Eficiencia de la Transgénesis Transitoria en Genotipos de

Tesina de Grado Licenciatura en Bioquímica – Montevideo, Uruguay 2020

INDICE

Eficiencia de la Transgénesis

Transitoria en Genotipos de

Soja Resistentes y

Susceptibles a Sequía

María Belén Listur

Tutora: Dra. María Martha Sainz

Co-tutor: Mag. Esteban Casaretto

Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Agronomía- UdelaR

Tesina de Grado de la Licenciatura en Bioquimica

Montevideo, Uruguay 2020

Tesina de Grado Licenciatura en Bioquímica – Montevideo, Uruguay 2020

AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos

A mi tutora Martita, por su guía, paciencia, disposición, y conocimiento brindado durante

este proceso de tesis.

A Mariana, por su ayuda con el microscopio, y su disposición a responder mis dudas.

A Esteban, por su disposición ante mis pedidos.

A Laura, por su flexibilidad y disposición.

A todos mis compañeros de laboratorio, por la buena onda y apoyo constante.

A mis amigos y compañeros de la FCien, por estos años de remarla siempre para un mismo

lado.

A mis amigas de toda la vida y a Cristian, por siempre apoyarme, confiar en mí, y darme

para adelante.

A mi familia, y en espacial a mis padres y hermano, por todo.

Tesina de Grado, Licenciatura en Bioquímica – Montevideo, Uruguay 2020 Tesina de Grado, Licenciatura en Bioquímica – Montevideo, Uruguay 2020 1

ÍNDICE

1. Índice…………………………………………………………………………………………….1

2. Resumen………………………………………………………………………………………..4

3. Introducción…………………………………………………………………….……………...6

3.1 Plantas Transgénicas……………………………………………….……………...6

3.1.1 Métodos Directos………………………….……………………………..7

3.1.1.1 Biolística……………………………………….………………..7

3.1.1.2 Electroporación…………………...………….………………..8

3.1.1.3 Sonicación………………………………………………………9

3.1.1.4 Liposomas………………………………………………………9

3.1.1.5 Microinyección………………………………………………..10

3.1.2 Métodos indirectos……………………………………………………...10

3.1.2.1 Vectores virales……………………………………………….10

3.1.2.2 Genero Agrobacterium………………………………………11

3.2 Transformación mediada por A. rhizogenes…………………………………..15

3.3 Transformación de soja…………………………………………………………...17

4. Objetivos……………………………………………………………………………………….21

4.1. Objetivo general……………………………………………………………………21

4.2. Objetivos específicos……………………………………………………………..21

5. Materiales y Métodos………………………………………………………………………...22

5.1. Material vegetal…………………………………………………………………….22

5.2. Cepa bacteriana…………………………………………………………………….22

5.3. Transformación de A. rhizogenes y selección de colonias………………..23

5.3.1. Transformación por electroporación………………………………..23


ÍNDICE

5.3.2. Confirmación de la presencia del vector binario…………………..23

5.3.3. Selección de la colonia efectiva………………………………………24

5.4. Transformación de soja mediada por A. rhizogenes………………………..26

5.4.1. Diseño experimental y análisis estadístico…………………………26

5.4.2. Cultivo de A. rhizogenes……………………………………………….27

5.4.3. Infección de las plántulas, aparición y crecimiento de hairy-

roots……………………………………………………………………………………….27

5.4.4. Identificación de raíces transgénicas……………………………….29

5.4.5. Cuantificación de la eficiencia de transformación………………..29

5.5. Extracción de ADN genómico de las hairy-roots…………………………....29

5.6. Amplificación por PCR de los genes rolB, virD, egfp.………………….…..30

5.7. Electroforesis de los productos de PCR en gel de agarosa……………….31

5.8. Análisis Western blot……………………………………………………………..32

5.8.1. Extracción y cuantificación de proteínas totales…………………32

5.8.2. SDS-PAGE………………………………………………………………..32

5.8.3. Transferencia de proteínas a membrana…………………………...33

5.8.4. Inmunodetección de GFP……………………………………………..33

5.9. Herramientas informáticas……………………………………………………....34

6. Resultados………………………………………………………………………………….....35

6.1. Agrobacterium rhizogenes………………………………………………………35

6.1.1. Verificación de la presencia del vector binario……………...……35

6.1.2. Selección de la colonia efectiva……………………………………..36

6.2. Soja…………………………………………………………………………………..37


ÍNDICE

6.2.1. Cinética del proceso de aparición de hairy-roots………………...37

6.2.2. Identificación de raíces transgénicas mediante microscopía…...42

6.2.3. Eficiencia de transformación…………………………………………44

6.2.4. Análisis Western blot para la confirmación de las raíces

transgénicas………………………………………………………………….…47

6.2.5. Análisis de la transformación mediante PCR (genes rolB, virD y

egfp)……………………………………………………………………………...49

7. Discusión……………………………………………………………………………………...51

7.1. Importancia de seleccionar la colonia efectiva. ………………………….…51

7.2. Análisis de la cinética del proceso de aparición de hairy-roots y su relación

con la eficiencia de transformación. ……………………………………………….53

7.3. Re-confirmación del material transgénico...………………………………….56

8. Conclusiones…………………………………………………………………………………60

9. Anexo……………………………………………………………………………………...…...61

10. Bibliografía……………………………………………………………………………...…...62

RESUMEN


2. Resumen

La soja es un cultivo de gran importancia en el Uruguay, siendo el principal cultivo

agrícola desde el año 2010. La generación de plantas transgénicas es una herramienta útil

para el estudio de dicho cultivo. La bacteria patógena Agrobacterium rhizogenes (A.

rhizogenes) tiene la capacidad de transferir e integrar en el genoma de su hospedero genes

contenidos dentro de su ADN de transferencia (ADN-T), que al expresarse inducen la

formación de raíces (hairy-roots). Debido a que sólo las secuencias borde del ADN-T son

requeridas para que la transferencia ocurra, se puede utilizar un sistema de vectores

binarios para introducir un gen(es) al genoma del hospedero. La transformación mediada

por A. rhizogenes es un tipo de transformación transitoria, donde se obtienen plantas

compuestas con la raíz transgénica y la parte aérea silvestre. En los ensayos de

transformación de soja es deseable que el genotipo a transformar comience a generar

raíces a los pocos días de la infección, que genere muchas hairy-roots y que tenga una alta

eficiencia de transformación. En particular, la cinética del proceso de aparición de las raíces,

que estaría relacionado con la susceptibilidad del genotipo a la transformación, no ha sido,

hasta el momento, caracterizado en detalle. En este trabajo nos propusimos poner a punto

la técnica de transformación mediada por A. rhizogenes en el genotipo de referencia para

la técnica (Thorne) y en dos genotipos de importancia agronómica (SO7_6557 y TJS2049).

Para los tres genotipos, se determinó la eficiencia de transformación y se analizó la cinética

de aparición de hairy-roots. La cepa K599 de A. rhizogenes fue transformada con el vector

pK7GWIWG2D(II),0 que contiene el gen reportero GFP. La infección se realizó por medio

de una herida en el hipocótilo de plántulas de 5 días, sobre la cual se colocó la bacteria.

Entre los días 8 y 18 post-infección se monitoreó la aparición de raíces con el fin de conocer

la cinética del proceso. Entre los días 15-18 se cortaron las hairy-roots originadas a partir

del sitio de infección y se identificaron las raíces positivas, transformadas, mediante

microscopía. Los resultados mostraron que la cinética del proceso de aparición de hairy-

roots presenta tres “etapas o fases”, pero no se encontraron diferencias significativas entre

genotipos en las variables analizadas. Por otro lado, tampoco se encontraron diferencias

significativas en la eficiencia de transformación de los genotipos. Por tanto, no se pudo

establecer una relación entre las variables evaluadas durante el análisis de la cinética de

aparición de raíces y las eficiencias de transformación.

RESUMEN


Palabras clave: transformación transitoria; soja; A. rhizogenes; hairy-roots

INTRODUCCIÓN


3. Introducción

3.1. Plantas transgénicas

El incremento constante de la población y urbanización han tenido como

consecuencia la pérdida de tierras de uso agrícola, el aumento en la demanda de recursos

alimentarios y de materias primas. Según la FAO (2018), para el año 2050 la población

mundial alcanzará los 9,7 mil millones, un 32% más que la población mundial en el 2015.

La urbanización continuará creciendo, y alrededor de dos tercios de la población mundial

será urbana. Para alimentar a esta población más grande y más urbana se necesitará

aumentar la producción y optimizar aspectos tecnológicos.

El mejoramiento de los cultivos para aumentar la producción se ha realizado a través

de selección por miles de años previo a la creación de los transgénicos.

Desafortunadamente, la selección y la cruza controlada de ejemplares con características

de interés solo ha podido resolver la demanda de manera parcial, por lo que se espera que

la implementación de herramientas y estrategias moleculares sumada a los métodos

empleados tradicionalmente, permita obtener plantas con una mayor productividad y

calidad y nuevos productos agrícolas (Quiroz-Chávez et al., 2012; Jhansi Rani and Usha,

2013).

Las plantas genéticamente modificadas o transgénicas se generan alterando el

genoma (introduciendo, eliminando o silenciando un gen o grupo de genes de interés)

utilizando la tecnología de ADN recombinante (Moeller and Wang, 2008). La transferencia

de genes deseados dirigida de un organismo a otro y la posterior integración estable y

expresión de dichos genes en el genoma se conoce como “transformación genética”. El gen

o los genes transferidos son conocidos como transgen(es). Estos pueden ser endógenos

modificados o genes foráneos aislado de grupos filogenéticos variados (Keshavareddy et

al., 2018).

El propósito de insertar un gen o una combinación de genes en una planta es hacerla

lo más útil y productiva posible. Este proceso proporciona ventajas como mejorar la vida

útil, mayor rendimiento, mejor calidad, resistencia a las plagas, resistencia a temperaturas

extremas y a la sequía, entre otras. Además, las plantas transgénicas se pueden emplear

INTRODUCCIÓN


con el fin de que expresen proteínas con fines terapéuticos y farmacéuticos (Cramer et al.,

1999; Beltrán, 2005; Jhansi Rani and Usha, 2013).

La generación de plantas transgénicas es un procedimiento complejo que consta de

varias etapas: primero se suministra ADN exógeno a la célula huésped; segundo, el ADN

exógeno se integra de manera estable en el genoma de la célula huésped dando como

resultado la expresión adecuada del gen; tercero, se regenera una planta transgénica viable

(Darbani et al., 2008).

A la hora de producir dichas plantas se deben tener en cuenta los siguientes

requisitos: un tejido diana con células competentes para la regeneración de la planta, un

método para introducir ADN exógeno en esas células con potencial de regeneración y, un

procedimiento para seleccionar y regenerar plantas transformadas con una frecuencia

satisfactoria. Por otra parte, es deseable que la técnica seleccionada sea simple, implicando

un mínimo número de manipulaciones, que genere transformantes estables y uniformes (no

quiméricos) para la propagación vegetativa de especies, y que permita obtener patrones de

integración simples y bajo número de copias, para minimizar el probabilidad de disrupción

genética no deseada en sitios de inserción o multicopia asociada al silenciamiento

transgénico (Keshavareddy et al., 2018).

Actualmente existen numerosos métodos de transformación disponibles,

desarrollados con el fin de transformar satisfactoriamente una amplia variedad de plantas.

Estos métodos se pueden dividir en dos grupos principales: directos e indirectos, de

acuerdo con el mecanismo utilizado para la transferencia del material genético hacia la

célula vegetal. Los métodos directos emplean procedimientos de naturaleza química,

fisicoquímica y mecánica (Rao et al., 2009; Granados and Chaparro-Giraldo, 2012). Los

métodos indirectos se basan en la utilización de vectores biológicos, empleando sus

características naturales de patogenicidad en plantas, para la introducción de los genes de

interés.

3.1.1. Métodos directos

3.1.1.1. Biolística

INTRODUCCIÓN


Esta técnica consiste en recubrir microportadores (partículas de oro o tungsteno de

0.5 - 5.0 µm; Sharma et al., 2005) con el ADN de interés mediante precipitación con cloruro

de calcio y espermidina (Kikkert et al., 2005). Luego, estas partículas son disparadas a

velocidades supersónicas hacia la célula blanco utilizando una pistola génica o equipo de

biolística. Una vez dentro de la célula, el ADN se eluye de los microportadores. Una fracción

de las moléculas de ADN podría alcanzar el núcleo e incorporarse de forma estable en un

cromosoma de la célula huésped. Por otro lado, el ADN puede permanecer extra

cromosómico en el núcleo y expresarse en forma transitoria (Kikkert et al., 2005).

La biolística ha sido utilizada con éxito en una amplia gama de especies vegetales

incluso en algunas recalcitrantes tanto a la transformación con Agrobacterium como a otros

métodos de transferencia directa (Kikkert et al., 2005; Barampuram and Zhang, 2011). Las

principales ventajas de este sistema es que es independiente de la especie y genotipo y

que no necesita vectores especializados para introducir el ADN, ya que pueden emplearse

construcciones de plásmidos circulares, lineales, o un cassette de expresión lineal

(Keshavareddy et al., 2018). Asimismo, esta estrategia se ha empleado, junto con la

microinyección, para la trasformación de cloroplastos (Maliga, 2004). La principal

desventaja del método es que da como resultado patrones de integración complejos con

múltiples copias o incluso concatémeros (repeticiones en tándem del transgen) en los sitios

de integración, pudiendo generar silenciamiento génico o variación en la expresión del

transgen (Darbani et al., 2008). Además, su uso está limitado por la capacidad de

regeneración del tejido que se bombardea y la eficiencia de la integración estable del ADN

(Stewart et al., 2011).

3.1.1.2. Electroporación

La electroporación consiste en aumentar la permeabilidad de las membranas

mediante un aumento significativo de la conductividad eléctrica causado por la aplicación

de un pulso eléctrico (Krassowska and Filev, 2007). Este pulso provoca la formación de

poros transitorios en las membranas que permiten el paso de macromoléculas, fuga de

iones, escape de metabolitos y mayor absorción de ADN por parte de las células

(Krassowska and Filev, 2007). La electroporación se lleva a cabo en un dispositivo llamado

electroporador, en el cual las células son tratadas con impulsos eléctricos controlados de

INTRODUCCIÓN


alto voltaje y pulsos cortos de duración de microsegundos a milisegundos, utilizando

campos entre los 200 V/cm hasta los 600 V/cm (Granados and Chaparro-Giraldo, 2012). La

absorción del ADN puede conducir a una expresión estable o transitoria del ADN (Stewart

et al., 2011). El método se aplicó originalmente a protoplastos de plantas monocotiledóneas

y dicotiledóneas y se ha aplicado también a células e incluso tejidos (Stewart et al., 2011).

3.1.1.3. Sonicación

Esta técnica, que se basa en el uso de ultrasonido con frecuencias superiores a 20

KHz (Yoon and Park, 2010), está diseñada para aumentar la permeabilidad de la membrana

plasmática de forma transitoria, para facilitar la absorción de ADN y otras macromoléculas.

El mecanismo por el cual ocurre la permeabilización de las membranas por la acción de

ultrasonido no se ha dilucidado por completo. Se cree que el mayor efecto de la sonicación

es debido a la cavitación acústica (Liu et al., 2006). Existen dos posibilidades que explican

cómo se aumenta la permeabilidad: primero debido al violento colapso de las burbujas de

cavitación, generando alta presión y ondas de choque a alta temperatura que posiblemente

podrían causar la ruptura localizada de la membrana plasmática y conducen a la absorción

de solutos exógenos seguidos de un restablecimiento de la integridad de la membrana. La

segunda posibilidad se origina en el modelo electromecánico presentado por Zimmermann

et al., (1974) que sugiere la existencia de una presión hidrostática crítica a la cual el

potencial intrínseco de la membrana es suficientemente alto para inducir la ruptura

mecánica de la membrana. Se ha reportado que el ultrasonido media la absorción de genes

en protoplastos de plantas, células en suspensión y tejidos (Liu et al., 2006).

3.1.1.4. Liposomas

Los liposomas son moléculas lipídicas circulares con un interior acuoso capaz de

transportar fragmentos de ADN y ARN. El modo por el cual el ADN ingresa a la célula aún

no está claro, si bien la fusión se acepta como el medio más probable de entrega (Gad et

al., 1990). Las células diana apropiadas para este tipo de transformación son los

protoplastos por su falta de pared celular (Gad et al., 1990). También se han logrado

INTRODUCCIÓN


transformar granos de polen y células con heridas en su membrana plasmática (Gad et al.,

1990). La transformación mediada por liposomas, a pesar de los bajos gastos y pocos

requisitos de equipamiento, está lejos de ser rutinaria debido a su laboriosidad y baja

eficiencia (Rao et al., 2009).

3.1.1.5. Microinyección

La técnica se basa en la introducción de ADN en el núcleo o en el citoplasma de las

células mediante el uso de una pipeta de inyección con capilar de vidrio (Morikawa and

Yamada, 1985). Requiere el uso de micro manipuladores, que constan de un microscopio

óptico y sus accesorios (Granados and Chaparro-Giraldo, 2012). Durante la introducción

del ADN, las células se inmovilizan en agar de bajo punto de fusión con una pipeta de

retención y de succión, y posteriormente el ADN se inyecta en el citoplasma o en el núcleo

(Barampuram and Zhang, 2011). En plantas esta técnica ha tenido poco éxito debido a las

gruesas paredes celulares y a la falta de disponibilidad de un sistema de regeneración de

célula a planta en la mayoría de las especies (Rao et al., 2009).

