Estas variables fueron determinadas con un medidor de fotosíntesis portátil (LSPro-SD,

ADC BioScientific Ltd.UK). Las mediciones fueron desarrolladas en la parte media de la

penúltima hoja del tallo principal de cada plántula, entre las 9am y las 12m. (Mohammed

et al., 2013; Mohammed y Tarpley, 2014). Las condiciones de la cámara de medición

fueron: flujo fotónico constante de 1200 µmol m-2 s-1, temperatura promedio de 30±2°C y

concentración de CO2 de 368±10 µmol mol-1 (Temperatura y concentración de CO2

ambientales).


3.1.4 Uso eficiente del agua y eficiencia de carboxilación

Estas dos variables fueron calculadas mediante las ecuaciones descritas por Kumar et

al.(2001) y Sikder et al. (2015)

𝑊𝑎𝑡𝑒𝑟 𝑈𝑠𝑒 𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑦 (𝑊𝑈𝐸) = 𝑃𝑛

𝐸

𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜𝑥𝑖𝑙𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑦 (𝐶𝐸) = 𝑃𝑛

𝐶𝑖

Donde Pn, E y Ci son la tasa fotosintética, la transpiración y la concentración de dióxido de

carbono subestomático, respectivamente.

3.1.5 Eficiencia máxima del PSII (Fv/Fm)

La relación se determinó con un fluorómetro no modulado (Handy PEA, Hansatech

Instruments, Kings Lynn, UK) en la misma hoja y a la misma hora que se realizaron las

mediciones de intercambio gaseoso. Para esto, las hojas fueron sometidas a 20 minutos de

oscuridad y luego se aplicó un pulso de luz de 0,1 µmol m-2s-1 para determinar la

fluorescencia mínima (Fo). Posteriormente, se aplicó un pulso de saturación de 3000 µmol

m-2 s-1 y se determinó la fluorescencia máxima Fm. Con estos datos se determinó Fv/Fm =

(Fm/(Fm-Fo)).

3.1.6 Contenido de clorofila a, clorofila b y carotenoides

Cincuenta miligramos de hojas frescas fueron macerados en un mortero con nitrógeno

líquido. Luego, la muestra se llevó a un volumen de 5mL con acetona al 80% y se centrifugó

a 7000g durante 10 minutos. Después, se determinó la absorbancia a longitudes de onda de

663nm, 647nm y 470nm con un espectrofotómetro BioMate 3 UV-Vis (Wisconsin, USA).

Los contenidos de clorofila a, b y carotenoides en hojas (mg L-1) se determinaron mediante

las formulas descritas por Lichtenthaler (1987) y Solarte et al. (2010)



3.1.7 Respiración oscura de la hoja

Esta variable fue determinada usando un equipo de fotosíntesis portátil LSPro-SD (ADC

BioScientific Ltd. UK.) en la parte media de la penúltima hoja de cada plántula (misma hoja

usada en fotosíntesis) entre las 21:00 y las 24:00 horas, como lo describen Mohammed y

Tarpley (2009b). En ambos tratamientos, se ajustó el flujo fotónico a 0 µmol m-2s-1 y la

temperatura de la cámara a 30°C o 24°C dependiendo del tratamiento. La respiración oscura

se asumió como la pérdida de CO2 proveniente de la hoja.

3.1.8 Contenido de Prolina

El contenido de Prolina se determinó siguiendo el protocolo de Bates et al. (1973)

modificado por Solarte et al. (2010) donde se tomaba 100 mg de tejido vegetal y se

homogenizaban en 5 mL de ácido sulfosalicílico al 3%. Posteriormente, la muestra era

centrifugaba a 4000g durante 30 minutos. Luego, en un tubo falcon se mezcló 1 mL del

sobrenadante con 1 mL de ninhidrina en medio ácido y 1 mL de ácido acético glacial. La

anterior mezcla fue agitada durante 1 minuto y en seguida sometida a baño maría a 95°C

por una hora. Después de este periodo de tiempo, la reacción fue detenida con hielo.

Finalmente, el producto de la reacción fue extraída con 3 mL de tolueno, agitando

vigorosamente los tubos con un vórtex. La absorbancia fue medida a 520 nm usando un

espectrofotómetro (Spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Madison, WI, USA). El

contenido de Prolina se determinó usando una curva de calibración y la siguiente ecuación:

𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑠𝑐𝑜=

[(

𝜇𝑔 𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎𝑚𝐿 𝑥 𝑚𝐿 𝑇𝑜𝑙𝑢𝑒𝑛𝑜)

115.5 𝜇𝑔𝜇𝑚𝑜𝑙

]

[𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

5]

3.1.9 Peroxidación Lipídica

Para la determinación de la peroxidación lipídica (representada como contenido de

Malondialdehído-MDA) se empleó el método del ácido tiobarbitúrico (TBA) descrito por

Hodges et al. (1999): Se homogenizaron 300 mg de hojas completamente desarrolladas con

nitrógeno líquido. Posteriormente, el homogenizado se mezcló con 3 mL de ácido


tricloroacético al 0,1%. La mezcla se centrifugó a 3000g por 10 min. Del sobrenadante se

extrajeron 2 mL para reaccionar en dos tubos de ensayo de la siguiente manera: (a) Con

TBA (+TBA); 1 mL de sobrenadante con 4 mL de ácido tricloroacético al 10% más ácido

tiobarbitúrico al 0,65%, (b) Sin TBA (–TBA); 1 mL de sobrenadante con 4mL de ácido

tricloroacético al 10%. Posteriormente, los tubos de ensayo fueron llevados a baño maría a

95°C durante 25 min y la reacción se detuvo con hielo. Las muestras fueron centrifugadas

nuevamente a 3000 g por 10 min y se leyeron las absorbancias a 440, 532 y 600 nm usando

un espectrofotómetro (BioMate 3 UV - Vis, WI, USA). Todas las variables fisiológicas y

bioquímicas se midieron a los 4, 8, 12 y 16 días después de iniciados los tratamientos tanto

en las plantas sometidas a 30°C como a 24°C. Para obtener la concentración de MDA se usó

la siguiente ecuación, asumiendo un coeficiente de extinción del MDA de 157 M mL-1:

𝐴 = [𝐴𝑏𝑠 532+𝑇𝐵𝐴 − 𝐴𝑏𝑠 600+𝑇𝐵𝐴 − (𝐴𝑏𝑠 532−𝑇𝐵𝐴 − 𝐴𝑏𝑠 600−𝑇𝐵𝐴)]

𝐵 = [(𝐴𝑏𝑠 440+𝑇𝐵𝐴 − 𝐴𝑏𝑠 600+𝑇𝐵𝐴) ∗ 0,0571]

𝑀𝐷𝐴 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 (𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑚𝐿−1) = (𝐴 − 𝐵157000⁄ ) ∗ 106

3.1.10 Análisis Estadístico

Los datos fueron analizados mediante un diseño factorial (temperatura nocturna (24 y 30°C)

vs tiempo de exposición (4, 8, 12 y 16 días) para un total de 8 tratamientos. Cada tratamiento

estuvo compuesto por 6 unidades experimentales y cada unidad experimental correspondió

a dos plantas. A los datos obtenidos, se les realizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov

y de Levene para comprobar normalidad y homogeneidad de varianza, respectivamente.

Luego, se desarrolló un análisis de varianza ANOVA. Cuando se observaron diferencias

significativas, se realizó una prueba de Tukey o contrastes polinómicos con el programa

SPSS (v20.0, IBM Company, USA).




ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

3.2.1 Tratamientos

Para el desarrollo del estudio se usó un genotipo susceptible a una alta temperatura diurna

('F60̍) (Sánchez-Reinoso et al. 2014) y cinco genotipos caracterizados por buen

comportamiento bajo condiciones de altas temperaturas tanto diurnas como nocturnas

utilizadas por la Federación Nacional de Arroceros dentro de sus programas de

fitomejoramiento (IR 1561, FLO 2764, LV447-1, CT19021, LV1401). Cuando las plantas

alcanzaron los 32 días después de emergencia (DE), estas fueron divididas en dos grupos de

16 plantas cada uno. El primer grupo siempre permaneció en el invernadero. Mientras el

segundo grupo fue ubicado en una cámara de crecimiento (MLR-351H, Sanyo, Bensenville,

Illinois, USA) a una temperatura de 30°C entre las 18:00 y 24:00 h y de 20°C entre las 00:01

y 06:00 por un periodo de 8 días. Cuando finalizaba el periodo de exposición en la cámara

de crecimiento, las plantas de arroz siempre eran retornadas a las condiciones de

invernadero. El experimento termino a los 40 DE.

3.2.2 Condiciones generales de crecimiento

El ensayo se desarrolló bajo condiciones de invernadero ubicado en la Facultad de Ciencias

Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Las condiciones de

crecimiento en el invernadero fueron las siguientes: temperatura diurna 30°C, temperatura

nocturna 24°C, humedad relativa promedio de 70% y un fotoperiodo natural de 12 h. Se

dispusieron dos plantas por matera de 450 mL de los diferentes genotipos a estudiar, las

cuales fueron fertirrigadas diariamente con 80 mL de una solución nutritiva que contenía un

fertilizante completo (Wuxal®, Bayer CropScience, Bogotá D.C., Colombia) a una

concentración de 2 mL L-1 H2O, siendo la concentración del fertilizante la siguiente:

Nitrógeno total 160 g L-1, (N amoniacal 38 g L-1, N nítrico 12 g L-1, N ureico 110 g L-1),

Fósforo asimilable (P2O5) 160 g L-1, Potasio soluble (K2O) 120 g L-1, Boro (B) 10 g L-1,

Cobre (Cu)* 0,21 g L-1, Hierro (Fe)0,43 g L-1, Manganeso (Mn)0,36 g L-1, Molibdeno (Mo)

0,07 g L-1, Zinc (Zn)* 10 g L-1. (*Quelatados con EDTA pH de 6,5 en solución al 10%,

Densidad a 25°C 1,40 g cm-3).


