PRAKTIKUM IZ MIKROBNE EKOLOGIJE - bf.uni-lj.si · Stopar, D., Stres, B. , Mahne I. Praktikum iz mikrobne ekologije za študente mikrobiologije. Univerza v Ljubljani, Biotehniška

PRAKTIKUM IZ MIKROBNE EKOLOGIJE

ZA ŠTUDENTE MIKROBIOLOGIJE

David Stopar, Blaž Stres in Ivan Mahne

Ljubljana, 2009

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Avtorji : David Stopar, Blaž Stres in Ivan Mahne

Naslov: Praktikum iz mikrobne ekologije za študente mikrobiologije

Recenzenta: prof. dr. Nina Gunde Cimerman

prof. dr. Gorazd Avguštin

Izdajatelj: Univerza v Ljubljani

Biotehniška fakulteta

Oddelek za živilstvo

CIP – Kataložni zapis o publikaciji

Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana

Način dostopa (URL): http://www.bf.uni-lj.si/zivilstvo

ISBN 978-961-6333-60-3

COBISS.SI-ID 234767872

Po sklepu dekana Biotehniške fakultete dne 9.10.2009 je delo Praktikum iz mikrobne

ekologije za študente mikrobiologije študijski pripomoček za laboratorijske vaje pri

predmetu Mikrobna ekologija.

Vse pravice pridržane. Ponatis (grafični, elektronski ali mehanski, vključno s

fotokopiranjem, snemanjem ali prenosom v baze podatkov) celote ali posameznih delov je

dovoljen le s pisnim soglasjem nosilca avtorskih pravic.

Stopar, D., Stres, B. , Mahne I. Praktikum iz mikrobne ekologije za študente mikrobiologije. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2009

I

KAZALO VSEBINE

1 UVOD………………………………………………………………………………… 1

1.1 POVZETEK POJMOV……………………………………………………...……… 1 1.1.1 Ekologija - osnovna terminologija………………………………………………... 1.1.2 Nepisana pravila v ekologiji………………………………………………………. 1.1.3 Kaj različni ljudje pojmujejo pod ekologijo…………………………………….. 1.1.4 Komponente ekosistema………………………………………………………….. 1.1.5 Kroženje energije snovi…………………………………………………………… 1.1.6 Biogeokemijski procesi pomembni pri kroženju snovi…………………………. 1.1.7 Prehranjevalni spleti……………………………………………………………… 1.1.8 Mikrobna prehranjevalna zanka…………………………………………………

1 1 1 2 3 3 4 4

1.2 MERITVE V MIKROBNI EKOLOGIJI……………………………………………. 5 1.2.1 Napake zaradi merilnih naprav………………………………………………….. 1.2.2 Napake zaradi neprimerne analitične metode…………………………………… 1.2.3 Napake pri vzorčenju……………………………………………………………… 1.2.4 Splošna pravila pri vzorčenju mikrobioloških vzorcev…………………………. 1.2.5 Primeri izračunavanja eksperimentalnih napak…………………………………

6 6 6 7 7

1.3 PLINSKA KROMATOGRAFIJA…………………………………………………… 11 1.3.1 Aparatura…………………………………………………………………………... 1.3.2 Nosilni plin…………………………………………………………………………. 1.3.3 Kolone………………………………………………………………………………. 1.3.4 Detektorji ………………………………………………………………………….. 1.3.5 Meritev CO2 in N2O………………………………………………………………..

11 11 11 13 14

2 OGLJIK……………………………………………………………………………… 15

2.1 KOMPLETNOST OKOLJA IN RAZGRADNJA ORGANSKEGA MATERIALA.. 15 VAJA1: Eksperimentalni model za proučevanje razgradnje celuloze…………………... 15

2.2 IZKORISTEK PORABE ORGANSKEGA SUBSTRATA V ODVISNOSTI OD FAKTORJEV OKOLJA……………………………………………………………..

19

VAJA 2: Eksperimentalni model porabe škroba in glukoze v okolju………………….. 19

2.3 VELIKOST ZDRUŽBE IN DELEŽ AMILOLITIČNIH MIKROBOV V VZORCIH TAL IN VODE…………………………………………………………..

22

VAJA 3: Velikost združbe amilolitičnih mikroorganizmov v vzorcih vode in tal……… 22

