1

Department of Women’s and Children’s Health

Uppsala University

Preparation of monoclonal antibodies against

immunoglobulin kappa of AL-amyloidosis and

characterization of antibody producing hybridoma cells

Ishrat Hossain

Practical supervisor: Gunilla Westermark

Address: Department of Medical Cell biology, Uppsala Biomedical center, Uppsala

University

Theoretical supervisor: Eva Hagforsen

Address: Department of Medical Sciences, Dermatology and Venereology,

Rudbeck Laboratory, Uppsala University

Examiner: Anneli Stavreus-Evers

Address: Department of Women and Children's Health,

Research Group; Reproductive biology, Akademiska Hospital

2

ABSTRACT

The most common type of systemic amyloidosis is immunoglobulin monoclonal light chain

(AL) amyloidosis. AL amyloidosis is caused by deposits of monoclonal light chains (kappa

and lambda). It is very important to be able to quickly apply the correct treatment to improve

survival among patients with AL-amyloidosis and therefore it is important to have fast and

accurate diagnosis. The antibodies used in immunohistochemistry today to type AL-

amyloidosis caused by kappa protein are not monoclonal and therefore not specific. The

treatment for Al-amyloidosis is cytostatics and bone marrow transplantation. To identify

amyloid, Congo red, polarization microscopy and immunohistochemistry are used in routine

diagnostics today. Diagnostics would be more rapid and specific, which would save both time

and money. Most importantly, the patient could be treated faster and thus the prognosis could

be better. The purpose of this study was to produce monoclonal antibodies against the protein

kappa of AL-amyloidosis. The methods chosen were hybridoma technology, ELISA, Western

blot, and immunohistochemistry. Results from the immunohistochemistry showed reactivity

in some cells, and a few of those cells were also positive in ELISA. None of the hybridoma

cells produced monoclonal antibodies against immunoglobulin kappa. The study can be

continued by using limited dilutions as well as additional analysis of cells showing reactivity

to find a subclone of hybridoma cells. The subclone should show positive reaction on

immunoglogulin kappa.

Keywords: Hybridoma technology, ELISA, Western blot, Congo red, transthyretin (ATTR)

3

INTRODUKTION

Amyloid kommer från amylum som är det latinska namnet för stärkelse då man

ursprungligen trodde att de upplagrade ämnena som man såg baserat på infärgning och

mikroskopering utgjordes av kolhydrater. Omvandlingen av normalt lösliga peptider och

proteiner till olösliga proteinaggregat och felveckade proteiner så kallade amyloida

inlagringar har blivit allt vanligare under de senaste åren. Ett stort intresse finns inom detta

forskningsområde efter upptäckten att sjukdomar associerade med amyloidinlagringar inte är

ovanliga. Dessa sjukdomar upptäcktes endast en till två generationer tillbaka, men några av

dem är väldigt vanliga sjukdomar i dagens samhälle [1-2]. Idag finns cirka 50 sjukdomar med

en mängd olika symptom som är associerade med felveckade proteiner och deras

efterföljande omvandling till svårbehandlade/icke behandlingsbara aggregat, amyloidfibriller.

Sådana fibriller är trådliknande strukturer och denna formation leder många gånger till

förlorad funktion av proteiner och toxiska intermediärer.

Många av dessa sjukdomar är associerade med ålder som till exempel Alzheimers och

andra till livsstil som till exempel diabetes typ II [3-8]. Inom 40 år är det beräknat att det

kommer att uppstå cirka 80 miljoner nya fall av Alzheimers i världen och diabetes typ II är

redan endemisk i många länder med över 300 miljoner drabbade människor världen över [4].

Amyloidos är en grupp sjukdomar som orsakas av onormal extracellulär deposition av

felveckade proteiner. Hittills har fler än 28 typer av amyloidprotein identifierats och deras

patologiska orsaker skiljer sig åt [9, 10]. Den vanligaste typen av systemisk amyloidos är

immunoglobulin monoklonal lätt kedja (AL) amyloidos.

AL amyloidos orsakas av inlagringar av monoklonala lätta immunoglobulinkedjor (kappa

och lambda) som utsöndras från neoplastiska plasmaceller eller B-cells kloner [11-12].

AL-amyloidos är av lambdatyp i nästan två tredjedelar av fallen och av kappatyp i resterande.

4

Vad detta beror på är inte helt fastställt men antas vara på grund av att lambdakedjor har

större tendens att aggregera till amyloidfibriller än kappakedjor.

Symtomen varierar mellan allt från trötthet till tryck över bröstet beroende på vilket eller

vilka organ som drabbas, oftast är det hjärtat och njurarna som utsätts. Behandlingen av

systemisk amyloidos är typspecifik och därmed är en korrekt typning av amyloidos viktigt för

att kunna behandla patienten. Det saknas effektiv behandling mot amyloidinlagringar men

man har konstaterat att det framgångsrikt går att behandla med cytostatika mot

myelomrelaterad och primär AL-amyloidos. Ett annat alternativ som har börjat användas är

benmärgstransplantation [13]. Tidigare levde många patienter inte mer ett något år efter

diagnos, men tack vare en snabbare diagnostik och bättre cytostatika, lever många upp till 5

år idag. Det finns andra typer av amyloidos som till exempel serum amyloid A (AA)

amyloidos, ärftlig variant av transthyretin (ATTR), ärftlig variant av apolipoprotein A1

(AApoA1) med flera [10].

För att identifiera amyloidinlagringar används främst två olika metoder i rutindiagnostiken,

kongorött och immunohistokemi. Kongorött kan efter bindning identifieras med hjälp av

polarisationsmikroskop. Med polarisation menas att ljusvågorna endast vibrerar i ett plan. Ett

sätt att åstadkomma detta är att använda polarisationsfilter som finns för mikroskop, det

kallas polarisator och sätts på ljuskällan. Polarisatorn roteras för att reglera vilken våglängd

som skall släppas igenom. När allt ljus släpps igenom är områden i vävnaden med

amyloidinlagringar färgade i rosa då kongorött bundit dit, när polarisatorn roteras kommer

ljuset att brytas i dessa områden och resultatet blir ett ljusgrönt ljus. På detta sätt är det

möjligt att konstatera om det finns amyloidinlagringar i vävnaden eller inte [14].

Vävnadsbiopsier är nödvändiga för att kunna diagnostisera amyloidos. Aspiration från

bukfett är det lättaste området att ta vävnadsbiopsi från och har en känslighet på 70-80 % när

5

amyloidinlagringar finns närvarande. Benmärgsbiopsi är också relativt enkel teknik med en

känslighet på cirka 60 % om amyloidinlagringar finns i biopsin.