3.2.3 Fotosíntesis

Entre los 37 y 40 DE, La penúltima hoja (de la base al ápice) del tallo principal de cada

planta fue utilizada para determinar la tasa asimilación de CO2 mediante un medidor portátil

de fotosíntesis (LI-COR 6200, Lincoln, Nebraska, USA). Durante las medidas de

fotosíntesis, las condiciones en la cámara de medición fueron las siguientes: Radiación

Fotosintéticamente Activa (PAR) mayor a 800 μmol m-2 s-1, temperatura de la hoja de 27 ±

5 °C y diferencia presión de vapor de agua del aire y la hoja 1,8 ± 0,5 kPa. La medición de

la tasa fotosintética se realizó entre las 09:00 y las 12:00 h. Finalmente, para la

determinación de la tasa de asimilación de CO2 se tomaron ocho plantas por tratamiento

(doce tratamientos: 2 temperaturas x 6 genotipos).

3.2.4 Eficiencia de Carboxilación y Uso eficiente del agua

La eficiencia de la carboxilación se determino mediante la ecuación de Sikder et al. (2015)

nombrada en el apartado 3.1.4, y el uso eficiente del agua así:

𝑊𝑎𝑡𝑒𝑟 𝑈𝑠𝑒 𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑦 (𝑊𝑈𝐸𝑖) = 𝑃𝑛

𝑔𝑆

Donde Pn corresponde a la tasa fotosintética, gS a la conductancia estomática y WUEi al

uso eficiente del agua Intrínseco.

3.2.5 Respiración oscura

Para determinar esta variable se siguió la metodología descrita por Sánchez-Reinoso et al.

(2014) que consiste en introducir las plantas en cámaras herméticas plásticas de 2 L de

capacidad. Posteriormente, sensores de Gas CO2 infrarrojo (CO2-BTA, Vernier, Beaverton,

OR, USA) fueron insertados en las cámaras y conectados a una interface portátil (LabQuest,

Vernier, Beaverton, OR, USA). Antes de introducir las plantas en las cámaras herméticas,

todas las macetas fueron cubiertas con una bolsa plástica para evitar la respiración del suelo

con el propósito de cuantificar únicamente la respiración del tejido vegetal. Luego, las

cámaras fueron colocadas en un cuarto oscuro por 300 segundos (s). Durante este periodo,

el sensor estimó cada 4 s la concentración de CO2 (mg kg-1) en la cámara, obteniéndose una

curva de tendencia lineal. Para obtener la tasa de respiración de la planta (mmol CO2 kg PF -1 h-1) se determinó la pendiente de la regresión lineal (mg kg-1/s) y se calculó sobre el peso

fresco total de la planta. Las mediciones fueron desarrolladas en las mismas fechas y el

mismo número de plantas donde se obtuvieron las medidas de fotosíntesis.



3.2.6 Parámetros de Fluorescencia de la clorofila a

Estos parámetros se calcularon en la parte media de la penúltima hoja de cada planta (las

mismas utilizadas para la estimación de la Fotosíntesis) entre las 9:00 am y las 13:00 horas

justo al finalizar el ensayo (40 DE). La fluorescencia de la clorofila fue estimada con un

fluorómetro modulado MINI-PAM (Heinz Walz, Effieltrich, Germany). Las hojas se

mantuvieron en la oscuridad por 20 minutos antes de medir Fv/Fm. La fluorescencia mínima

(Fo) fue medida con un pulso de luz modulado menor a 50 µmol m-2 s-1 y la máxima

fluorescencia fue inducida por un pulso de 0,8s con una intensidad de 3000 µmol m-2 s-1. El

rendimiento cuántico potencial del PSII (Fv/Fm) fue determinado así: Fv/Fm = (Fm-Fo)/Fm.

Para alcanzar el estado basal de la fotosíntesis (Fs’) las muestras se sometieron a una luz

actínica de 900 µmol m-2 s-1 y luego de esto se sometieron a un segundo pulso saturante

(3000 µmol m-2 s-1 por 0,8s) para obtener la máxima fluorescencia en estado adaptado a la

luz (Fm’). Se calculó Fo’ mediante la fórmula de Oxborough y Baker (1997): Fo’= 1/(1/Fo-

1/Fm+1/Fm’). Con las variables anteriores y de acuerdo con Brestic y Zivcak (2013) se

estimó: el rendimiento cuántico real del fotosistema II (ΦPSII= Fm’-F’/Fm’), Rendimiento

cuántico de la disipación de la energía no regulada (ΦNO = 1/ (NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)),

rendimiento cuántico de la disipación de la energía regulada(ΦNPQ = 1 - ΦPSII – ΦNO),

disipación no fotoquímica (NPQ = (Fm-Fm’)/Fm’), coeficiente de disipación fotoquímica

basado en el “Lake model” (qL = ((Fm’-Fs’)/(Fm’-Fo’)*(Fo/Fs’) y coeficiente de disipación

no fotoquímica de la fluorescencia variable (qN = Fm-Fm’/Fm-Fo’).

3.2.7 Parámetros de Crecimiento

Al finalizar los tratamientos, cuatro plantas por tratamiento se sometieron a 70°C por 48h

con el fin de determinar la acumulación de masa seca por órgano (tallo+vaina foliar y lamina

foliar). Se determinó el área foliar de las láminas foliares de cada planta usando un medidor

de área foliar LI-3000C (LI-COR Lincoln, Nebraska, USA). Con las anteriores variables se

determinó masa foliar especifica (relación masa foliar/área foliar de cada planta) y la

relación hojas/tallo (masa de hojas/masa de tallo+vaina foliar por planta)

3.2.8 Pérdida de electrolitos

Esta variable fue determinada mediante el protocolo del porcentaje de fuga de electrolitos

descrito por Sanchez-Reinoso et al. (2014). Después del período de estrés a los 40 DE,

aproximadamente 300 mg de hojas frescas fueron cortados en trozos de 1 cm de longitud y


colocadas en tubos de ensayo con 30 mL de agua desionizada. Posteriormente, los tubos

fueron incubados en baño maría a 30°C por 2 h y se determinó la conductividad eléctrica

inicial (CE1). Posteriormente, las muestras fueron sometidas a 100°C en baño maría por 15

min para liberar todos los electrolitos. Finalmente, se enfrió la muestra en cama de hielo y

se determinó la conductividad eléctrica final (CE2). El porcentaje de electrolitos se calculó

así:

%𝐸𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑜𝑠 = (𝐸𝐶1

𝐸𝐶2) 𝑥 100

3.2.9 Clorofila y Carotenoides

A los 40 DE, trozos de lámina foliar de 1 cm de longitud (50 mg de peso fresco) de una hoja

completamente desarrollada fueron macerados usando nitrógeno líquido y almacenados a -

80 °C hasta que se realizaron los respectivos análisis (descrito en el apartado 3.1.6).

3.2.10 Prolina y Malondialdehído (MDA)

Después de los ocho días del periodo de estrés (40 DE), se maceraron 300 mg de hojas

completamente desarrolladas del tallo principal con nitrógeno líquido y se conservaron a

una temperatura de -80°C hasta su análisis: el cual corresponde al del apartado 3.1.8.

Para la determinación de la peroxidación lipídica (representada como contenido de MDA)

se empleó el método del ácido tiobarbitúrico (TBA) descrito por Hodges et al. (1999), el

cual también es descrito en el apartado 3.1.9.

3.2.11 Diseño experimental y análisis estadístico

Se realizó un diseño en arreglo factorial con ocho plantas por tratamiento, donde el factor

principal fueron los genotipos (F60, LV447, FLO2764, LV1401, CT19021, IR1561) y el

factor secundario fue la temperatura nocturna (24 vs 30 °C). Cuando se presentaron

diferencias significativas, se usó el test de Tukey como prueba de comparación de medias.

Los datos se analizaron usando el programa SPSS (v20.0, IBM Company, USA).



3.3 CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

3.3.1 Condiciones generales de crecimiento

El ensayo fue desarrollado bajo condiciones de casa de mallas en el Centro de Investigación

Las Lagunas de la Federación Nacional de Arroceros (FEDEARROZ) ubicado en el

municipio de Saldaña (Colombia) (3º54’46’’ N; 74º59’7’’ W) entre Septiembre de 2014 y

Enero de 2015. En bandejas plásticas de 9L de capacidad se sembraron seis plantas por

genotipo. En cada bandeja se usó suelo franco arenoso como sustrato y cada planta fue

fertilizada con 221mg de N (157 Kg ha-1), 15mg de P (54 Kg ha-1), 215mg de K (142 Kg ha-

1), 71mg de S (13 Kg ha-1) y 23 mg de Zn (12 Kg ha-1). Las condiciones ambientales a lo

largo del experimento fueron las siguientes: temperatura diurna promedio de 33°C,

temperatura nocturna promedio de 23.5°C, Humedad relativa del 77% y un fotoperiodo

natural de 12 horas. Los anteriores valores fueron registrados por una estación climática

(Davis Vantage Pro 2 Plus, NSW, AUS) ubicada en la zona de experimento.