3.1.2. Métodos indirectos

3.1.2.1. Vectores virales

Esta técnica se basa en la introducción de un virus con un gen de interés quien, al

entrar a la planta huésped, se replicará y posteriormente la proteína de interés será

producida en cantidades significativas. Existen dos estrategias empleadas para la

construcción de vectores virales (Gleba et al., 2004, 2007). En la primera, llamada “virus

completo”, el suministro de amplicones se logra infectando al huésped con una partícula

viral madura o con una molécula de ADN/ARN que contiene una copia completa del vector

viral (Gleba et al., 2004). Esta estrategia tiene las siguientes desventajas: las inserciones

mayores a 1 Kb generalmente no se pueden expresar, la infección progresa a diferentes

velocidades y el vector suele ser inestable por lo que muchos tejidos infectados no expresan

la proteína de interés (Gleba et al., 2007). En la segunda estrategia, llamada “virus

deconstruido”, el virus es completamente reconstruido, eliminando o sustituyendo regiones

INTRODUCCIÓN


virales, manteniendo los elementos virales necesarios para la expresión eficiente, y

remplazando las funciones faltantes utilizando componentes no virales (Gleba et al., 2004,

2007). Las desventajas de este enfoque es que algunas maquinarias resultantes suelen ser

bastante ineficientes, que la capacidad del virus para moverse sistémicamente suele ser

específica de los tejidos y especies, y que se deteriora fácilmente debido a la manipulación

genética (Gleba et al., 2007). El uso de vectores da como resultado la expresión de

proteínas de forma transitoria, es decir, no forma un rasgo heredable ya que el gen no se

incorpora en el genoma de la planta (Gleba et al., 2007).

3.1.2.2. Género Agrobacterium

El género Agrobacterium es utilizado como mediador para la introducción de genes

de interés en plantas debido a su capacidad y eficiencia para infectar diversos organismos

vegetales (Hellens et al., 2000; Tzfira et al., 2004). La transformación mediada por

Agrobacterium marcó el inicio de la era modera de la biotecnología vegetal en 1983, cuando

tres grupos de investigadores obtuvieron plantas transformadas (Vasil, 2008). El género

Agrobacterium fue creado por Conn (1942) quien lo incluyó dentro de la familia

Rhizobiaceae junto con el género Rhizobium (Flores-Félix et al., 2019). En la actualidad, el

género contiene 14 especies, incluyendo las especies Agrobacterium rhizogenes (A.

rhizogenes) causante de la enfermedad de las raíces velludas y Agrobacterium tumefaciens

(A. tumefaciens) causante de la enfermedad agalla de la corona (Flores-Félix et al., 2019).

La infección por Agrobacterium en una planta es el resultado de un proceso de

evolución altamente especializado: la transferencia horizontal de genes desde bacterias

hacia plantas (Granados and Chaparro-Giraldo, 2012). Hasta la fecha, la comprensión

básica de los mecanismos moleculares de la transformación genética de plantas por los

miembros del género Agrobacterium se basa en extensos estudios realizados en A.

tumefaciens, si bien se considera que el proceso general de infección es similar entre A.

tumefaciens y A. rhizogenes (Veena and Taylor, 2007).

Los componentes genéticos portados por A. tumefaciens requeridos para la

transformación de plantas incluyen: 1) el ADN de transferencia (ADN-T), que se transfiere

a la célula vegetal, 2) la región de virulencia (vir) del plásmido inductor de tumores (Ti), 3)

los loci chvA, chvB y pscA, esenciales para el proceso de transferencia y cuya expresión es

INTRODUCCIÓN


constitutiva en contraste con la región vir (Ziemienowicz, 2014). El ADN-T se encuentra en

el plásmido Ti, y contiene dos tipos de genes: genes oncogénicos, que codifican enzimas

involucradas en la síntesis de auxinas y citoquininas (que causan la formación de tumores),

y genes involucrados en la producción de opinas (Barampuram and Zhang, 2011) (Figura

1). El ADN-T está flanqueado por dos repeticiones directas de 25 pb, llamadas borde

izquierdo (BI) y borde derecho (BD), que actúan como una señal de elemento cis para la

transferencia del ADN-T (Zupan et al., 2000) (Figura 1). Los genes vir se encuentran fuera

del ADN-T en el plásmido Ti (Figura 1). Estos genes están organizados en varios operones

(virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG y virH). Los otros operones necesarios para la

transformación (chvA, chvB y pscA) son cromosómicos (Ziemienowicz, 2014).

.

El mecanismo de transferencia de genes de A. tumefaciens a las células vegetales

implica varios pasos que incluyen: la colonización bacteriana, la inducción del sistema de

virulencia bacteriana, la generación del complejo de transferencia de ADN-T, la

transferencia del ADN-T y la integración del ADN-T en el genoma de la planta

(Ziemienowicz, 2014). Antes de iniciarse la transferencia, las bacterias se adhieren a las

Figura 1. Representación esquemática del plásmido

Ti. Se indican las secuencias borde, delimitando el

ADN-T y los genes que contiene (en rojo). Las regiones

restantes del plásmido (en gris) incluyen los genes vir,

los genes para el catabolismo de opina y el inicio de la

replicación (Adaptado de Heldt and Piechulla, 2011).

INTRODUCCIÓN


células vegetales dañadas gracias a la biosíntesis de un polisacárido extracelular

denominado polisacárido unipolar, fibras de celulosa y otros compuestos (Hwang et al.,

2017). El proceso de transferencia del ADN-T se inicia cuando Agrobacterium percibe

ciertos compuestos fenólicos y azúcares provenientes de las células vegetales heridas

(Winans, 1992; Bourret and Silversmith, 2010). Estos compuestos fenólicos sirven como

inductores (o co-inductores) de los genes vir (Gelvin, 2000). Las sustancias fenólicas como

la acetosiringona y compuestos relacionados se perciben a través de la proteína sensorial

VirA, que en coordinación con el transportador de monosacáridos ChvE, inducen la

autofosforilacion de VirA, que posteriormente activa mediante fosforliacion a la proteína

VirG (Gelvin, 2003; Krenek et al., 2015). Finalmente, la proteína VirG activada actúa como

factor de transcripción induciendo la transcripción de los genes vir (Krenek et al., 2015). La

expresión de los genes de virulencia conduce a la producción de un ADN-T monocatenario,

denominado cadena T, que luego se transporta a la célula huésped. Las proteínas VirD1 y

VirD2 tienen un papel esencial en este paso, al reconocer las secuencias BI y BD del ADN-

T y cortar los extremos de la hebra, gracias a su actividad endonucleasa (Gelvin, 2003).

Este proceso da como resultado la generación de moléculas de cadena T unidas

covalentemente a VirD2 en el extremo 5' del BD. Luego, la cadena T junto con varias

proteínas vir se exportan al citoplasma de la célula huésped a través del aparato de

exportación de tipo IV formado por VirD4 y varias proteínas VirB (Hwang et al., 2017). A

este conjunto formado por la cadena T, VirD2 y VirE2 se le conoce como complejo T (Gelvin,

2000). Las proteínas VirD2 y VirE2 contienen secuencias de localización nuclear activas en

la planta, las cuales se cree que están involucradas en la importación de ADN-T al núcleo

(Hwang et al., 2017); además, se sabe que hay varias proteínas vegetales que participan

con VirD2 y VirE2 en este proceso (Krenek et al., 2015). Luego, el complejo T ingresa al

núcleo celular mediante un mecanismo activo mediado por la maquinaria de importación

nuclear de la célula huésped (Barampuram and Zhang, 2011). Esto facilita la integración de

la cadena T en el genoma en posiciones aleatorias mediante un proceso de recombinación

no homóloga (Barampuram and Zhang, 2011).

A. tumefaciens es capaz de transformar numerosas células huésped, entre las que

se incluyen plantas dicotiledóneas y algunas especies de angiospermas monocotiledóneas

y gimnospermas (DeCleene and DeLey, 1976). Este método presenta varias ventajas sobre

otros métodos de transformación ya que es fácil de usar, relativamente económico y

INTRODUCCIÓN


generalmente da como resultado un bajo número de copias e inserciones de ADN (Travella

et al., 2005; Zhang et al., 2005; Gao et al., 2008). Sin embargo, muchas especies tales

como especies forestales utilizadas para la producción de madera, papel y pulpa no son

susceptibles a este tipo de transformación (Gelvin, 2003). Si bien en las últimas décadas se

ha avanzado en la tecnología de cultivo de tejidos y en la comprensión del mecanismo de

transferencia, la base molecular y genética para el rango de huéspedes de una cepa de

Agrobacterium dada sigue sin estar clara (Keshavareddy et al., 2018). Además, otros

factores tales como el vector plasmídico, composición del medio de cultivo, daño tisular,

supresión o eliminación de la infección por Agrobacterium después del co-cultivo, afectan

la transferencia e integración del ADN-T (Ziemienowicz, 2014).

Para utilizar A. tumefaciens como vector para generar plantas transgénicas, se

emplean cepas desarmadas, es decir, aquellas a las que se les ha eliminado los oncogenes

del ADN-T salvaje. El gen de interés y los marcadores de selección pueden introducirse

dentro del ADN-T del plasmido Ti, o colocarlos en un sistema vectores binarios. Debido a

que el plasmido Ti es grande y generalmente tiene un número de copias bajo, resulta difícil

su aislamiento y clonación (Gelvin, 2003; Hwang et al., 2017). Por este motivo se opta por

utilizar un sistema de vectores binarios, que consiste en introducir dentro de la cepa de

Agrobacterium un vector que contenga el gen de interés y el marcador de selección

flaqueado entre las secuencias BI y BD. Como los genes vir presentes en el plasmido Ti

actúan en trans reconociendo los BI y BD sin discriminar su naturaleza, no es necesario

que los genes de interés se encuentren dentro del ADN-T del plásmido bacteriano (Gelvin,

2003; Hwang et al., 2017).

Las estrategias de transformación mediadas por Agrobacterium se pueden dividir en

aquellas que requieren cultivo in vitro de tejidos y aquellas en las que la transformación

ocurre en plantas enteras (Keshavareddy et al., 2018). Las primeras se basan en la

selección de explantes adecuados, la inoculación de éstos con Agrobacterium, el co-cultivo

explante-Agrobacterium, la posterior eliminación de la bacteria, la selección de los

explantes transformados y por último la posterior regeneración a planta completa (Charity

et al., 2005; Hiei and Komari, 2006). La transformación de plantas enteras es un método

alternativo, que tiene como ventajas una menor mano de obra, un período de tiempo más

corto, menores posibilidades de contaminación y variación somaclonal (Hwang et al., 2017;

Keshavareddy et al., 2018). Enfoques como la agroinfiltración (Wroblewski et al., 2005;

INTRODUCCIÓN


Tague and Mantis, 2006) y la inmersión floral emplean esta estrategia (Clough and Bent,

1998).

3.2. Transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes

A. rhizogenes se identificó por primera vez hace más de 70 años como el agente

causante de la enfermedad de la raíz velluda, o también conocida por su sigla en inglés

hairy-root (Hildebrand, 1939). Es una bacteria Gram negativa en forma de bastón, no

esporulada, que puede presentarse individualmente o en pares y que es móvil por medio

de uno a seis flagelos peritricos (Ozyigit et al., 2013). Todas las cepas de A. rhizogenes se

caracterizan por la presencia del plásmido inductor de raíces (Ri) (Gelvin, 2003; Veena and

Taylor, 2007), cuyo ADN-T contiene los oncogenes rol, implicados en el inicio y desarrollo

de la enfermedad, y genes esenciales para la biosíntesis de opinas (Hansen et al., 1994).

Las hairy-roots son órganos completamente funcionales que se caracterizan por un

crecimiento plagiotrópico, un alto grado de ramificación lateral y una profusión de pelos

radiculares (Balandrin et al.,1985; Flores et al.,1999). Una de las características importantes

de las raíces inducidas por A. rhizogenes es su capacidad para crecer in vitro en ausencia

de fitohormonas (Rao and Ravishankar, 2002).

El rango de hospederos naturales de A. rhizogenes parece estar restringido a un

número bajo de especies de plantas como manzana, pepino, tomate o melón. No obstante,

bajo condiciones de laboratorio más de 450 especies diferentes de plantas pueden ser

susceptibles a la infección por A. rhizogenes (Porter and Flores, 1991), incluida una amplia

gama de dicotiledóneas y familias de plantas monocotiledóneas (DeCleene and DeLey,

1981; Tepfer et al., 1989) y algunas gimnospermas (Diouf et al., 1995; Yibrah et al., 1996).

Distintos tejidos y órganos vegetales como el hipocótilo, la hoja, el tallo, el pecíolo, el

cotiledón, entre otros, han demostrado ser susceptibles a la infección y transformación por

A. rhizogenes, con la producción resultante de hairy-roots (Mugnier, 1988; Królicka et al.,

2001; Jualang Azlan et al., 2002). Cabe señalar que las respuestas varían dependiendo de

la cepa de A. rhizogenes que se utilice (ya que cada una cuenta con un rango de

hospederos), su interacción con la especie vegetal y el tipo de tejido (Veena and Taylor,

2007; Bahramnejad et al., 2019).

INTRODUCCIÓN


El mecanismo por el cual se generan las hairy-roots puede dividirse en cuatro pasos:

1) activación del sistema de virulencia bacteriano, 2) procesamiento del ADN-T, 3)

movimiento del ADN-T desde la bacteria a la célula hospedera, 4) inducción de la formación

y crecimiento de la raíz (Veena and Taylor, 2007). Se conoce que los primeros tres

mecanismos son muy similares a los de A. tumefaciens debido al alto grado de homología

entre los plásmidos Ri y Ti (Ozyigit et al., 2013). Sin embargo, el mecanismo por el cual se

forman las hairy-roots no está completamente dilucidado hasta el momento (Veena and

Taylor, 2007). Diversos estudios han evidenciado que los genes rol presentes en el ADN-T

(Figura 2) son los responsables de los rasgos característicos de las raíces transformadas,

como el rápido crecimiento plagiotrópico con un aumento de la ramificación lateral y el

crecimiento independiente de fitohormonas (Bahramnejad et al., 2019). Se presume que los

genes rol alteran las características fisiológicas y bioquímicas de las plantas al alterar la

percepción hormonal (Bahramnejad et al., 2019). Algunas cepas contienen además en el

ADN-T genes que están involucrados en la biosíntesis de auxina. Se ha propuesto que

estos genes proporcionan las auxinas necesarias para que los genes rol induzcan la

formación de raíces (Cardarelli et al., 1985), y que además serían necesarios para extender

el rango de hospedadores de la bacteria (Ozyigit et al., 2013).

Al igual que A. tumefaciens, A rhizogenes puede ser empleado como vector

biológico para introducir genes exógenos en células vegetales. El plásmido Ri se emplea

sin eliminar los oncogenes específicos del ADN-T cuando se quiere inducir las hairy-roots

(Bahramnejad et al., 2019). La introducción de un vector binario en una cepa de A.

Figura 2. Componentes del ADN-T de la cepa K599 de A. rhizogenes. Se

indican los oncogenes rolA, rolB, rolC y rolE, marcos de lectura abiertos (orf)

y el gen implicado en la síntesis de cucumopina (cus) (Adaptado de Xiang et

al., 2016).

INTRODUCCIÓN


rhizogenes que porta un plásmido Ri eventualmente conducirá a la co-transformación de la

planta huésped con el ADN-T de ambos vectores, es decir, el ADN-T del plásmido Ri y el

ADN-T del vector binario, dando como resultado hairy-roots que pueden o no contener el

transgen (Cho et al., 2000).

Las hairy-roots son una gran herramienta ya que se pueden utilizar para determinar

el patrón de expresión de promotores (Isayenkov et al., 2005), localización subcelular de

proteínas (Marjamaa et al., 2006), inducir silenciamiento de genes (Robert et al., 2018),

estudiar interacciones raíces-rizobios (Estrada-Navarrete et al., 2006), raíces-hongos

(Mugnier, 1988) y nemátodos (Morriss et al., 2017). Además de sus usos en investigación,

son empleadas para producción de metabolitos secundarios (Georgiev et al., 2012) y

fitorremediación (Guillon et al., 2006).

3.3. Transformación de soja

La soja [Glycine max (L.) Merrill] es, a nivel mundial, el principal cultivo económico

de semillas oleaginosas (Manavalan et al., 2009). Este cultivo se emplea para diversos

usos, como alimenticios, nutricionales, industriales y farmacéuticos. Las semillas de soja

contienen aproximadamente 40% de proteína y 20% de aceite en base seca (Manavalan et

al., 2009; Yamada et al., 2011). Además, son una fuente de macronutrientes, minerales,

metabolitos secundarios tales como isoflavonas (Sakai and Kogiso, 2008), saponinas, ácido

fítico, oligosacáridos (Liener, 1994) y fitoestrógenos (Ososki and Kennelly, 2003). En

nuestro país es el principal cultivo agrícola desde el año 2010; su área de cultivo ha crecido

constantemente en los últimos años situándose, actualmente, en más de un millón de

hectáreas (DIEA 2016).

