1

Raport Stiintific Sintetic

Proiect 184 / 2011

(intocmit pentru toata perioada de executie a proiectului 2011 - 2016)

Peroxinitritul: Relevanta pentru Siguranta Alimentara si Noua Metoda de Detectie Electrochimica

(Peroxynitrite: Relevance for Food Safety and Novel Electrochemical Detection)”

Acest raport este structurat pe Milestone-uri (M) si Task-uri (T) conform planului de lucru.

Scopul si motivatia proiectului

Unul din scopurile acestui proiect de cercetare exploratorie a constat in dezvoltarea de noi

senzori electrochimici pentru determinarea sensibila si selective a peroxinitritului (PON) precum

si pentru investigarea rolului acestuia in modularea oxidarii oximioglobinei si conversia la

metmioglobina in tesutul scheletal muscular post- mortem (muschiul de carne, ca aliment), care

duce la acea culoare bruna a carnii cruda corelata cu lipsa de prospetime. Senzori electrochimici

elaborati in acest proiect pot fi optimizati si miniaturizati pentru monitorizarea dinamicii unor

specii nitro-oxidative (ca peroxinitritul) in alimente, cu perspective de a intelege mai bine

implicatiile pentru calitatea si siguranta alimentara. De asemenea, acesti senzori electrochimici

vor putea fi studiati si ca posibile alternative bioanalitice in studiul actiunii compusilor nitro-

oxidativi, inclusiv in domeniu toxicitatii de mediu sau clinic-medical.

Descrierea sintetica a rezultatelor proiectului structurate pe Milestone-uri (M)

si Task-uri (T), conform planului de lucru M1. Sinteza si caracterizarea filmelor electrocatalitice peroxinitrit (PON)-senzitive

(T1) Prepararea peroxynitritului (PON) s-a efectuat in doua variante: prin sinteza din

componente si prin eliberarea sa dintr-un complex chimic.

2

In prima varianta, peroxinitritul a fost sintetizat din anion hidroperoxid in faza apoasa si de izoamil

nitrit in faza organica [12]. «Semnatura» PON este ilustrata in Figura 1 prin peak-ul de absorptie

in UV la 302 nm.

A doua metoda consta in generarea de PON prin eliberare graduala din complexul 3-

morpholinosydnonimine (SIN-1) preparat in solutia tampon, in prezenta oxigenului atmosferic,

conform reactiei din figura 2 dreapta [13].

Figura 1. Sinteza PON este masurata prin cresterea peak-ului de absorptie a PON (a.u.) in timp

(stinga) si respectiv este generat de complexul SIN-1 in prezenta oxigenului atmosferic

(dreapta).

Doua aspecte sunt absolut esentiale de cunoscut in detectia peroxynitritului: (i) natura analitului

(PON) sintetizat din componente sau eliberat de complexul donator si (ii) modul de folosire din

solutie.

(T2) Prepararea si caracterizarea filmelor PON-senzitive pe electrozi s-a realizat cu mai

multe variante de filme si de electrozi.

Astfel, in cazul utilizarii carbunelui sticlos (glassy carbo) ca electrod de lucru (WE) au fost

investigate filme bazate pe: hemina (Hm); Hm–PEDOT (polyethylenedioxythiophene); oxid de

grafena redusa-hemina (rGO-Hm). Au fost testate mai multe metode de depunere a filmelor pe

electrozi: picatura aplicata pe suprafata electrodului urmata de evaporarea solventului (drop-

casting), aplicare prin imersare in solutie (dip-coating), electropolimerizare cu electrodul

imersat in solutie, si depunerea pe electrod din solutie cu evaporare in plasma (MAPLE).

Primele rezultatele obtinute au inclus prepararea unor filme de hemina (Hm), prin depunere

electrochimica din solutie [14]. Astfel, Figura 2 prezintă o voltamograma ciclică (CV) tipica

pentru monomerul de hemina 1,5 mM in diclormetan cu 0,1 M tetrafluoroborat de

tetrabutilamoniu ca electrolit suport, pentru o viteza de scanare de 0,1 V/s. Reducerea cvasi-

3

reversibilă a Heminei inregistrata la aprox. -0,4 V vs Ag/AgCl are la baza fierul si corespunde

cuplului redox FeIII/FeII.

Figura 2. Voltamograma ciclica (CV) in solutie de 1.5 mM hemina monomer in diclormetan cu

0,1 M tetrafluoroborat de tetrabutilamoniu ca electrolit suport si viteza de scanare de

0,1 V/s (partea stinga). Scanari CV consecutive pe ramura oxidative in aceeasi solutie

evidentiaza formarea unui film de hemina polimerizata prin electro-depunere pe

suprafata electrodului de lucru (WE) imersat in solutia de monomer (dreapta).

M2. Optimizarea filmelor electrocatalitice peroxinitrit (PON) -senzitive

(T3) Modificarea electrozilor de lucru a presupus mai intii In urma testele preliminare

voltametrice si amperometrice, inclusiv raspunsul la potentiale specii interferente.

In Figura 3A se pot observa curbele de raspuns ale Hm-GCE la PON si oxid de azot (NO).

Eventualele interferente la nitrit si nitrat s-au investigat prin CV pentru Hm-GCE in solutii

tampon in prezenta a 400 µM PON. Cum arata si figura 3B, s-au comparat raspunsul aceluiasi

electrod Hm- GCE la 1 mM nitrit si 1 mM nitrat la viteza de scanare 150 mV/s.

Figura 3. (A) Curbele de raspuns ale Hm-GCE la PON si NO; (B) CV-uri ale Hm-GCE in solutii

tampon in prezenta a 400 µM PON si comparat cu raspunsul la 1 mM nitrit si 1 mM nitrat la

viteza de scanare 150 mV/s.

4

(T4) Validarea senzorilor electrochimici cu peroxinitrit (PON) in solutii tampon s-a realizat

si printr-un studiu complex al proprietatilor electrocatalitice ale filmului de hemina in interactie

cu PON.

In testele de voltametrie ciclica, raspunsul filmului de Hm la adaugarea de PON prezinta un peak

de oxidare la 1070 mV vs. Ag/AgCl, in prezenta a 0,45 mM PON in solutie tampon. Acest peak

nu este observat pentru electrozii nemodificati «bare» care au un raspuns mai slab definit si

produs doar la potentiale peste 1350 mV vs. Ag/AgCl. Varful curentului valului voltametric dat

de electrodul cu Hm in prezenta PON, raportat la acelasi curent masurat in absenta PON,

determina eficienta catalitica (raportul I/Io). Acest raport I/Io depinde invers proportional de

viteza de scanare, adica o comportare tipica unui proces electrocatalitic la care oxidarea PON

este mediata de filmul de Hm polimerizata (Figura 4).