Både aspiration från bukfett och benmärgsbiopsi kan färgas med kongorött och vid

kombination av dessa undersökningar är detektionsgraden cirka 95 % [15-16]. För att sedan

typa amyloidos måste man använda sig av specifika antikroppar riktade mot de olika typer av

amyloidos som finns.

Det finns olika subklasser av antikroppar såsom IgM, IgG, IgA, IgE och IgD. IgM är de

första immunoglobuliner som utsöndras under ett immunsvar. Efter affinitetsmognad kan

cellerna utsöndra antikroppar av IgG-klass med stark affinitet som är inriktade mot ett

specifik antigen. Cellerna som producerar IgG med hög affinitet differentieras till

minnesceller. Antikroppsmolekyler med en IgG-subklass är de vanligaste och även önskvärda

för bioteknisk produktion [17].

Framtagning av monoklonala antikroppar sker med hjälp av att immunsvar induceras genom

immunisering av djur. Idag används främst kanin, råtta och får [18-20].

Immunsystemet reagerar snabbt på virusliknande partiklar och därför används ofta

peptidsekvenser från virusliknande partiklar för att trigga immunförsvartet hos djuret. Detta

leder till ett mycket snabbt och specifikt immunsvar [21]. Djuret får endast immuniseras var

5:e vecka och immuniseringstider varierar mellan 20-30 veckor med flera boosterdoser för att

aktivera immunologiskt minne som leder till IgG antikroppsproduktion med hög affinitet mot

ett specifikt antigen.

Sju dagar efter den sista boosterdosen, testas sera från de immuniserade djuren med

avseende på närvaro av den specifika antikroppsmolekylen som man önskar. Den vanligaste

metoden som tillämpas är enzyme-linked immunoassay (ELISA). Principen är att man fäster

målantigenet på botten i en platta, sedan binder primärantikroppen till antigenet. Efter detta

tillsätts en sekundärantikropp till vilken ett enzym sitter konjugerat.

6

Sekundärantikroppen binder till primärantikroppen samt förändrar (oxidation eller reduktion)

substratet vilket leder till färgförändring.

Möjligheten att generera monoklonala antikroppar för biotekniska tillämpningar skapades av

två framstående forskare - George Köhler och Cesar Milstein. De uppfann en teknik under år

1975 som gjorde det möjligt att fusera antikroppsproducerande B-lymfocyter med

myelomceller vilket leder till en hybridomcell som producerar antikroppar samt delar sig

konstant [22]. Myelomceller kommer från B-lymfom som kännetecknas av konstant tillväxt

och dessa celler utsöndrar inga immunoglobuliner.

Idag är hybridomteknik standardmetoden för att generera monoklonala antikroppar.

Principen bakom metoden är att B-lymfocyter från till exempel mjälte från immuniserad mus

fuseras med myelomceller vilket resulterar i hybridomceller. Selektionen av hybridomceller

efter fusion är ett kritiskt steg i monoklonal antikroppsproduktion. Vid selektion används

oftast hypoxanthine-azaserine-thymidine (HAT) medium. Under fusionsprocessen

förekommer tre typer av celler, ofuserade myelomceller som har brist på enzymenet

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), ofuserade mjältceller, och

fuserade hybridomceller. Ofuserade mjältceller selekteras bort enkelt eftersom de inte delar

sig i cellkulturen genom att använda HAT då mediet blockerar de novo pathway (DNA

nukleotidsyntesväg). När denna väg är blockerad, kommer celler att utnyttja den alternativa

vägen”salvage pathway” och detta kan göras endast vid närvaro av HAT. Ofuserade

myelomceller har inte ett fungerande HGPRT enzym från mjältceller och därmed kan de inte

utnyttja ”salvage pathway” och dör inom 1 vecka. De enda cellerna som kan göra detta är

fuserade celler, d.v.s. hybridomceller då dessa celler har enzymet HGPRT som cellen kan ha

fått från mjältcellerna. 1

1 https://www.moleculardevices.com/hybridoma-selection-using-hat-medium

7

Med hybridomteknik har tusentals olika antikroppsproducerande cellinjer etablerats.

Dessa celler har antingen tagits fram för att producera antikroppar av intresse eller

antikroppar med olika specificitet. Nästa viktiga steg för att framställa en antigenspecifik

antikroppsproducerande cellinje är bestämma reaktivitetsmönstret och att säkerställa att

antikropparna kommer från en klon. Limited dilution är en standardteknik för att ta fram

cellklon av intresse från en blandning av celler framtagna genom hybridomteknik [23]. Om

någon/några brunnar ger ett positivt resultat vid screening, späds supernatanten från den

brunnen med odlingsmedium och pipetteras över i en ny 96-hålsplatta. [24-26]. För att

säkerställa att antikroppen reagerar specifikt mot ett antigen, testas antikropparna med bland

annat standardmetoderna immunohistokemi, ELISA samt Western blot.

Fixering är väsentligt vid immunohistokemi för att bevara vävnadsmorfologi men denna

process kan också ha en negativ inverkan vid immunohistokemi. Fixering kan förändra de

kemiska bindingarna hos proteinet så att epitopen av intresse ”maskeras” och inte längre kan

binda till den primära antikroppen. Denna maskering av epitopen kan orsakas av tvärbindning

av aminosyror inom epitopen. En tvärbindning kan förändra konformationen av en epitop

eller förändring av den elektrostatiska laddningen av antigenet.

Antigen retrieval är en teknik för att återställa epitopen så att antikroppen kan binda. Det

finns flera tekniker för att återställa immunreaktiviteten hos en epitop. Metoder som att ändra

pH och ändra temperatur kan påverka affiniteten hos en antikropp för dess epitop [27].

Vid framställning av antikroppar mot kappa proteinet vid AL-amyloidos, kan det finnas andra

proteiner som antikroppar reagerar mot. Serum amyloid P komponent (SAP) är ett normalt

blodprotein och heparan sulfat proteoglykan är ett protein som finns i vävnader. Dessa två

proteiner finns alltid i amyloidinlagringar oberoende av vilken typ av amyloidos det är.

8

Detta ställer krav på att testa antikropparna med ett flertal metoder för att säkerställa att

antikroppar reagerar mot ett specifikt protein och inte mot ett protein som finns generellt i

amyloid.