Existen genotipos de soja que, por selección, mejoramiento y/o transformación

genética, presentan características específicas como resistencia a herbicidas, a plagas o

con una respuesta diferencial al déficit hídrico. En particular, en nuestro laboratorio se han

caracterizado genotipos que presentan una respuesta rápida a dicho estrés a los que

llamamos “susceptibles” y genotipos que responden de forma más lenta cuando se

encuentran en una condición de déficit hídrico a los que llamamos “resistentes”. La

diferencia entre los genotipos en la respuesta implica que, frente a una condición de déficit

hídrico, aquel de respuesta lenta no presenta a nivel metabólico y/o fisiológico cambios

INTRODUCCIÓN


fenotípicos evidentes que indiquen una percepción clara del estrés en las primeras etapas

de imposición del mismo; por el contrario, aquel de respuesta rápida presenta, en esa

misma situación de estrés, cambios que evidencian una respuesta a esa condición de déficit

hídrico.

Debido a su importancia, durante la última década la soja modificada genéticamente

ha seguido siendo el cultivo biotecnológico más comercializado (Jia et al., 2015). A nivel

internacional se han desarrollado bases de datos con una gran disponibilidad de

información genómica y transcriptómica. Su genoma se encuentra completamente

secuenciado, anotado y disponible en bases de datos tales como: Phytozome, SoyKb y

Soybase (http://phytozome.org/; http://soykb.org/; http://soybase.org/). Además, se han

desarrollado varios recursos entre los que se encuentran una base de datos de secuencias

nucleotídicas expresadas (ESTs, de “expressed sequence tags”), de ADN copia de longitud

completa y de microarreglos de ADN copia (Stacey et al., 2008; Umezawa et al., 2008).

Estos recursos brindan una variedad de oportunidades para el mejoramiento de la soja

mediante distintos enfoques genéticos.

La transformación genética de la soja ha sido un desafío debido a la variabilidad

genética de los cultivares, a las diferencias en sus respuestas al cultivo in vitro y a

procedimientos de transformación (Droste et al., 2000). Los métodos que han resultado ser

más exitosos para la generación de plantas transformadas de forma estable son el

bombardeo de partículas donde se utilizan embriones somáticos inducidos a partir de

cotiledones inmaduros y la transformación mediante A. tumefaciens donde se emplean

mayormente explantes de nodos cotiledonarios de plántulas jóvenes y semillas maduras

embebidas (Yamada et al., 2011). Sin embargo, estas técnicas de transformación requieren

de un intenso trabajo y son demasiado ineficiente para ser utilizadas a gran escala.

Cuando se está trabajando en biología de raíz, ya sea estudiando la función de

genes relacionados a ella, con interacciones simbióticas y patogénicas, con absorción de

nutrientes o transporte de hormonas, se puede hacer uso de la transformación mediada por

A. rhizogenes (Kereszt et al., 2007). Para este tipo de abordaje se utiliza el "sistema de

plantas compuestas" que fue desarrollado por Hansen et al., (1989) y que consiste en la

obtención de una planta con la parte aérea salvaje y con las raíces transgénicas (Collier et

al., 2005). Una de las ventajas más importante de esta técnica es la capacidad de generar

información a nivel de toda la planta, en comparación con raíces crecidas en cultivos in

http://soybase.org/

INTRODUCCIÓN


vitro, lo cual permite realizar un análisis funcional. Las plantas compuestas generadas de

esta manera se pueden trasplantar y cultivar con éxito en el suelo o en hidroponia, según

se desee. Al eliminar el componente de cultivo de tejidos, que sí requiere la transformación

vía A. tumefaciens, el método se simplifica enormemente en cuanto a costos e

infraestructura requerida. Además, este sistema reduce significativamente el tiempo

necesario para generar raíces genéticamente transformadas de varios meses a pocas

semanas, si se lo compara con la generación de plantas transgénicas mediada por A.

tumefaciens (Veena and Taylor, 2007).

El método consiste en generar una herida en el nodo cotiledonario y/o en la región

proximal del hipocótilo y, posteriormente, colocar sobre dicha herida alguna cepa

hipervirulenta de A. rhizogenes transformada previamente con la construcción de interés.

En particular, la cepa K599 ha demostrado ser muy efectiva en la generación de hairy-roots

en soja (Savka et al., 1990). Después de 2-3 semanas de la infección, cuando las hairy-

roots se han desarrollado a partir del sitio de infección y alcanzado una longitud de 5-10

cm, la raíz principal de la planta se elimina cortando el hipocótilo justo por debajo del sitio

de infección y las plantas compuestas pueden utilizarse para realizar los análisis deseados

(Kereszt et al., 2007). Hay dos aspectos metodológicos del proceso antes mencionado que

son muy relevantes si se quiere lograr una alta eficiencia de transformación. Uno es que las

plántulas a infectar presenten los cotiledones verdes y sin separar y el otro es mantener

durante el período de generación de las hairy-roots niveles altos de humedad (al menos

85%) en el sitio de infección (Kereszt et al. 2007).

De todas formas, aún teniendo el protocolo de transformación optimizado, se ha

visto que la eficiencia de transformación es muy variable y dependiente de factores

biológicos tales como el genotipo de soja a transformar (Savka et al., 1990; Cho et al., 2000)

y la virulencia de la cepa de A. rhizogenes empleada (Savka et al., 1990; Ozyigit et al.,

2013), pero también de otros factores como la experiencia del usuario que lleva a cabo el

protocolo. En este sistema, hay tres características que son deseables encontrar en el

genotipo a transformar: 1) que la generación de hairy-roots comience pocos días después

de la infección (que redunda en ensayos más cortos y menor requerimiento de espacio); 2)

que genere muchas hairy-roots (que implica la obtención de mayor cantidad de material

potencialmente transgénico); 3) que presente una alta eficiencia de transformación (que es

lo que finalmente determina la cantidad de material transgénico con el cual realizar los

INTRODUCCIÓN


estudios posteriores deseados). A pesar de esto, no es común encontrar genotipos que

cumplan con todas estas características (Cao et al., 2009). Además, la cinética del proceso

de aparición de las raíces, que podría estar relacionado con la susceptibilidad del genotipo

a la transformación, no ha sido, hasta el momento, caracterizado en detalle, así como

tampoco su relación con la eficiencia de transformación. Este aspecto fue de especial

interés en este trabajo de tesis ya que se buscó conocer dicha cinética y evaluar su posible

relación con la eficiencia de transformación en los distintos genotipos ensayados.


OBJETIVOS

4. Objetivos

4.1. Objetivo general

Evaluar la eficiencia de transformación de genotipos de soja por medio de

Agrobacterium rhizogenes.

4.2. Objetivos específicos

- Poner a punto la técnica de transformación transitoria en el genotipo de soja de

referencia para esta técnica.

- Obtener plantas transformadas de otros dos genotipos de soja de interés para el

laboratorio.

- Analizar la cinética de aparición de hairy-roots en los tres genotipos y evaluar su

relación con la eficiencia de la transformación.


MATERIALES Y MÉTODOS

5. Materiales y Métodos

5.1. Material vegetal

Se trabajó con dos genotipos de soja con respuesta contrastante a sequía, el S07-

6557, tolerante, y el TJS049, susceptible (cedidos por Sergio Ceretta-INIA La Estanzuela),

de interés para el laboratorio, y con el genotipo Thorne, que es el modelo para la

transformación transitoria mediada por A. rhizogenes (McBlain et al., 2003).

5.2. Cepa bacteriana

Se utilizó la cepa hipervirulenta K599 de A. rhizogenes (NCPPB2659), la cual

contiene el plásmido RI 2659 de tipo cucumopina (Xiang et al., 2016) y resistencia a

espectinomicina 30 µg/µL (Sm/SpR). La cepa fue proporcionada por el Dr. Germán Robert

del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Córdoba, Argentina.

Esta cepa fue transformada con el vector binario pK7GWIWG2D(II),0 (Figura 3) que

presenta dos marcadores de selección: Sm/SpR para la selección en bacterias (100 µg/µL

en Agrobacterium y 50 µg/µL en E.coli), y el gen de resistencia a kanamicina (Kan) para la

selección en el tejido vegetal y, además, contiene como gen reportero a la proteína verde

fluorescente GFP.

Figura 3. Esquema del vector pk7GWIWG2D(II),0. Se indican las regiones comprendidas en el ADN-T y

el gen de resistencia a espectinomicina para la selección en bacteria (Sm/SpR). La imagen fue extraída del

Software SnapGene.



5.3. Transformación de A. rhizogenes y selección de colonias

5.3.1. Transformación por electroporación

La transformación se realizó con un electroporador modular (The Gene Pulser

Xcell™, Biorad), usando el programa “Agrobacterium” de dicho equipo. Se partió de una

alícuota de 50 µl de células competentes de la cepa K599 de A. rhizogenes a la cual se

adicionó 1 µl de ADN plasmídico (vector pK7GWIWG2D(II),0) con una concentración de

142,8 ng/µL. Se colocó la muestra dentro de la cubeta del electroporador (0,1 cm) y se

generó un impulso eléctrico a 2,4 Kvolt, 200 Ω y 25 µf. Inmediatamente después se adicionó

200 µL de medio SOC (Tabla 1), y se incubaron las células durante 4 h a 28 °C.

Seguidamente, las células se plaquearon en medio Luria-Bertani (LB)-agar (Tabla 2) con

100 µg/µL Sm/Sp, y se incubaron durante 48 h a 28°C.

5.3.2. Confirmación de la presencia del vector binario

Previo a la transformación de las plantas, se verificó la presencia del vector binario

en 10 colonias presuntamente transformadas mediante PCR de colonia empleando los

cebadores para amplificar el gen egfp (Tabla 3). Se utilizó el termociclador Senso Quenst

Nutriente Concentración

Triptona 2%

Extracto de

levadura

0,5%

NaCl 10 mM

KCl 2,5 mM

MgCl2 10 mM

MgSO4 10mM

Glucosa 20 mM

Nutriente Concentración (g/L)

Triptona 10

Extracto de levadura 5

Cloruro de sodio 5

Tabla 1. Composición del medio SOC.

Tabla 2. Composición del medio LB.



modelo Labcycler.

El mix de PCR empleado se muestra en la Tabla 4 y el programa del termociclador

en la Tabla 5. El molde de la reacción se preparó resuspendiendo una parte de cada colonia

en 20 µL hidróxido de sodio 20 mM durante 10 min a temperatura ambiente. De esta

preparación se utilizaron 2 µL por reacción.

5.3.3. Selección de la colonia efectiva

Las colonias que contenían la construcción se repicaron en placas LB-agar con 100

µg/µL Sm/Sp y se incubaron durante 24 h a 28 °C. El césped de células obtenido se colectó

Nombre Secuencia (5’→ 3’) Tm (°C) Tamaño del Fragmento (pb)

eGFP Fwd CTCGATGTTGTGGCGGATCT 60,5 535

eGFP Rev ATTATCCTCGGCCGACATGG 60,5

Componentes Concentración

Taq Buffer 1X

MgCl2 2 mM

dNTPs 0,12 mM

Taq (Thermo Scientific; #EP041)

0,06 U/µL

Cebador Fwd 0,12 µM

Cebador rev 0,12 µM

Fase Temperatura (ºC) Tiempo (seg) Ciclos

Desnaturalización Inicial 94 180 1

Desnaturalización 94 40 25

Hibridación 53 30

Extensión 72 40

Extensión final 72 120 1

Tabla 3. Oligonucleótidos usados para confirmar le presencia del vector binario en las colonias de A.

rhizogenes. Fwd: cebador sentido; Rev: cebador antisentido.

.

Tabla 4. Mix de PCR.

Tabla 5. Programa del termociclador.



en un microtubo y se resuspendió en 50 µL de agua ultra pura estéril hasta formar una

“pasta” homogénea.

Se utilizaron 6 cotiledones por colonia para seleccionar la colonia efectiva. Los

cotiledones se obtuvieron de plántulas de 5 días del genotipo Thorne (Figura 4: a). Estos

fueron colocados sobre una placa de Petri y se esterilizaron superficialmente con etanol

70% con la finalidad de bajar la carga microbiana que pudieran tener (Figura 4: b). Luego,

con una jeringa de 1 mL se pincharon los cotiledones en la cara abaxial (Figura 4: c) y se

colocó “pasta” bacteriana sobre las heridas (Figura 4: d). Por último, los cotiledones se

colocaron en placas de Petri con agar/agua al 0,8% con el lado abaxial hacia arriba (Figura

4: e) y se colocaron en cámara de crecimiento con un fotoperíodo de 16/8 h (luz/oscuridad),

con 25/18 oC (día/noche) y una radiación de 800 µmol de fotones·m-2·seg-1. El experimento

se monitoreó cada 5 días, observando la aparición de callos y raíces, hasta el día 15. La

colonia seleccionada fue la que más hairy roots generó. A partir de ella se obtuvieron

gliceroles que se almacenaron en alícuotas de 100 µL a -80 ºC hasta su uso.

Figura 4. Etapas del proceso de transformación de cotiledones

para la selección de la colonia efectiva. Se muestran las distintas

etapas del proceso de transformación. a) Escisión del cotiledón con

una pinza previamente esterilizada. b) Esterilización superficial con

etanol 70%. c) Generación de heridas mediante pinchazos en la cara

abaxial del cotiledón. d) Colocación de la pasta bacteriana sobre las

heridas. e) Los seis cotiledones empleados por colonia colocados en

placas con medio agar-agua al 0,8%.



5.4. Transformación de soja mediada por A. rhizogenes

Se siguió la metodología descripta en Kereszt et al., 2007 con algunas modificaciones en

cuanto al cultivo de la bacteria y al crecimiento de las plantas, que se detallan en las

secciones 5.4.2. y 5.4.3., respectivamente.

5.4.1. Diseño experimental y análisis estadístico

El experimento se realizó en tres ensayos. Cada ensayo es considerado un

ambiente. En cada uno de estos ambientes se evaluaron los siguientes genotipos de soja:

Thorne, SO7-6557, TJS2049 bajo un diseño completamente al azar con 10 repeticiones por

genotipo. En cada ensayo se sembraron 48 semillas por genotipo en bandejas de 31x15x10

cm utilizando como sustrato vermiculita. Las bandejas se colocaron en la cámara de

crecimiento antes mencionada (5.3.2.) con un fotoperiodo de 16/8 h (luz/oscuridad) y

30/20 oC (día/noche). Las plantas se regaron con solución nutritiva B&D (Broughton y

Dilworth, 1971; Tabla 6). Pasados 5 días desde la siembra se eligieron 10 plántulas para

ser infectadas. Estas plántulas infectadas se trasplantaron a macetas de 355 mL (unidad

experimental).

Nutriente Concentración (mg/L)

CaCl2·2H20 147,05

KH2P04 68,05

Fe-Citrato 6,63

MgSO4·7H20 61,65

K2SO4 43,50

MnSO4.H20 0,17

H3BO3 0,12

ZnSO4.7H20 0,14

CuSO4.5H20 0,05

CoCl2.6H20 0,03

Na2MoO4 0,03

Tabla 6. Composición de la solución nutritiva B&D.

El pH se ajustó a 6,5-6,7 con KOH 2M.



Para el análisis estadístico se utilizó el siguiente modelo lineal general: yij=µ+αi+εij

donde yij es la variable medida, µ es la media general, α ij es el efecto del i-ésimo

genotipo y εij es el error experimental con N~(0,σ2). Para saber si hubo diferencias

significativas entre los genotipos se compararon las medias mediante un análisis de la

varianza (ANAVA) y LSD Fisher en cada ensayo. En todos los casos las diferencias se

consideraron estadísticamente significativas con valores de p < 0,05.

5.4.2. Cultivo de A. rhizogenes

Para la infección de las plantas de cada ensayo, se empleó una alícuota del glicerol

de la colonia efectiva para cada genotipo. Cada alícuota fue plaqueada en LB/agar con 100

µg/µl Sm/Sp y 200 µg/µl acetociringona, y se incubó durante 48 h a 28 oC. El césped de

células obtenido se colectó en un microtubo y se resuspendió en 100 µL de agua ultra pura

estéril hasta formar una “pasta” homogénea.

Al mismo tiempo se creció un cultivo de la misma cepa (K599) sin el vector binario

(no transformada) en medio LB-agar con 30 µg/µL Sm/Sp y 200 µg/µl acetociringona

durante 48 h a 28 °C. De igual forma que para el cultivo de la colonia efectiva, éste se

colectó y se resuspendió en agua destilada ultra pura estéril. Este cultivo fue utilizado para

realizar los controles negativos de la transformación.