Figura 4. (A) Dependenta eficientei catalitice I/Io de log. vitezei de scanare pentru un GCE modificat

(Hm- GCE) cu hemina in solutie tampon la concentratii de 0,55; 0,90; 1,45 mM de PON. (B)

Comportarea I/Io ca functie de concentratia de PON la 0,15 V/s viteza de scanare, corespunde

cu modelul Michaelis-Menten pentru un KM de 0,7 mM. Graficul inserat reprezinta variant

Lineweaver-Burk („‟double-reciprocal plot‟‟) tot pentru KM de 0,7 mM. (C) Raspuns CV

tipic al unui Hm-GCE in solutie tampon pentru 40-460 mM PON la 150 mV/s viteza de

scanare. Graficul inserat reprezinta potentialul varfului de curent catalitic ca functie de

concentratia de PON. (D) Raspuns amperometric tipic al Hm-GCE, polarizat la +0,7 V vs

Ag/AgCl. Curba de calibrare este inserata.

5

(T5) Caracterizarea (macro) senzorilor, limita detectie, timpu raspuns, domeniului masura

facuta initial, a relevat necesitatea unei optimizari si gasirea de solutii de imbunatatire in special

a limitei de detectie.

Astfel, s-a decis studiul, sinteza si utilizarea grafenei reduse (rGO) prin incorporarea rGO cu

hemina (Hm) in compusi rGO-Hm. La obtinerea complexului rGO-Hm s-a folosit o metoda

«prietenoasa cu mediul» de reducere a grafenei GO fara a folosi hidrazina sau alti compusi

toxici. In plus, complexul rGO-Hemin obtinut a dovedit o sensibiltate ridicata pentru peroxinitrit

[21,22] .Complexul a fost caracterizat prin spectrofotometrie UV-VIS si comparat cu

spectrele obtinute pentru hemina si GO. Caracterizarea filmelor si senzitivitatea la PON pentru

GCE modificati cu rGO/Hemin (albastru), GCE modificat cu rGO si apoi imersat in solutie de

hemina pentru 12 ore (rosu) si GCE curat (negru) in solutie tampon in care s-a barbotat azot s-a

realizat prin voltametrie ciclica la 100 mV/s viteza de scanare este prezentata in Figura 5.

Figura 5. (B) CV pentru GCE modificati cu rGO/Hemin (albastru), GCE modificat cu rGO si apoi

imersat in solutie de hemina pentru 12 ore (rosu) si GCE curat in solutie tampon in care s-

a barbotat azot, voltamograma realizata la 100 mV/s viteza de scanare. (C) CV in

prezenta a 200 nM SIN-1 pentru GCE modificati cu complexul rGO/Hemin (albastru) si

cu rGO si imersat in hemina (negru), viteza de scanare 100 mV/s.

In Figura 6 sunt reprezentate: amperomerograma obtinuta pentru GCE modificat cu rGO-Hm

la adaugarea de 5 nM PON la potential de 1.1 V vs. Ag/AgCl. si curbele de calibrare pentru

GCE modificati cu complexul rGO-Hm (albastru) si cu rGO si imersat in Hm (rosu) in

prezenta de PON obtinut din SIN-1.

6

Figura 6. (A) Amperometria pentru GCE modificat cu complexul rGO-Hm la aditia de 5 nM PON la

potential de 1.1 V vs. Ag/AgCl. (B) Curbe de calibrare pentru GCE modificati cu complexul

rGO-Hm (albastru) si cu rGO si imersat in Hm (rosu) in prezenta de PON obtinut din SIN-1.

O alta strategie de realizare a filmelor sensitive pentru PON s-a bazat pe Evaporarea Laser

Pulsata Asistata in Matrice (Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation, sau MAPLE) folosind

un laser Nd-YAG 266 nm in puls de 6 ns, cu fluenta de 400 mJ/cm2, la o distanta dintre tinta

si substrat de 3-4 cm, cu frecvente de 10 Hz. Filme de grafena redusa (rGO) cu hemina (rGO-

hemin) au fost depuse cu MAPE in vacuum din solutii 1,0 % w/w concentratie in dimetil

formamida (DMF) ca solvent. Morfologia tipica a filmelor depuse pe suprafata difera

substantial in functie de tipul de material: rGO, hemina, sau rGO-hemina. Mai precis, filmele

obtinute din solutii de hemina par sa fie netede, iar prezenta rGO pare sa genereze straturi

tridimensionale cu pori ocazionali. Diferentele par sa fie corelate cu miscibilitatea imperfecta

a solutiei de pornire pentru rGO si pentru rGO-hemina, prin comparatie cu solutiile de

hemina. Aceasta observatie este confirmata de analiza imaginilor tridimensionale AFM pentru

filme depuse cu MAPLE pe suprafata de siliciu sunt ilustrate in Figura 7 pentru rGO (a),

hemina (b) si (c) rGO-hemina. Pentru suprafata filmelor de rGO s-a calculat o rugozitate tipica

de 447 nm, prin comparatie cu 23 nm pentru filmele de hemina si 50 nm pentru filmele

obtinute din solutii avind complexul (rGO-hemina). Se presupune ca exista o corelatie intre

aceste valori ale rugozitatii si parametrii de perfromanta a filmelor, ca: senzitivitate

(sensibilitate) sau durabilitatea sau durata de viata (lifetime).

7

Figura 7. Imagini tridimensionale o b t i n u t e p r i n microscopie de forta atomica (atomic force

microscopy, AFM) pentru filme realizate cu metoda MAPLE din solutii de (a) rGO; (b)

hemina; (c) rGO-hemina dizolvate in dimetil formamida (DMF). Suprafata filmelor de rGO

au tipic rugozitatea de 447 nm, comparat cu 23 nm pentru hemina si 50 nm pentru

complexul rGO-hemina

Raspunsul filmelor de hemina (Hm) si rGO-hemina (rGO-Hm) depuse prin metoda MAPLE pe

GCE au fost interogate cu voltametrie ciclica (CV) in prezenta solutiilor de peroxinitrit avind

concentratiile de 0 (zero); 0,17; 0,31; 0,60 ;1,00; si 1,43 nM si au prezentat peak-uri de reducere

si oxidare, ca in Figura 8.

Figura 8. (A) Raspunsul filmelor de Hm si rGO-Hm depuse prin metoda MAPLE pe GCE au fost

interogate cu voltametrie ciclica (CV) in prezenta solutiilor de PON cu concentratiile de 0

(zero); 0,17; 0,31; 0,60 ; 1,00; si 1,43 nM si au prezentat peak-uri de reducere si oxidare;

(B) Amperograma tipica s-a facut cu polarizarea WE la 1,17 V vs Ag/AgCl si arata si

reversibilitatea raspunsului; (C) Curbele de calibrare indica o crestere de 2 ori a

senzitivitatii la PON la filmul rGO-Hm in comparatie cu filmul de Hm fara rGO.