SAP är ett protein som har utnyttjats och fortfarande forskas vidare på för att upptäcka

amyloid i ett tidigt stadium. Biopsier kan visa mikroskopiska spår av amyloidinlagringar i

små vävnadsprover men kan inte ge en hel kroppsöversikt. En sådan översikt är nödvändig

och informativ vid utvärdering av patienter eftersom de flesta patienter med systemisk

amyloidos kan ha amyloidavlagringar i organ som inte har biopserats och/eller inte kan

biopseras. Men dessa organ kan tyckas fungera normalt. SAP-skanning är det enda sättet att

få en fullständig bild av sjukdomens omfattning.

SAP är alltid är närvarande i amyloidavlagringar i alla typer av amyloidos eftersom det

binder starkt till amyloidfibriller av alla typer. Hos friska människor finns det mycket små

mängder SAP i blodet men inte i organen, medan det hos patienter med amyloidos finns,

förutom små mängder av SAP i blodet, stora mängder SAP beläggning på

amyloidavsättningar i organen. I SAP-skanningen ses all denna beläggning tydligt genom att

patienten får en spruta med radioaktivt märkt SAP som binder till amyloidfibriller och en

radioaktiv signal kan plockas upp med en gammakamera. Alla kroppsdelar där radioaktiv

signal detekteras innehåller amyloidavlagringar. På detta sätt erhålls en mycket tydlig bild av

placeringen och kvantiteten av amyloidavsättningen i organ i hela kroppen. Sedan kan man

gå vidare och typa amyloidosen med till exempel immunohistokemi.2

Syftet med denna studie var att framställa monoklonala antikroppar mot proteinet kappa vid

AL-amyloidos med hjälp av hybdriomteknik. De antikroppar som används vid

immunohistokemi idag för att typa AL-amyloidos orsakad av kappa protein, är inte

monoklonala och är därmed inte specifika.

2 http://www.amyloidosis.org.uk/diagnosis/sap-scintigraphy-3/

9

MATERIAL OCH METOD

Etik

Då projektet involverar djurförsök (mus), krävdes en godkänd etikprövning. Uppsala

djurförsöksetiska nämnd vid Uppsala tingsrätt har övervägt för- och nackdelar med studien

och huruvida djuren kan påverkas. Etikprövningen godkändes och diarienumret är C 49/14

med titeln ”Framställning av monoklonala antikroppar specifika för mänskliga

amyloidproteiner (bl. AL-kappa, TTR, medin, ApoA1) i mus”.

Ingen särskild etikprövning krävs för institutionen för att färga vävnadssnitt från patienter då

det finns en godkänd etikprövning som täcker hela biobanken.

Kontroll av amyloid på vävnadssnitt från kappa respektive lambda positiv patient

För att säkerställa att rätt preparat valts för test av monoklonala antikroppar från

hybridomceller, gjordes immunohistokemi på vävnadssnitt från 2 olika preparat, dels från en

patient med AL-amyloidos orsakad av kappa immunoglobulin och dels från en patient med

AL-amyloidos orsakad av lambda immunoglobulin.

Parallellt färgades snitt från båda preparaten med kongorött för att identifiera var amyloid

fanns i snitten och för att undersöka om antikroppar mot lambda respektive kappa bundit till

samma områden på snitten.

Immunohistokemi

Tre glas med avparaffinerade och hydrerade kappa-positiva vävnadssnitt från njure sköljdes i

TBS (Tris-buffered saline) i 20 min. Sheep-anti human kappa (produkt kod AU015) (The

Binding Site Group Ltd) späddes i tre steg (1:100, 1:1 000, 1:5 000) och inkuberades i en

fuktkammare över natt. Dagen efter tvättades alla snitt i TBS 3x3 min, och inkuberades med

Alexa Flour 488 Donkey, anti-sheep IgG (H+L) spädd 1:1 000 i en fuktkammare under en

10

timme. Sedan tvättades glasen i TBS 3x3 min och förvarades mörkt. Glasen monterades i

DAPI och PBS glycerol (1:1). Slutligen fixerades täckglaset med lite Pertex runt kanterna och

fick torka i 40 min. Vävnadssnitten undersöktes i ett fluorescensmikroskop (Leica, LEITZ

DMRBE med Leica, DFC420 C). Programvaran som användes var LAS V4.2.

Vid en tidigare studie framställdes antikroppar (PWlam) mot lambda protein vid

AL-amyloidos. Dessa antikroppar användes vid kontroll av förekomst av lambda-protein i

vävnadssnitt från lambda-positiv patient samt som negativ kontroll på vävnadssnitt från

kappa-positiv patient.

Tre glas med avparaffinerade och hydrerade lambda-positiva vävnadssnitt från hjärta

sköljdes i 0,3 % H2O2 i TBS i 20 minuter. Därefter tvättades de i TBS under 2 x 3 min och

inkuberades med PVlam (lösning från cellodling) i en fuktkammare över natt. Dagen efter

tvättades alla snitt i TBS 3x3 min. Polyclonal kanin anti-mus IgG HRP (Dako) späddes 1:200

och snitten inkuberades i en fuktkammare under en timme. Sedan tvättades glasen i TBS 3x3

min innan de framkallades med DAB (färdiga rör vid Institutionen för medicinsk cellbiologi)

i 15 min. Glasen tvättades i kranvatten och färgades med Mayers hematoxylin under 1 min

och tvättades återigen i kranvatten. Vävnadssnitten dehydrerades och monterades med Pertex

och studerades sedan i mikroskop.

Hybridomceller (TTR) testades med hjälp av immunohistokemi från tio olika brunnar där

cellerna växte som bäst. Glas med vävnadssnitt från TTR-positiv patient från hjärta användes.

Sedan följdes metoden för immunohistokemi för lambda-positiva vävnadssnitt.

Intensiteten av infärgningen studerades och på antikroppar som färgade in vävnadssnitt

starkast gjordes en limited dilution, det vill säga antikropparna blandades med 10 ml

odlingsmedium och såddes ut på en ny 96-hålsplatta (100 µl/brunn). Efter en vecka valdes

11

brunnar med flest hybridomceller från varje platta ut och immunohistokemi gjordes som

ovan.

Alkalisk kongorött

Vävnadssnittet kärnfärgades under 2 min i Mayers hematoxylin efter avparaffinering, sedan

fick snittet blåna i kranvatten under 10 min. Efter detta inkuberades glaset i Kongo A-lösning

(färdiga flaskor vid Institutionen för medicinsk cellbiologi) under 20 min och Kongo-B

lösning (färdiga flaskor vid Institutionen för medicinsk cellbiologi) i 20 min.