5.4.3. Infección de las plántulas, aparición y crecimiento de hairy roots

Las 10 plantas que se seleccionaron por cada genotipo y en cada ensayo

presentaban similares características y se encontraban en condiciones óptimas para la

transformación (cotiledones verdes y sin separar) (Figura 5: A). A cada plántula, se le cortó

un pequeño segmento (1 cm de largo x 3 mm de profundidad, aproximadamente) del

hipocótilo proximal con una hoja de bisturí (Figura 5: B) y se pinchó la herida con una jeringa

de 1 mL conteniendo el cultivo de la colonia efectiva (5.3.3.) (Figura 5: C). Luego, las

plántulas se colocaron individualmente en vasos de telgopor de 355 mL de volumen

conteniendo vermiculita previamente humedecida, teniendo la precaución de que la herida

quedara bien cubierta (Figura 5: D). Los vasos se colocaron en cámara de crecimiento con

las condiciones antes mencionadas (5.3.2.) (Figura 5: E). En la Figura 5: H se muestra una

planta infectadas, pero no transformada.



Entre los días 8 y 17 post-infección, se cuantificó la aparición de raíces con el fin de

conocer la cinética del proceso en los tres genotipos evaluados (Figura 5: F). Entre los días

15-18 se cortaron las hairy-roots originadas a partir del sitio de infección (Figura 5: G) y se

identificaron las raíces positivas, transformadas, mediante la expresión de GFP en un

microscopio de epifluorescencia.

Para los controles negativos se transformaron 2 plántulas del genotipo TJS2049, 2

plántulas del genotipo S07-6557 y 5 plántulas del genotipo Thorne para cada bloque de

forma idéntica al resto del ensayo, pero infectándolas con la cepa K599 vacía, sin

transformar. Entre los días 20 y 25 post-infección se cortó la raíz principal de las plantas

transformadas.

Para todas las plantas, las hairy-roots que emergieron a partir del sitio de infección

fueron cortadas y lavadas 3 veces con agua ultra pura estéril durante 15 seg; seguidamente,

se incubaron 2 veces con 5 mg/mL cefotaxima durante 40 min y después nuevamente se

realizaron 3 lavados de con agua ultra pura estéril durante 15 segundos. La finalidad de los

lavados con cefotaxima es la eliminación del Agrobacterium que pueda quedar adherido a

las raíces. Al finalizar los lavados, las muestras fueron maceradas en nitrógeno líquido y

posteriormente almacenadas a -80°C hasta su uso.

.

Figura 5: Etapas del proceso de transformación de soja. Se observan las distintas etapas, desde la

germinación de las semillas hasta el día de observación de las hairy-roots. A) Plántulas de 5 días de edad. B)

Sitio de infección en el hipocótilo. C) Infección de plántulas con la cepa K599 de A. rhizogenes transformada

con el vector pK7GWIWG2D(II),0. D) Plántula post-infección. E) Plantas después de la infección en cámara

de crecimiento con temperatura controlada (25/18 oC día/noche, respectivamente). F) Observación de la

aparición de hairy roots desde el día 8 al 18 post-infección. G) Planta el día de corte y observación de las hairy

roots en microscopio. H) Planta no transformada.



5.4.4. Identificación de raíces transgénicas

Con el fin de identificar las raíces transgénicas, se cortaron todas las hairy-roots

(enteras) generadas a partir del sitio de infección. La identificación se basó en la

observación macroscópica de fluorescencia cuando las raíces eran excitadas con la luz UV

del microscopio de epifluoresencia (ZEISS-AXIO Imager M2), aplicando filtros de excitación

entre 450-490 nm y emisión a 515 nm. Una vez observada la fluorescencia, las raíces fueron

separadas en pools llamados “positivo o transgénico”, “negativo” e “intermedio”, de acuerdo

con el nivel de emisión que presentaban.

5.4.5. Cuantificación de la eficiencia de transformación

Para evaluar nuestros resultados en cuanto a la eficiencia del proceso, se calcularon

para cada genotipo y ensayo, dos parámetros: la “frecuencia de transformación” que se

define como el número de plantas que presentaron al menos una raíz transgénica sobre la

cantidad de plantas totales, y la “eficiencia de transformación por ensayo”, que se calcula

haciendo el promedio de la eficiencia de transformación por planta definida como el número

de raíces transgénicas sobre el total de raíces. Ambos parámetros se expresan en

porcentaje.

𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (%) =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑔é𝑛𝑖𝑐𝑎𝑠

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠∗ 100

𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑜𝑟 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎 (%) =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑎í𝑐𝑒𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑔é𝑛𝑖𝑐𝑎𝑠

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑎í𝑐𝑒𝑠∗ 100

5.5. Extracción de ADN genómico de las hairy-roots

Se realizó la extracción del ADN genómico de los pools de hairy-roots obtenidos en

la sección 5.4.5. para cada genotipo y en cada ensayo con la finalidad de confirmar por

PCR la presencia de los genes rolB y egfp, y la ausencia del gen virD en las hairy-roots

positivas. Se siguió el protocolo que se indica a continuación:



1) Se colocó aproximadamente 100 mg de la muestra en un microtubo de 1,5 mL. En

campana de gases se adicionó a cada tubo 0,7 mL de 2X CTAB (CTAB 2% (w/v);

NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM) con 7 µL β-mercaptoetanol.

2) Se mantuvieron las muestras en hielo 5 min.

3) Se maceró cada muestra con una vía de plástico durante 3-5 min.

4) Se incubaron las muestras en un baño de agua a 65 °C durante 30 min con ocasional

inversión.

5) Se dejaron enfriar las muestras a temperatura ambiente.

6) En campana de gases, se agregó a cada muestra 600 µL de cloroformo/alcohol

isoamilico (24:1) invirtiendo los tubos 5-6 veces. Luego se centrifugó durante 10 min

a 10000 rpm.

7) En campana de gases, se transfirió la fase acuosa (500 µL) a microtubos nuevos.

Seguidamente se precipitó el ADN con igual volumen de isopropanol y se mezcló.

Se mantuvieron los tubos a -20°C durante 90 min.

8) Se centrifugaron las muestras durante 15 min a 13000 rpm, descartándose

posteriormente el sobrenadante.

9) Se lavó el ADN precipitado con 1 ml de etanol al 70%, y se centrifugó durante 15

min a 13000 rpm. Se descartó el etanol.

10) Se secó el pellet durante 20-40 min en un SpeedVac (Savant DNA 120, Thermo

Scientific).

11) Se resuspendió el pellet en 30 µL de agua ultra pura estéril.

5.6. Amplificación por PCR de los genes rolB, virD, egfp

Para la re-confirmación del material transgénico se realizó la amplificación mediante

PCR de los genes rolB, virD, egfp, empleando los cebadores de las Tablas 3 y 7, y utilizando

el ADN extraído en la sección 5.5.. El equipo empleado fue el termociclador Senso Quenst,

modelo Labcycler. El mix utilizado se muestra en la Tabla 8 y el programa del termociclador

se muestra en la Tabla 9.



5.7. Electroforesis de los productos de PCR en gel de agarosa

El ADN se analizó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1% para

los productos de la sección 5.3.2. y de 1,2% para los productos de la sección 5.6.. El tampón

para los geles y la electroforesis fue TAE 1X (0,04 M Tris-acetato, 0,001 M EDTA). En los

Nombre Secuencia (5’→3’) Tm (°C) Tamaño del Fragmento (pb)

virD Fwd TCCGACAGCATGGCCATAAG 60,5 247 virD Rev CGGACAAAATGGAACGGAGC 60,5

rolB Fwd TCACGCCAGCATTTTTGGTG 58,4 238 rolB Rev GAGATGGTCCGTGCTCACAA 60,5

Componentes Concentración

Taq Buffer 1X

MgCl2 2 mM

dNTPs 0,12 mM

Taq (Thermo Scientific; #EP041)

0,06U/µL

Cebador Fwd 0,12 µM

Cebador rev 0,12 µM

Molde 40 ng

Fase Temperatura (ºC) Tiempo (seg) Ciclos

Desnaturalización Inicial 94 180 1

Desnaturalización 94 40 25

Hibridación - 30

Extensión 72 40

Extensión final 72 180 1

Tabla 8. Mix de PCR empleado para re-confirmar

el material transgénico.

Tabla 7. Oligonucleótidos usados para re-confirmar el material transgénico. Fwd: cebador sentido; Rev: cebador antisentido.

Tabla 9. Programa del termociclador empleado para re-confirmar el material transgénico.

.trtransgénico.



geles se agregó SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen) en la cantidad indicada por el

fabricante. Las muestras se mezclaron con el volumen del buffer de carga Orange G 6X (10

mg/mL Orange G, 40% glicerol), necesario para obtener una concentración final 1X. Como

marcador de peso molecular se utilizó 1 Kb Ladder plus y 100 bp Ladder (Fermentas). Las

electroforesis se realizaron a 90 V y el ADN se visualizó en un transiluminador con luz UV

(Dynalight Dual intensity UV transilluminator), registrando y almacenándose las imágenes

(Kodak Gel Logic 100, Imagine System).

5.8. Análisis Western blot

5.8.1. Extracción y cuantificación de proteínas totales

Se maceraron 100 mg de raíces previamente molidas con nitrógeno líquido (sección

5.4.5.) con 500 µL de buffer de extracción (0.1 M tampón fosfato potásico pH 7.0; 1 mM

EDTA; 0.2% ácido ascórbico; 0.1% triton x100; 15% glicerol; 1% polivinilpirrolidona (PVP);

1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF); 0.36 µM β-mercaptoetanol). Se centrifugó el

homogenado a 15000g durante 15 min a 4 °C y se recogió el sobrenadante. La

cuantificación de proteínas se realizó según Bradford, 1976.

5.8.2. SDS-PAGE

La electroforesis de proteínas totales en condiciones desnaturalizantes se realizó en

geles de poliacrilamida-SDS. Para la preparación del gel y el tampón se siguió el protocolo

propuesto por Sambrook y Russel, 2000. La concentración de poliacrilamida utilizada para

los geles concentrador y separador fue 5% y 12%, respectivamente. El tampón de corrida

utilizado fue 25 mM Tris pH 8.3, 0.9 M glicina y 1% SDS.

Los extractos obtenidos según 5.8.1. se mezclaron con tampón de carga (0.192 M

Tris-HCl pH 6.8; 0.002% (p/v) Azul de bromofenol; 2% (p/v) SDS; 5% (v/v) β-

mercaptoetanol; 10% (v/v) glicerol) en una relación 5:1 y se calentaron durante 10 min a 90

°C. Se cargó 10 µg de proteína por pocillo. La electroforesis se realizó en una cuba Bio-

Rad® (MiniProtean® III), la cual se inició a 80 V hasta que la muestra ingresara al gel

separador y luego se continuó a 100 V hasta el final de la corrida.



5.8.3. Transferencia de proteínas a membrana

Una vez finalizada la electroforesis, los geles se equilibraron durante 10 min en

tampón de transferencia (25 mM tris, 192 mM glicina pH 8.3, 20% metanol). Previamente,

se saturaron en el mismo tampón las membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno),

cortadas 0,5 cm más grande que el gel, y las hojas de papel Whatman 1, cortadas del

mismo tamaño que las esponjas y rejillas del dispositivo de electrotransferencia, que se

montó según las instrucciones del fabricante (Bio-Rad®). La electrotransferencia se realizó

a 31 mA durante 1 h. La membrana se tiñó en una solución 0.5% (p/v) de rojo ponceau

(Sigma) y 1% (v/v) ácido acético para comprobar la correcta transferencia de las proteínas.

5.8.4. Inmunodetección de GFP

Para la inmunodetección de GFP se utilizaron anticuerpos policlonales fabricados

en conejo. Las membranas se incubaron en TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.5 y 0,5 M NaCl) en

agitación a 30 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Como solución de bloqueo se

utilizó leche en polvo libre de grasa 5% en TBS-T (TBS-Tween 20 al 0.1%). Las membranas

se incubaron en agitación a 30 rpm durante 1 h a temperatura ambiente con la solución de

bloqueo y, posteriormente, se lavaron 3 veces con TBS-T durante 10 min cada vez. A

continuación, se incubaron durante 1 h en agitación a 30 rpm a temperatura ambiente con

la solución del anticuerpo primario anti-GFP (dilución 1:400; G-1544-Sigma-Aldrich®). Las

membranas se lavaron 3 veces con TBS-T durante 10 min cada vez y luego se incubaron

durante 1 h en agitación a 30 rpm a temperatura ambiente con la solución del anticuerpo

secundario anti-IgG de conejo generado en cabra conjugado con HRP (dilución 1:10000;

Agrisera®-#AS09602). Las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T durante 10 min cada

vez y se procedió a su revelado con el kit ECL (Bio-Rad®) o con el kit Super Signal (Thermo

Fisher®) según las indicaciones de los fabricantes y según el requerimiento. Por último,

luego de 1 min de incubación se removió el líquido sobrante de las membranas y se

revelaron en el visualizador C-Digit® (LI-COR).



5.9. Herramientas informáticas

Las secuencias de los genes rolB y virD empleadas para el diseño de los cebadores

se obtuvieron en la web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI)

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

La secuencia de ADN para el diseño de los cebadores para el gen egfp se obtuvo

en el sitio web Gateway Vectors (https://gatewayvectors.vib.be/).

Para el diseño de cebadores de los genes rolB y virD se utilizó el programa online

Primer designing Tool del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).

El diseño de cebadores del gen egfp se realizó en el programa online Pirmer3Plus

(https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi).

El análisis estadístico se realizó en el programa el InfoStat® versión 2019 (Universidad

Nacional de Córdoba, Argentina)

(https://www.infostat.com.ar/index.php?mod=page&id=46)

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

https://gatewayvectors.vib.be/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

https://www.infostat.com.ar/index.php?mod=page&id=46


RESULTADOS

6. Resultados

6.1. Agrobacterium rhizogenes

6.1.1. Verificación de la presencia del vector binario

Antes de proceder con la transformación de las plantas, se verificó la presencia del

vector pK7GWIWG2D (II),0 en colonias de la cepa K599 presuntamente transformadas.

Esta verificación se basó en la amplificación del gen egfp mediante la técnica de PCR de

colonia.

En la Figura 6 se muestran los productos de PCR obtenidos para 10 colonias

seleccionadas al azar. Todas mostraron una banda por encima de los 500 pb, al igual que

el control positivo (dilución 1:100 del vector pK7GWIWG2D (II),0), correspondiendo al

producto esperado de 535 pb. Por otro lado, en el control negativo (reacción de PCR donde

se sustituyó el vector por agua) no se obtuvo ninguna banda, por lo cual, confirmamos que

los productos obtenidos son específicos.

.

Figura 6. Confirmación de la presencia del vector binario pK7GWIWG2D (II),0

en colonias de la cepa K599 de A. rhizogenes. Gel de agarosa al 1% en el cual

se observan los productos de PCR para 10 colonias (1-10). Como control positivo

(C+) se utilizó una dilución 1:100 del vector pK7GWIWG2D (II),0. El control

negativo (C-) consistió en una reacción de PCR sustituyendo el vector por agua.

MPM (pb): marcador de peso molecular.


RESULTADOS

6.1.2. Selección de la colonia efectiva

Durante este trabajo de tesis observamos que la capacidad de infección de distintas

colonias de la cepa K599 de A. rhizogenes transformadas con la construcción

pK7GWIWG2D (II),0 era muy variable. Por esto, previo a la realización de los ensayos de

transformación de plántulas de soja, chequeamos la capacidad de formación de hairy-roots

de 10 colonias luego de realizar la transformación de las bacterias. La evaluación de la

capacidad de infección y generación de hairy-roots se realizó mediante la infección ex-vitro

de cotiledones. El uso de cotiledones como explantes para la regeneración de plantas se

emplea hace más de 3 décadas (Wright et al., 1986) y también son comúnmente usados

para transformar plantas (Hienchee et al., 1988; Paz et al., 2006). En el caso de la infección

de los mismos con A. rhizogenes, el método se emplea para obtener rápidamente material

transgénico (raíces) (Chen et al., 2018) o, como en este caso, para chequear la virulencia

de las colonias. La transformación de las 10 colonias evaluadas fue confirmada en la

sección 6.1.1. Se utilizaron 6 cotiledones de plántulas de 5 días por colonia evaluada.

Con la finalidad de presentar de forma resumida el proceso de evaluación de

colonias que se realizó, en la Figura 7 se presenta la evolución en 3 puntos (5, 10 y 15 dpi)

del proceso de transformación de los cotiledones infectados en 3 de las 10 colonias

evaluadas (colonia 2, 3 y 8), que son representativas del conjunto. Se puede observar que

a 5 dpi aún no han aparecido raíces en ninguno de los cotiledones para ninguna de las

colonias (Figura 7: A, D y G). A 10 dpi solo 1 cotiledón de la colonia 3 presentó una raíz

(Figura 7: E), y 1 cotiledón de la colonia 8 presentó 3 raíces (Figura 7: H). En este mismo

punto, ningún cotiledón infectado con la colonia 2 presentó raíces (Figura 7: B). A 15 dpi, el

último punto de observación del proceso, 2 de los 6 cotiledones infectados con la colonia 3

presentaban 1 raíz (Figura 7: F) y 3 de los 6 cotiledones infectados con la colonia 8

presentaban múltiples raíces (Figura 7: I). En cuanto a la colonia 2, todos los cotiledones

continuaron sin tener raíces (Figura 7: C). A partir de este análisis queda claro que la colonia

que mayor número de raíces generó, es decir, la más virulenta, fue la colonia 8 (Figura 7:

G-I) y por tanto fue la seleccionada para los ensayos de infección de plántulas de soja.