8

M3. Cuantificarea prezentei peroxinitritului in solutie tampon pe medii model in situ si in

timp real

(T6) Micro-miniaturizarea senzorilor s-a realizat inclusiv prin prepararea unui electrod de

lucru (WE) din fibra de Carbon de 10 sau 30 µM diam. incastrate etans prin topire in sticla, cu un

fir de contact electric. Electrozii auxiliar (Aux) si de referinta (Ref) au fost aceiasi pentru moment,

respectiv Platina si Ag/AgCl – impreuna denumit microsenzor cu fibra de carbune (µFE) [23]. De

asemenea, au fost utilizati si sezori serigrafiati modificati cu diversi mediatori chimici.

Au fost folosite diferite materialele pentru senzorii FSSP (film senzitiv si selectiv pentru

peroxinitrit) cum ar fi cobalt ftalocianina [24]. Astfel, ne-am propus in exploatarea cuplului redox

Co2+

/ Co1+

, deoarece acesta apare la potentiale mai negative decat cuplul Co3+

/ Co2, iar pe langa

sensibilitate, putea fi atinsa o selectivitate deosebita pentru peroxinitrit, in detrimentul altor specii

interferente. Senzorii au fost caracterizati din punct de vedere fizico-chimic folosind tehnicile SEM

(Figura 9) si FT-IR,precum si din punct de vedere electrochimic.

A

B

C

D E

Figura 9. Micrografii SEM pentrusenzorii:(A) SPCE nemodificat, (B) SPCE/CoPc, (C) SPC/CoPcE,

(D) SPCNFE unmodificat, (E) SPCNFE/CoPc.

9

(T7) Testare (micro)senzori electrochimici cu peroxinitrit (ONOO-) in solutie tampon

Voltametria ciclica (CV) s-a folosit pentru a determina potentialele la care raspunde peroxinitritul cu

ajutorul electrozilor serigrafiati de grafit (SPCE nemodificati si modificati cu CoPc) si electrozii

serigrafiati de grafit si de nanofibre grafitizate de carbon (SPCNFE nemodificati si modificati cu

CoPc). Astfel, in urma experimentelor efectuate s-a identificat un pic de oxidare pentru peroxinitrit

cu un maxim la cca. 0,2 V pentru SPCE/CoPc si la 0,1 V pentru SPCNF/CoPc. Electrozii

nemodificati nu prezinta nici un raspuns pentru peroxinitrit in intervalul ales ( intre -0.2 V si 0.6V).

(Figura 8).

Figura 8. (A). Voltametrie ciclica in solutie tampon (PBS pH 9) a electrozilor SPCNF/CoPc in absenta

(rosu) si in prezenta de peroxinitrit 780 M (albastru). (B) Voltametrie ciclica in solutie tampon

(PBS pH 9) a electrozilor SPCE nemodificati, respectiv SPCE/CoPc in absenta (verde, respectiv

negru) si in prezenta de peroxinitrit 780 M (rosu, respectiv albastru).

(T8) Caracterizare: timp de raspuns, interval de masurare, limita de detectie a

microsenzorilor FSSP

Folosind intervalul de potential de la -1.0 V la 1.0 V in voltametrie ciclica (CV), microsenzorul

SPCE/CoPc a fost caracterizat mai intai in solutie salina de tampon fosfat (PBS pH 7.4) in absenta si

in prezenta de SIN-1 25 mM. S-a observat ca oxidarea speciilor Co1+

la speciile Co2+

au creat un

efect electrocatalitic pentru peroxinitrit, ducand la aparitia picului de oxidare la +0.35 V, si

reducerea acestor specii, unui pic de reducere la potentialul -0.75 V (Figura 9A). Amperometria a

fost folosita pentru a determina limita de detectie (400 nM) si sensibilitatea electrodului. Doua

domenii liniare au fost observate, cu sensibilitati diferite: (i) 0.450 µM - 31.6µM cu o sensibilitate

de 0.0729 ± 0.003 µA/µM, si (ii) 31.6 µM - 67 µM cu o sensibilitate de 0.0325 ± 0.0012µA/µM

(Figura 9B). Aceste domenii sunt adecvate masuratorilor in vitro.

(A)

(B)

10

Figura 9. (A) CV inregistrata in solutie salina de tampon fosfat ( PBS pH 7.4) cu electrozii SPCE/CoPc in

absenta ( albastru) si in prezenta de peroxinitrit ( SIN-1 25 mM) ( negru). (B) Curbele de

calibrare a raspunsului amperometric pentru SIN-1, cu polarizare la +0.35 V, in PBS pH 7.4,

pentru 2 domenii liniare: (i) 0.450 µM - 31.6 µM si (ii) 31.6 µM - 67 µM

(M4) Cuantificarea reactiei dintre ONOO- si oximioglobina in fractii solubile din muschi.

(T9) Reactia oximioglobinei cu ONOO- in solutie tampon si monitorizarea ONOO

- cu

microsenzori

Rezultatele preliminarii au fost obtinute cu peroxinitrit sintetizat la pH 12, folosit ca atare sau

neutralizat la pH 9, cu microsenzorii descrisi la (T8). Tehnica UV-Vis a fost deasemenea folosita

pentru a urmari simultan aceasta reactie. La pH 12, din spectrul UV-Vis se poate observa ca

indiferent de timpul de incubare a 170 µM de peroxinitrit cu 107 µM de mioglobina (Figura 10),

metmioglobina nu poate fi identificata (absortie maxima la 502 nm [31]). Concentratia solutiilor

MbFe2+

O2 a fost verificată prin măsurarea absorbantei la 417, 542, si/sau580 nm (ε417=128 mM-1

cm-1

, ε542=13.9 mM-1

cm-1

si ε580=14,4 mM-1

cm-1

) [32].

Figura 10. Spectrul UV-Vis al mioglobinei (Mb, 107 µM) dupa diferite perioade de incubare cu 170 µM

PON, in PB pH 12: 0 min (negru), 10 minute (verde), 30 minute (potocaliu), 180 minute (rosu).

(A

)

(B

)

(i)

(ii)

11

De asemenea, s-au îmbunătățit și caracterizat senzorii FSSP (film senzitiv și selectiv pentru

peroxinitrit bazat pe un film de cobalt ftalocianină depus pe suprafața unui electrod serigrafiat de

carbon (SPCE) produs de compania spaniola Dropsens) pentru reducerea PON, în vederea detecției

electrochimice în soluții tampon și în extracte de carne.

Senzorii SPCE/CoPC au fost caracterizati prin voltametrie ciclica in prezenta si absenta de PON

(Figura 11). In intervaul de potential studiat procesul redox care implica PON are loc in jurul valorii

de +0,1 V (Ec=0.047 V, Ea=0,072V, ∆E= 25 mV), dar curentul de reducere este mai mic ceea ce

sugereaza ireversibilitatea procesului de reducere al PON. Un alt pic de reducere, mult mai mare,

este de asemenea observat la –0.3 V, datorat probabil oxidarii chimice a Co1+

la Co2+

de catre PON,

care apoi este redus electrochimic de la Co2+

la Co1+

.