Efter inkuberingen sköljdes glaset i absolut etanol under mindre än 1 min och därefter i en

andra kyvett med absolut etanol innan det fick stå i xylen 2 x 5 min. Montering gjordes med

Pertex och snitten analyserades i ett polarisationsmikroskop (Olympus, BX53).

Framställning av monoklonala antikroppar och karaktärisering av hybridom

För att kunna framställa monoklonala antikroppar fuserades mjältceller från mus och

myelomceller. Det är viktigt att gynna tillväxten av myelomceller med hjälp av peritoneala

makrofager (feederceller) som finns bukvätskan på mus då dessa producerar IL-6.

Musen injicerades med 100 µg antigen mot kappa-protein 3-4 dagar innan fusion.

Vid framtagning av peritonealmakrofager sövdes musen först och halskotorna

dislocerades. Peritonealhålan fylldes med 5 ml iskall PBS med hjälp av en fin nål och

masserades in. Huden klipptes upp och vätskan sögs ut med hjälp av en pasteurpipett.

Feedercellerna centrifugerades i 800 x g i 10 min och pelleten löstes upp i 16 ml

odlingsmedium (1640 Medium med L-glutamine och natriumbicarbonat, Sigma-Aldrich), 5

ml natriumpyruvat (Sigma-Aldrich), 50 ml FCS (Fetalt bovine serum, Sigma-Aldrich),

250 µl Betamercaptoetanol (0,1 M), 5 ml PEST (Penicillin-Steptomycin, Sigma-Aldrich))

och 50 µl pipetterades i varje brunn på 96 håls-plattor.

12

Från odlingsmediet (se framtagning av peritoneala makrofager, ”Feederceller”) tillsattes

sedan 5 ml till sex stycken mindre odlingsflaskor och till sist tillsattes 500 µl

makrofager/feederceller från mus till varje odlingsflaska. Detta fick stå i ett värmeskåp över

natt och sedan tillsattes myelomceller Sp2/0 (Sp2/0-Ag14, LGC Standards-ATCC) till

odlingsflaskorna. Efter två dagar byttes odlingsmediet på samtliga odlingsflaskor. Efter

ytterligare 4 dagar studerades cellerna i odlingsflaskorna för att se vilka celler som delat sig

mest. De flaskor som det var dålig tillväxt i kastades och de flaskor där mycket celldelning

kunde ses delades upp i fler flaskor.

Från varje flaska pipetterades 5 ml lösning ner i två nya odlingsflaskor (2,5 ml i vardera).

Sedan tillsattes 5 ml odlingsmedium i samtliga flaskor, det vill säga ursprungsflaskan med

Sp2/0 och “feederceller” samt de två nya odlingsflaskorna som innehöll 2,5 ml lösning från

ursprungsflaskan.

Två dagar senare fördes cellerna tillsammans med odlingsmediet över till ett 50 ml Falconrör

och centrifugerades i 5 minuter i 1000 x g. Sedan löstes pelleten upp med 50 ml nytt

odlingsmedium och pipetterades över till två nya stora odlingsflaskor.

Denna procedur upprepades dagen innan fusion så att det totalt fanns 4 odlingsflaskor med

myelomceller Sp2/0. Från dessa odlingsflaskor pipetterades 100 µl feederceller/brunn på

96-håls plattor som en förberedelse inför fusionen.

Fusion av mjältceller och myelomceller

Musen sövdes, dislocerades och lades på höger sida. Buken spritades av och huden samt

peritoneum klipptes upp. Mjälten togs ut och lades i ett rör med serumfritt medium (RPMI

och 5 ml PEST).

Tre stycken 10 ml sprutor fylldes med serumfritt medium och nålar sattes på. Med nålen

pickades många hål i mjälten och sedan sprutades mediet genom mjälten.

13

Cellsuspensionen fördes över till ett 50 ml rör och fick stå i 2 min. För att bli av med stora

vävnadsbitar dekanterades cellsuspensionen över till ett nytt rör som centrifugerades i 800 x g

under 10 min och supernatanten pipetterades bort. Cellerna tvättades sedan 2 ggr i 20 ml

serumfritt medium och centrifugerades i 800 x g under 10 min. Efter tvättningen späddes

pelleten med 10 ml serumfritt medium, antalet celler räknades i bürkerkammare.

Myelomcellerna fördes över till ett 50 ml rör och centrifugerades i 800 x g under 10 min

och sedan pipetterades supernatanten bort. Cellerna tvättades i 20 ml serumfritt medium två

gånger och centrifugerades i 800 x g under 10 min mellan varje tvätt. Efter tvättningen

späddes pelleten med 10 ml serumfritt medium och antalet celler räknades i bürkerkammare.

Mjältcellerna och myelomcellerna blandades 10:1 i ett 50 ml rör och centrifugerades.

Pelletten löstes genom att försiktigt knacka på röret och sedan placerades röret i ett kärl med

37 °C vatten. Efter detta tillsattes 1 ml polyetylenglykol (PEG, 37 °C, Sigma-Aldrich) under

1 min och röret roterades hela tiden så att allt blandades väl.

Sedan tillsattes 10 ml serumfritt medium långsamt under cirka 5 min och blandades genom

att försiktigt vända röret upp och ner för att låta vätskan rinna tillbaka försiktigt längs kanten.

Röret roterades och 10 ml serumfritt medium tillsattes och sedan tillsattes 10 ml medium med

15 % FCS, därefter ytterligare 20 ml medium med 15 % FCS och slutligen tillsattes 2 ml

FCS. Röret fick sedan stå i inkubator i 1,5 timmar. Cellerna centrifugerades ner i 600 x g

under 10 min och späddes upp till en cellkoncentration (mjält + myelomceller) på

4-10 x 105 celler/ml och 50 µl/brunn såddes ut i 96-håls plattor med feederceller.

HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium förbereddes genom att blanda 100 ml

komplett medium med 4 ml HAT och 50 µl 0,1 M 2-merkaptoethanol. Dagen efter fusion

tillsattes 100 µl HAT-medium per brunn på 96-hålsplattorna.

Efter en vecka byttes HAT-medium på cellerna igen.

14

Screening för att påvisa antikroppsproduktion mot immunoglobulin kappa

Efter ytterligare en vecka studerades brunnarna på 96-hålsplattan med hybridomceller och

från brunnar med mest tillväxt av hybridomceller, utfördes immunohistokemi på

mediumlösningen. De antikroppar från hybridomceller som påvisade reaktivitet vid

immunohistokemi, såddes ut i varsin brunn (150 µl/brunn) i en 12-hålsplatta med 2 ml HATx

1 medium. Efter 4 dagar valdes brunnar ut från 12-håls-plattan där tillväxt av hybridomceller

kunde konstateras. Brunnar från 96-håls-plattan med mycket hybridomceller valdes också ut

och immunohistokemi utfördes på de utvalda brunnarna från 12-hålsplattan och 96-

hålsplattan. Efter ytterligare några dagar utfördes immunohistokemi på samtliga brunnar från

12-hålsplattan.