3.3.2 Genotipos y tratamientos

Para el desarrollo del presente estudio, se usaron dos variedades comerciales de arroz

susceptibles a condiciones de estrés térmico (Fedearroz 50 y 60) (Restrepo-Diaz y Garces-

Varon, 2013; Sánchez-Reinoso et al., 2014). Adicionalmente, se seleccionaron cinco líneas

utilizadas por la Federación Nacional de Arroceros dentro de sus programas de

fitomejoramiento (IR 1561, FLO 2764, LV447-1, CT19021, LV1401). Estas líneas fueron

seleccionadas porque han mostrado un buen comportamiento bajo condiciones de altas

temperaturas tanto diurnas como nocturnas. Los tratamientos correspondieron en separar

cada material genético en dos grupos de seis plantas cada uno. Un primer grupo (Plantas

Control) siempre estuvo situado en la casa de mallas a una temperatura nocturna ambiental

de ̴24°C. El segundo grupo de plantas de arroz fue ubicado en una cámara de crecimiento

(KBW-400, Binder, Germany) a una temperatura de 30°C entre las 18:00 y 24:00h por un

periodo de 8 días. Al noveno día las plantas fueron retornadas a la casa de mallas y se

estimaron las variables de respuesta fisiológica y bioquímica. Asimismo, la exposición de

las plantas a 30°C fue desarrollada cuando estas estaban en el estado fenológico grano

lechoso. Debido a las diferencias en el desarrollo fenológico de los genotipos evaluados, las

plantas fueron ubicadas en diferentes fechas en la cámara de crecimiento: IR 1561 y F50 el


23 de diciembre de 2014, LV447-1 y FLO 2764 el 30 de Diciembre de 2014, LV1401 y

CT19021 el 6 de enero de 2015 y F60 el 15 de enero de 2015.

3.3.3 Componentes de rendimiento

Al final del ciclo de cada genotipo se tomaron las panículas de cada planta y se determinaron

por panícula los siguientes componentes: masa de granos llenos, número total de granos,

número de granos vanos, número de granos llenos (presionando entre los dedos se determinó

completamente y parcialmente llenos), porcentaje de fertilidad (expresado como la relación

entre granos llenos y número total de sitios reproductivos) y masa promedio de grano.

3.3.4 Parámetros de Fluorescencia de la Clorofila a

Esta variable se determinó en la parte media de la hoja bandera de cada planta en ambos

tratamientos de temperaturas nocturnas entre las 9:00am y la 1:00pm, al día siguiente de

finalizar el periodo térmico de las plantas expuestas a 30°C en cada genotipo. Los

parámetros de fluorescencia de la clorofila a fueron estimados como se describe en el

apartado 3.2.6

3.3.5 Contenido de Clorofila y Carotenoides

Luego de la determinación de los parámetros de fluorescencia de la clorofila a, las hojas

bandera de cada panícula fueron cortadas y almacenadas bajo refrigeración un máximo de

12 horas. Posteriormente, las muestras fueron maceradas usando nitrógeno líquido y

almacenadas a -80 °C hasta que se realizaron las respectivas determinaciones (descrito en el

apartado 3.1.6).

3.3.6 Prolina y Malondialdehído (MDA)

Para el análisis de estas dos variables se usaron muestras de las hojas bandera del tallo

principal almacenadas a una temperatura de -80°C hasta su análisis: el cual corresponde a

los apartados 3.1.8 y 3.1.9



3.3.7 Análisis Estadístico

Para el análisis estadístico se usó un diseño factorial, donde el primer factor correspondió a

la temperatura nocturna (24 vs 30°C) y el segundo factor al genotipo (F50, F60, IR 1561,

FLO 2764, LV447-1, CT19021 y LV1401), para un total de 14 tratamientos (cada uno con

6 unidades experimentales representada por una planta). A los datos obtenidos se les realizo

la prueba de normalidad de Kruskal-Wallis y de homogeneidad de varianzas de Levene

previamente al análisis de varianza (ANOVA). Cuando se observaron diferencias se

realizaron la prueba de comparación de medias de Tukey. El análisis de datos fue

desarrollado con el programa estadístico SPSS (v20.0, IBM Company, USA).

Resultados 45

4. RESULTADOS

4.1 RESPUESTA FISIOLÓGICA DE PLANTULAS DE ARROZ SOMETIDAS A

PERIODOS DE ALTA TEMPERATURA NOCTURNA.

4.1.1 Fotosíntesis, conductancia estomática, transpiración y concentración interna de

CO2

Según el análisis polinomico la tasa fotosintética (Pn) de plantas control (24°C) no se ajustó

significativamente a una ecuación lineal, cuadrática ni cúbica (Fig. 2A). Sin embargo, se

observó un comportamiento cúbico (P≤0,01) en plantas sometidas a altas temperaturas

nocturnas (ATN), presentándose una disminución drástica de la tasa de asimilación de

carbono en plantas de arroz sometidas a ATN durante 16 días. En general, la Pn disminuyó

alrededor de un 12% en plantas de arroz sometidas a temperaturas nocturnas de 30°C en

comparación al control (24°C) (Fig. 2A). En relación a la conductancia estomática (gS),

también se presentó un comportamiento cúbico en plantas sometidas a ATN, con una

disminución a los 8 y 16 días de exposición (DDE), en comparación al control (24°C) (Fig.

2B). Con respecto a la transpiración (E), esta variable también mostró un comportamiento

cúbico en ambas temperaturas, con una mayor transpiración a los 8 y 12 días en plantas

sometidas a 30°C. Sin embargo, se observó una disminución de la tasa de transpiración a los

16 DDE en las dos condiciones de temperaturas nocturnas (Fig. 2C). Por otro lado, la

concentración interna de CO2 (Ci) también fue mayor en plantas sometidas a 30 °C a los 4,

8 y 12 DDE y presentó una respuesta cúbica en ambas temperaturas (P≤0,01). Sin embargo,

estas diferencias no se mantuvieron al final del experimento (16 DDE) (Fig. 2D).



DDE

4 8 12 16

Tra

nsp

ira

ció

n (

mm

ol

H2O

m-2

s-1

)

9

10

11

12

13

14 Con

du

cta

ncia

est

om

ati

ca (

mol

H2O

m-2

s-1

)

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

Fo

tosí

nte

sis

(µm

ol

CO

2 m

-2 s

-1 )

26

28

30

32

34

36

38

4024°C

30°C

A B

C*

n.s

DDE

4 8 12 16

Ci

(µm

ol

mo

l-1)

140

150

160

170

180

190

200

210

220

DC

y = 0.0023x3 - 0.0784x2 + 0.7948x - 1.2933*

R2

=1

y = -0.0098x3 + 0.1123x2 + 0.521x + 29.632**

R2

= 1

y = -0.0101x3 + 0.2792x2 - 2.4191x + 19.239**

R2

=1

y = -0.0088x3 + 0.2157x2 - 1.5141x + 15.717**

R2

=1

y = 0.1447x3 - 4.0309x2 + 31.868x + 122.76**

R2

=1

y = 0.1795x3 - 5.0875x2 + 43.443x + 67.14***

R2

=1

n.s

Figura 2. Fotosíntesis(A), Conductancia estomática(B), transpiración(C) y Concentración

intercelular de CO2(D) de plántulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs

30°C). Las ecuaciones representan el comportamiento cúbico en el tiempo. n.s,*, ** y ***

representa no significativo y significancia con P≤0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente. Cada

punto representa el promedio de 12 valores.

4.1.2 Eficiencia de la carboxilación y uso eficiente del agua

La eficiencia de la carboxilación entendida como la relación Pn/Ci fue mayor en plantas

control (24°C) a través del experimento. Sin embargo, se observó una menor eficiencia en

ambos tratamientos a los 16 DDE (Fig. 3A). Asimismo, el uso eficiente del agua

(WUEe=Pn/E) mostró similares tendencias a las encontradas en Pn/Ci (Fig. 3B). En general,

el comportamiento de estas dos variables fue un 15% mayor en plantas control (24°C) en

comparación a las plantas sometidas a ATN.

Resultados 47

DDE

4 8 12 16

WU

Ee

(µm

ol

CO

2/m

mol

H2O

)

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

3,2

3,4

3,6

DDE

4 8 12 16

Pn

/Ci

(mol

m-2

s-1

)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

24°C

30°C * **

**

C*

A B

n.s

n.s

n.s

Figura 3. Eficiencia de carboxilación(A) y Uso eficiente del agua(B) de plántulas de arroz

sometidas a dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). n.s y * representan no significativo y

significancia, entre temperaturas para un mismo día, con P≤0,05 según la prueba de Tukey.

Cada barra de gráfico representa la medía de doce valores+Error estándar.

4.1.3 Respiración oscura y balance de carbono

La respiración oscura de la hoja (Ro), de plantas sometidas a una temperatura nocturna de

30°C, presento un comportamiento cúbico y un incremento de 70% (en comparación a

plantas sometidas a 24°C) durante los primeros cuatro día. Entre los 8 y 12 DDE esta pérdida

de CO2 presentó valores similares a los obtenidos en la plantas control (24°C). Al final del

experimento (16 DDE), la Ro volvió a ser mayor en las plantas de arroz sometidas a una

temperatura nocturna de 30°C con respecto al control (Fig. 4). Por otro lado, cuando se

analiza el efecto de la ATN sobre el balance entre Pn y Ro expresado como balance de

carbono (relación entre la fijación de CO2 por fotosíntesis y la pérdida de este gas por

respiración oscura), se observó una menor acumulación de CO2 en plantas expuestas a 30°C

especialmente a los 4 y 16 DDE (Fig. 5). En este sentido, plántulas de arroz sometidas a

ATN mostraron disminución del 17% y 25% en la acumulación de carbono en los periodos

de estrés térmico mencionados anteriormente.