Pentru a micșora timpul de detecție și a crea o procedură simplificată pentru determinarea

peroxinitritului (obiective necesare datorită instabilității peroxinitritului (PON) atât în soluții

tampon, dar cu atât mai mult în fracții solubile de mușchi) a fost realizat și utilizat un sistem de

analiza prin injectare în flux (FIA) cu un singur canal, rezultatele prezentate in continuare fiind

obținute cu acest sistem. Avand in vedere faptul ca dezavantajul multor metode de determinare a

PON consta in electrooxidarea la potentiale mai mari de 1V, unde pot interfera multi alti compusi

prezenti in probe de tipul extractelor de carne, aplicarea unui potential in jurul valorii de 0,1 V

atunci cand sunt utilizati electrozii SPCE / CoPc reprezinta o imbunatatire semnificativa in

selectivitatea determinarii PON in matrici biologice.

Figura 11. Voltametrii ciclice inregistrate cu electrodul SPCE/CoPc in absenta (negru) si prezenta 45 µM

PON (rosu). Viteza de scanare = 9 mV/s

In Figura 12A este prezentata curba de calibrare obtinuta pentru determinarea PON in

amperometrie FIA utilizand PBS pH 9 ca flux purtator, iar in Figura 12B este prezentata

inregistrarea FIA care sta la baza curbei de calibrare. Graficul de calibrare este descris de

12

urmatoarea ecuatie: I (nA) = 6.313·CPON (µM) + 17.469; (R² = 0.9938). Limita de detectie este de

2.37 µM iar domeniul linear de concentratii este cuprins intre 3 si 180 µM.

Figura 12 (A) Grafic de calibrare pentru PON, PBS pH 9 cu electrodul SPCE/CoPc (B) Amperograma FIA

obtinuta la injectarea de PON (100 L) cu diverse concentratii utilizand electrodul SPCE/CoPc,

E=0.1 V, debit = 0.4 ml/min.

(T10) Monitorizarea concentrației de mioglobină și metmioglobină pe durata reacției de mai

sus

Monitorizarea concentratiei de mioglobina si de metmioglobina este de asemenea posibila prin

inregistrarea spectrului UV-Vis. In conditiile experimentale alese de noi, urmarirea absorbantei la

502 nm ( ε502 = 10.2 mM -1cm-1) a permis determinarea metmioglobinei formata ca urmare a reactiei

dintre peroxinitrit si mioglobina. Deasemenea, rezultatele studiilor noastre sunt in concordanta cu

datele de literatura conform carora timpul de incubare nu reprezinta o variabila importanta, deoarece

reactia dintre peroxinitrit si mioglobina este foarte rapida (mai putin de 1 secunda) [33].

Pentru a realiza studiile direct pe oximioglobina, aceasta a fost obținută prin tratarea mioglobinei cu

borohidrură de sodiu 75. Reacția și formarea oximioglobinei a fost monitorizată prin spectrometrie

UV-Vis (Figura 13). Inițial, metmiglobina a fost folosită pentru a urmări reacția acesteia cu

peroxinitritul. Amprenta metmioglobinei în amperometrie (prezența unui pic dublu), poate fi de

mare folos în identificarea ulterioară a acestei compus, și în a îl deosebi de oximioglobină sau

ferilmioglobină.

Tehnica UV-Vis a fost de asemenea folosită pentru a monitoriza reacția redMb cu PON. După

reducerea metMb, concentrația soluțiilor de redMb a fost verificată prin măsurarea absorbanței la

417, 542, și / sau 580 nm [ε417 = 128 mM-1

cm-1

, ε542 = 13.9 mM-1

cm-1

și ε580 = 14,4 mM -1

cm-1

]

conform ref. [33]. În timpul incubării a 170 µM peroxinitrit cu 107 µM de mioglobină, la pH 12,

metmioglobina nu a putut fi identificată (absorție maximă la 502 nm, ε502=10.2 mM -1

cm-1

). Pe de

altă parte, la pH 9 (PBS), putem observa clar cum redMb (identificată la 542 și 580 nm), este

13

transformată, în decurs a 3 min, în metMb (Figura 14A), și folosind coeficientul molar de extincție

pentru 502 nm, putem confima că stoechiometria redMb/metMb este 1:1, deoarce 10 µM de redMb

sunt oxidați la 10 µM de metMb (Figura 14B). Aceste rezultate sunt în deplină concordanță cu

măsurătorile electrochimice.

Figura 13. Spectre UV-Vis pentru diverși timpi de reacție dintre metMb şi borohidrură de sodiu

(A)

(B)

Figura 14. (A) Spectrul UV-Vis al oximioglobinei (redMb, 10 µM cu roșu), PON (100 µM, cu verde),

metmioglobinei (metMb, 10 µM cu maro) și după diferite perioade de incubare a metMb cu PON,

în PBS pH 9, (B) Porțiunea UV (450 – 700 nm) a spectrelor descris anterior.

(M5) Cuantificarea reactiei ONOO- cu oximoiglobina in muschiul maruntit de vaca.

(T11) Reactia oximioglobinei cu ONOO in muschiul maruntit de vaca si T12) Monitorizarea

nivelelor de mioglobina si metmioglobina pentru reactia in muschiul maruntit.

Extractul de carne a fost obținut din carne de mânzat (având vârsta mai mică de 2 ani) conform

metodei descrisă în referința [34]. Acesta a fost folosit proaspăt pentru analizele UV-Vis și

electrochimice. Inițial, diferite diluții ale extractului (PBS pH 9) au fost analizate prin metoda

14

electrochimică descrisă mai sus și prin spectrometrie UV-Vis. Metoda FIA amperometrică raportată

anterior a fost aplicată pentru a înregistra curenții produși de diferitele diluții injectate.

Cuantificarea concentrației de oximioglobină a fost realizată prin masurători de absorbție la 580 nm

(ε580 = 14,4 mM -1

cm-1

). În stocul de extract de carne concentrația de oximioglobină a fost

determinată ca fiind de 480 µM, ceea ce corespunde la aproximativ 20 mg de mioglobină pentru 1 g

de carne, concentrație asemănătoare datelor descrise în literatură.

Descreșterea concentrației de PON nu poate fi monitorizată în UV datorită suprapunerii picului de

absorție caracteristic proteinelor (280 nm) cu cel al peroxinitritului la 302 nm (Figura 15A).

Urmărind spectrofotometric, în domeniul UV, reacția dintre mioglobina ce se găsește în extractul de

carne și peroxinitrit, putem observa în timp apariția metmiglobinei (absorție la 502 nm, ε502=10.2

mM -1

cm-1

, respectiv 610 nm), dar și a deoximioglobinei (absorție la cca. 520 nm) [35] (Figura

15B). Similaritatea spectrelor de absorbție, în special în zona UV, corespunzătoare oximioglobinei și

extractului de carne dupa incubarea cu PON, susțin încă odată faptul că peroxinitritul este

descompus odată cu oxidarea ireversibilă a oximioglobinei.

(A)

(B)

Figura 15. Spectrele UV-Vis ale oximioglobinei din extractul de carne (diluat de 20 de ori), PON (200

µM, cu verde) și după diferite perioade de incubare a extractului cu PON, în PBS pH 9 (B)

Porțiunea UV (450 – 700 nm) a spectrelor descrise anterior.