Vävnadssnitt från njure på kappa-positiv patient behandlades med 3 olika buffertar, Tris-

buffert (0,1 M, pH 10), citrat-buffert (0,1 M, pH 6) och glycerin-buffert (0,1 M, pH 3).

Bufferten med glasen värmdes upp tills det började koka. Efter detta fick glasen svalna och

sköljdes i TBS i 20 minuter. Snitten inkuberades i fuktkammare över natt med 100 µl

medium (primära antikroppen). Dagen efter tvättades de i TBS 3x3 min. Polyclonal kanin

anti-mus IgG HRP (Dako) späddes 1:200 och inkuberades i en fuktkammare under en timme.

Sedan tvättades glasen i TBS 3x3 min innan framkallning skedde med DAB (färdiga rör från

Institutionen för medicinsk cellbiologi) i 15 min.

Glasen tvättades i kranvatten och färgades med Mayers hematoxylin under 1 min och

tvättades återigen i kranvatten. Vävnadssnitten dehydrerades, monterades i Pertex och

studerades i mikroskop.

ELISA

Syftet med att göra en ELISA var att göra en antikroppsscreening för att se om det fanns

antikroppar från hybridomceller som var riktade mot kappaproteinet.

15

En 96-hålsplatta coatades med 50 µl/brunn kappaprotein i karbonatbuffert (0.1 M, pH 9.8).

Aluminiumfilm sattes på 96-hålsplattan och sedan fick den stå över natt i 4 °C. Vätskan slogs

ut ur alla brunnar genom att slå plattan mot bunt en av papper. Sedan tvättades brunnarna

med TBS buffert två gånger (300 µl/brunn). Blockeringslösning gjordes genom att tillsätta

150 µL/brunn av 5 % albumin i TBS och inkuberades under 1 timme. Brunnarna sköljdes

med TBS 3 ggr (150 µl/brunn).

Medium (100 µl) pipetterades över från 96-hålsplattan där odling av hybridomceller skett

till den coatade 96-hålsplattan. Aluminiumfilm sattes på plattan och sedan inkuberades den

över natt i 4°C. Plattan tvättades med TBS 3 ggr och bufferten slogs av mellan tvättarna.

Sekundärantikroppen (Polyclonal kanin anti-mus IgG HRP (Dako)) späddes 1:1 500 och 100

µl tillsattes till varje brunn och inkuberades under 1 timme. Efter detta tvättades brunnarna

med TBS 3 ggr. Sedan tillsattes 100 µl/brunn substrat (3,3’ 5,5’- Tetramethylbenzidine

(TMB) Liquid substrate system (T8665, Sigma)) och plattan inkuberades under 10 min och

analyserades vid 370 och 655 nm i en fluoroscann (Fluostar Omega, BMG Labtech) under 15

min. De brunnar som var positiva enligt ELISA pipetterades över till en 24-hålsplatta och 1,5

ml odlingsmedium tillsattes.

ELISA på hybridomceller (TTR) utfördes för att göra antikroppsscreening för att se om det

fanns antikroppar från U6 celler som var riktade mot TTR proteinet. En 96-hålsplatta

coatades med 50 µl/brunn TTR protein i karbonatbuffert (0.1 M, pH 9.8). Aluminiumfilm

sattes på 96-hålsplattan och sedan fick den stå över natt i 4°C. Sedan följdes

metodbeskrivningen ovan.

16

Karaktärisering av U6 med hjälp av immunohistokemi, ELISA och Western blot

U6 är icke karaktäriserade hybridomceller från mus som frysts ned vid Institutionen

medicinsk cellbiologi. Dessa hybridomceller producerar troligtvis antikroppar mot

amyloidostypen Transthyretin (TTR).

Till en odlingsflaska med myelomcellerna Sp2/0 tillsattes U6 (hybridomceller) för att kunna

karaktärisera hybridomcellerna. Dessa hybridomceller fick växa i odlingsmediet och sedan

testades antikroppar från tio olika brunnar på vävnadssnitt från hjärta från TTR-positiva

patienter med immunohistokemi.

Western blot: Hybridomceller (TTR)

Då immunohistokemi på vävnadssnitt från TTR-positiv patient påvisade positiv reaktion men

ELISA inte påvisade antikroppar, gjordes en Western blot. Syftet var att testa om

antikropparna reagerade med renat TTR-protein med en annan metod för att kunna dra

slutsatsen om det fanns antikroppar mot TTR eller inte.

7X är en antikropp som tidigare tagits fram vid Institutionen för medicinsk cellbiologi som

reagerar starkt med TTR-protein och därför användes denna antikropp som positiv kontroll.

De andra två proverna som testades kom från två olika batcher av U6.

Separationsgelen förbereddes genom att blanda 3,1 ml Akrylamid 4K-40 % Mix 29:1

(Saveen Werner AB), 2,5 ml gel buffert, 750 µl glycerol (AppliChem), 1,125 ml destillerat

vatten, 50 µl ampas (färdigt rör från institutionen för medicinsk cellbiologi) samt 5 µl Temed

(Sharlau). Spacergelen förbereddes genom att blanda 750 µl Akrylamid 4K-40 % Mix 29:1

(Saveen Werner AB), 1 ml gel buffert (färdig flaska från Institutionen för medicinsk

cellbiologi), 1,25 ml destillerat vatten, 20 µl ampas (färdigt rör från institutionen för

medicinsk cellbiologi) samt 2 µl Temed (Sharlau). Stackninggelen förbereddes genom att

blanda 500 µl Akrylamid 4K-40 % Mix 29:1 (Saveen Werner AB), 1,25 ml gel buffert (färdig

17

flaska från Institutionen för medicinsk cellbiologi), 3,25 ml destillerat vatten, 80 µl ampas

(färdigt rör från institutionen för medicinsk cellbiologi) samt 8 µl Temed (Sharlau).

Renat TTR proteinpulver (från Institutionen för medicinsk cellbiologi) blandades med 150

µl loadingdye (från Institutionen för medicinsk cellbiologi) och hettades upp till 95 °C under

5 min. De två yttersta brunnarna laddades med 20 µl buffert, sedan laddades en brunn med

20 µl stege (Low range protein, Spectra multicolor) och resten av brunnarna med 20 µl av

proteinprovet. Efter detta kördes gelen över natt i 10 mA. Proteinerna från gelen överfördes

till nitrocellulosamembran (GE Healthcare) i 40 V, 400 mA under 3 timmar.