DDE

4 8 12 16

Resp

ira

ció

n (

µm

ol

CO

2 m

-2 s

-1 )

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,024°C

30°C

y = -0.0075x3 + 0.2582x2 - 2.7689x + 12.093***

R2

=1

y = -0.0112x3 + 0.31x2 - 2.5199x + 8.6305*

R2

=1

Figura 4. Respiración oscura de plántulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas

(24 vs 30°C). Las ecuaciones presentan un comportamiento cúbico en el tiempo. * y ***

representan significancia con P≤0,05 y 0,001, respectivamente. Cada punto representa el

promedio de 12 valores.

Days of Exposition

4 8 12 16

Ba

lan

ce C

O2 (

µm

ol

CO

2 m

-2 s

-1 )

0

10

20

30

4024°C

30°C *

*

n.s n.s

Figura 5. Balance de CO2 de plántulas de arroz sometidas a dos temperaturas nocturnas (24

vs 30°C). n.s y * representan no significativo y significancia con P≤0,05, entre temperaturas

para un mismo día, según la prueba de Tukey. Cada barra de gráfico representa la medía de

doce valores+Error estándar.

Resultados 49

4.1.4 Eficiencia del fotosistema II y contenido de pigmentos fotosintéticos.

La eficiencia del PSII también fue menor en plántulas de arroz a 30°C entre los 4 y 8 DDE.

A los 16 DDE, plantas control tuvieron los menores valores de la relación Fv/Fm (Fig. 6).

A diferencia de la anterior variable, el contenido de clorofila total y carotenoides en hojas

de arroz mostró una respuesta lineal negativa en relación al tiempo en ambas condiciones

de temperatura. Por otra parte, el contenido de pigmentos fotosintéticos fue siempre menor

en plantas bajo 30°C en comparación con plantas sometidas a 24°C (Fig. 7).

DDE

4 8 12 16

Fv

/Fm

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,024°C

30°C

n.s n.s* *

Figura 6. Eficiencia máxima potencial del PSII (Fv/Fm) de plántulas de arroz sometidas a

dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). n.s y * representan no significativo y significancia

con P≤0,05, entre temperaturas para un mismo día según la prueba de Tukey. Cada barra de

gráfico representa la medía de doce valores+Error estándar.



DDE

4 8 12 16

Pig

men

tos

Fo

tosi

nte

tico

s (m

g g

-1 M

F)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0Chl 24°C

Chl 30°C

CAR (x+c) 24°C

CAR (x+c) 30°C

y = -0.0944x + 2.9788***

R2=0.94

y = -0.074x + 2.4484***

R2=0.92

y = -0.0345x + 1.0667***0.99

y = -0.0223x + 0.7387***

R2=0.84

Figura 7. Contenido de clorofila y carotenoides de plántulas de sometidas a dos

temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). Líneas con la letra L presentan un comportamiento

lineal (P≤0,001). Cada punto representa el promedio de 12 valores.

4.1.5 Peroxidación lipídica y contenido de prolina

La Peroxidación lipídica de hojas (representado como Contenido de MDA) de arroz

sometidas a 24 y 30°C no presentó diferencias significativas durante todo el ensayo. Sin

embargo, una disminución del contenido de MDA fue observada a los 16 DDE en ambas

temperaturas (Fig. 8A). Por otro lado, el contenido de Prolina presentó diferencias entre

tratamientos de temperaturas nocturnas en los días 12 y 16 (Fig. 8B). En general, un aumento

del contenido de este aminoácido fue mayor en las plantas expuestas a 30°C desde los 8

hasta los 16 DDE en comparación a las plantas control que mostraron una reducción en la

síntesis de este aminoácido en el mismo periodo de tiempo mencionado anteriormente.

Resultados 51

DDE

4 8 12 16

MD

A (

nm

ol

g-1

MF

)

0

5

10

15

20

25

24°C

30°C

4 8 12 16

Pro

lin

a (

µm

ol

g-1

MF

)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25A B

* *

n.s

n.sn.s

n.s

n.s

n.s

Figura 8. MDA(A) y contenido de Prolina (B) de plántulas de arroz sometidas a dos

temperaturas nocturnas (24 vs 30°C). n.s y * representan no significativo y significancia con

P≤0,05, entre temperaturas para un mismo día, según la prueba de Tukey. Cada barra del

gráfico representa la medía de doce valores+Error estándar.


ESTADO VEGETATIVO A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

4.2.1 Fotosíntesis, Eficiencia de la Carboxilación y Uso eficiente del Agua

La mayoría de las investigaciones reportan que la fotosíntesis es uno de los procesos más

sensibles a una alta temperatura (Sánchez-Reinoso et al., 2014). En este caso, una alta

temperatura nocturna (30°C) disminuyo la tasa fotosintética en todos los genotipos

evaluados (Fig. 9A). En general, la tasa de asimilación de CO2 se redujo entre un 35 y un

40% en las plantas de arroz expuestas a una temperatura nocturna de 30°C. Se presentó una

tendencia similar en la eficiencia de la carboxilación y en la eficiencia intrínseca del uso del

agua (WUEi) bajo las condiciones anteriormente descritas (Fig. 9B y D). El uso eficiente de

agua (WUEi), disminuyo, alrededor de un 75%, en comparación a las otras variables.

Finalmente, no se encontraron diferencias con respecto a la concentración interna de CO2

(Ci) (Fig. 9C).



Fo

tosí

nte

sis

(µm

ol

CO

2 m

-2 s

-1)

0

5

10

15

20

25

3024°C

30°C

Genotipo

F60

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

Ci

(µm

ol

mo

l-1)

0

100

200

300

400

500A

/Ci

(mo

l m

-2 s

-1)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Genotipo

F60

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

WU

Ei

(µm

ol

CO

2 2

m-2

cm

-1)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

A B

C D

*

** *

***

* *

*

*

*

*

*

**

*

*

n.s

Figura 9. Fotosíntesis (A), Eficiencia de la carboxilación (B), CO2 intercelular (C), y Uso

eficiente del agua intrínseco (D) de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y *

representan no significativo y significancia con P≤0,05, entre temperaturas para un mismo

día, según la prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticiones±Error

estandar.

4.2.2 Respiración

En el caso de la respiración total de las plantas, también se observaron diferencias entre

genotipos y temperaturas nocturnas (Fig. 10). En general, la tasa respiratoria fue mayor

cuando la temperatura nocturna se incrementó, especialmente en los genotipos CT19021,

FLO2764, IR1561, LV1401, y LV447. En este sentido, las plantas de ̍LV1401̍ presentaron

el mayor aumento (̴75%) en la tasa respiratoria. Por otro lado, las plantas de ̍F60̍ no

mostraron variación en esta variable entre las temperaturas nocturnas estudiadas, sugiriendo

una posible aclimatación de este material a esta condición ambiental estresante.

Resultados 53

Genotipo

F60

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

Res

pir

aci

ón

(g

CO

2 K

g-1

h-1

)

0

1

2

3

4

524°C

30°C

*

*

*

*

*

Figura 10. Respiración de hojas de plantas de seis genotipos de arroz. n.s y * representan

no significativo y significancia con P≤0,05, entre temperaturas para un mismo día, según la

prueba de Tukey. Los datos representan el promedio de 8 repeticiones±Error estándar.

4.2.3 Variables de Crecimiento

Se presentaron diferencias entre genotipos y temperaturas en las variables masa seca total,

masa seca de hojas, masa seca de tallos, área foliar y relación hojas/Tallo (Tabla 3). La alta

temperatura nocturna disminuyó el crecimiento de las plantas de arroz, expresado como una

menor acumulación de masa seca en hojas y tallos, como también, el área foliar. En este

aspecto, una reducción del 50 y 60% del área foliar y masa seca total fue observada bajo

una condición de 30°C. Con respecto a los genotipos, plántulas de ̍F60̍ fueron las que

presentaron mayor acumulación de masa seca y área foliar en comparación a los otros

materiales. Sin embargo, plántulas del genotipo LV 1401 tuvieron la mayor área foliar

específica.



Tabla 4. Variables de crecimiento de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos

diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30°C)

Parámetro

Masa

seca

Total

(mg)

Masa

seca

Hojas

(mg)

Masa

seca

Tallo

(mg)

Relación

Hojas/tallo

Área

foliar

(cm-2)

Masa

Foliar

especifica

(mg cm-1)

Genotipo

F60 521,23a z 281,55a 239,67 1,28a 61,08a 4,67bc

LV447 477,98ab 254,62ab 223,27 1,22a 57,51ab 4,45c

FLO2764 378,25b 201,39bc 176,85 1,22a 45,16bc 4,55bc

LV1401 361,62b 173,65c 187,96 1,04b 33,00c 5,22a

CT19021 395,17ab 210,79bc 184,38 1,24a 50,02ab 4,21c

IR1561 477,29ab 242,94ab 234,85 1,17ab 48,63abc 5,03ab

Significancia *** y *** N,S *** *** ***

Temperatura (°C)

24 620,36 307,04 313,31 0,99 66,64 4,74

30 254,15 152,72 111,43 1,36 33,64 5,66

Significancia *** *** *** *** *** N.S

Temperatura*Genotipo

Significancia N.S N.S N.S N.S N.S N.S

z Dentro de cada columna y para cada factor, Filas con letras diferentes indican diferencias

significativas según la prueba de Tukey (P≤0,05). y N.S. y *** representan no significativo y significativo a P≤0,001

4.2.4 Fluorescencia de la clorofila a

En las variables relacionadas con la fluorescencia de la clorofila, un periodo de exposición

a una temperatura nocturna de 30°C disminuyó la eficiencia máxima potencial del

fotosistema II (Fv/Fm), la fluorescencia máxima y mínima en condiciones de luminosidad

(Fm’ y Fo’) y la disipación fotoquímica en forma controlada (Y(NPQ)). Sin embargo, esta

condición de alta temperatura nocturna aumentó la disipación de energía en forma no

controlada (Y(NO)), la eficiencia máxima real del PSII (Y(II)) y la proporción de centros

de reacción abiertos (qL) (Tabla 4). En relación a los genotipos evaluados, FLO2764

presento la mayor Y(II), Fm’, Y(NO) y Fv/Fm. Finalmente, no se observaron diferencias en

la interacción genotipo vs temperatura nocturna.