Pentru studiile electrochimice ale reactiei dintre metMb si PON a fost folosit senzorul SPCE/CoPc

dezvoltat anterior. Aceasta reactie nu este usor de observat deoarece formarea compusului

intermediar al feril mioglobinei este greu de observat, datorita instabilitatii sale. Situatia este

diferita atunci cand oxiMb reactioneaza cu PON, dar relevanta acestei reactii este scazuta pentru

extractele de carne care au in compozitia lor in principal metMb. Avand in vedere faptul ca metoda

15

spectrofotometrica este neadecvata pentru determinarea PON (datorita suprapunerii peak-ului

caracteristic proteinelor de la 280 nm cu cel al PON de la 302 nm), metoda electrochimica propusa

in cadrul acestui proiect bazata pe senzori selectivi pentru PON este adecvata pentru studierea

reactiei PON cu metMb, precum si pentru determinarea PON in extractele de carne.

In Figura 16 sunt prezentate amperogramele FIA inregistrate pentru (A) 50 M PON si (B) 150 M

PON, in prezenta si absenta metMb la diversi timpi de incubare a acestora. Descompunerea PON-

ului a fost de asemenea studiata la aceiasi timpi de incubare pentru a demonstra ca picurile

inregistrate se datoreaza prezentei PON in solutia de metMb, si nu metMb in sine.

A B

Figura 16. Amperogramele FIA inregistrate cu senzorul SPCE/CoPC pentru (A) 50 mM PON si (B) 150

mM PON, in prezenta si absenta a 15 µM metMb la diversi timpi de incubare a acestora (flux

purtator = PBS pH 9, E=0,1, debit = 0,4 ml/min).

In etapa 5 a proiectului (anul 2015) a fost depusa cererea de brevet de inventie OSIM nr.:

A2015/00929 / 27.11.2015 cu titlul: PROCEDEU DE OBŢINERE ŞI DE UTILIZARE A UNUI

MATERIAL ELECTROSENZITIV PENTRU DETERMINAREA SELECTIVĂ A

PEROXINITRITULUI.

Pana la momentul depunerii cererii de brevet nu au putut fi dezvaluite / publicate detalii privind noul

tip de material electrosenzitiv dezvoltat pentru determinarea PON. In etapa 6 a proiectului (anul

2016) au fost realizate o serie de experimente suplimentare pentru caracterizarea si utilizarea acestui

nou tip de material bazat pe electropolimerizarea 2,6-dihidroxinaftalinei (2,6-DHN) pe electrozi

serigrafiati de carbon – SPCE (Dropsens, Spania). Rezultatele experimentale obtinute precum si

aplicarea acestui sensor pentru determinarea PON in extracte de carne au facut ulterior subiectul

16

unui articol ISI [36]. Activitatile realizate pentru dezvoltarea acestui nou tip de sensor se incadreaza

in M2, M3 si M4.

Electrodepunerea filmului de poli(2,6-DHN) s-a realizat prin voltametrie ciclica prin utilizarea unei

solutii de monomer 2,6-DHN cu concentratia 2 mM, in PBS pH 7.4. Primul ciclu al

voltamogramelor ciclice inregistrate pentru viteze de scanare de 5, 10 si 201 mV/sec sunt

caracterizate de un cuplu redox in jurul potentialului de 0 V, iar un peak larg de oxidare poate fi

observat la aprox. +0.4 V (Figura 17A). In Figura 17B se poate observa pentru al doilea peak,

precum si pentru urmatoarele, peak-urile de oxidare descresc semnificativ, fapt care indica formarea

filmului pe suprafata electrodului de lucru. S-a putut observa ca la suprafata electrodului de lucru a

fost depus un film de culoare albastru inchis (Figura 18).

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

-30

-20

-10

0

10

20

30

40 5 mV/s

10 mV/s

20 mV/s

I /

A

E / V

(A)

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

-20

-10

0

10

20

30

40

scan 10

scan 1

scan 10

scan 1

I /

A

E / V

(B)

Figura 17. (A) Primul ciclu al VC inregistrate pentru electrodul SPCE in 2,6-DHN 2 mM (viteza de

scanare = 5, 10 and 20 mV/sec); (B) 10 voltametrii ciclice successive pentru SPCE in 2,6-

DHN 2 mM, viteza de scanare = 5 mV/sec.

Figura 18. Aspectul senzorului SPCEmodificat cu poli(2,6-DHN).

Comportamentul electrocatalitic al poli(2,6-DHN)/SPCE a fost evaluat prin voltametrie ciclica in

prezenta si absenta PON 50 M in PBS pH 9.0. Raspunsul senzorului preparat prin electrodepunere

cu o viteza de scanare de 5 mV/sec (Figura 19) arata in prezenta PON o crestere semnificativa

ambelor peak-uri (catodic si anodic) caracteristice poli(2,6-DHN). De asemenea se observa ca PON

induce o deplasare a ambelor peak-uri catre valori de potential mai mici. De asemenea, se poate

17

observa ca in prezenta PON peak-ul anodic este mai mare decat cel catodic. Aceste resultate indica

faptul ca senzorul poli(2,6-DHN)/SPCE prezinta o activitate electrocatalitica de oxidare a PON.

-0.2 0.0 0.2 0.4

-40

-20

0

20

40 PBS pH 9.0

PON 50 M

I /

A

E / V

Figura 19. Voltamograme ciclice pentru senzorul poli(2,6-DHN)/SPCE in 0.1 M PBS pH 9.0, in

prezenta (albastru) si absenta (negru) PON 50 M (viteza de scanare = 100 mV/sec)

Studiul influentei vitezei de scanare pentru PON 50 M in PBS pH 9.0 a aratat ca atat peak-ul

anodic, cat si cel catodic, cresc linear cu radacina patrata a vitezei de scanare, sugerand un

comportament tipic pentru procesele controlate de difuzie.

Si pentru acest tip de senzor a fost preferata utilizarea unui sistem de analiza prin injectare in flux

(FIA). Influenta debitului fluxului purtator (PBS pH 9.0) a fost investigata pentru domeniul 0,2 –

0,5 mL/min, constantandu-se ca inaltimea semnalelor FIA creste cu debitul. Cel mai bun raport

inaltime semnal FIA / zgomot a fost obtinut pentru debitul de 0,38 mL/min (Figura 20A). In

amperometrie pentru atingerea unei limite de detectie foarte joase si a unei sensibilitati ridicate este

foarte importanta alegerea potentialului aplicat electrodului de lucru. In Figura 20B este

reprezentata influenta potentialului aplicat asupra inaltimii semnalelor FIA pentru diverse

concentratii de PON. Pentru E=100 mV vs Ag/AgCl a fost inregistrata cea mai buna sensibilitate

(11,62 nA/ M), dar domeniul linear a fost limitat intre 1 M si 50 M PON. Potentialul optim a

fost determinat a fi E=75 mV vs Ag/AgCl datorita domeniului mare de concentratii ale PON (2–300

M) si a sensibilitatii de 4.12 nA/ M (Figura 20C). Pentru acest potential a fost calculate o limita

de detectie de 0,2 M PON. Pentru a testa aplicabilitatea senzorului poli(2,6-DHN)/SPCE pentru

determinarea PON in probe reale, a fost studiata influenta unor posibili compusi prezenti in

extractele de carne cum ar fi ar fi acidul ascorbic sau nitritul. In Figura 20D sunt prezentate

semnalele FIA inregistrate la injectarea de acid ascorbic 1 mM si nitrit de soodiu 1 mM

comparative cu semnalul obtinut pentru PON 50 M, constatandu-se ca influenta acestor

interferenti este redusa.