Efter 3 timmar kontrollerades om stegen överförts till membranet. Membranet tvättades i

TBS och sedan kokades membranet i TBS under 5 min. Efter detta blockerades det med 5 %

mjölkpulver (Semper) i TBS under 1 timme. Membranet klipptes i 3 delar och stoppades in i

varsitt Falconrör och 3 ml av olika primära antikroppar (7X, U6 1 & U6 2) tillsattes i

Falconrören. Membranbitarna inkuberades över natt i 4 °C.

Dagen efter tvättades de med blockeringsbuffert (2x5 min, 1x10 min). Sedan späddes den

sekundära antikroppen (Polyclonal kanin anti-mus IgG HRP (Dako)) med blockeringsbuffert

(1:1 500), 3 ml av lösningen tillsattes i varje rör och inkuberades under 2 timmar.

Membranet tvättades med TBS (2x5 min, 1x10 min). Sedan tillsattes 3 ml av substrat

(Immobilon Western, Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore) och inkuberades under 5

min. Slutligen togs bilder med ChemiDoc XRS (Bio-Rad).

Statistik

Vid denna studie kunde inte statistik tillämpas då studiens syfte var att framställa

monoklonala antikroppar mot amyloidproteinet kappa vid AL-amyloidos. Detta medför att

resultaten endast kan bli ja/nej beroende på om framställning av den monoklonala

antikroppen lyckats eller ej.

18

RESULTAT

Kontroll av amyloid på vävnadssnitt från kappa respektive lambda positiv patient

För att säkerställa att rätt preparat användes, färgades vävnadssnitt från olika preparat (patient

med AL-amyloidos av kappa-typ samt patient med AL-amyloidos av lambda-typ) med

alkalisk kongorött och immunohistokemi utfördes.

Immunohistokemi: Kappa

Sheep-anti human kappa är en polyklonal antikropp som används vid patologen på Rudbeck,

Akademsika sjukhusetMed hjälp av denna antikropp kunde preparatet från kappa-positiv

patient verifieras.

Immunohistokemi: Lambda

PWlam antikroppen har framställts vid Institutionen för medicinsk cellbiologi, BMC,

Uppsala universitet. Detta är en monoklonal antikropp som är riktad mot lambda proteinet vid

AL-amyloidos. Med hjälp av denna antikropp kunde det verifieras att preparatet kom från en

lambda-positiv patient, fig 1.

A B

Figur 1. Vävnadssnittet från lambda positiv patient (A) blev positiv vid immunohistokemi

med PWlam medan vävnadssnittet från kappa positiv patient (B) blev negativt.

19

Alkalisk kongorött

Vävnadssnitt från kappa-positiv samt lambda-positiv patient färgades med alkalisk kongorött

och det kunde konstateras att amyloida inlagringar fanns närvarande i snitten från de olika

preparaten, figur 2 och figur 3.

A B

Figur 2. Färgning med kongorött av vävnadssnitt från njure på kappa-positiv patient som

påvisar amyloid i ett polarisationsmikroskop. kongorött binder till amyloid. På bild A är

vissa områden mörkrosa och samma område på bild B blir ljusgrönt då ljuset bryts där

kongorött binder.

A B

Figur 3. Färgning med kongorött av vävnadssnitt från hjärta på lambda positiv patient som

påvisar amyloid i ett polarisationsmikroskop. Kongorött binder till amyloid. På bild A är

vissa områden mörkrosa och samma område på bild B blir ljusgrönt då ljuset bryts där

kongorött binder.

20

Screening för att påvisa antikroppsproduktion mot immunoglobulin kappa

Immunohistokemi: Test av hybridomceller (Kappa)

Brunnar med mest tillväxt av hybridomceller valdes ut på 96-håls-plattan och

immunohistokemi utfördes med cellodlingsmediet som primär antikropp, figur 4. Intensiteten

på infärgningen kunde skilja sig mycket beroende på om antikroppen bundit till ett protein

eller inte. Bland de reaktiva snitten fanns också en skillnad beroende på hur mycket antikropp

som bundit till proteinet.

A B C

Figur 4. Antikroppar producerade av hybridomceller testades på kappa-positiva vävnadssnitt

och intensiteten på färgningen bedömdes. Bilderna visar resultat från immunohistokemi med

cellmedium från olika brunnar (ospätt cellmedium), som sekundär antikropp användes

polyclonal kanin, anti-mus IgG HRP (1:200. Bild A visar negativt resultat, bild B visar en

viss reaktivitet och bild C påvisar reaktivitet.

ELISA – Hybridomceller (kappa)

Syftet med att göra en ELISA var att göra en antikroppsscreening för att se om det fanns

antikroppar från hybridomceller som var riktade mot kappa-proteinet. Resultatet från ELISA

påvisade reaktivitet i ett fåtal brunnar.

21

Karaktärisering av U6 med hjälp av immunohistokemi, ELISA och Western blot

U6 är icke karaktäriserade hybridomceller från mus som framställts vid Institutionen för

medicinsk cellbiologi.

Dessa hybridomceller producerar troligtvis antikroppar mot amyloidos av typen TTR

(Transthyretin). Immunohistokemi gjordes på vävnadssnitt från TTR-positiv patient och vissa

brunnar påvisade en positiv reaktivitet.

Vid ELISA påvisade alla brunnar negativt resultat och likaså vid Western blot där 2 batcher

från 2 ursprungsflaskor testades, figur 5.

Figur 5. U6 antikropparna (2 batcher) påvisade inget positivt resultat vid Western blot. På

bilden kan man se stegen till höger och grå banden till vänster är positiv kontroll (antikropp

7X).

22

DISKUSSION

Det finns ett flertal sjukdomar i dagens samhälle som orsakas av felveckade proteiner som

förlorat sin funktion. AL-amyloidos är en av dessa sjukdomar som orsakas av inlagringar av

monoklonala lätta immunoglobulinkedjor (kappa och lambda). Det är av stor betydelse att

snabbt kunna sätta in rätt behandling för att förbättra överlevnad hos patienter med

AL-amyloidos och därför är det viktigt att ha en snabb och korrekt diagnostisering. De

antikroppar som används vid immunohistokemi idag för att typa AL-amyloidos orsakad av

kappaprotein, är inte monoklonala och därmed inte specifika.