RESULTADOS

Se optó por observar el proceso de infección entre los 5 y 15 dpi ya que este período

de tiempo es suficiente para identificar la colonia efectiva. Sin embargo, es relevante aclarar

que el número de raíces sigue aumentando hasta aproximadamente 35 dpi; a partir de este

punto ya no se obtienen nuevas raíces.

6.2. Soja

6.2.1. Cinética del proceso de aparición de hairy-roots

Como se mencionó previamente, en este trabajo analizamos la cinética del proceso

de emergencia de hairy-roots a partir del sitio de infección con el fin de evaluar si ésta está

Figura 7. Resumen del proceso de transformación de cotiledones para la selección de la colonia

efectiva. Se muestra el proceso para las colonias 2, 3 y 8 a los 5, 10 y 15 días post-infección (dpi). Las

flechas en color amarillo indican pequeñas raíces.


RESULTADOS

relacionada con la susceptibilidad del genotipo a la transformación, es decir, a la eficiencia

del proceso. En este sentido, se cuantificó la emergencia de las hairy-roots durante el

período de tiempo comprendido entre 8 y 15-18 dpi en los 3 genotipos ensayados (Thorne,

SO7_6557 y TJS2049). El período de tiempo seleccionado se debió a que antes de los 8

dpi en ningún caso observamos emergencia de raíces, y el punto final, de 15-18 dpi, nos

permitió obtener raíces de una longitud adecuada para ser escindidas del sitio de

emergencia y posteriormente observadas en el microscopio.

Según puede observarse en la Figura 8, hay variación en el punto final (día de corte

y observación en el microscopio) entre los distintos ensayos y genotipos. Si bien para el

genotipo Thorne el punto final fue 17 dpi en los 3 ensayos (Figura 8: A, B y C) para los

genotipos SO7_6557 y TJS2049 el punto final del tercer ensayo (Figura 8: F, I) varió

respecto al primer y segundo ensayo, de 18 dpi y 15 dpi, respectivamente (Figura 8: D, E,

G, H), a 17 dpi, con la finalidad de uniformizar para los 3 genotipos en el último ensayo el

día final de observación y corte de raíces.

En el ensayo 1 de Thorne (Figura 8: A), las hairy-roots comenzaron a emerger a 9

dpi. A 12 dpi, salvo 1 planta, todas las restantes tenían al menos 1 raíz. A tiempo final, se

observó que el número de raíces por planta fue muy variable (entre 11 y 35). En este caso

se descartaron 2 plantas, una que no generó raíces y otra que presentó errores en la

cuantificación. En el ensayo 2 de Thorne (Figura 8: B), las hairy-roots comenzaron a

emerger a 10 dpi. A 13 dpi la mayoría de las plantas presentaban raíces. A tiempo final, de

forma similar a lo ocurrido en el ensayo 1, el número de raíces por planta fue muy variable

(entre 4 y 38). En este caso se descartó 1 planta que no generó raíces. En el ensayo 3 de

Thorne (Figura 8: C), las hairy-roots comenzaron a emerger a 9 dpi. A 14 dpi todas las

plantas tenían al menos 1 raíz. A tiempo final, salvo 1 planta, las restantes tenían entre 3 y


RESULTADOS

30 raíces, un rango más acotado que en los ensayos 1 y 2. En este caso se descartó 1

planta por presentar errores en la cuantificación.

Es de remarcar que en el ensayo 3 en general (Figura 8: C, F, I), para los 3

genotipos, se observó un retraso en el día de emergencia de raíces, un menor número de

raíces por planta, así como una menor variación de esta variable entre las distintas plantas

si se lo compara con los 2 ensayos anteriores. Esto podría deberse a las condiciones de la

Figura 8. Cinética de aparición de hairy-roots para los genotipos Thorne, SO7_6557 y TJS2049 en los

ensayos 1, 2 y 3. El período en el que se cuantificó el proceso fue entre 8 y 15-18 dpi, dependiendo del

genotipo y ensayo.


RESULTADOS

cámara de cultivo al momento del ensayo o a alguna particularidad del cultivo bacteriano

empleado para transformar las plantas de este ensayo.

En el ensayo 1 de SO7_6557 (Figura 8: D), las hairy-roots comenzaron a emerger

a 11 dpi. A 15 dpi casi la totalidad de las plantas presentaban raíces. A tiempo final, el

número de raíces totales se encontró nuevamente dentro de un rango muy disperso (entre

4 y 31). En este caso se descartaron 2 plantas que no generaron raíces. Es importante

mencionar que en el ensayo 2 hubo problemas con la temperatura de la cámara de

crecimiento donde germinaron las semillas, lo que provocó que las plántulas de los

genotipos SO7_6557 y TJS2049 (no así las de Thorne) usadas para la transformación no

estuvieran en las condiciones óptimas (con cotiledones verdes y cerrados, y uniformes)

para la transformación. Esto provocó que pocos días después de ser infectadas, muchas

de estas plántulas murieran. Este es el motivo de por qué en este ensayo presentamos

datos solo de 4 plantas del genotipo SO7_6557 (Figura 8: E) y de 2 plantas para el genotipo

TJS2049 (Figura 8: H). Para el genotipo SO7_6557 (Figura 8: E), todas las plantas

presentaban al menos 1 raíz a 12 dpi. A tiempo final, el rango de número de raíces por

planta se situó entre 4 a 21. En el ensayo 3 de SO7_6557 (Figura 8: F), las raíces

comenzaron a emerger a 11 dpi, y a 15 dpi todas las plantas presentaban al menos 1 raíz.

A tiempo final, el rango de número de raíces por planta fue de 6 a 10. En este caso se

descartaron 4 plantas que no generaron raíces, y 2 que presentaron un comportamiento

atípico.

En el ensayo 1 de TJS2049 (Figura 8: G), las hairy-roots comenzaron a emerger a

10 dpi. A 12 dpi todas las plantas presentaban raíces. A tiempo final, el rango de número

de raíces por planta obtenido fue muy disperso situándose entre 9 y 41. En este caso se

descartaron 2 plantas, 1 que no generó raíces y otra que presentó un comportamiento

atípico. En el ensayo 2 de TJS2049 (Figura 8: H), las 2 plantas que pudieron ser

cuantificadas presentaban raíces a 10 dpi, y a tiempo final una de ellas presentaba 10 raíces

y la otra 15. En el ensayo 3 de este mismo genotipo (Figura 8: I), las hairy-roots comenzaron

a emerger a 10 dpi. A 13 dpi la mayoría de las plántulas presentaban al menos 1 raíz. A

tiempo final, el número de raíces por planta fue de entre 8 y 29. En este caso, se descartaron

2 plantas que no generaron raíces, y 1 por tener errores en la cuantificación.


RESULTADOS

A modo de resumen de lo antes mencionado, en la Tabla 10 se muestra el rango de

número de raíces obtenido a tiempo final (día de corte y observación) para cada genotipo y

en cada ensayo.

Genotipo Ensayo Rango de número de

raíces

Thorne 1 11-35

SO7_6557 1 4-31

TJS2049 1 9-41

Thorne 2 4-38

SO7_6557 2 4-21

TJS2049 2 10-15

Thorne 3 3-30

SO7_6557 3 6-10

TJS2049 3 8-29

Como se mencionó anteriormente, una característica deseable de encontrar en un

genotipo en proceso de transformación es que las raíces comiencen a emerger a los pocos

días de haber realizado la infección (Cao et al., 2009). En la Tabla 11 se muestra el día de

aparición de hairy-roots después de la infección bacteriana (DAI, por su nombre en inglés

Days of hairy-roots emergence after bacterial infection), con su respectivo desvío estándar

para cada genotipo y ensayo. A excepción del genotipo SO7_6557 en el ensayo 1, en los

demás ensayos no se presentaron diferencias significativas entre los genotipos.

Genotipo Ensayo DAI

Thorne 1 10,9 ± 1,7

SO7_6557 1 3 ± 1,8*

TJS2049 1 11 ± 0,9

Thorne 2 11,7 ± 1,7

SO7_6557 2 11,5 ± 0,6

TJS2049 2 10,5 ± 0,7

Thorne 3 12,4 ± 1,6

SO7_6557 3 13,8 ± 2,6

TJS2049 3 13 ± 1,8

Tabla 10. Rango de número de raíces para los genotipos

Thorne, SO7_6557 y TJS2049 en los ensayos 1, 2 y 3.

Tabla 11. DAI para los genotipos Thorne, SO7_6557 y

TJS2049 en los ensayos 1, 2 y 3. Se indica con *

diferencias significativas (p = < 0,05).


RESULTADOS

Analizando la Figura 8 en su conjunto se puede concluir que la variable analizada,

el número de hairy-roots por planta transformada, presenta una alta variabilidad entre

ensayos y genotipos. Sin embargo, es posible identificar distintas “etapas” o “fases” en el

proceso de aparición de raíces en el tiempo. La primera es la que comprende el período de

emergencia de las primeras raíces y es la que involucra más días, desde 1 dpi hasta 10 dpi

en promedio. La segunda etapa involucra un aumento moderado en el número de raíces

por planta (entre 10 y 14 dpi, aproximadamente), y es seguida de una última o tercera etapa

en la cual el número de raíces aumenta más rápidamente (a partir de 14 dpi y hasta el punto

final).

En particular, analizando con más detalle la segunda etapa, se puede observar que

existe variación entre genotipos y entre ensayos. En el ensayo 1 y 2 de Thorne (Figura 8:

A, B) el número de raíces aumenta lentamente durante los 2 días siguientes a la emergencia

de las primeras raíces, en cambio, en el ensayo 3 (Figura 8: C) lo hace durante 4 días. Los

ensayos 1 y 2 del genotipo SO7_6557 no presentan etapas tan claras como los otros casos;

en el primer caso es debido a la gran dispersión de los datos (Figura 8: D), y en el otro a

las pocas plantas que se pudieron analizar (Figura 8: E). En el ensayo 3 se observa un

aumento más lento en el número de raíces durante los 4 días posteriores a la aparición de

las primeras raíces. En el ensayo 1 de TJS2049 (Figura 8: G) se observa que el número de

raíces aumenta lentamente solo durante un día después de haber emergido las primeras

raíces. El ensayo 2 (Figura 8: H) no puede analizarse debido a que solo se tienen datos de

2 plantas. En el ensayo 3 (Figura 8: I) el número de raíces crece lentamente durante los 3

días siguientes a la aparición de las primeras raíces.

6.2.2. Identificación de raíces transgénicas mediante microscopía

La identificación de las raíces transgénicas (aquellas que presentaban la proteína

GFP) se basó en su observación macroscópica al excitarlas con luz UV y observando su

emisión de fluorescencia. Fue así que, durante la selección de raíces en los 3 genotipos

evaluados, observamos la existencia de 3 poblaciones (Figura 9) con distintas intensidades

de emisión de fluorescencia a las que denominamos:

- Población “positiva o transgénica”: conformada por raíces que emitían fluorescencia, se

veían de un color verde intenso (Figura 9: A).


RESULTADOS

- Población “negativa”: conformada por raíces que no emitían fluorescencia, se veían de

color rojo (Figura 9: C).

- Población “intermedia”: conformada por raíces que emitían una intensidad de

fluorescencia notoriamente menor a la población “positiva”, se veían ligeramente verdes

(Figura 9: B).

En la Figura 10 se muestran raíces de las tres poblaciones antes definidas

observadas al microscopio. En concordancia con la observación macroscópica, aquí se

observó una intensa emisión de fluorescencia para la población “positiva o transgénica”

(Figura 10: A), una emisión muy baja para la población “negativa” (Figura 10: C), y una

emisión de fluorescencia de intensidad intermedia para la población “intermedia” (Figura

10: B).

En cuanto a cantidad de raíces, la población mayoritaria fue la “negativa”, seguida

por la población “positiva o transgénica” y por último la “intermedia” de la cual se obtuvo

Figura 9. Identificación macroscópica de las tres poblaciones de hairy-roots mediante la

observación de emisión de fluorescencia. A) Población “positiva o transgénica”. B) Población

“intermedia”. C) Población “negativa”. Las imágenes fueron tomadas con la cámara del celular

Samsung Galaxy J5.

Figura 10. Observación microscópica de las tres poblaciones de hairy-roots. A) Población

“positiva o transgénica”. B) Población “intermedia”. C) Población “negativa”. Fotos tomadas con

el software del microscopio (Zeiss-ZENpro Imaging Software).


RESULTADOS

muy poca cantidad de raíces. Cada una de las poblaciones antes mencionadas obtenidas

en los tres ensayos se juntaron y se utilizaron para la posterior re-confirmación del material

transgénico mediante análisis Western blot y amplificación de genes por PCR.

6.2.3. Eficiencia de transformación

Conocer la eficiencia del proceso de transformación que se planea llevar a cabo es

muy relevante ya que permite conocer, de forma aproximada, cuanto material transgénico

se obtendrá al finalizar el ensayo. Esto, a su vez, permite adaptar la cantidad de material

de partida a transformar para luego obtener una cantidad de material transgénico adecuada.

Por otro lado, la información sobre eficiencias de transformación de procesos llevados a

cabo con distintas metodologías es un insumo para elegir aquella adecuada para los

intereses, recursos y experiencia del usuario. Debido a que nuestra metodología de

transformación se basó en el uso de un vector biológico, factores como el genotipo de la

planta, la cepa bacteriana utilizada y su virulencia y la manipulación por parte del usuario

probablemente han influido en la eficiencia global del proceso de transgénesis. Por esto,

calculamos la frecuencia de transformación, la eficiencia de transformación por planta y

ensayo (como se destalla en la sección 5.4.5.) en todos los 3 genotipos con el fin de evaluar

nuestros resultados en cuanto a la eficiencia del proceso.

En cuanto a las frecuencias de transformación, en la Tabla 12 se muestran los

valores obtenidos para los 3 genotipos en cada ensayo. El genotipo Thorne tuvo frecuencias

elevadas (80-100 %) en los 3 ensayos. El genotipo TJS2049 presentó valores elevados

para los ensayos 1 y 3 (80 %), y un valor bajo en el ensayo 2 (20 %), debido a que solo 2

plantas finalizaron el ensayo (como se mencionó en la sección 6.2.1.). El genotipo

SO7_6557 presentó valores medios (60-70 %) en los ensayos 1 y 3, y un valor bajo en el

ensayo 2, porque solamente 4 plantas finalizaron el ensayo (como se mencionó en la

sección 6.2.1.).


RESULTADOS

En cuanto a la eficiencia de transformación por planta, en la Figura 11 se muestran

los box plots correspondientes a este parámetro para cada genotipo y para cada ensayo.

Se observa una gran dispersión de los datos en la mayoría los genotipos y ensayos. Para

el ensayo 1 (E1) de Thorne, se observó una distribución bastante simétrica y con poca

dispersión de los datos en comparación con los ensayos 2 (E2) y 3 (E3) que presentaron

una distribución asimétrica negativa con una mayor dispersión. Por otro lado, observando

los valores de medianas vemos que fueron diferentes en cada ensayo, quedando los

valores de mediana de E2 y E3 al límite del rango intercuartílico de E1. Para el genotipo

SO7_6557, también se obtuvo una tendencia dispersa de los datos en los 3 ensayos. El E1

mostró una distribución más simétrica, pero a la vez más dispersa en comparación con E2

y E3 que presentaron una distribución asimétrica positiva y una dispersión levemente

menor. El valor de mediana en E2 y E3 fue muy similar, y en E1 se encontró comprendido

dentro del rango intercuartílico de los otros ensayos. Para el genotipo TJS2049 se observó

nuevamente una dispersión de los datos en todos los ensayos, aunque un poco menor que

en SO7_6557. Los datos de E1 mostraron una distribución asimétrica positiva, en E2

simétrica y en E3 asimétrica negativa. El valor de la mediana fue similar entre E1 y E2, y

muy diferente en E3, quedando fuera del rango intercuartílico de los otros ensayos.

Genotipo Ensayo Frecuencia (%)

Thorne 1 90

SO7_6557 1 70

TJS2049 1 80

Thorne 2 80

SO7_6557 2 40

TJS2049 2 20

Thorne 3 100

SO7_6557 3 60

TJS2049 3 80

Tabla 12. Frecuencias de transformación de los

genotipos Thorne, SO7_6557 y TJS2049 en los

ensayos 1, 2 y 3. La frecuencia de transformación se

define como el porcentaje del número de plantas que

presentaron al menos una raíz transgénica sobre la

cantidad de plantas totales.


RESULTADOS

Los valores de eficiencia de transformación por ensayo (Tabla 13) para todos los

genotipos son relativamente bajos, presentan altos valores de desvío estándar (salvo en el

ensayo 1 del genotipo Thorne) como era de suponer a partir de la dispersión de los datos

observadas en la Figura 11. Además, no se encontraron diferencias significativas entre los

genotipos en cada ensayo (p ensayo 1 = 0,8764, p ensayo 2 = 0,8116 y p ensayo 3 = 0,6815).

Genotipo Ensayo Eficiencia (%)

Thorne 1 34±7

SO7_6557 1 27±17

TJS2049 1 29±10

Thorne 2 36±21

SO7_6557 2 33±16

TJS2049 2 27±15

Thorne 3 45±26

SO7_6557 3 35±31

TJS2049 3 35±17

Tabla 13. Eficiencia de transformación de los genotipos

Thorne, SO7_6557 y TJS2049 en los ensayos 1, 2 y 3. La

eficiencia de transformación por ensayo es el promedio de la

eficiencia de transformación por planta definida como el

número de raíces transgénicas sobre el total de raíces. Se

expresa en porcentaje.