VAJA 4: Delež amilolitičnih mikrobov v mikrobni združbi……………………………. 24

2.4 MIKROBNA BIOMASA……………………………………………………………. 26 VAJA 5: S substratom inducirana respiracija (SIR)…………………………………….. 27

2.5 METAN OKSIDIRAJOČE BAKTERIJE…………………………………………… 29 VAJA 6: Velikost združbe metan-oksidirajočih bakterij………………………………... 29

3 ŽVEPLO……………………………………………………………………………... 32

3.1 MINERALIZACIJA ŽVEPLA……………………………………………………… 32 VAJA 7: Anaerobna mineralizacija organskega žvepla………………………………… 32


II

3.2 REDUKCIJA SULFATOV………………………………………………………….. 34

VAJA 8: Velikost združbe sulfatnih respiratorjev………………………………………. 34

VAJA 9: Vpliv kisika na sulfatno respiracijo…………………………………………… 35

VAJA 10: Sulfatna respiracija v sedimentu……………………………………………... 36

4 DUŠIK………………………………………………………………………………... 38

4.1 MINERALIZACIJA DUŠIKA………………………………………………………. 38 VAJA 11: Velikost združbe amonifikatorjev…………………………………………… 38 VAJA 12: Vpliv kisika in razmerja C:N organske snovi na kapaciteto za mineralizacijo dušika……………………………………………………………

40

VAJA 13: Določanje NH4+-N in (NO3

-+NO2-)-N………………………………………. 42

4.2 NITRIFIKACIJA…………………………………………………………………….. 47 VAJA 14: Velikost mikrobne združbe nitrifikatorjev…………………………………... 47

VAJA 15: Vpliv pH na nitrifikacijo…………………………………………………….. 49

VAJA 16: Vpliv aeriranja na nitrifikacijo………………………………………………. 49 VAJA 17: Vpliv dodajanja obogatene kulture nitrifikatorjev na proces nitrifikacije v tleh……………………………………………………………….

50

4.3 DISIMILATIVNA REDUKCIJA NITRATA IN DENITRIFIKACIJA…………….. 53 VAJA 18: Velikost mikrobne združbe anaerobnih bakterij in denitrifikatorjev………… 53

VAJA 19: Vpliv aeriranja in organske snovi pri denitrifikaciji…………………………. 55

VAJA 20: Ugotavljanje kapacitete vzorca za denitrifikacijo z merjenjem N2O………... 56

5 IZBRANA POGLAVJA V MIKROBNI EKOLOGIJI………………………….. 58

5.1 POMNOŽEVANJE OKOLJSKIH VZORCEV DNA Z VERIŽNO REAKCIJO S POLIMERAZO (PCR)……………………………………………………………….

58

VAJA 21: Raztapljanje in priprava začetnih oligonukleotidov…………………………. 58

VAJA 22: Temperatura taljenja začetnih oligonukleotidov…………………………….. 59

VAJA 23: Izračun sestave PCR…………………………………………………………. 60

VAJA 24: Ločevanje DNA na agaroznih gelih…………………………………………. 61

5.2 ADSORPCIJA MIKROORGANIZMOV NA TRDNO PODLAGO………………... 62 VAJA 25: Adsorpcija mikrobov na minerale glin………………………………………. 63

VAJA 26: Opazovanje adsorpcije mikroorganizmov na steklo…………………………. 63

5.3 MATEMATIČNI MODELI V MIKROBNI EKOLOGIJI………………………….. 63 5.3.1 Matematični opis homogenih sistemov……………………………………………. 5.3.2 Matematični opis heterogenih sistemov…………………………………………… 5.3.3 Matematični opis mikrobne rastne kinetike……………………………………….. 5.3.4 Najbolj pogosti matematični modeli v mikrobni ekologiji………………………... 5.3.5 Matematična analiza modelov……………………………………………………..

63 64 64 65 65

VAJA 27: Primer simuliranja eksperimentalnih podatkov z ustreznim matematičnim modelom v programu Microsoft Excel………………………….

66

6 PRILOGE: Raztopina mikroelementov, McCrady-jeva preglednica, Preglednica BAM-MPN z makroji ……………………………………………………………………..