Hybridomtekniken är välkänd världen över och används som standardmetod för

framställning av monoklonala antikroppar. Denna metod är väl utarbetad och har fungerat i

tidigare studier även vid Institutionen för medicinsk cellbiologi. Nackdelen med denna metod

är att det är en lång process och innehåller många steg varav många kritiska. För att

framställningen ska lyckas måste alla steg i processen bli rätt. Något som kunde ha gjorts

bättre var framtagningen av mjältceller då undersökningen senare i mikroskop visade

mjältceller men inte i den mängd som förväntats. Detta kunde ha förbättrat fusionen,

resultatet skulle ha blivit fler hybridomceller och därmed skulle chansen att hitta en subklon

ökat. Vid fortsatt odling av hybridomceller uppstod ett flertal infektioner i odlingsplattorna

och detta var svårt att undvika. Byte av odlingsmedium samt limited dilution av positiva

brunnar är nödvändigt för att hybridomcellerna ska fortsätta växa men detta medför även en

ökad risk för kontamination.

Metoder som ELISA och Western blot är också välkända och metodbeskrivningarna är väl

utarbetade för att kunna undvika felkällor. Det finns dock ett flertal steg i båda metoderna

som sträcker sig över 2-3 dagar, där fel kan uppkomma som till exempel miss av ett tvättsteg

eller blockeringsteg, vilket kan påverka resultatet.

23

Immunohistokemi på vävnadssnitt från patienter är också en metod som är enkel men i och

med att all immunohistokemi under denna studie gjordes manuellt, kan felkällor uppstå. Det

förekom ett flertal gånger att vävnadssnittet hade konstig bakgrundfärg eller inte färgats som

det skulle. I sådana fall var det svårt att avgöra vad exakt det berodde på, det kunde vara allt

från avparaffinering till den slutliga monteringen.

Många studier har lyft vikten av immunohistokemi för att kunna typa amyloidos.

Immunohistokemi samt färgning med kongorött av vävnadsbiopsier är i dagsläget den enda

diagnostiken som finns för att fastslå vilken typ av amyloidos det är [29-31].

Att undvika falskt positiva resultat var en väsentlig del i studien och därför användes

immunohistokemi samt kongorött. Men hjälp av immunohistokemi och kongorött var det

möjligt att säkerställa lokalisationen för amyloidinlagringar.

Antikroppen mot lambda-proteinet var monoklonal då resultatet påvisade specifik bindning

på lambda-positiva vävnadssnitt i områden där amyloidinlagringar lokaliserats med hjälp av

kongorött. Immunohistokemi på kappa-positiv patient med den kommersiella polyklonala

antikroppen fick göras om två gånger samt med olika spädningar av antikroppen för att

närvaron av proteinet kappa skulle kunna fastställas. Detta för att fluorescens inte kunde ses

vid första tillfället vilket kunde bero på att antikroppen inte kunde binda. Kommersiella

antikroppar anses i många studier inte tillräckligt känsliga och förlitliga för typning av

amyloidos [32-37].

Resultatet från immunohistokemi där antikroppar från hybridomceller användes som

primärantikroppar påvisade reaktivitet i vissa brunnar. Några av dessa brunnar påvisade även

reaktivitet vid ELISA medan andra inte gjorde det.

Anledningen till att reaktivitet sågs vid immunohistokemi men inte med ELISA kan vara på

grund av att proteinet har en annan konformation i vävnaden som gör att antikroppen binder

bättre alternativt att antikroppen binder ett annat protein i vävnaden och inte kappa. Det kan

24

uppstå ospecifika bindningar om antikroppen binder till andra blodproteiner som till exempel

SAP och heparansulfat-proteoglykan. De brunnar som påvisade reaktivitet både vid ELISA

och immunohistokemi kan innehålla en klon som producerar monoklonala antikroppar mot

kappa.

Vid karaktärisering av U6 mot amyloidostypen TTR (Transthyretin), påvisade

immunohistokemi positiv reaktivitet i vissa brunnar men ingen reaktivitet vid ELISA och

Western blot. Med avseende på detta kan slutsatsen dras att U6 reagerade med annat protein i

vävnaden vid immunohistokemi och inte med TTR-proteinet. Om det skulle finnas

antikroppar mot TTR, skulle U6 reagera mot renat TTR-protein som fanns närvarande vid

både ELISA och Western blot.

Studien med både U6 och kappa-antikroppar kan fortsättas genom att köra limited dilution

samt upprepa immunohistokemi, ELISA och Western blot på de brunnar som påvisar

reaktivitet. Detta för att uppnå syftet att slutligen hitta en subklon som ger positivt resultat på

ett flertal kappa positiva vävnadssnitt från olika patienter samt påvisar positivt resultat vid

ELISA eller Western blot. Många gånger blir det inte ett positivt resultat på Western blot

även om antikroppen är monoklonal för det renade proteinet vilket kan bero på att

proteinstrukturen är förändrad. Vid Western blot tillsätts SDS som förändrar proteinets

ursprungliga struktur och beroende på om epitopen sitter på den primära, sekundära eller

teritära strukturen, kan det påverka om antikroppen kan binda eller inte.

Om man slutligen kan få fram en subklon som producerar monoklonala antikroppar mot

kappa-proteinet, kommer detta att vara till stor hjälp vid diagnostisering av AL-amyloidos

orsakad av kappa-immunoglobuliner. Diagnostiseringen skulle bli snabbare och mer specifik

vilket skulle spara både tid och pengar. Det viktigaste vore dock att patienten skulle kunna

behandlas snabbare och därmed skulle prognosen kunna bli bättre.

25

Det pågår forskning om SAP-scintigrafi som används flitigt i Storbritannien. Problemet med

SAP är att denna molekyl är så pass komplicerad att den inte går att framställa kemiskt utan

måste renas från människor. Detta är möjligt i vissa länder men inte i till exempel USA då det

inte är tillåtet att rena fram något från en människa och sedan spruta in det på en patient på

grund av Bovine spongiform encephalopathy (BSE).

Att framställa SAP är både omständigt och kräver mycket resurser och därför pågår även

forskning på molekyler som går att framställa kemiskt. Dessa molekyler liknar kongorött-

molekylen så att de kan binda amyloidinlagringar lika bra som kongorött. Tanken är att dessa

molekyler ska sprutas in i patienten precis som SAP och sedan kunna detekteras med hjälp av

PET-kamera. Detta skulle kunna ge en översikt över hela kroppen precis som vid SAP-

scintigrafi så att man inte behöver ta biopsier för att undersöka hur utspridd amyloidosen är

och för att följa upp en behandling. Detta skulle i sådana fall vara mer praktiskt och mindre

kostsamt än SAP-scintigrafi. För att sedan typa amyloidosen behöver man gå vidare med

immunohistokemi och där kommer återigen vikten av monoklonala antikroppar in.