Figura 11. Box plots correspondientes a

la eficiencia de transformación por

planta de cada genotipo para cada

ensayo. Ensayo 1 (E1), Ensayo 2 (E2),

Ensayo 3 (E3). La eficiencia de

transformación se define como el

porcentaje del número de raíces

transgénicas sobre el total de raíces.


RESULTADOS

6.2.4. Análisis Western blot para la confirmación de las raíces transgénicas

Entre la amplia variedad de genes reporteros existentes, el uso de GFP para la

identificación de raíces transgénicas se encuentra entre los más utilizados ya que se conoce

que el gen se integra en el genoma y que se expresa de manera eficiente (Cho et al., 2000).

Si bien este método presenta como desventaja en sistemas vegetales la presencia de

autofluoresencia debida a tejidos lignificados y con alto contenido de flavonas, que emiten

en los mismos máximos espectrales que GFP (Lin et al., 2011), en este trabajo pudimos

identificar raíces transgénicas que expresaban GFP con este método. Sin embargo, con el

fin de validar el criterio tomado para las poblaciones “positiva o transgénica” y “negativa”,

es decir re-confirmar los resultados obtenidos en la sección 6.2.2., y dilucidar si la

florescencia emitida por la población “intermedia” era producto de la correcta inserción y

expresión del transgén o se debía a autofluoresencia, realizamos un análisis Western blot

para identificar la proteína GFP.

En la Figura 12 se presentan los Western blot utilizando un anticuerpo anti-GFP de

las poblaciones de hairy-roots “positiva o transgénica”, “negativa” y “intermedia” de los

genotipos Thorne, TJS2049 y SO7_6557. En estos experimentos se incluyó el control

negativo de la transformación (plantas transformadas con la cepa K599 sin vector binario)

para el genotipo Thorne y, como control negativo del experimento se utilizaron raíces

salvajes de plantas Thorne crecidas en una cámara distinta a la que se encontraba el

ensayo de transformación (para evitar la contaminación). Solo se incluyó el control negativo

de la transformación para el genotipo Thorne debido a que los genotipos TJS2049 y

SO7_6557 no se transformaron en este caso.


RESULTADOS

La población “positiva o transgénica” de Thorne (Figura 12: A) presentó una banda

por encima de los 25 KDa la cual corresponde a la proteína GFP que tiene un peso

molecular de 27 KDa; para la población “negativa” y ambos controles no se observó ninguna

banda. Por otra parte, la población “intermedia” también presentó una banda de 27 KDa

pero de menor intensidad que la población “positiva”. Iguales resultados se obtuvieron para

los genotipos SO7_6557 y TJS2049 (Figura 12: B). Las poblaciones “positivas o

transgénicas” de ambos presentaron una banda de 27 KDa de igual forma que las

poblaciones “intermedias”, si bien en este caso la banda es de menor intensidad. No se

observó banda para las poblaciones “negativas” ni en los controles negativos. En la

población “positiva o transgénica” del genotipo TJS2049 se observó además una banda

inespecífica de 55 kDa aproximadamente.

Figura 12. Análisis Western blot utilizando un anticuerpo anti-GFP de las poblaciones de hairy-

roots “positiva o transgénica”, “negativa” y “intermedia” de los genotipos Thorne, SO7_6557 y

TJS2049. (+) Población “positiva o transgénica”, (-) Población “negativa”, (+/-) Población “intermedia”,

(c-) Control negativo de la transformación, (wt) raíces salvajes, PM (KDa): marcador de peso molecular.


RESULTADOS

6.2.5. Análisis de la transformación mediante PCR (genes rolB, virD y egfp)

Otra metodología mediante la cual re-confirmamos la identidad de las poblaciones

de hairy-roots “positivas o transgénicas” y “negativas” de los distintos genotipos fue PCR.

No se incluyeron en este análisis las poblaciones “intermedias” debido a que no se contaba

con material suficiente. Se incluyó como control positivo la cepa K599 transformada con el

vector pK7GWIWG2D (II), 0, el control negativo de la transformación (plantas transformadas

con la cepa K599 sin vector binario) y, como control negativo del experimento, raíces

salvajes de plantas Thorne.

La estrategia se basó en amplificar tres genes: nuestro gen de interés egfp, el cual

se espera que esté presente en las raíces positivas y, eventualmente, en raíces negativas

(ya que las copias pueden haberse insertado en algún sitio del genoma que se encuentre

silenciado, y por tanto, no puedan expresarse); el oncogén rolB, confirmando la presencia

de ADN-T del plásmido Ri, y por tanto, ratificando la identidad de las raíces como hairy-

roots, esperando que este se encuentre presente en raíces positivas y negativas. Por

último, para validar que nuestros resultados se deben efectivamente a inserciones del ADN-

T de ambos plásmidos en el genoma de las raíces, y no debido a una eventual

contaminación por A. rhizogenes, incluimos en el análisis al gen virD que está presente

únicamente en la bacteria (ya que no se transfiere al genoma de la planta).

En la Figura 13 se presentan los resultados obtenidos para la amplificación de los 3

genes antes mencionados para las poblaciones de hairy-roots “positivas o transgénicas” y

“negativas” de los 3 genotipos. Para el gen egfp en Thorne (Figura 13: A) se observó una

banda superior a 500 bp en las raíces positivas, negativas, control negativo de la

transformación y control positivo, los cuales corresponden con el fragmento esperado de

unos 553 pb. Para el gen rolB, las raíces positivas y negativas mostraron una banda

superior a los 200pb, al igual que el control positivo, coincidiendo con el fragmento esperado

de unos 238 pb. Para el gen virD se obtuvo una banda superior a 200 pb para las raíces

positivas, negativas y control positivo, correspondiendo con el fragmento esperado de unos

247 pb. Las raíces salvajes no mostraron ningún producto amplificado para los 3 genes.


RESULTADOS

Figura 13. Re-confirmación del material

transgénico mediante PCR. Gel de agarosa al 1,2%

donde los carriles (+) representan la población

“positiva o transgénica”, (-) población “negativa”, (C+)

cepa K599 transformada con pK7GWIWG2D (II), 0,

(wt) raíces salvajes y (C-) control negativo de la

transformación. A) Thorne, B) SO7_6557, C) TJS2049.

A

B

C


RESULTADOS

Para el genotipo SO7_6557 (Figura 13: B) se obtuvieron iguales resultados que en

el genotipo Thorne para los genes egfp, rolB y virD. Además, las raíces salvajes mostraron

3 bandas inespecíficas para el gen egfp de aproximadamente 400 pb, 1250 pb, y 1350 pb;

también mostraron otra banda inespecífica en rolB de aproximadamente 600 pb, y para el

gen virD otra banda de aproximadamente 400 pb. De igual manera que Thorne y

SO7_6557, para el gen egfp de TJS2049 (Figura 13: C), se observó el fragmento esperado

de 535 pb para las raíces positivas, negativas, control negativo de la transformación y

control positivo. Para el gen rolB, se observó una banda de 238 pb para las raíces positivas

y control positivo, mientras que las raíces negativas no mostraron una banda clara. Se

obtuvieron productos de unos 247 pb para el gen virD en las raíces positivas, negativas y

control positivo. Las raíces salvajes mostraron una banda inespecífica en el gen rolB (mayor

a 500 pb) y ninguna banda para egfp y virD.


DISCUSIÓN

7. Discusión

7.1. Importancia de seleccionar la colonia efectiva

A la hora de optimizar un protocolo de transformación mediada por A. rhizogenes en

las condiciones propias de laboratorio, es imprescindible reproducir las condiciones de

cultivo que han demostrado ser clave para el éxito de esta transformación. Entre estas

condiciones, se cuenta el lograr mantener en todo momento una alta humedad en el sitio

de infección, necesaria para la morfogénesis y desarrollo de las raíces (Kereszt et al., 2007;

Mohammadi-Dehcheshmeh et al., 2014), y mantener la temperatura de la cámara de

crecimiento a no más de 25 °C/28 °C durante el período de crecimiento de las hairy-roots,

puesto que a temperaturas superiores la maquinaria de transferencia del ADN-T se ve

afectada, disminuyendo drásticamente la transformación (Kereszt et al., 2007; Cao et al.,

2009). Otro aspecto relevante que condiciona en gran medida el éxito de la transformación

es elegir plántulas con cotiledones cerrados y verdes (Kereszt et al., 2007). La importancia

de este aspecto lo comprobamos en el ensayo 2 con los genotipos SO7_6557 y TJS2049,

en el cual se obtuvieron muy pocas plantas transformadas en cada genotipo debido a que

las plántulas que fueron infectadas no estaban en condiciones óptimas. Además de que es

deseable contar con eficiencias de transformación altas, es decir, un alto número de raíces

transgénicas respecto al total de raíces obtenidas, otro factor que limita la cantidad de

material transgénico que se va a obtener es el número de hairy-roots generadas. Este factor

depende en gran parte de la virulencia de la cepa bacteriana empleada en la

transformación. Durante este trabajo observamos que la virulencia de distintas colonias de

la cepa K599 de A. rhizogenes transformadas con el vector pK7GWIWG2D (II),0 era

diferente, es decir, cada una de ellas tenía una capacidad distinta de generar hairy-roots

(Figura 7). Por esto, y con el fin de optimizar nuestro protocolo de manera de identificar

aquella colonia que nos permitiera generar mayor número de hairy-roots en los ensayos de

transformación de plántulas de soja y, por tanto, obtener mayor cantidad de material

potencialmente transgénico, realizamos una búsqueda entre 10 colonias transformadas

para seleccionar la colonia efectiva, aquella más virulenta. Para cumplir este objetivo

infectamos 6 cotiledones con cada colonia y monitoreamos la cantidad de hairy-roots


DISCUSIÓN

generadas a 5, 10 y 15 dpi. Los resultados evidenciaron virulencias muy diferentes entre

las colonias. Hubo colonias, como la 2, que no tuvieron la capacidad de generar hairy-roots

en el lapso de tiempo evaluado (Figura 7: C). Otras, como la colonia 3, presentaron una

escasa capacidad de generación de hairy-roots, generando 2 o 3 raíces en algunos de los

6 cotiledones (Figura 7: F). Sin embargo, algunas colonias se destacaron por tener la

capacidad de generar muchas hairy-roots en más de un cotiledón. Es así que de las 10

colonias evaluadas, la colonia 8 (Figura 7: I) fue la seleccionada para realizar los ensayos

de transformación en las plántulas de soja por ser la que generó mayor número de hairy-

roots en los cotiledones. Una posible hipótesis que explicaría esta diferencia en la

capacidad de generación de raíces entre las colonias podría ser el número de copias del

plásmido que ingresaron en las células durante la transformación. Para poder confirmar

esta hipótesis se podría hacer un cultivo liquido de cada colonia, extraer el ADN plasmídico

y cuantificarlo.

7.2. Análisis de la cinética del proceso de aparición de hairy-roots y su relación con

la eficiencia de transformación

El análisis de la cinética del proceso de aparición de hairy-roots se basó en la

cuantificación de las variables “número de hairy-roots” y “DAI”. Como se mencionó en la

sección 3.3., tanto el número de hairy-roots que se obtienen a partir del sitio de infección

en un proceso de transformación como el tiempo en que tardan esas raíces en emerger son

aspectos relevantes a considerar en un genotipo a la hora de evaluar un protocolo de

transformación. Por esto, era de nuestro interés evaluar si los distintos genotipos se

comportaban de manera similar o no en estos aspectos, y también si existía alguna relación

con la eficiencia de transformación.

Durante este análisis (Figura 8) observamos que la variable “número de hairy-roots”

por planta transformada presentaba una alta variabilidad tanto entre plantas del mismo

genotipo y ensayo, como entre genotipos. Esta variabilidad probablemente sea

consecuencia de la manipulación al momento de herir e infectar las plántulas, ya que como

se detalló en la sección 5.4.3. este procedimiento es meramente manual, siendo imposible

de reproducir de forma idéntica en cada plántula, y determinante a la hora de generar


DISCUSIÓN

plantas transformadas. A pesar de esta gran variabilidad, se identificaron 3 “etapas” o

“fases” a lo largo del tiempo, en las cuales predominarían diferentes procesos biológicos.

La primera fase se caracteriza por ser la más larga en el tiempo y donde se observa la

presencia de pequeños callos y eventualmente 1 o 2 raíces. Durante esta fase

probablemente ocurra la activación del sistema de virulencia bacteriano, procesamiento del

ADN-T, movimiento del ADN-T desde la bacteria a la célula hospedera e inserción del ADN-

T en el genoma de la planta. La segunda fase, que transcurre durante un periodo corto de

tiempo (1-4 días), se caracteriza por un aumento en el número de callos y crecimiento de

los mismos, y escasa aparición de raíces, predominando la proliferación celular y posterior

inducción de la raíz. La tercera y última etapa alcanza el tiempo final de observación y se

caracteriza por la generación de más de una raíz en 24 h, predomina la diferenciación del

tejido (callo) al fenotipo raíz y el crecimiento en longitud de las mismas.

La variable “DAI” presentó una alta dispersión en la mayoría de los genotipos y

ensayos, salvo para el genotipo TJS2049 en el ensayo 1 (sin considerar el ensayo 2 para

los genotipos TJS2049 y SO7_6557 por el bajo número de plantas, por lo mencionado en

la sección 6.1.2.). Esta dispersión podría deberse a efectos de la técnica (manipulación) al

momento de la infección de las plántulas. Por otra parte, solo en el ensayo 1 hubo

diferencias significativas del genotipo SO7_6557 con respecto a los genotipos Thorne y

TJS2049 (Tabla 11). Si bien en los dos ensayos posteriores (ensayos 2 y 3) no se

encontraron diferencias significativas entre los genotipos evaluados, es relevante indicar

que estos ensayos tuvieron características diferentes al ensayo 1 (mencionadas en la

sección 6.1.2.), que derivó, en el ensayo 2, con que contáramos con un número muy

desigual de plantas a evaluar entre los distintos genotipos. En el caso del ensayo 3, ocurrió

un retraso significativo de DAI con respecto al ensayo 1 en los genotipos Thorne y TJS2049

(ver Anexo). Estas diferencias en las características de los ensayos probablemente han

influido en la variabilidad de los resultados obtenidos, por lo cual, sería necesario realizar

otro ensayo con iguales condiciones que el ensayo 1 para poder dilucidar si el genotipo

SO7_6557 es significativamente diferente a los genotipos Thorne y TJS2049 en cuanto a

la variable DAI. Concluimos que los valores obtenidos de la variable “DAI” para todos los

genotipos y ensayos fueron aceptables en el sentido de que en todos los casos el punto

final, es decir, el día de corte y observación de las hairy-roots, fue menor a 21 dpi, siendo

este valor el límite establecido en la metodología de referencia (Kereszt et al., 2007).


DISCUSIÓN

En cuanto al número de hairy-roots obtenidas a tiempo final del análisis (corte y

observación de las raíces al microscopio), se obtuvo un rango amplio de valores para los 3

genotipos en el ensayo 1, y para los genotipos Thorne y SO7_6557 en el ensayo 2 (Tabla

10). Esta gran variabilidad entre plantas del mismo genotipo y ensayo podría deberse

nuevamente a efectos de la manipulación del material en el momento de la infección de las

plantas. Por otro lado, los inconvenientes ocurridos en el ensayo 3 derivaron en rangos de

número de hairy-roots más acotados, debido a un enlentecimiento del proceso de aparición

de hairy-roots que se evidencia por un DAI más grande en los genotipos Thorne y TJS2049

(ver Anexo). Nuestros resultados están en concordancia con los obtenidos por Kereszt et

al., 2007; se logró obtener mediante este protocolo una buena cantidad de hairy-roots en

todos los genotipos, superando el promedio obtenido según el protocolo de referencia

(Kereszt et al., 2007) de 6-7 raíces por planta.

Como se mencionó anteriormente, con el fin de evaluar nuestra metodología de

transformación y facilitar la comparación entre los ensayos se calcularon dos parámetros:

la “frecuencia de transformación” y la “eficiencia de transformación” por ensayo de los 3

genotipos. En este sentido, el genotipo que resultó ser más susceptible a la transformación

fue Thorne ya que presentó una alta frecuencia de transformación (80-100 %) en todos los

ensayos, siendo además dicha frecuencia mayor a la de los restantes genotipos en todos

los ensayos (Tabla 12). Si se tienen en cuenta los ensayos 1 y 3, el genotipo con el valor

más alto de frecuencia de transformación después de Thorne fue TJS2049 con un 80%

(Tabla 12). Por último, el genotipo que resultó ser menos susceptible a la transformación

en nuestras condiciones fue SO7_6557 con un promedio de frecuencia de transformación

del 65% (Tabla 12). No se tomó en cuenta para el cálculo de estos parámetros el ensayo 2

para los genotipos SO7_6557 y TJS2049 porque, como hemos mencionado previamente,

el bajo número de plantas transformadas se debió a una mala calidad de las plántulas a

transformar y no a que las plantas no se hayan transformado. Comparando nuestros

resultados con los del protocolo de referencia (Kereszt et al., 2007), coincidimos en los

valores de frecuencia obtenidos para los genotipos Thorne y TJS2049, estando

comprendidos en el rango de 70%-100% obtenido en dicho protocolo, y un valor inferior

para el genotipo SO7_6557 (65%).