18

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600

0

200

400

600

800

1000

1200 300 M

200 M

100 M

50 M

25 M16.5 M

12.5 M10 M5 M

I / n

A

Time / s

0 50 100 150 200 250 300

0

200

400

600

800

1000

1200

E=0 V

E=50 mV

E=75 mV

E=100 mV

I /

A

PON / M (A) (B)

0 50 100 150 200 250 300

0

200

400

600

800

1000

1200 I = 4.12 cPON

- 3.95

R2 = 0.9781

I / n

A

PON / M

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

-150

-100

-50

0

50

100

150

200

Sodium nitrite

1 mM

Ascorbic acid

1 mM

PON

50 M

I / n

A

Time / s (C) (D)

Figura 20. (A) Amperograma FIA pentru diverse concentratii de PON; E = +75 mV;

debit = 0.38 mL/min; (B) Dependenta inaltimii semnalelor FIA de potentialul aplicat pentru

diferite concentratii de PON; debit = 0.38 mL/min; (C) Hrafic de calibrare pentru

determinarea PON in conditiile optimizate; E = +75 mV; debit = 0.38 mL/min; (D)

Semnale FIA pentru PON 50 M, acid ascorbic 1 mM si nitrit de sodiu 0.1 M; E = +75

mV; debit = 0.38 mL/min.

Pentru evaluarea aplicabilitatii senzorului poli(2,6-DHN)/SPCE in extract de carne a fost realizat un

grafic de calibrare prin injectarea in sistemul FIA a unor probe constituite din extract de carne diluat

1/10 (cu PBS pH 9.0) la care a fost adaugat PON in concentratii cuprinse intre 5 si 200 M (Figura

21). Probele au fost injectate la 15 sec de la adaugarea PON. S-a observat ca extractul de carne fara

PON adaugat a dat un semnal FIA invers foarte mic. Graficul de calibrare obtinut pentru extractul de

carne imbogatit cu PON a aratat o buna linearitate pentru domeniul de concentratii studiat si o

sensibilitate de 3.45 nA/μM, aceasta reprezentand ~84% din sensibilitatea inregistrata la

determinarea PON in PBS. Aceste rezultate demonstreaza ca matricea extractului de carne are o

influenta redusa in determinarea PON cu senzorul poli(2,6-DHN)/SPCE.

19

500 1000 1500 2000 2500 3000

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 50 100 150 200

0

100

200

300

400

500

600

700

800

I = 3.45 cPON

- 4.15

R2 = 0.9839

I / nA

added PON / M

200 M

100 M

50 M

37.5 M

25 M

10 M5 M

meat extract

(diluted 1/10)

I / nA

Time / s Figura 21. Amperograma FIA pentru PON adaugat in extract de carne (diluat 1/10 cu PBS pH 9.0).

Interior: grafic de calibrare pentru PON in extract de carne. E = +75 mV; debit = 0.38

mL/min.

M6. Diseminarea si/sau exploatarea rezultatelor proiectului.

(T13) Mobilitati ale tinerilor cercetatori. Participari la conferinte internationale. Protectia

proprietatii industriale.

Rezultatele obtinute pe parcursul derularii proiectului IDEI au fost diseminate prin publicarea a 5

articole ISI, 7 capitole de carte si 18 lucrari prezentate la manifestari internationale. In acest moment

inca doua manuscrise se afla in pregatire pentru a fi trimise spre publicare la Electrochimica Acta si

Meat Science. De asemenea, a fost depusa o cerere de brevet de inventie la OSIM.

Mobilitatile tinerilor cercetatori (Ioana Silvia Hosu, Mihaela Calugareanu) au fost realizate prin

intermediul celor 3 proiecte de mobilitati cu Ungaria, China si Franta realizate in paralel cu acest

proiect.

Articole in jurnale cotate ISI

1. R.H. Perera, P.M. Peris, S.F. Peteu, M. Bayachou, Nitric oxide synthase loaded liposomes as

a platform for nitric oxide delivery of NO deficient targets, Electroanalysis 24: 37-41, 2012.

2. S.F. Peteu, T. Bose, M. Bayachou, Polymerized hemin for peroxynitrite electrocatalytic

oxidation and detection, Analytica Chimica Acta, 780: 81-88, 2013.

3. R. Oprea, S.F. Peteu, P. Subramanian, E. Pichonat, H. Happy, R. Boukherroub, S. Szunerits,

High Peroxynitrite activity of hemin-functionalized reduced graphene oxide formed in an

environmental friendly way, Analyst,138: 4345-4352, 2013.

4. I.S. Hosu, Q. Wang, A. Vasilescu, S. F. Peteu, V. Raditoiu, S. Railian, V. Zaitsev, K.

Turcheniuk, Q. Wang, M. Li, R. Boukherroub, S. Szunerits, “ Cobalt phthalocyanine

tetracarboxylic acid modified reduced graphene oxide: a sensitive matrix for the

electrocatalytic detection of peroxynitrite and hydrogen peroxide, RSC Advances, 5, 1474-

1484, 2015.

20

5. I.S. Hosu, D. Constantinescu-Aruxandei, M.-L. Jecu, F. Oancea, M. Badea Doni,

Peroxynitrite Sensor Based on a Screen Printed Carbon Electrode Modified with a Poly(2,6-

dihydroxynaphthalene) Film, Sensors, 16(11), 1975 – 1990, 2016.

Carti si capitole de carte

1. S.F. Peteu, M.S. Banihani, M.M. Gunesekera, P. Peiris, O.A. Sicuia, M. Bayachou,

Peroxynitrite and nitroxidative stress: detection probes and micro-sensors. A case of a

nanostructured catalytic film, Oxidative stress and antioxidants: diagnosis and therapy, pp

311-339, Edited by Andreescu & Hepel, American Chemical Society Symposium Series,

ISBN 9780841226845, 2011.

2. S.F. Peteu, S. Szunerits, A. Vasilescu, W. Knoll. Nanoscale architectures for smart

biointerfaces: Advances and challenges. Nanofabrication, pp 63-98, Intech, Yoshitake,

Edited by Masuda, ISBN 978-953-307-912-7, 2012.

3. S.F. Peteu, S. Szunerits, Peroxynitrite Quantification Challenges and Recent Advances,

Detection Challenges in Clinical Diagnostics, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK,

Edited by Vadgama & Peteu, ISBN 978-1-84973-612-1, 2013.