Resultados 55

Tabla 5. Eficiencia máxima real y eficiencia máxima potencial y formas de disipación de la

energía del PSII en hojas de seis genotipos de arroz expuestos a dos diferentes temperaturas

nocturnas (24 vs 30°C)

Parámetro Y(II) Fm’ Fo’ qL Y(NPQ) Y(NO) Fv/Fm

Genotipo

F60 0,28ab z 761,23b 325,15 0,30 0,45ab 0,27ab 0,78b

LV447 0,26b 786,47ab 338,53 0,28 0,46a 0,27ab 0,78ab

FLO2764 0,32a 900,93a 350,20 0,31 0,40b 0,28ab 0,79ª

LV1401 0,30ab 814,06ab 326,69 0,31 0,42ab 0,26ab 0,79ª

CT19021 0,30ab 852,46ab 336,62 0,29 0,41ab 0,28a 0,78ab

IR1561 0,29ab 780,00ab 330,71 0,31 0,45ab 0,26b 0,79ab

Significancia * y * N.S N.S * * *

Temperatura (°C)

24 0,28 1112,46 454,90 0,27 0,46 0,26 0,79

30 0,31 571,23 235,11 0,32 0,41 0,28 0,78

Significancia *** *** *** *** *** *** ***


Significancia N.S N.S N.S N.S N.S N.S N.S

z Dentro de cada columna y para cada factor, filas con letras diferentes indican diferencias

significativas según la prueba de Tukey (P≤0,05). y N.S. y *** representan no significativo y significativo a P≤0,001

4.2.5 Fuga de electrolitos, MDA, Prolina y pigmentos fotosintéticos

Se presentaron diferencias en la interacción entre genotipo y temperatura nocturna en el

contenido de malondialdehído (MDA) y fuga de electrolitos en hojas de plántulas de arroz

(Fig. 11 A y B). Las plántulas de LV1401 bajo una temperatura de 30°C tuvieron la mayor

peroxidación lipídica de membranas. Se encontró una tendencia similar en la fuga de

electrolitos, con LV1401 con la mayor pérdida de electrolitos. Con respecto a las otras

variables bioquímicas, se observó que una alta temperatura nocturna incrementó el

contenido de carotenoides y clorofila, y disminuyó la relación clorofila/carotenoides. Por

otro lado, se encontraron diferencias en el contenido de clorofila b, clorofila total y la

relación clorofila a/b entre genotipos, siendo las plántulas de ̍FLO2764̍ las que presentaron

mayores valores (Tabla 5). Finalmente, no se encontraron diferencias en el contenido de

prolina entre genotipos, ni entre temperaturas.



Genotipo

F60

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

Per

did

a d

e E

lect

roli

tos

(%)

0

5

10

15

20

25

30

24°C

30°C

Genotipo

F60

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61M

DA

(n

mo

l g

-1 P

F)

0

10

20

30

40

50

60

70A B

Interaction: T x G* Interaction: T x G*

Figura 11. Perdida de electrolitos (A) y Producción de MDA (B) de hojas de plantas de seis

genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 8 repeticiones±Error. Asteriscos

significan diferencias significativas en la interacción de Temperatura (T) x Genotipo (G) a

P≤0,05 de acuerdo con el ANOVA.

Resultados 57

Tabla 6 Pigmentos fotosintéticos y Prolina de hojas de seis genotipos de arroz expuestos a

dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C)

Parámetro CAR

(mg g-1)

Chla

(mg g-1)

Chlb

(mg g-1)

Chl Total

(mg g-1) Chl a/b Chl/CAR

Prolina a

(µmol g-1)

Genotipo

F60 0,84 2,60 0,91ab z 3,46b 2,88b 4,34 0,22

LV447 0,98 3,31 1,08ab 4,40ab 3,05ab 4,73 0,25

FLO2764 1,09 3,80 1,14ab 4,78ab 3,43a 4,39 0,25

LV1401 0,78 2,77 0,90b 3,67ab 3,11ab 4,75 0,22

CT19021 1,10 3,98 1,41a 5,39a 2,90b 4,97 0,23

IR1561 0,98 3,07 1,01ab 4,08ab 3,04ab 4,22 0,29

Significancia N.S N.S * * * N.S N.S

Temperatura (°C)

24 0,85 3,0 1,015 3,99 3,03 4,77 0,22

30 1,10 3,5 1,15 4,66 3,03 4,30 0,26

Significancia ** y N.S N.S * N.S ** N.S

Genotipo*Temperatura

F60*24 0,81 2,60 0,93 3,53 2,83 4,50 0,19

F60*30 0,84 2,53 0,86 3,39 2,94 4,20 0,23

LV447*24 0,98 3,38 1,16 4,54 2,87 5,09 0,22

LV447*30 0,98 3,26 1,02 4,28 3,19 4,42 0,27

FLO2764*24 0,94 3,70 1,05 4,45 3,65 4,73 0,22

FLO2764*30 1,35 4,02 1,32 5,34 3,01 3,92 0,25

LV1401*24 0,66 2,40 0,76 3,16 3,17 4,85 0,19

LV1401*30 1,03 3,51 1,19 4,70 2,99 4,54 0,28

CT19021*24 1,01 3,85 1,41 5,25 2,84 5,18 0,22

CT19021*30 1,25 4,20 1,40 5,60 2,98 4,63 0,25

IR1561*24 0,71 2,30 0,76 3,06 3,04 4,36 0,28

IR1561*30 1,36 4,42 1,37 5,51 3,05 4,03 0,30

Significancia N.S N.S N.S N.S N.S N.S N.S a Prolina determinada por gramo de masa fresca.

z Dentro de cada columna y para cada factor, filas con letras diferentes indican diferencias

significativas según la prueba de Tukey (P≤0,05). y N.S. * y ** representan no significativo y significativo a P≤0,05 y 0,01 , respectivamente.



4.3 CARACTERIZACIÓN FISIOLOGICA DE SIETE GENOTIPOS DE ARROZ

SOMETIDOS A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

4.3.1 Componentes de rendimiento (Número de granos vanos, Número de granos

llenos, Porcentaje de fertilidad y masa de granos llenos por panícula)

En las variables N° total de granos, N° de granos llenos, N° de granos vanos y porcentaje de

fertilidad (Fig. 12) se encontraron diferencias significativas (P≤0,05) entre la interacción

Genotipo-Temperatura, mientras no hubo diferencias en la masa promedio del grano. Plantas

de 'F50' produjeron mayor número total de granos en comparación a los otros genotipos

sometidos a una temperatura nocturna de 30°C (Fig. 12A). En relación al número de granos

llenos, los genotipos F50, F60 y LV1401 tuvieron el mayor valor en ambas condiciones de

temperatura (24 y 30°C) (Fig. 12B). La mayoría de genotipos evaluados no presentaron

diferencias sobre el número de granos vanos, excepto plantas de arroz de CT19021 y 'F50'

que presentaron el mayor número de granos vanos a 30 y 24°C, respectivamente. Los

anteriores resultados son corroborados mediante el porcentaje de fertilidad, ya que esta

variable fue menor en plantas de 'F50' y 'CT19021' en las condiciones mencionadas (Fig.

12D).

Resultados 59

Genotipo

F60 F50

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

N°

Gra

no

s V

an

os/

pa

nic

ula

0

20

40

60

80

100

N°

Gra

no

s L

len

os/

pa

nic

ula

0

20

40

60

80

100

120

N°

Tota

l d

e g

ra

no

s/p

an

icu

la

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

24°C

30°C

A B

C

abcd

ab

a a

abcd

abc

bcdebcde

cde cdede

ee

e

a

a

bcd

bcd

b

bc

bcd

bcd

cd cdd ddd

abb

cdef

bcdef

bcdebc

f

def

a

def

b

defdef

f

Genotipo

F60 F50

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

Po

rcen

taje

de f

erti

lid

ad

0

20

40

60

80

100D

ab a

abcd

abcabc

aab abc ab

de

bcdabcd

e

cd

Figura 12. Efecto de dos temperaturas nocturnas (24 vs 30°C) sobre el número total de

granos (A), de granos llenos (B), de granos vanos (C) y porcentaje de fertilidad (D) en siete

genotipos de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticiones±Error. Barras con

letras distintas indican diferencias significativas a P≤0,05 según la prueba de Tukey.

Con respecto a la masa de granos llenos por panícula no se obtuvieron diferencias en la

interacción entre genotipos y temperaturas nocturnas. Sin embargo, se encontraron

diferencias por separado en los factores genotipo y temperatura (Fig. 13). Se pudo observar

que un incremento de la temperatura nocturna favoreció la masa de los granos llenos en

plantas de arroz (Fig. 13A). Por otro lado, los genotipos de arroz 'F50', 'F60' y 'LV1401'

presentaron la mayor masa de granos/panícula al final del experimento (Fig. 13B).