En cuanto al parámetro “eficiencia de transformación por planta”, y según se observa

en la Figura 11, éste mostró una gran variabilidad tanto entre ensayos como entre


DISCUSIÓN

genotipos. Esta variabilidad era esperable luego de observar los altos desvíos estándares

que se obtuvieron en los valores de eficiencia de transformación por ensayo (Tabla 13).

Esta variabilidad podría deberse a múltiples factores como: efectos de la manipulación al

momento de la herida e infección de las plántulas, errores al momento de la cuantificación

de las raíces transgénicas (pérdida de raíces durante el corte y observación en el

microscopio), o una característica intrínseca de la variable. Por otro lado, los valores de

eficiencia de transformación por ensayo mostraron que todos los genotipos tienen una baja

susceptibilidad a este tipo de transformación (Tabla 13). Esto podría deberse a una

característica intrínseca de los genotipos ensayados ya que el éxito de la transformación

mediada por Agrobacterium es genotipo-dependiente, o a que la metodología empleada no

permite obtener transformaciones más eficientes en las condiciones de nuestro laboratorio.

A pesar de haberse obtenido una baja eficiencia de transformación en todos los

genotipos evaluados, cuando el objetivo es el estudio de la biología de la raíz esta técnica

continúa siendo una buena opción en comparación con los métodos de transformación

estable, ya que, permite obtener en poco tiempo material transgénico, con una

manipulación y equipamiento sencillo y permitiendo ajustar la cantidad de material

aumentando el número de plantas transformadas (Collier et al., 2005; Veena and Taylor,

2007). En este sentido, debido a que el genotipo SO7_6557 presentó la menor frecuencia

de transformación, se debería aumentar considerablemente el número de plantas a

transformar con respecto a los genotipos Thorne y TJS2049. En cuanto a uno de los

objetivos de este trabajo que era evaluar una posible relación entre alguna(s) variable

evaluada durante el análisis de la cinética de aparición de hairy-roots y la eficiencia de

transformación, debemos decir que debido a la alta variabilidad que mostró el proceso de

cinética de aparición de hairy-roots, y a que no hubo diferencias significativas en la

eficiencia de transformación en los genotipos evaluados, no pudimos establecer ninguna

relación entre ellos.

7.3. Re-confirmación del material transgénico

Durante la identificación de las raíces transgénicas, aquellas que expresaban GFP,

observamos la existencia de 3 poblaciones de raíces con distintas intensidades de emisión


DISCUSIÓN

de fluorescencia en todos los genotipos evaluados. Las denominamos: “positiva o

transgénica”, aquellas raíces cuya emisión de fluorescencia correspondía a la presencia de

GFP; “negativa”, aquellas raíces que no emitían fluorescencia y por lo cual concluimos que

no expresaban GFP; “intermedia”, aquellas raíces que presentaban cierta emisión de

fluorescencia que podría deberse a la presencia de GFP o a la autofluorescencia intrínseca

del tejido. A pesar de que pudimos reconocer exitosamente mediante microscopía las raíces

que expresaban el transgén, decidimos realizar un análisis Western blot para confirmar la

presencia de la proteína GFP, y un análisis mediante PCR para identificar la presencia o

ausencia de los genes egfp, rolB y virD en las distintas poblaciones de hairy-roots. La

finalidad de las 2 aproximaciones mencionadas fue validar el criterio tomado para las

poblaciones de raíces “positiva o transgénica” y “negativa”, y dilucidar si la florescencia

observada en la población “intermedia” era producto de la proteína GFP o se debía a la

autofluorescencia del tejido.

Los resultados obtenidos mediante la técnica Western blot re-confirmaron el criterio

tomado para las poblaciones de raíces “positivas o transgénicas” de los genotipos Thorne,

SO7_6557 y TJS2049 ya que como se observa en la Figura 12 en esta población de cada

genotipo se obtuvo una banda de 27 kDa correspondiente a la proteína GFP. Además, no

se observó banda tanto en el control negativo de la transformación (hairy-roots obtenidas

de plantas transformadas con la cepa K599 vacía, sin vector binario), como en el control

del experimento (raíces salvajes), lo cual valida que los resultados se deben realmente a la

presencia de GFP, y no a algún producto inespecífico o eventual contaminación. Para las

poblaciones de raíces “negativa”, nuevamente re-confirmamos el criterio tomado en todos

los genotipos evaluados ya que no se obtuvo banda (Figura 12) y por lo tanto concluimos

que estas raíces no presentaban GFP. Por último, confirmamos que la fluorescencia emitida

por las poblaciones de raíces “intermedia” (observada en la sección 6.2.2.) se debía a la

proteína GFP y no a la autofluorescencia intrínseca del tejido ya que se obtuvo la banda de

27 kDa correspondiente a GFP en todos los genotipos (Figura 12). Por tanto, esta población

no son más que raíces transgénicas con un nivel de emisión de fluorescencia notoriamente

menor. Esta diferencia en el nivel de emisión de fluorescencia se debe a una menor

cantidad de GFP, ya que, la intensidad de fluorescencia depende de forma lineal de la

cantidad de proteína presente en el tejido (Richards et al., 2003). Esta disminución de la

cantidad de proteína presente en las raíces de la población “intermedia” está asociada a un


DISCUSIÓN

menor nivel de expresión del transgen, ya que la inserción del mismo ocurre de forma

aleatoria en el genoma de la planta. Este hecho conlleva que cada evento pueda quedar

flanqueado por distintas secuencias génicas afectando su nivel de expresión (Hernandez-

Garcia et al., 2009), debido a que estas secuencias pueden contener elementos

reguladores que pueden influir en la transcripción del transgen (De Bolle et al., 2003).

Además, la estructura de la cromatina del ADN flanqueante determina la accesibilidad de

las secuencias reguladoras por la maquinaria de transcripción, influyendo en la eficiencia

transcripcional (De Bolle et al., 2003). El hecho que las raíces “mas-menos” sean en

realidad “positivas o transgénicas” indica que tenemos un error en la cuantificación de las

raíces transgénicas, subestimamos su valor, y, por consiguiente, tenemos un error en el

cálculo de la eficiencia de transformación. Sin embargo, consideramos que este error no

tuvo un impacto significativo en los resultados ya que esta población fue muy pequeña en

comparación con las poblaciones “positiva o transgénica” y “negativa”.

Los resultados obtenidos mediante PCR mostraron la presencia de contaminación

con A. rhizogenes en las poblaciones “positiva o transgénica” y “negativa” de los 3 genotipos

evaluados, y en el control negativo de la transformación, ya que se amplificó el fragmento

de 247 pb especifico del gen virD, que como se mencionó anteriormente, no se transfiere

al genoma de la plata, y se encuentra únicamente en el genoma de la bacteria (Figura 13).

Además, esta contaminación se confirmó al observar en el control negativo de la

transformación la amplificación del fragmento de 553pb correspondiente a egfp. Estos

resultados muestran que el método empleado para la eliminación de A. rhizogenes de las

raíces no fue eficiente, debido a que la bacteria no solo se encuentra presente en la

superficie de las raíces, sino que además, se halla en el sistema vascular de las mismas y

en las células del parénquima que rodean al xilema (Falasca et al., 2000). Por tanto, para

próximos experimentos se debería optar por otra metodología de extracción de ADN

genómico de forma que nos permita obtener y/o discriminar el ADN genómico de las hairy-

roots del ADN de A. rhizogenes, ya que nuestros resultados muestran que es muy difícil

eliminarlo por completo de las raíces. Además, este resultado evidencia que la

contaminación del control negativo de la transformación ocurrió en la cámara de

crecimiento, y/o a partir de material contaminado (vasos de telgopor, vermiculita, mesada

de trabajo). En el control negativo del experimento (raíces salvajes), como era de esperar,

no se observó la amplificación correspondiente a ninguno de los genes ensayados. En


DISCUSIÓN

conclusión, debemos decir que no se logró re-confirmar mediante esta aproximación los

resultados obtenidos inicialmente mediante microscopía. Sin embargo, los resultados del

análisis Western blot son suficiente evidencia para poder concluir que el criterio tomado

inicialmente para las poblaciones de raíces “positiva o transgénica” y “negativa” es correcto.

Para la población de raíces “positiva o transgénica”, el hecho de haber confirmado la

presencia de GFP ya nos indica que ambos transgenes (ADN-T del vector RI y ADN-T del

vector binario) se insertaron en el genoma de la planta, y que las raíces son efectivamente

hairy-roots. Por otra parte, en el caso de la población de raíces “negativa”, si bien la técnica

de Western blot no nos brinda información (directamente) acerca si hubo o no inserción de

los transgenes, un organismo se considera transformado genéticamente cuando un gen o

grupo de genes se inserta de forma estable en el genoma y se expresa de manera

adecuada (Darbani et al., 2008; Keshavareddy et al., 2018). Por lo tanto, como nuestro fin

era poder identificar el material transgénico para luego poder cuantificarlo, es correcto tomar

como población negativa o no transgénica a aquella que no expresa el transgén, que en

nuestro caso es GFP.


CONCLUSIONES ____________________________

8. Conclusiones

La selección previa de la colonia efectiva es un paso importante para optimizar un

protocolo de transformación mediante A. rhizogenes.

Se logró poner a punto la técnica de transformación transitoria para los tres

genotipos evaluados, obteniéndose plantas transformadas con altas frecuencias,

pero bajas eficiencias.

El análisis de la cinética de aparición de hairy-roots puede dividirse en tres “etapas

o fases”.

No se encontraron diferencias significativas en la eficiencia de transformación entre

los genotipos.

No se pudo establecer ninguna relación entre las variables evaluadas durante el

análisis de la cinética del proceso de aparición de hairy-roots y la eficiencia de

transformación.

Para próximos experimentos deben incluirse dentro de la población de raíces

transgénicas aquellas que presentan una emisión de fluorescencia intermedia.


ANEXO _______________________

9. Anexo

En la tabla 14 se compararon los DAI de cada genotipo en los 3 ensayos. Se

encontraron diferencias significativas en los DAI de los ensayos 1 y 3 en los genotipos

Thorne y TJS2049, respectivamente.

Genotipo Ensayo DAI

Thorne 1 10.9 A

Thorne 2 11.7 A B

Thorne 3 12.4 B

SO7_6557 1 13 A

SO7_6557 2 11.5 A

SO7_6557 3 13.8 B

TJS2049 1 11 A

TJS2049 2 10.5 A

TJS2049 3 13 B

Tabla 14. Comparación de DAI para los

genotipos Thorne, SO7_6557 y TJS2049 en

los 3 ensayos. Se representan con letras

distintas donde hubo diferencias significativas (p

< 0,05).

BIBLIOGRAFÍA


10. Bibliografía

Bahramnejad, B., Naji, M., Bose, R., Jha, S., 2019. A critical review on use of Agrobacterium

rhizogenes and their associated binary vectors for plant transformation. Biotechnol.

Adv. 37, 107405. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.06.004

Balandrin, M.F., Klocke, J.A., Wurtele, E.S., Bollinger, W.H., 1985. Natural plant chemicals:

Sources of industrial and medicinal materials. Science. 228, 1154–1160.

https://doi.org/10.1126/science.3890182

Barampuram S., Zhang, Z.J., 2011. Recent advances in plant transformation, in: Plant

choromosome engineering, ed by James A Birchler. Humana Press, New Delhi, India,

pp 1-35. https://doi.org/10.1007/978-1-61737-957-4_1

Beltrán, J.P., 2005. La ingeniería genética de las plantas cultivadas, clave para mejorar la

nutrición y la salud humanas. An. la Real Acad. Nac. Farm. 71, 587–608

Bourret, R.B., Silversmith, R.E., 2010. Two-component signal transduction. Curr. Opin.

Microbiol. 13, 113–115. https://doi.org/10.1016/j.mib.2010.02.003

Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation the principle of

protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248–254.

https://doi.org/10.1016/j.sbi.2014.10.005

Cao, D., Hou, W., Song, S., Sun, H., Wu, C., et al., 2009. Assessment of conditions affecting

Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean. Plant Cell. Tissue

Organ Cult. 96, 45–52. https://doi.org/10.1007/s11240-008-9458-x

Cardarelli, M., Spanò, L., De Paolis, A., Mauro, M.L., Vitali, G., Costantino, P., 1985.

Identification of the genetic locus responsible for non-polar root induction by

Agrobacterium rhizogenes 1855. Plant Mol. Biol. 5, 385–391.

https://doi.org/10.1007/BF00037559

Charity, J.A., Holland, L., Grace, L.J., Walter, C., 2005. Consistent and stable expression of

the nptII, uidA and bar genes in transgenic Pinus radiata after Agrobacterium

tumefaciens-mediated transformation using nurse cultures. Plant Cell Rep. 23, 606–

BIBLIOGRAFÍA


616. https://doi.org/10.1007/s00299-004-0851-6

Chen, L., Cai, Y., Liu, X., Guo, C., Sun, S., et al., 2018. Soybean hairy roots produced in

vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Crop J. 6, 162–171.

https://doi.org/10.1016/j.cj.2017.08.006

Cho, H.J., Farrand, S.K., Noel, G.R., Widholm, J.M., 2000. High-efficiency induction of

soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta 210, 195–

204. https://doi.org/10.1007/PL00008126

Clough, S.J., Bent, A.F., 1998. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated

transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735–743.

https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.1998.00343.x

Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Lutke, W.K., Taylor, C.G., 2005. Ex vitro composite plants:

An inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. 43, 449–457.

https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2005.02454.x

Conn, H.J., 1942. Validity of the genus alcaligenes. J. Bacteriol. 44, 353–360.

Cramer, C.L., Boothe, J.G., Oishi, K.K., 1999. Transgenic plants for therapeutic proteins:

Linking upstream and downstream strategies. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240, 95–

118. https://doi.org/10.1007/978-3-642-60234-4_5

Darbani, B., Farajnia, S., Toorchi, M., Zakerbostanabad, S., Noeparvar, S., Stewart Jr., C.N.,

2008. DNA-delivery methods to produce transgenic plants. Biotechnol. 7, 385-402.

https://doi.org/10.3923 / biotech.2008.385.402

De Bolle, M.F.C., Butaye, K.M.J., Coucke, W.J.W., Goderis, I.J.W.M, Piet F.J. Wouters,

P.F.J., et al., 2003. Analysis of the influence of promoter elements and a matrix

attachment region on the inter-individual variation of transgene expression in

populations of Arabidopsis thaliana. Plant Sci. 165, 169–179.

https://doi.org/10.1016/S0168-9452(03)00156-0

DeCleene, M., DeLey, J., 1976. The host range of crown gall. Bot. Rev. 42, 389–466.

https://doi.org/10.1007/BF02860827

DeCleene, M., DeLey, J., 1981. The host range of infectious hairy-root. Bot. Rev. 47, 147–

BIBLIOGRAFÍA


194.

DIEA 2016. Anuario estadístico. http://www.mgap.gub.uy/unidad-organizativa/oficina-

deprogramacion-y-politicas-agropecuarias/publicaciones/anuarios-diea/anuario2016

Diouf, D., Gherbi, H., Prin, Y., Franche, C., Duhoux, E., Bogusz, D., 1995. Hairy root

nodulation of Casuarina glauca: A system for the study of symbiotic gene expression

in an actinorhizal tree. Mol. Plant-Microbe Interact. https://doi.org/10.1094/MPMI-8-

0532

Droste, A., Pasquali, G., Bodanese-Zanettini, M.H., 2000. Integrated bombardment and

Agrobacterium transformation system: an alternative method for soybean

transformation. Plant Mol. Biol. Report. 18, 51–59. https://doi.org/10.1007/BF02825294

Estrada-Navarrete, G., Alvarado-Affantranger, X., Olivares, J.E., Díaz-Camino, C., Santana,

O., et al., 2006. Agrobacterium rhizogenes transformation of the Phaseolus spp.: A tool

for functional genomics. Mol. Plant-Microbe Interact. 19, 1385–1393.

https://doi.org/10.1094/MPMI-19-1385

Falasca, G., Reverberi, M., Lauri, P., Caboni, E., De Stradis, A., Altamura, M.M., 2000. How

Agrobacterium rhizogenes triggers de novo root formation in a recalcitrant woody plant:

An integrated histological, ultrastructural and molecular analysis. New Phytol. 145, 77–

93. https://doi.org/10.1046/j.1469-8137.2000.00558.x

Flores-Félix, J.D., Menéndez, E., Peix, A., García-Fraile, P., Velázquez, E., 2019. History

and current taxonomic status of genus Agrobacterium. Syst Appl Microbiol. 43:126046.

https://doi.org/10.1016/j.syapm.2019.126046

Flores, H.E., Vivanco, J.M., Loyola-vargas, V.M., 1999. 'Radicle' biochemistry: the biology

of root-specific metabolism. Trends Plant Sci. 4:220-226. https://doi.org/

10.1016/s1360-1385(99)01411-9

Gad, A.E., Rosenberg, N., Altman, A., 1990. Liposome-mediated gene delivery into plant

cells. Physiol. Plant. 79, 177–183. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1990.tb05883.x

Gao, C., Long, D., Lenk, I., Nielsen, K.K., 2008. Comparative analysis of transgenic tall

fescue (Festuca arundinacea Schreb.) plants obtained by Agrobacterium-mediated

http://www.mgap.gub.uy/unidad-organizativa/oficina-deprogramacion-y-politicas-agropecuarias/publicaciones/anuarios-diea/anuario2016

http://www.mgap.gub.uy/unidad-organizativa/oficina-deprogramacion-y-politicas-agropecuarias/publicaciones/anuarios-diea/anuario2016

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31818496

http://sci-hub.cc/10.1016/j.syapm.2019.126046


https://doi.org/10.1016/s1360-1385(99)01411-9

BIBLIOGRAFÍA


transformation and particle bombardment. Plant Cell Rep. 27, 1601–1609.

https://doi.org/10.1007/s00299-008-0578-x

Gelvin, S.B., 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and

integration. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 51, 223–256.