4. A. Vasilescu, A. Vezeanu, Y. Liu, I. Hosu, R. Worden, S. Peteu, Chapter 16: Meat

Freshness: Peroxynitrite's Oxidative Role, Its Natural Scavengers, and New Measuring

Tools, pp. 303-332, in: Instrumental Methods for the Analysis of Bioactive Molecules, ACS

Books, 2015.

5. A. Vasilescu, V. Dinca, M. Filipescu, L. Rusen, I.S. Hosu, R. Boukherroub, S. Szunerits, M.

Dinescu, S.F. Peteu, Chapter 9: Recent Approaches to Enhance the Selectivity of

Peroxynitrite Detection, pp. 166- 185, in: Peroxynitrite Detection in Biological Media:

Challenges and Advances, RSC Detection Science, Editors: S. Peteu, S. Szunerits, M.

Bayachou, 2015.

6. Andrei F. Danet, Mihaela Badea Doni, Chapter 32: Determination of Lipid Oxidation by

Chemiluminescence Reagents, pp. 623-638, in: Flow Injection Analysis of Food Additives,

CRC Press, Francis & Taylor Group, Editors: Claudia Ruiz-Capillas, Leo M. L. Nollet,

2015.

7. B. Bucur, I.S. Hosu, A. Vasilescu, Chapter: Biosensors for characterization of bioactive

compounds from wines, pp. 147-189(43) in: Bioactive compounds: natural sources,

physicochemical characterization, applications, Bentham Science Publishers, Editor:

C.Apetrei, DOI: 10.2174/97816810834141160101

Conferinte internationale

1. S.F. Peteu, R. Coserea, F. Oancea, Electroactive Nano-materials and Their Potential for

Precision Agriculture, Poster presentation, the 63rd Annual ISE Meeting, Prague, Czech

Republic, 19-24 August, 2012.

2. S.F. Peteu et al., Poster presentation, the RSE-SEE3, Bucharest, 13-17 May 2012.

3. S.F. Peteu, R. Oprea, T. Bose, R. Boukherroub, S. Szunerits, M. Bayachou, Recent

Advances in Peroxynitrite Detection, Oral presentation, the 63rd Annual Meeting of the

International Society of Electrochemistry (ISE), Prague, Czech Republic, 19-24 August,

2012.

4. S.F. Peteu et al., Oral presentation, the Third Regional Symposium on Electrochemistry -

South-East Europe (RSE-SEE3), Bucharest, Romania, 13-17 May, 2012.

21

5. S.F. Peteu et al., New peroxynitrite-sensitive microsensor and its potential to quantify the

muscle protein oxidative dynamics, Oral Presentation accepted, the 246th ACS National Fall

Meeting, 3-8 September, 2013.

6. S.F. Peteu et al., An analytical chemistry challenge and recent advances: peroxynitrite

quantification, Oral Presentation accepted, the 246th American Chemical Society (ACS)

National Fall Meeting, Indianapolis Indiana, United States, 3-8 September 2013.

7. S.F. Peteu et al., Graphene complex with metallo-macrocycles as electrocatalytic film

created by matrix-assisted pulsed laser evaporation (MAPLE) and chemical sensing

application, Oral Presentation accepted, the 246th ACS National Fall Meeting, 3-8

September 2013.

8. I. S. Hosu, M. Badea-Doni, The electrocatalytic oxidation of peroxynitrite at a modified

Co(II) phthalocyanine Glassy Carbon Electrode, Poster at New Trends on Sensing-

Monitoring- Telediagnosis for Life Sciences, Brasov, Romania, 24-26 Iulie 2014.

9. I. S. Hosu, M. Badea-Doni, Electrochemical detection of peroxynitrite on a cobalt

phthalocyanine modified Screen-Printed Carbon Electrode, Poster at RO-ICAC'2014

(International Conference on Analytical Chemistry - Analytical Chemistry for a Better Life),

Targoviste, Romania, 17-21 Septembrie 2014.

10. S.O. Dima, I.S. Hosu, M. Badea-Doni, F. Oancea, T. Dobre, Acrylic copolymer-based

sensors for the detection of hydrogen peroxide, Poster at RO-ICAC'2014 (International

Conference on Analytical Chemistry - Analytical Chemistry for a Better Life), Targoviste,

Romania, 17-21 Septembrie 2014.

11. I.S. Hosu, M. Badea-Doni, Cobalt(II) phthalocyanine Screen Printed Carbon Electrode for

studying the interaction between myoglobin and peroxynitrite, Oral Presentation at

International Symposium PRIOCHEM (Prioritatile Chimiei pentru o Dezvoltare Durabila),

Editia a-X-a, Bucharest, Romania, 30-31 Octombrie 2014.

12. I.S. Hosu, M. Badea-Doni, Flow injection system for the electrochemical detection of

peroxynitrite with a cobalt phthalocyanine modified screen printed carbon electrode, Flow

Analysis XIII, Praga, Cehia, 5-10 July 2015

13. I.S. Hosu, F.Oancea, M. Doni, Flow injection system for the electrochemical monitoring of

peroxynitrite and its reaction with myoglobin, Priorities of Chemistry for a Sustainable

Development - PRIOCHEM XI, Bucuresti, România, 29-30 October 2015

14. M. Badea Doni, M.-L. Arsene, M.-L. Jecu, Sensors based on screen printed electrodes for

nitrite and peroxynitrite determination in meet, Invited lecture at International Workshop

'New methodologies and advanced nanomaterials for electrochemical biosensors', Bucuresti,

Romania, 20 May 2016

15. M. Badea Doni, I.S. Hosu, D. Constantinescu-Aruxandei, M.-L. Arsene, F. Oancea, M.-L.

Jecu, Flow injection system based on a modified screen printed electrode for peroxynitrite

determination in meat extracts, Poster at RO-ICAC'16 - 3rd International Conference on

Analytical Chemistry, Iasi, Romania, 28 – 31 August 2016

16. M. Badea Doni, G. Petcu, M. Patrascu, M.-L. Arsene, V. Fruth, M-L Jecu, Screen printed

carbon electrode modified with copper oxide nanoparticles for glucose determination, Poster

at RO-ICAC'16 - 3rd International Conference on Analytical Chemistry, Iasi, Romania, 28 –

31 August 2016

17. M. Badea Doni, I.S. Hosu, D. Constantinescu-Aruxandei, M.-L. Arsene, M.-L. Jecu, F.

Oancea, Peroxynitrite sensor based on a modified screen printed carbon electrode, Poster at

The 16th

International Conference of Physical Chemistry “ROMPHYSCHEM”, Galati,

Romania, 21-24 September 2016

18. I.S. Hosu, D. Constantinescu-Aruxandei, M.-L. Jecu, M.-L. Arsene, F. Oancea, M. Badea

Doni, Screen printed carbon electrodes modified with cobalt phthalocyanine vs poly(2,6 –

