Actividad 1: Las enzimas de restricción: tijeras moleculares.

Preparación previa:

Objetivos.

Alícuota de los reactivos, tales como enzimas de restricción, tampones, y ADN lambda

(opcional)

Vierta geles de agarosa. "Si usted prefiere tener a sus estudiantes vierten sus propios

geles en el laboratorio, preparar la agarosa antes de tiempo, si se prepara con antelación,

de agarosa disuelto debe mantenerse a 55-60 º C hasta que el gel se vierten.

Establecer los estudiantes y estaciones de trabajo docente.

Tiempo requerido.

De 30 minutos a 1 hora, dependiendo de cómo preparamos los geles de agarosa.

Que se requiere?

Cámara de electroforesis, bandejas de fundición, y peines tampón de electroforesis

(1x TAE)

Agarosa en polvo.

ADN colorante de carga.

Procedimiento.

Cada grupo necesitará muestras de enzima de restricción, ADN lambda, y tampón de

restricción. Puedes repartir alícuotas en los tubos para cada grupo, o puedes dejar los

tubos ya hechos para que los cojan cada grupo.

1. Alícuotas de restricción enzimática. Alícuotas de 5 microlitros de dicha enzima en ocho microtubos de ensayo limpios ( un total de 24 tubos). Rotular los tubos como: HINDIII, Pstl, y EcoRI.

Importante: Las enzimas de restricción a la temperatura y deben de estar introducidas en hielo todo el tiempo. Colocar las enzimas en el congelador una vez se hayan usado. El día del laboratorio, coloque los tubos en hielo y distribuya un tubo a cada grupo. 2. Alícuotas de dión tampón de restricción. Alícuotas de 60 microlitos de

tampón de restricción en 8 microtubos de ensayos limpios. Rotúlalos como “TR”. Colocar los tubos en hielo y distribuir un tubo para cada grupo.

3. Alícuotas de ADN lambda. Alícuotas de 25 microlitros de ADN lambda en 8 microtubos de ensayo y rotúlalos como “lambda”. Colocar los tubos en hielo y distribuir un tubo para cada grupo.

4. Preparación de los geles de agarosa. Se recomienda una concentración de agarosa en los geles sea del 1% de agarosa. Esta concentración de agarosa ofrece una buena resolución y minimiza el tiempo de ejecución necesario para la separación electroforética de fragmentos de ADN. Se recomienda un espesor del gel entre 0.75 – 1 cm para una fácil manipulación del gel. Asegúrate de uses un tampón de electroforesis y no agua en la preparación de los geles de agarosa.

a. Preparación del tampón de electroforesis. TAE (Tris-acetato- EDTA) tampón de agarosa ofrece una concentración de 50x. Además del tampón TAE 1x necesario para preparar gel de agarosa se requieren de el 275 mL aproximadamente por cada cubeta de electroforesis. Tres litros son suficientes para preparar 8 cubetas de electroforesis y 8 geles de agarosa. Para preparar de 3 L de 1x TAE desde el de 50x TAE, cogemos 60mL del de 50x y lo añadimos en 2,94 L de agua destilada.

b. Preparación de la agarosa. Este procedimiento se puede realizar de 1 a 2 días de anticipación por el profesor durante la clase o hecho por los equipos.

i. Para preparar solución de agarosa al 1% tomamos 1 g de agarosa por cada 100 mL de tampón de electroforesis 1x TAE. Asegúrate de que es tampón de electroforesis y no agua.

Si las cubetas de electroforesis son limitadas, puedes usar bandejas 7x10 cm y dos de 8 y peines para verter un gel que se puede utilizar para ejecutar dos series de resúmenes de los estudiantes. Usa esta tabla como guía para los volúmenes de gel requerido cuando introduzcamos de uno o varios geles. Volumen de 1% de agarosa para:

Número de gel Bandeja de 7x7 cm

Bandeja de 7x10 cm

1 40mL 50mL

2 80mL 100mL 4 160mL 200mL 8 320mL 400mL

ii. Añadir el polvo de agarosa a un recipiente adecuado (por ejemplo, erlenmeyer de 500 ml 200 ml o menos). Añadir la cantidad adecuada de tampón de electroforesis TAE 1x y agitar para suspender el polvo de agarosa en el búfer. Si se utiliza un erlenmeyer invertido un erlenmeyer de 25 ml en el extremo abierto del matraz Erlenmeyer de 500 ml que contiene la agarosa. El frasco pequeño actúa como una cámara de reflujo, lo que permitirá a largo o vigorosa ebullición sin mucha evaporación. La agarosa se pueden fundir para la fundición del gel de agarosa al hervir hasta que se haya derretido por completo en un plato caliente magnético, baño de agua caliente, o en un horno microondas.

Método del horno microondas. Esta técnica es la forma más rápida y segura para disolver la agarosa. Coloque la solución de gel en una botella o frasco apropiado en el microondas. Afloje la tapa del SI USTED ESTA UTILIZANDO UNA BOTELLA. Use un ajuste a medio y establece en 3 minutoes. Detener el horno de microondas cada 30 segundos y agitar el frasco para suspender cualquier undissolver agarosa. Hervir y agitar la solución hasta que todas las partículas de agarosa transparente pequeños se disuelven. Ponga a un lado y deje enfriar a 55-60 º C antes de servir.

Método magnético de la placa caliente. Añadir un stirbar a la solución de agarosa disuelta. Calentar la solución a ebullición mientras se agita en un plato caliente magnético. Burbujas o espuma debe e interrumpido antes de subir a te cuello del matraz. Hervir la solución hasta que todas las partículas pequeñas transarent agarosa se disuelven. Deje enfriar a 55-60 º C antes de verter los geles. Procedimiento para la emisión de geles: Esta actividad de laboratorio requiere que cada gel tenga al menos 4 pozos. Sigue las instrucciones que vienen a continuación para preparar la agarosa al 1% y determinar el volumen que necesitas. Vierte la suficiente agarosa para cubrir los dientes del peine de gel o hasta una profundidad de 0.5 a 0.75 cm. No mover ni manejar hasta que esté solidificado. El gel solidificado puede ser almacenado en bolsas sellables a temperatura ambiente hasta un día o en un refrigerador durante una semana. Etiquetar las bolsas. El tiempo necesario para verter el gel es aproximadamente de 30 minutos. Si es posible, ten uno o dos más preparados. 1.- Sellar los extremos de la bandeja del gel de forma segura con tiras de cinta estándar de laboratorio. Presione la cinta firmemente a los bordes de la bandeja del gel de forma un sello hermético 2-. Asegurarse que el equipo de electroforesis está bien nivelado , usando el calibrador del aparato. 3.- Preparar el concentración deseada y la cantidad de agarosa en tampón de electroforesis TAE 1x. 4.- Enfría la agarosa a menos de 60 ºC antes de verter. 5.- Mientras la agarosa se está enfriando, coloque el peine en la ranura correspondiente en la bandeja de gel. Los peines de gel deberían colocarse a media pulgada del extremo de la bandeja, si es de un pozo simple. Para tener un gel de uso doble se puede poner un peine a la distancia indicada anteriormente y otro a mitad de camino. 6.- Dejar solidificar a temperatura ambiente durante 10 o 20 minutos. Se volverá turbio o opaco cuando esté listo para usarse. 7.- Retirar el peine con cuidado y dejar solidificar. 8.- Retirar las tiras de cinta colocadas anteriormente en los extremos de la bandeja.l 9.- Tienes dos opciones: Opción 1: Si no tienes suficiente tiempo para realizar la lección 2, almacena el gel en una bolsa sellable a temperatura ambiente durante un día o en frigorífico una semana antes de su uso. Etiquetar siempre la bolsa.

Opción 2: Si tienes suficiente tiempo para realizar la lección 2, coloca la bandeja de gel en la cámara de electroforesis de modo que los pozos de la muestra queden por el lado del cátodo. Así, las muestras de ADN migrarán hacia en ánodo mientras dura la electroforesis. Digestión de las enzimas de restricción: 30 minutos de incubación de digestión en estufa a 37º C.