Gelvin, S.B., 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the

“gene-jockeying” tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16–37.

https://doi.org/10.1128/MMBR.67.1.16

Georgiev, M.I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J., 2012. Genetically transformed roots:

From plant disease to biotechnological resource. Trends Biotechnol. 30, 528–537.

https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2012.07.001

Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S., 2007. Viral vectors for the expression of proteins in

plants. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134–141.

https://doi.org/10.1016/j.copbio.2007.03.002

Gleba, Y., Marillonnet, S., Klimyuk, V., 2004. Engineering viral expression vectors for plants:

The “full virus” and the “deconstructed virus” strategies. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 182–

188. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2004.01.003

Granados, C.D., Chaparro-Giraldo, A., 2012. Métodos de transformación genética de

plantas. U.D.C.A Actual. Divulg. Científica 15, 49–61.

Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P.K., Rideau, M., Gantet, P., 2006. Hairy root

research: recent scenario and exciting prospects. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 341–346.

https://doi.org/10.1016/j.pbi.2006.03.008

Hansen, G., Das, A., Chilton, M.D., 1994. Constitutive expression of the virulence genes

improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium. Plant Biol. 91, 7603–

7607. https://doi.org/10.1073/pnas.91.16.7603

Hansen, J., Jørgensen, J.E., Stougaard, J., Marcker, K.A., 1989. Hairy roots - a short cut to

transgenic root nodules. Plant Cell Rep. 8, 12–15. https://doi.org/10.1007/BF00735768

Heldt, H.-W., Piechulla, B., 2011. Biotechnology alters plants to meet requirements of

agriculture, nutrition and industry, in: Plant Biochemistry. Academic Press, pp 551–586.

http://sci-hub.cc/10.1073%2Fpnas.91.16.7603

BIBLIOGRAFÍA


https://doi.org/10.1016/b978-0-12-384986-1.00022-3

Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H., 2000. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.

Trends Plant Sci. 5, 446–451. https://doi.org/10.1016/S1360-1385(00)01740-4

Hernandez-Garcia, C.M., Martinelli, A.P., Bouchard, R.A., J.Finer, J., 2009. A soybean

(Glycine max) polyubiquitin promoter gives strong constitutive expression in transgenic

soybean. Plant Cell Rep. 837–849. https://doi.org/10.1007/s00299-009-0681-7

Hiei, Y., Komari, T., 2006. Improved protocols for transformation of indica rice mediated by

Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue Organ Cult. 85, 271–283.

https://doi.org/10.1007/s11240-005-9069-8

Hienchee, M.A.W., Connor-Ward, D. V., Newell, C.A., McDonnell, R.E., Sato, S.J., et al.,

1988. Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA

transfer. Nat. Biotechnol. 6, 709–712. https://doi.org/10.1038/nbt0988-1065

Hildebrand, E., 1934. Life history of the hairy-root organism in relation to its pathogenesis

on nursery apple trees. J. Agric. Res. 48, 857–885.

Hwang, H.-H., Yu, M., Lai, E.-M., 2017. Agrobacterium-mediated plant transformation:

biology and applications. Arab. B. 15, e0186. https://doi.org/10.1199/tab.0186

Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B., 2005. Suppression of allene

oxide cyclase in hairy roots of Medicago truncatula reduces jasmonate levels and the

degree of mycorrhization with Glomus intraradices. Plant Physiol. 139, 1401–1410.

https://doi.org/10.1104/pp.105.069054

Jhansi Rani, S., Usha, R., 2013. Transgenic plants: Types, benefits, public concerns and

future. J. Pharm. Res. 6, 879–883. https://doi.org/10.1016/j.jopr.2013.08.008

Jia, Y., Yao, X., Zhao, M., Zhao, Q., Du, Y., et al., 2015. Comparison of soybean

transformation efficiency and plant factors affecting transformation during the

Agrobacterium infection process. Int. J. Mol. Sci. 16, 18522–18543.

https://doi.org/10.3390/ijms160818522

Jualang Azlan, G., Marziah, M., Radzali, M., Johari, R., 2002. Establishment of Physalis

BIBLIOGRAFÍA


minima hairy roots culture for the production of physalins. Plant Cell, Tissue Organ Cult.

69, 271–278. https://doi.org/10.1023/A:1015662118877

Kikkert, J.R., Vidal, J.R., Reisch, B.I., 2005. Stable transformation of plants cells by particle

bombardment/biolistics, in: Transgenic Plants: Methods and protocols. Methods in

Molecular Biology, ed by Peña L. Humana Press, pp 61–78. https://doi.org/10.1385/1-

59259-827-7:061

Kereszt, A., Li, D., Indrasumunar, A., Nguyen, C.D.T., Nontachaiyapoom, S., Kinkema, M.,

Gresshoff, P.M., 2007. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean

to study root biology. Nat. Protoc. 2, 948–952. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.141

Keshavareddy, G., Kumar, A.R.V., S. Ramu, V., 2018. Methods of plant tansformation- A

review. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci. 7, 2656–2668.

https://doi.org/10.20546/ijcmas.2018.707.312

Krassowska, W., Filev, P.D., 2007. Modeling electroporation in a single cell. Biophys. J. 92,

404–417. https://doi.org/10.1529/biophysj.106.094235

Krenek, P., Samajova, O., Luptovciak, I., Doskocilova, A., Komis, G., Samaj, J., 2015.

Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles,

methods and applications. Biotechnol. Adv. 33, 1024–1042.

https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.03.012

Królicka, A., Staniszewska, I., Bielawski, K., Maliński, E., Szafranek, J., Lojkowska, E., 2001.

Establishment of hairy root cultures of Ammi majus. Plant Sci. 160, 259–264.

https://doi.org/10.1016/S0168-9452(00)00381-2

Liener, I.E., 1994. Implications of antinutritional components in soybean foods. Crit Rev

Food Sci Nutr. 34, 31-67. https://doi.org/10.1080/10408399409527649

Lin, M.H., Gresshoff, P.M., Indrasumunar, A., Ferguson, B.J., 2011. PHairyRed: A novel

binary vector containing the DsRed2 reporter gene for visual selection of transgenic

hairy roots. Mol. Plant 4, 537–545. https://doi.org/10.1093/mp/ssq084

Liu, Y., Yang, H., Sakanishi, A., 2006. Ultrasound: Mechanical gene transfer into plant cells

by sonoporation. Biotechnol. Adv. 24, 1–16.



BIBLIOGRAFÍA



Maliga, P., 2004. Plastid transformation in higher plants. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 289–

313. https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.55.031903.141633

Manavalan, L.P., Guttikonda, S.K., Phan Tran, L.S., Nguyen, H.T., 2009. Physiological and

molecular approaches to improve drought resistance in soybean. Plant Cell Physiol.

50, 1260–1276. https://doi.org/10.1093/pcp/pcp082

Marjamaa, K., Hildén, K., Kukkola, E., Lehtonen, M., Holkeri, H., et al., 2006. Cloning,

characterization and localization of three novel class III peroxidases in lignifying xylem

of Norway spruce (Picea abies). Plant Mol. Biol. 61, 719–732.

https://doi.org/10.1007/s11103-006-0043-6

McBlain BA, Fioritto RJ, St Martin SK, Calip-Dubois AJ, Schmitthenner AF, et al., 2003.

Registration of ‘Thorne’ Soybean. Crop Sci. 33, 6.

Moeller, L., Wang, K., 2008. Engineering with precision: Tools for the new generation of

transgenic crops. Bioscience 58, 391–401. https://doi.org/10.1641/b580506

Mohammadi-Dehcheshmeh, M., Ebrahimie, E., Tyerman, S.D., Kaiser, B. N., 2014. A novel

method based on combination of semi- in vitro and in vivo conditions in Agrobacterium

rhizogenes-mediated hairy root transformation of Glycine species. In Vitro Cell Dev-Pl.

50, 282–291. https://doi.org/10.1007/s11627-013-9575-z

Morikawa, H., Yamada, Y., 1985. Capillary microinjection into protoplasts and intranuclear

localization of injected materials. Plant Cell Physiol. 26, 229–236.

https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.pcp.a076901

Morriss, S.C., Studham, M.E., Tylka, G.L., MacIntosh, G.C., 2017. Validation of a hairy roots

system to study soybean-soybean aphid interactions. PLoS One 12, 1–12.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174914

Mugnier, J., 1988. Establishment of new axenic hairy root lines by inoculation with

Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Rep. 7, 9–12.

https://doi.org/10.1007/BF00272966

Ososki, A.L., Kennelly, E.J., 2003. Phytoestrogens: A review of the present state of

BIBLIOGRAFÍA


research. Phyther. Res. 17, 845–869. https://doi.org/10.1002/ptr.1364

Ozyigit, I.I., Dogan, I., Artam Tarhan E., 2013. Agrobacterium rhizogenes-mediated

transformation and its biotechnological applications in crops, in: Crop improvement:

New approaches and modern techniques, ed by K. R. Hakeem et al. Springer. pp 1-

48. https://doi.org/DOI 10.1007/978-1-4614-7028-1_1

Paz, M.M., Martinez, J.C., Kalvig, A.B., Fonger, T.M., Wang, K., 2006. Improved

cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for

efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation. Plant Cell Rep. 25, 206–

213. https://doi.org/10.1007/s00299-005-0048-7

Porter, J.R., Flores, K., 1991. Host range and implications of plant infection by

Agrobacterium rhizogenes. Crit. Rev. Plant Sci. 10, 387–421.

http://dx.doi.org/10.1080/07352689109382318

Quiroz-Chávez, J., García-Pérez, L.M., Quiroz-Figueroa, F.R., 2012. Mejoramiento vegetal

usando genes con funciones conocidas. Ra Ximhai 8, 79–92.

https://doi.org/10.35197/rx.08.03.e2.2012.08.jq

Rao, A.Q., Bakhsh, A., Kiani, S., Shahzad, K., Shahid, A.A., et al., 2009. The myth of plant

transformation. Biotechnol. Adv. 27, 753–763.


Rao, S.R., Ravishankar, G.A., 2002. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary

metabolites. Biotechnol. Adv. 20, 101–153. https://doi.org/10.1016/S0734-

9750(02)00007-1

Richards, H.A., Halfhill, M.D., Millwood, R.J., Stewart, C.N., 2003. Quantitative GFP

fluorescence as an indicator of recombinant protein synthesis in transgenic plants.

Plant Cell Rep. 22, 117–121. https://doi.org/10.1007/s00299-003-0638-1

Robert, G., Muñoz, N., Alvarado-affantranger, X., Saavedra, L., Davidenco, V., 2018.

Phosphatidylinositol 3-kinase function at very early symbiont perception : A local

nodulation control under stress conditions ? J. Exp. Bot.

https://doi.org/10.1093/jxb/ery030

BIBLIOGRAFÍA


Sakai, T., Kogiso, M., 2008. Soy isoflavones and immunity. J. Med. Investig. 55, 167–173.

https://doi.org/10.2152/jmi.55.167

Savka, M.A., Ravillion, B., Noel, G.R., Farrand, S., 1990. Induction of hairy roots on

cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode.

Phytopathology 80, 503– 508. https://doi.org/10.1094/Phyto-80-503

Sharma, K.K., Bhatnagar-Mathur, P., Thorpe, T.A., 2005. Genetic transformation

technology: Status and problems. In Vitro Cell Dev-Pl 41, 102–112.

https://doi.org/10.1079/IVP2004618

Stacey, G., Parrott, W.A., Vodkin, L., Shoemaker, R.C., 2008. Draft Plan for Soybean

Genomics National Science Foundation-Sponsored Workshop Report . Draft Plan for

Soybean Genomics 1. Plant Physiol 135, 59–70.

https://doi.org/10.1104/pp.103.037903.1

Stewart, C.N., Touraev, A., Citovsky, V., Tzfira, T., (Ed.). 2011. Plant Transformation

Technologies. Wiley-Blackwell. https://doi.org/10.1002/9780470958988

Tague, B.W., Mantis, J., 2006. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum

infiltration. Methods Mol. Biol. 323, 215–223. https://doi.org/10.1385/1-59745-003-

0:215

Tepfer, D., Metzger, L., Prost, R., 1989. Use of roots transformed by Agrobacterium

rhizogenes in rhizosphere research: applications in studies of cadmium assimilation

from sewage sludges. Plant Mol. Biol. 13, 295–302.

https://doi.org/10.1007/BF00025317

Travella, S., Ross, S.M., Harden, J., Everett, C., Snape, J.W., Harwood, W.A., 2005. A

comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and

Agrobacterium-mediated techniques. Plant Cell Rep. 23, 780–789.

https://doi.org/10.1007/s00299-004-0892-x

Tzfira, T., Li, J., Lacroix, B., Citovsky, V., 2004. Agrobacterium T-DNA integration: Molecules

and models. Trends Genet. 20, 375–383. https://doi.org/10.1016/j.tig.2004.06.004

Umezawa, T., Sakurai, T., Totoki, Y., Toyoda, A., Seki, M., et al., 2008. Sequencing and

http://sci-hub.cc/10.1094/Phyto-80-503

BIBLIOGRAFÍA


analysis of approximately 40,000 soybean cDNA clones from a full-length-enriched

cDNA library. DNA Res. 15, 333–346. https://doi.org/10.1093/dnares/dsn024

Vasil, I.K., 2008. A short history of plant biotechnology. Phytochem. Rev. 7, 387–394.

https://doi.org/10.1007/s11101-007-9075-z

Veena, V., Taylor, C.G., 2007. Agrobacterium rhizogenes: recent developments and

promising applications. In Vitro Cell Dev-Pl 43, 383–403.

https://doi.org/10.1007/s11627-007-9096-8

Winans, S.C., 1992. Two-way chemical signaling in Agrobacterium-plant interactions 56,

12–31.

Wright, M.S., Koehler, S.M., Hinchee, M.A., Carnes, M.G., 1986. Plant regeneration by

organogenesis in Glycine max. Plant Cell Rep. 5, 150–154.

https://doi.org/10.1007/BF00269257

Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R., 2005. Optimization of Agrobacterium-

mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant

Biotechnol. J. 3, 259–273. https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2005.00123.x

Xiang, T., Wang, S., Li, Y., Zhang, T., Wu, D., Zhou, S., 2016. Cucumopine type

Agrobacterium rhizogenes K599 (Ncppb2659) T-DNA mediated plant transformation

and Its application. Bangladesh J. Bot. 45, 935–945.

Yamada, T., Takagi, K., Ishimoto, M., 2011. Recent advances in soybean transformation

and their application to molecular breeding and genomic analysis. Breed. Sci. 61, 480–

494. https://doi.org/10.1270/jsbbs.61.480

Yibrah, H.S., Grönroos, R., Lindroth, A., Franzén, H., Clapham, D., Von Arnold, S., 1996.

Agrobacterium rhizogenes-mediated induction of adventitious rooting from Pinus

contorta hypocotyls and the effect of 5-azacytidine on transgene activity. Transgenic

Res. 5, 75–85. https://doi.org/10.1007/BF01969425

Yoon, C.S., Park, J.H., 2010. Ultrasound-mediated gene delivery. Expert Opin Drug Deliv 7,

321–330. https://doi.org/10.1517/17425241003596329

Zhang, Y., Yin, X., Yang, A., Li, G., Zhang, J., 2005. Stability of inheritance of transgenes in

BIBLIOGRAFÍA


maize (Zea mays L.) lines produced using different transformation methods. Euphytica

144, 11–22. https://doi.org/10.1007/s10681-005-4560-1

Ziemienowicz, A., 2014. Agrobacterium-mediated plant transformation: Factors,

applications and recent advances. Biocatal. Agric. Biotechnol. 3, 95–102.

https://doi.org/10.1016/j.bcab.2013.10.004

Zimmermann, U., Pilwat, G., Riemann, F., 1974. Dielectric breakdown of cell membranes.

Biophys. J. 14, 881–899. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(74)85956-4

Zupan, J., Muth, T.R., Draper, O., Zambryski, P., 2000. The transfer of DNA from

Agrobacterium tumefaciens into plants: A feast of fundamental insights. Plant J. 23,

11–28. https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.2000.00808.x

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Eficiencia de la Transgénesis Transitoria en Genotipos de