Genotipo

F60 F50

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61M

asa

de g

ra

no

s ll

en

os/

pa

nic

ula

(m

g)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Temperatura (°C)

24 30

Ma

sa d

e g

ra

no

s ll

en

os/

pa

nic

ula

(m

g)

0

500

1000

1500

2000a

ab

bc

dc

a

d

dc

a

b

Figura 13. Masa de granos llenos de panículas de arroz bajo dos temperaturas nocturnas

(A) y en siete genotipos (B). Los datos representan el promedio de 6 repeticiones±Error

estándar. Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P≤0,05 según la

prueba de Tukey.

4.3.2 Fluorescencia de la Clorofila a

Los índices relacionados con la disipación de la energía Y(II), Y(NPQ) y Y(NO) son

competitivos y la sumatoria de estos tres debe ser igual a uno (1). Es decir la disminución

en uno de los índices significa un aumento en alguno de los otros dos (Demmig-Adams

et al., 1996). En este aspecto, se observaron diferencias de estos índices entre genotipos (Fig.

14). El mayor rendimiento cuántico real Y(II) lo presentaron los genotipos 'IR 1561', 'F50',

'LV447' y 'FLO 2764' (Fig. 14A). Un efecto inverso se observó en la disipación no

fotoquímica controlada de la energía (Y(NPQ)) donde los mayores valores se presentaron

en los genotipos 'F50' y 'CT 19021' (Fig. 14B). Por otro lado, plantas del genotipo FLO 2764

fueron las que tuvieron una mayor disipación no controlada (Y(NO)) (Fig. 14C).

Finalmente, todos los genotipos presentaron un valor inferior al optimo (0,8) de la máxima

eficiencia del PSII (Fig. 14D), con 'CT19021' con el menor valor.

Resultados 61

Genotipo

F60 F50

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

Y(N

O)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Genotipo

F60 F50

LV44

7

FLO27

64

LV14

01

CT19

021

IR15

61

Fv

/Fm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Y(N

PQ

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Y(I

I)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5A B

C D

a

ab aba

bc

cd d

a

bb

abab ab ab

aa

bab ab abab

a ab

bcbcd

cdcd

d

Figura 14. Rendimiento cuántico real del fotosistema II (Y(II))(A), Disipación no

fotoquímica controlada (Y(NPQ))(B), Disipación no fotoquímica no controlada (Y(NO))(C)

y Rendimiento cuántico potencial del PSII (Fv/Fm)(D) de la hoja bandera de siete genotipos

de plantas de arroz. Los datos representan el promedio de 6 repeticiones±Error estándar.

Barras con letras distintas indican diferencias significativas a P≤0,05 según la prueba de

Tukey.

4.3.3 Pruebas bioquímicas (Pigmentos fotosintéticos, MDA y Prolina)

Se observaron solamente diferencias (P≤0,05) sobre el contenido de clorofilas y

carotenoides entre los diferentes genotipos estudiados (Tabla 6). En general, el contenido de

pigmentos fotosintéticos (clorofila a, b y carotenoides) fueron menores en plantas de 'F60'

en comparación a los demás genotipos. Cuando los pigmentos fotosintéticos fueron

estudiados mediante la relación clorofila/carotenoides, se pudo observar que plantas de arroz



del genotipo 'FLO2764' presentaron la mayor relación. Con respecto a la producción de

MDA, plantas de 'F60' también presentaron la menor Peroxidación lipídica de la hoja

bandera en comparación a los demás genotipos. Finalmente, no se obtuvieron diferencias

entre temperaturas ni entre genotipos en el contenido de prolina.

Tabla 7. Contenido de Pigmentos fotosínteticos (Clorofilas y Carotenoides),

Malondialdehído (MDA) y prolina en hojas banderas de siete genotipos de arroz expuestos

a dos diferentes temperaturas nocturnas (24 vs 30°C).

Parametro CAR

(mg g-1)

Chla

(mg g-1)

Chlb

(mg g-1)

Chl/CAR

(x+c)

MDAa

(nmol g-1)

Prolina

(µmol g-1)

Genotipo

F60 0,33cz 0,95b 0,38b 4,24b 32,11b 25,38

F50 0,75b 2,13ab 0,84ab 3,96b 40,81ab 38,64

LV447 1,16a 2,99a 1,10a 3,50b 78,17a 47,98

FLO2764 0,81ab 3,03a 1,30a 5,43a 66,14ab 40,99

LV1401 0,84ab 2,57ª 0,93a 4,13b 58,11ab 43,36

CT19021 0,84ab 2,43ª 0,99a 4,18b 67,04ab 58,67

IR1561 1,01ab 3,16ª 1,25a 4,34b 43,05ab 29,09

Significanciay * * * * * N,S

Temperatura (°C)

24 0,84 2,50 0,97 4,11 53,82 38,99

30 0,79 2,37 0,93 4,28 59,84 46,65




a MDA (Malondialdehido) y prolina determinados por gramo de masa fresca. z Dentro de cada columna y para cada factor, letras diferentes a continuación de las medias

indican diferencias significativas según la prueba de Tukey o ANOVA (P≤0,05). y N.S. y * representan no significativo y significativo a P≤0,05

Discusión 63

5. DISCUSIÓN

5.1 PRIMER EXPERIMENTO: PERIODOS DE ESTRÉS

La fotosíntesis (Pn) de las plantas es uno de los procesos fisiológicos más sensibles a las

altas temperaturas, tanto diurnas como nocturnas (Ashraf y Harris, 2013). En el presente

estudio, la tasa fotosintética disminuyó alrededor de un 15% por una alta temperatura

nocturna (30°C) a lo largo del experimento (Fig. 2). Mohammed et al. (2013) obtuvieron

resultados similares, donde temperaturas nocturnas de 30°C causaron una reducción

del ̴10% sobre la Pn de arroz. Esta reducción de la Pn, causada por ATN, puede deberse a

alteraciones tanto en la fase lumínica como en la fase de carboxilación del proceso

fotosintético. Con respecto a la fase lumínica, se ha reportado que periodos largos de altas

temperaturas nocturnas disminuyen el contenido de pigmentos fotosintéticos y la eficiencia

del PSII en arroz. En este ensayo, La alta temperatura nocturna provocó un daño leve en el

PSII lo que pudo producir una fotoinhibición, teniendo en cuenta que la relación Fv/Fm

disminuyo en los primeros 8 días (Fig. 6) y es la medida más usada para medir fotoinhibición

(Goh et al., 2012).

Asimismo, una menor asimilación de CO2 puede deberse al hecho que ATN causa

limitaciones asociadas al ciclo de Calvin (Song et al., 2013; Mohammed y Tarpley, 2014).

En este aspecto, se observó una menor eficiencia de carboxilación y una acumulación de

CO2 intercelular (Fig. 2D y 3). Durante todo el ensayo se presentó una menor tasa de

carboxilación (Fig. 3) y hacia el día 12 está pudo ser la principal causa de la disminución de

la tasa fotosintética, teniendo en cuenta que la relación Fv/Fm no disminuyo luego del día

12 en plantas sometidas a 30°C.

La menor eficiencia de carboxilación significa una menor capacidad de la Rubisco para fijar

CO2, provocando una mayor acumulación intercelular de este gas (Kiran et al., 2013). Esta

menor eficiencia de carboxilación pudo ser causada por la disminución de pigmentos

fotosintéticos y una menor actividad de la Rubisco activasa (Yamori et al., 2012; Yin et al.,

2010), ya que se ha reportado que la Rubisco activasa es más susceptible a la alta

temperatura que la Rubisco.

Un mecanismo que soporta la idea de que el principal factor que limita la fotosíntesis durante

una alta temperatura es un daño en el PSII y en la menor actividad de la Rubisco es una

reorganización en la membrana tilacoidal que hace que mayor número de unidades del

LHCII se asocien al PSI y no al PSII (Marutani et al., 2014; Pastenes y Horton, 1996;



Allakhverdiev et al., 2008), aumentando el flujo cíclico de electrones y disminuyendo la

tensión en el PSII. Esto ocurre mediante la fosforilación de las antenas LHCII lo cual

provoca que estos complejos se asocien al PSI y no al PSII (Shikanai, 2014; Goldschmidt-

Clermont y Bassi, 2015; Minagawa, 2011).

El hecho de que no haya una relación positiva entre el contenido de CO2 intercelular y la

conductancia estomática (Fig. 2) soporta la hipótesis de que la disminución de la tasa

fotosintética no se debe a un cierre estomático sino a una limitación no estomática: menor

eficiencia de la Carboxilación de la Rubisco provocada por un menor estado de activación

y daño en el PSII. lo cual también es reportado por (Kubien y Sage, 2008) en plantas de

tabaco sometidas a altas temperaturas.

Trabajos desarrollados por Mohammed y Tarpley, (2009b) mostraron que periodos largos

de ATN causaron una disminución de pigmentos fotosintéticos y relación Fv/Fm

repercutiendo negativamente en la Pn en plantas de arroz. Similares observaciones fueron

también obtenidas en el presente estudio donde una reducción del contenido de clorofilas y

carotenoides y una menor relación Fv/Fm fueron encontradas en plantas de arroz expuestas

a 30°C (Fig. 6). Lo anterior junto con la menor eficiencia de carboxilación pudo provocar la

menor capacidad de la Rubisco para fijar CO2, y en consecuencia se produjo una mayor

acumulación intercelular de CO2 (Kiran et al., 2013).

Con respecto a la Ro, está mostró un incremento alrededor del 50% en plántulas de arroz

sometidas a 30°C en comparación al control (24°C) principalmente a los 4 y 16 DDE (Fig.