Monoklonala antikroppar för varje amyloidostyp och då även mot immunoglobulin kappa,

skulle bespara vården resurser och patienten onödigt lidande.

Slutsatsen för denna studie är att en subklon för produktion av monoklonala antikroppar

mot immunoglobulin kappa vid Al-amyloidos kunde ej framställas men denna studie kan

fortsättas genom att upprepa de metoder som tillämpats under studien.

26

REFERENSER

[1] Chiti F, Dobson C.M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu

Rev Bioch.75, 333-366 (2006)

[2] Alzheimer's disease international. World Alzheimer report (2010)

[3] Dobson C.M. Protein folding and misfolding. Nature. 426, 884-890 (2003)

[4] Olshansky S.J, Passaro DJ. et al. A potential decline in life expectancy in the United

States in the 21st century. N Engl J Med. 352, 1138-1145 (2005)

[5] Alzheimer’s disease: Facts and figures. Alzheimer’s association (2012)

[6] Hardy J, Selkoe D.J. Medicine - the amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress

and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).

[7] Eisenberg D, Jucker M. The amyloid state of proteins in human diseases. Cell. 148, 1188-

1203 (2012)

[8] Bucciantini M, Giannoni E. et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common

mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002)

[9] Leung N, Nasr SH, Sethi S. How I treat amyloidosis: the importance of accurate

diagnosis and amyloid typing. Blood.120:3206-16 (2012)

[10] Merlini G, Seldin DC, Gertz MA. Amyloidosis: pathogenesis and new therapeutic

options. J Clin Oncol. 29:1924-33 (2011)

[11] Kyle RA, Linos A. et al. Incidence and natural history of primary systemic amyloidosis

in olmsted County, Minnesota, 1950 through 1989. Blood. 79:1817-22 (1992)

[12] Chesi M, Bergsagel PL. Molecular pathogenesis of multiple myeloma: basic and clinical

updates. Int J Hematol. 97:313-23 (2013)

[13] Kanji M, Shigeo K, Kenshi S. Abdominal subcutaneous fat pad aspiration and bone

marrow examination for the diagnosis of AL-amyloidosis: the reliability of

immunohistochemistry. Int J Hematol. 102:289-295 (2015)

27

[14] Alexander J Howie, Brewer DB. et al. Physical basis of colors seen in Congo red-stained

amyloid in polarized light. Lab Invest. 88, 232-242 (2008)

[15] Swan N, Skinner M, O’Hara CJ. Bone marrow core biopsy specimens in AL (primary)

amyloidosis. A morphologic and immunohistochemical study of 100 cases. Am J Clin Pathol.

120:610-6 (2003)

[16] Kyle RA, Greipp PR. Amyloidosis (AL). Clinical and laboratory features in 229 cases.

Mayo Clin Proc. 58:665-83 (1983)

[17] Hanack K, Messerschmidt K, Listek. Antibodies and selection of monoclonal

antibodies. Adv Exp Med Biol. 917:11-22 (2016)

[18] Spieker-Polet H, Sethupathi P, Yam PC, Knight KL. Rabbit monoclonal antibodies:

generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas. PNAS USA. 92:9348–9352

(1995)

[19] Kilmartin JV, Wright B, Milstein C. Rat monoclonal antitubulin antibodies derived by

using a new nonsecreting rat cell line. J Cell Biol. 93:576–582 (1982)

[20] Osborne J, Harrison P. et al. Novel super-high affinity sheep monoclonal antibodies

against CEA bind colon and lung adenocarcinoma. Hybridoma. 18:183–191 (1999)

[21] Messerschmidt K, Hempel S. et al. IgA antibody production by intrarectal immunization

of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol

Immunol. 2:231–238 (2012)

[22] Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

predefined specificity. Nature. 256:495–497 (1975)

[23] Puck TT, Marcus PI. A rapid method for viable cell titration and clone production with

HeLa cells in tissue culture: the use of x-irradiated cells to supply conditioning factors. PNAS

USA. 41:432–437 (1995)

28

[24] Browne SM, Al-Rubeai M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines.

Trends Biotechnol. 25:425–432 (2007)

[25] Underwood PA, Bean PA. Hazards of the limiting-dilution method of cloning

hybridomas. J Immunol Methods. 107:119–128 (1988)

[26] Coller HA, Coller BS. Poisson statistical analysis of repetitive subcloning by the limiting

dilution technique as a way of assessing hybridoma monoclonality. Methods Enzymol.

121:412–417 (1986)

[27] Shi SR, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded

tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based upon microwave

oven heating of tissue section. J Histochem Cytochem. 39:741-748 (1991)

[28] Mahmood T, Yang P-C. Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North

American Journal of Medical Sciences. 4(9):429-434 (2012). doi:10.4103/1947-2714.100998

[29] Swan N, Skinner M, O’Hara CJ. Bone marrow core biopsy specimens in AL (primary)

amyloidosis. A morphologic and immunohistochemical study of 100 cases. Am J Clin Pathol.

120:610–6 (2003)

[30] Duston MA, Skinner M, Shirahama T, Cohen AS. Diagnosis of amyloidosis by

abdominal fat pad aspiration. Analysis of four years’ experience. Am J Med. 82:412–4 (1987)

[31] Libbey CA, Skinner M, Cohen AS. Use of abdominal fat tissue aspirate in the diagnosis

of systemic amyloidosis. Arch Intern Med. 143:1549–52 (1983)

[32] Schönland SO, Hegenbart U. et al. Immunohistochemistry in the classification of

systemic forms of amyloidosis: a systematic investigation of 117 patients. Blood. 119:488–93

(2012)

[33] Röcken C, Schwotzer EB. et.al. The classification of amyloid deposits in

clinicopathological practice. Histopathology. 29:325–35 (1996)

29

[34] . Linke RP, Oos R. et.al. Classification of amyloidosis: misdiagnosing by way of

incomplete immunohistochemistry and how to prevent it. Acta Histochem. 108:197–208

(2006)

[35] Kebbel A, Röcken C. Immunohistochemical classification of amyloid in surgical

pathology revisited. Am J Surg Pathol. 30:673–83 (2006)

[36] Collins AB, Smith RN, Stone JR. Classification of amyloid deposits in diagnostic

cardiac specimens by immunofluorescence. Cardiovasc Pathol. 18:205–16 (2009)