22

dihydroxynapthalene) for peroxynitrite determination, International Symposium 'Priorities of

Chemistry for a Sustainable Development' - PRIOCHEM 12nd Edition, Bucharest, Romania,

27-28 October 2016

Brevete 1. PROCEDEU DE OBŢINERE ŞI DE UTILIZARE A UNUI MATERIAL ELECTROSENZITIV

PENTRU DETERMINAREA SELECTIVĂ A PEROXINITRITULUI

Mihaela Doni, Ioana Silvia Hosu, Maria-Luiza Jecu, Florin Oancea

Cerere de brevet OSIM no.: A2015/00929 / 27.11.2015

CONCLUZII

Proiectul si-a atins scopul in intregime. Toate obiectivele au fost indeplinite cu succes fiind

dezvoltate mai multe tipuri de senzori electrochimici pentru determinarea peroxinitritului in

extractele de carne, in prezenta mioglobinei. Dezvoltarea si optimizarea acestor senzori a fost

raportata in literatura de specialitate sub forma unor articole originale in jurnale cotate ISI. De

asemenea, senzorul poli(2,6-DHN)/SPCE a fost protejat prin depunerea unei cereri de brevet OSIM.

Director proiect,

Dr. Mihaela (Badea) Doni

23

Bibliografie

[1] J.S. Beckman, T.W. Beckman, J. Chen, P.A. Marshall, B.A. Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87 (1990)

1620-1624.

[2] N.V. Blough, O.C. Zafiriou, Inorg. Chem., 24 (1985) 3502-3504.

[3] P. Pacher, J.S. Beckman, L. Liaudet, Physiol. Rev., 87 (2007) 315-424.

[4] P. Ascenzi, A. di Masi, C. Sciorati, E. Clementi, Biofactors, 36 (2010) 264-273.

[5] R. Radi, G. Peluffo, M.N. Alvarez, M. Naviliat, A. Cayota, Free Radic. Biol. Med., 30 (2001) 463-488.

[6] F.P. Serban, B. Saleem, M.G. Mutha, P. Pubudu, A.S. Oana, B. Mekki, Peroxynitrite and Nitroxidative Stress:

Detection Probes and Micro-Sensors. A Case of a Nanostructured Catalytic Film, in: Oxidative Stress: Diagnostics,

Prevention, and Therapy, American Chemical Society, 2011, pp. 311-339.

[7] H. Barr, P. Vadgama, S. Peteu, M. Thompson, Detection Challenges in Clinical Diagnostics, Royal Society of

Chemistry, 2013.

[8] S.S. Marla, J. Lee, J.T. Groves, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 94 (1997) 14243-14248.

[9] C. Szabo, H. Ischiropoulos, R. Radi, Nat. Rev. Drug Discov., 6 (2007) 662-680.

[10] S. Bartesaghi, V. Valez, M. Trujillo, G. Peluffo, N. Romero, H. Zhang, B. Kalyanaraman, R. Radi, Biochemistry,

45 (2006) 6813-6825.

[11] J.C. Niles, J.S. Wishnok, S.R. Tannenbaum, Nitric Oxide, 14 (2006) 109-121.

[12] S. Peteu, P. Peiris, E. Gebremichael, M. Bayachou, Biosens. Bioelectron., 25 (2010) 1914-1921.

[13] R. Oprea, S.F. Peteu, P. Subramanian, W. Qi, E. Pichonat, H. Happy, M. Bayachou, R. Boukherroub, S. Szunerits,

Analyst, 138 (2013) 4345-4352.

[14] S.F. Peteu, T. Bose, M. Bayachou, Anal. Chim. Acta, 780 (2013) 81-88.

[15] I.S. Hosu, Q. Wang, A. Vasilescu, S.F. Peteu, V. Raditoiu, S. Railian, V. Zaitsev, K. Turcheniuk, Q. Wang, M. Li,

R. Boukherroub, S. Szunerits, RSC Advances, 5 (2015) 1474-1484.

[16] J.N. Younathan, K.S. Wood, T.J. Meyer, Inorg. Chem., 31 (1992) 3280-3285.

[17] K.M. Kadish, D.G. Davis, Ann.NY Acad.Sci., 206 (1973) 495-503.

[18] K.M. Kadish, G. Larson, Bioinorg Chem, 7 (1977) 95-105.

[19] Kaminska, I., S. Szunerits, et al, ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 1016.

[20] Kaminska, I., S. Szunerits et al, Chem. Commun. 2012, 48, 1221.

[21] Peteu, S.F., S. Szunerits et al, Analyst 2013,138, 4345

[22] Peteu S.F., and Szunerits S. in «Detection Challenges in Clinical Diagnostics», Editors Peteu & Vadgama, ©

RSC 2013, ISBN 9780841226845.

[23] Peteu, S.F., M. Bayachou et al, Biosens. & Bioelectr. 2010, 25, 1914.

[24] I. Hosu, Q. Wang, A. Vasilescu, S. Peteu, V. Raditoiu, S. Railian, V. Zaitzev, K. Turcheniuk, Q. Wang, M. Li, R.

Boukherroub, S. Szunerits, RSC Advances, (2014).

[25] P. Kumar, A. Kumar, B. Sreedhar, B. Sain, S.S. Ray, S.L. Jain, Chem.-Eur. J., 20 (2014) 6154-6161.

[26] D.R. Tackley, G. Dent, W.E. Smith, Physical Chemistry Chemical Physics, 2 (2000) 3949-3955.

[27] D.R. Tackley, G. Dent, W. Ewen Smith, Physical Chemistry Chemical Physics, 2 (2000) 3949-3955.

[28] D. Verma, R. Dash, K.S. Katti, D.L. Schulz, A.N. Caruso, Spectroc. Acta Pt. A-Molec. Biomolec. Spectr., 70

(2008) 1180-1186.

[29] A. Kaniyoor, R. Imran Jafri, T. Arockiadoss, S. Ramaprabhu, Nanoscale, 1 (2009) 382-386.

[30] M. Brunori, Trends in Biochemical Sciences, 26 (2001) 209-210.

[31] F.J. Rehmann, Mechanistic Studies of the Nitrogen Monoxide- and Nitrite-mediated Reduction of Ferryl

Myoglobin and Ferryl Hemoglobin, 2002.

[32] S. Herold, M. Exner, F. Boccini, Chem. Res. Toxicol., 16 (2003) 390-402.

[33] M. Exner, S. Herold, Chem. Res. Toxicol., 13 (2000) 287-293.

[34] M. Badea, A. Amine, M. Benzine, A. Curulli, D. Moscone, A. Lupu, G. Volpe, G. Palleschi, Microchim. Acta, 147

(2004) 51-58.

[35] J. Tang, C. Faustman, T.A. Hoagland, Journal of Food Science, 69 (2004) C717-C720.

[36] I.S. Hosu, D. Constantinescu-Aruxandei, M.-L. Jecu, F. Oancea, M. Badea Doni, Sensors, 16(11), 1975 – 1990,

2016.