4). Esta pérdida de carbono en forma de respiración también ha sido reportada por

Mohammed y Tarpley (2010b) y Zhang et al. (2013) donde muestran que temperaturas

nocturnas entre 30 y 32°C causaron un aumento aproximadamente del 50% de la Ro en

plantas de arroz. Este incremento de la respiración se puede deber a factores como un

aumento de la actividad de la Oxidasa alternativa con el fin de mantener el flujo de electrones

en la mitocondria y evitar estrés oxidativo (Plaxton y Podestá, 2006), sintetizar más ATP

para producir NAD+ (el cual es afectado negativamente bajo una alta temperatura) (Wahid

et al., 2007) y aumentar la síntesis y regeneración de proteínas (Lambers et al., 2008). Los

procesos descritos anteriormente tienen el propósito de reducir los efectos negativos

producidos por ATN (Plaxton y Podestá, 2006).

Por otro lado, el contenido de MDA no mostró diferencias entre las dos temperaturas

nocturnas (Fig. 8A). Sin embargo, estos resultados contrastan con otros estudios donde la

Peroxidación lipídica fue mayor cuando se incrementó la temperatura nocturna (Kumar

et al., 2011; Xue et al., 2012). Lo anterior permite inferir que una temperatura nocturna de

Discusión 65

30°C no causa un mayor daño de membranas a nivel celular en este cultivar de arroz

colombiano a pesar que la fotosíntesis y respiración sufran modificaciones. Esto es

reportado como una característica de tolerancia a altas temperaturas (Narayanan et al., 2016;

Bahuguna et al., 2015; Zhou et al., 2012), sin embargo es necesario comparar con otros

genotipos para corroborar dicha hipótesis.

Asimismo, otra respuesta bioquímica bajo condiciones de estrés térmico es la producción

de prolina (Sánchez-Reinoso et al., 2014). En nuestro estudio, la producción de prolina

mostró diferencias entre temperaturas nocturnas, observándose un aumento de este osmolito

en plántulas de arroz a 30°C a través del experimento (Fig. 8B). La mayor concentración de

prolina producida en plantas bajo un estrés térmico es reportado por otros autores como

Kumar et al. (2011): una temperatura superior a 35/30°C día/noche provoca un aumento en

plántulas de arroz y teniendo en cuenta que la alta temperatura redujo la eficiencia de PSII

(Fig. 6) y que (Yan et al., 2012; Vani et al., 2001b) reportan que esto se debe a un daño en

la sección donadora y aceptora de electrones. En estas condiciones, la prolina puede actuar

como un donador de electrones del PSII y como antioxidante evitando daños en el PSII (De

Ronde et al., 2004). Por lo anterior se puede inferir que la acumulación de prolina en

plántulas de arroz de 'F60' es una estrategia de aclimatación a la alta temperatura nocturna.

5.2 SEGUNDO Y TERCER EXPERIMENTO: RESPUESTA DE SIETE

GENOTIPOS DE ARROZ A UNA ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

El uso de genotipos tolerantes a altas temperaturas es una de las herramientas más efectivas

para mantener la estabilidad y altas producciones en el cultivo del arroz con el propósito de

mitigar los efectos negativos del cambio climático (Horie et al., 1996) Por tal motivo, es

importante identificar métodos o técnicas para determinar la tolerancia de genotipos (Zhang

et al., 2013). En consecuencia, varios autores han reportado que técnicas como los

parámetros de la fluorescencia de la clorofila (Sayed 2003; Šebela et al. 2015), la tasa de

respiratoria (Cheng et al., 2009; Mohammed et al., 2013), la acumulación de biomasa y

rendimiento (Zhang et al., 2013), pruebas bioquímicas (Sánchez-Reinoso et al. 2014) y la

fotosíntesis (Rodríguez et al., 2005) son importantes para conocer el grado de tolerancia o

susceptibilidad a condiciones de estrés abiótico. En este aspecto, en el presente estudio, se

observaron diferencias en algunas variables de crecimiento debido a la alta temperatura

nocturna (Tabla 3). La biomasa total de plantas de arroz sometidas a 30°C disminuyó

alrededor de un 60% con respecto a las plantas de 24°C de temperatura nocturna. Zhang

et al. (2013) también encontraron que una alta temperatura nocturna (ATN) reduce la

acumulación de biomasa debido a una menor tasa del crecimiento del cultivo. En general, la

tasa de producción de materia seca del arroz está condicionada por el balance entre



fotosíntesis y respiración nocturna (Cheng et al., 2009; Mohammed et al., 2013). Una ATN

reduce la tasa fotosintética, incrementa la respiración y puede afectar negativamente la

estabilidad de las membranas, causando una disminución en la biomasa (Peng et al., 2004).

En este sentido, los resultados obtenidos en el presente experimento pueden soportar las

anteriores afirmaciones donde una ATN disminuyo la fotosíntesis e incremento la

respiración (Fig. 9 y 10), disminuyendo la acumulación de biomasa de la planta. Por otro

lado, las diferencias en crecimiento entre genotipos puede deberse principalmente a

diferencias varietales, ya que el ANOVA no mostro un interacción entre genotipos y

temperatura nocturna (Zhang et al., 2013; Garcés-Varon y Restrepo-Díaz, 2015).

Con respecto a los parámetros de Fluorescencia de la clorofila a, una ATN (30°C)

disminuyó la eficiencia máxima potencial del PSII (Fv/Fm) cuando las hojas estaban en

estado vegetativo (Tabla 4). La relación Fv/Fm indica la máxima proporción de la energía

que la planta es capaz de usar en la fotosíntesis y generalmente disminuye bajo una

condición de estrés (Baker, 2008). Esta reducción es causada generalmente por un daño en

la proteína del PSII: D1 o en el sistema de reparación de esta proteína (Gururani et al.,

2015). Asimismo, un mayor qL fue observado en hojas de arroz sometidas a una ATN en

fase vegetativa, lo que significa una mayor capacidad de la planta para usar los productos

finales de la fotosíntesis (Lu y Zhang, 1999; Marutani et al., 2014). El aumento de este

índice al aumentar la temperatura nocturna puede ser una forma de aclimatación de la planta,

sugiriendo que las hojas desarrollan mecanismos para consumir los productos de la

fotoquímica (por ejemplo fotorespiración) con el fin de mantener el flujo de electrones y

evitar la fotoinhibición (Ort y Baker, 2002; D’Ambrosio et al., 2006). Por otro lado, la ATN

no provocó cambios en los parámetros de la fluorescencia de la clorofila a en la fase de

maduración. En este sentido estudios desarrollados por Mohammed y Tarpley (2014) y

Glaubitz et al. (2014) tampoco encontraron diferencias sobre estos índices cuando se

expusieron diferentes genotipos de arroz a altas temperaturas nocturnas (≥ 28°C).

Aunque no se encontraron diferencias entre temperaturas nocturnas, si se observaron entre

las hojas bandera de los genotipos en estado de maduración. Es importante señalar que el

índice Y(NO), el cual se ha definido como una forma no controlada y perjudicial de disipar

la energía (Brestic y Zivcak, 2013), mostró un incremento en el genotipo 'FLO

2764'(Y(NO)= 0,3) . Por lo anterior, Y(NO)estaría indicando que el genotipo 'FLO 2764'

pudo haber presentado ciertos daños en el PSII en las condiciones de la zona arrocera donde

se desarrolló la presente investigación en comparación a 'LV447' y 'F60' (Y(NO)= 0,25 y

0,24), respectivamente. La relación Fv/Fm de todos los genotipos fue menor al valor óptimo

reportado en la literatura (~0,8 (Murchie y Lawson, 2013; Baker, 2008)) en el experimento

de la fase de maduración. Sin embargo, un menor valor entre 0,7 y 0,8 no necesariamente

Discusión 67

significa un daño en el PSII debido a una condición estresante, sino puede ser propio del

genotipo o producto de la senescencia de la hoja (Lim et al., 2007; Panda y Sarkar, 2013).

La principal función de las clorofilas y carotenoides es recolectar y trasmitir la energía

lumínica para luego ser transformada en energía química (Taiz y Zeiger, 2006). Igualmente,

la concentración de estos pigmentos generalmente disminuye bajo una condición estresante

(Mohammed y Tarpley, 2009a) o durante la senescencia de la hoja (Hörtensteiner, 2006) .

El contenido de pigmentos fotosintéticos como carotenoides, clorofila total y clorofila b

aumentó en plantas sometidas a una ATN en el segundo experimento (Fase vegetativa)

(Tabla 3). El aumento del contenido de clorofilas es contrario a lo reportado en plantas de

arroz sometidas a altas temperaturas nocturnas Mohammed y Tarpley, (2009b). Sin

embargo, es importante analizar que la relación clorofila:carotenoides disminuyó a una

temperatura de 30°C. Según Camejo et al. (2005) y Wahid et al. (2007), una reducción de

esta relación es una respuesta de tolerancia por parte de la planta al estrés térmico.

Asimismo, la acumulación de carotenoides puede ser otro mecanismo de la planta para

reducir el estrés producido por la alta temperatura, ya que los carotenoides pueden disipar

la energía en forma de calor a través del ciclo de las xantofilas o actuar como antioxidantes

(Jahns y Holzwarth, 2012). Sin embargo, estas tendencias no se mantuvieron en la fase de

maduración entre temperatura y solo se presentaron diferencias entre los diferentes

genotipos evaluados. Dong et al. (2014) encontraron que la concentración de clorofila a y b

disminuyo cuando sometieron dos materiales de arroz a una alta temperatura nocturna

(28°C) y concluyeron que las diferencias pueden depender del momento en el que se

desarrolla la evaluación. En nuestro caso, las diferencias entre genotipos y la no

significancia entre temperaturas puede deberse al hecho que la evaluación de esta variable

fue desarrollada en estado avanzados de la etapa de maduración donde se presenta una

mayor senescencia de las hojas (Restrepo-Diaz y Garces-Varon, 2013).

En cuanto a los marcadores bioquímicos, resultados contrastantes fueron observados en la

producción de MDA entre los experimentos dos y tres. La producción de MDA fue mayor

en el genotipo LV 1401 cuando fue expuesto a una ATN en la fase vegetativa. Por otro lado,

las temperaturas no provocaron un aumento de la Peroxidación lipídica ni la producción de

prolina (osmolito involucrado en la homeostasis celular) en la fase de maduración. Esta

diferencia entre los resultados observados entre fases de desarrollo es debido también a la

senescencia, ya que la peroxidacion lipídica esta influenciada por la edad de la hoja (Zapata

et al., 2005). Los anteriores resultados permiten sugerir que la peróxidación lipídica y el

aumento de la permeabilidad de las membranas puede ser usadas para seleccionar genotipos

susceptibles a altas temperaturas en estado vegetativo del cultivo del arroz.



Una temperatura nocturna de 30°C disminuyo el porcentaje de fertilidad en plantas de 'F50'

alrededor de un 30% aproximadamente en comparación a los genotipos ̍F60̍, 'LV1401' y

'IR1561'(Fig. 12). Una posible explicación a las diferentes respuestas entre los genotipos

estudiados en este trabajo puede ser que las variedades presenten diferentes mecanismos de

aclimatación bajo esta condición de estrés (Jagadish et al., 2010). En este sentido,

Mohammed y Tarpley (2009a) argumentan que un alto número de espiguillas estériles puede

ser causado por un incremento de la respiración de mantenimiento en la etapa de

maduración, mientras que Shi et al. (2013) lo asocian con una reducción en la translocación

de nitrógeno y carbohidratos no estructurales desde las hojas y tallos hacía las panículas,

como también, una menor expresión de proteínas de choque térmico (del tipo FKBP),

proteínas de señalización de calcio (calmodulinas y quinasas) y mecanismos de reparación

o modificación de ADN y proteínas (especialmente en la etapa de maduración).

Teniendo en cuenta que la producción de todos los genotipos está asociada con el número

de granos llenos (Fig. 12 y 13) y que la masa promedio de grano no fue afectada por la alta

temperatura, se puede inferir que la disminución en la fertilidad del genotipo 'F50' y el

aumento en 'CT19021' está asociada con el proceso de polinización y viabilidad del polen y

no con el proceso de llenado del grano. Esto lo confirma Jagadish et al. (2015), quien afirma

que la alta temperatura disminuye la viabilidad del polen, el crecimiento del tubo polínico

y perjudica el desarrollo de los ovarios y que los genotipos que no presentan estas

características son tolerantes a altas temperaturas.

Con respecto a otro componente de rendimiento como es la masa de los granos llenos, las

variedades comerciales ('F50' y 'F60') y el genotipo LV1401 fueron los que mayor masa de

granos presentaron (Fig. 13.). Teniendo en cuenta lo anterior y que no se presentaron

diferencias en la masa del grano (datos no mostrados) los mayores rendimientos en estos

genotipos se debe a un mayor número de granos/panícula producidos, como también lo

enuncia Mohammed y Tarpley (2011).

Modelo Teórico 69

6. MODELO TEÓRICO DEL EFECTO DE LA

ALTA TEMPERATURA NOCTURNA

Con base a los resultados obtenidos y como una forma de conclusión general del presente

estudio de investigación, se generó un modelo o esquema conceptual del efecto de una alta

temperatura nocturna sobre la fisiología de una planta de arroz. Este modelo empieza

indicando que una alta temperatura nocturna (30°C) disminuyo el contenido de pigmentos

(Fig. 7 y Tabla 5), la capacidad del PSII y probablemente afecto negativamente la actividad

de la Rubisco activasa. Estos eventos provocan una menor asimilación de CO2 en la hoja

(Fig. 2 y 9). En cuanto a la respiración, la alta temperatura puede disminuir la vida media de

moléculas como proteínas y lípidos, lo que aumento la tasa metabólica y la necesidad de

regenerar dichas moléculas, lo cual requiere energía y dicha energía es suministrada por la

respiración. Esto provocó una mayor tasa respiratoria en la mayoría de los genotipos (Fig.

10). En este sentido, las alteraciones en la fotosíntesis y la respiración pueden causar a una

menor acumulación de carbohidratos que son usados en el crecimiento, lo cual también se

observó en el segundo experimento donde se evaluaron 6 genotipos y todos presentaron una

disminución en su crecimiento expresado como menor acumulación de masa seca y área

foliar (Tabla 3). Asimismo, la temperatura disminuyó la asimilación de CO2, sin embargo;

es poco probable que se deba a daños en el PSII, ya que no hubo una correlación entre Fv/Fm

Y(II) en general.

Por otro lado, la eficiencia de la carboxilación presentó un comportamiento similar a la

asimilación de CO2: constante en el tiempo y menor en plantas de F60 sometidas a 30°C

(Fig. 2A, 2B y 3), y menor en los 6 genotipos, en estado vegetativo, sometidos a una ATN

(Fig. 9A y 9B). Teniendo en cuenta lo anterior y que tampoco se encontró una relación

directa entre conductancia estomática y asimilación de CO2 se podría inferir que la menor

asimilación de CO2 se debe a una limitación en la capacidad de carboxilación de la RUbisCO

o en su activación y no a una disminución en la tasa de transporte de electrones o a un cierre

estomático.

Teniendo en cuenta las variables de fluorescencia y la asimilación de CO2 en los dos

primeros experimentos, se puede inferir que la distribución de la energía lumínica es la

siguiente: la energía destinada a la fotorespiración, reacción de Mehler o al flujo cíclico de

electrones aumenta (es necesario realizar otras investigaciones para determinar cuál de estos

procesos es el de mayor demanda de electrones en estas condiciones), mientras la destinada

a la fotosíntesis disminuye. Esto se comprueba con un aumento en la eficiencia operativa



del PSII (Y(II))(Tabla 4) acompañado por una disminución en la asimilación de CO2 (Fig.

9), lo que quiere decir que aumenta la energía lumínica usada en el transporte de electrones,

pero que la energía química producto de esta transporte de electrones no se está usando en

la asimilación de CO2 sino probablemente en la fotorespiración (Foyer et al., 2012; Murchie

y Lawson, 2013). Lo mismo sucede con la disipación en forma de calor (Y (NPQ)) que

disminuye con un aumento de la temperatura. Mientras aumenta la forma de disipación no

controlada, lo que podría indicar junto con lo nombrado anteriormente que el principal

mecanismo de disipación de la energía es la fotorespiración y que cuando no se puede disipar

de esta forma, dicha energía se disipa de forma no controlada, lo que podría ocasionar un

daño del aparato fotosintético.

En el caso del estado de maduración, no se presentaron los efectos provocados por las altas

temperaturas sobre las hojas en las plantas en estado vegetativo (Fig. 14 y Tabla 5). Sin

embargo, las variables reproductivas mostraron que el genotipo F50 es más susceptible a la

alta temperatura nocturna que los demás genotipos y los genotipos LV1401 y CT19021

presentan mayor tolerancia a la alta temperatura nocturna (Fig. 12). Finalmente, la Figura

15 resume el modelo teórico expuesto anteriormente:

Figura 15. Modelo conceptual de los efectos y las características de tolerancia y

susceptibilidad de arroz sometido a altas temperaturas nocturnas (30°C). Los símbolos

dentro de cada recuadro indican aumento (↑), disminución (↓) o sin cambios (=) del proceso

dentro del recuadro. El origen de la flecha roja indica las posibles causas de un proceso y el

final de la flecha roja indica el proceso afectado.

Conclusiones y Recomendaciones 71

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

7.1 Conclusiones

Periodos superiores a cuatro días de exposición a una ATN pueden causar

alteraciones en el balance de carbono en estado vegetativo y una disminución en los

componentes de rendimiento de la panícula.

El uso de variables fisiológicas como fotosíntesis, respiración, crecimiento de

órganos y contenidos de pigmentos fotosintéticos pueden ser consideradas como

marcadores de tolerancia o susceptibilidad en programas de mejoramiento genético

de arroz a una condición de ATN, especialmente, en etapas de desarrollo iniciales.

Los parámetros asociados a la fluorescencia de la clorofila, en general, no mostraron

utilidad para caracterizar tolerancia o susceptibilidad de genotipos a una ATN en una

etapa de maduración.

La determinación de MDA y fuga de electrolitos permite cuantificar susceptibilidad

de genotipos en etapas iniciales de la planta.

Los componentes de rendimiento de la panícula (fertilidad de la panícula y número

de granos vanos) mostraron ser un componente importante para la caracterización de

genotipos sometidos a un estrés por ATN en fase de maduración.

7.2 Recomendaciones

Evaluar el efecto de periodos de tiempo, de alta temperatura nocturna igual o

menores a dos días sobre la fisiología de plantas de arroz en estado vegetativo.

En una condición de alta temperatura nocturna, evaluar variables relacionadas con

la viabilidad del polen, tiempo de floración, características de las anteras y del

estigma de las líneas F60, F50 y CT19021, con el fin de conocer los mecanismos que

las hacen tolerantes y susceptibles a esta condición.

Determinar el efecto de la alta temperatura nocturna sobre la fotorespiración, además

de la fotosíntesis y variables de la fluorescencia, para tener un mayor entendimiento

sobre como la planta disipa la energía lumínica.



Evaluar el efecto de la alta temperatura nocturna sobre variables relacionadas con

fotosíntesis y con estrés oxidativo en otros estados de desarrollo de la planta como,

floración y embuchamiento.

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