69

7 LITERATURA……………………………………………………………………… 73


1

1 UVOD 1.1 PREGLED POJMOV 1.1.1 Ekologija – osnovna terminologija oikos – hiša, prostor za življenje logos – študij Ekologija odgovarja na vprašanje kako deluje narava. Ekologija je veda, ki preučuje interakcije med organizmi in okoljem v katerme živijo. Interakcije opišemo s silami. 1.1.2 Nepisana pravila v ekologiji: - ničesar ne moreš vreči stran brez posledice za okolje - vse je povezano z vsem - v naravi ni zastonj kosila - narava zna najbolje kako in kaj 1.1.3 Kaj različni ljudje pojmujejo pod ekologijo (nekateri zadetki na internetu): - microbial ecology - animal ecology - plant ecology - landscape ecology - conservation ecology - socio-ecology - deep ecology - ecofeminism - Cheesmans ecology safari in anctarctica - urban ecology - body ecology attunement - cultural ecology - behavioural ecology - 944 ecology porsche parts - restoration ecology - molecular ecology - chemical ecology - dental ecology


2

1.1.4 Komponente ekosistema: abiotske in biotske 1.1.4.1 Najvažnejši fizikalni abiotski faktorji: _____________________________ - temperatura - elektromagnetno valovanje - pritisk - struktura in tekstura okolja - difuzija - tokovi (vodni sistemi) 1.1.4.2 Najpomembnejši kemijski abiotski faktorji: ____________________________ - dostopnost vode - dostopnost hranil - redoks potencial - pH - prisotnost toksičnih spojin 1.1.4.3 Najpomembnejši biotski faktorji v ekosistemu: ____________________________ - kompeticija - predatorstvo - parazitizem - mutualizem - komenzalizem - amenzalizem - nevtralizem 1.1.4.4 Znotraj biotske komponente ločujemo: _______________________________ - primarne producente (autotrofi) - sekundarne producente (heterotrofi) - terciarne producente (heterotrofi) - kvartarne producente (heterotrofi) V izbranem ekosistemu najdemo: - avtohtone vrste - alohtone vrste


3

1.1.5 Kroženje energije in snovi Ločimo: - geološko kroženje (npr. hidrološki cikel, kroženje CO2) - biogeokemijska kroženja C, N, S, P in ostalih biogenih elementov Rezervoarji. Za razumevanje krožanje je zelo koristen koncepet velikost rezervoraja in pretok snovi in energije med različnimi rezervoarji. Rezervoar pri kroženju elementov lahko predstavljajo različne kemijske oblike elementa. Globalne rezervoarji za izbrano hranilo so običajno v stacionarnem stanju. Lokalno lahko v posameznih habitatih prihaja do neravnotežja (npr. kopičenje ali odstranjevanje snovi). Pomembna je velikost rezervoarja. Pri majhnih rezervoarjih se zelo hitro pozna vsaka motnja in s tem porušenje ravnotežja. 1.1.6 Biogeokemijski procesi pomembni pri kroženju snovi: 1.1.6.1 Mineralizacija Mineralizacija je proces, ki prevede organsko obliko katerega koli elementa v mineralno obliko. Večinsko poteka zaradi delovanja mikroorganizmov. 1.1.6.2 Imobilizacija Imobilizacija je eden od procesov, ki deluje v nasprotni smeri mineralizacije. Slednja je proces, pri katerem prihaja do vnosa anorganske oblike hranila v celico, čemur lahko sledi prevezava v organsko obliko. Procesa mineralizacije in imobilizacije največkrat ne moremo ločiti, saj potekata sočasno. Delež neto mineralizirane snovi je odvisen od količine snovi, ki jo mikrob imobilizira. V kolikor je v mineralizirani snovi ravno dovolj snovi za prehranske potrebe udeleženega mikroba ne pride do neto mineralizacije. 1.1.6.3 Oksidacije in redukcije Pri večini kemijskih reakcij, ki potekajo v okolju gre za transport elektronov. V procesih kroženja, kjer so udeleženi mikroorganizmi gre predvsem za redoks reakcije. V tem primeru kroženje elementa definiramo kot spremembo redoks stanja spojine iz reducirane v oksidirano in ponovno v reducirano obliko. Za samo delovanje organizma pa je dodatno pomembno vzdrževanje ustreznega redoks stanja v celici. Npr. razmerje NAD+ : NADH ~ 1000 : 1 vzdrževanje oksidacijske moči v celici, oziroma NADP+ : NADPH ~ 1 : 100 vzdrževanje redukcijske moči v celici 1.1.6.4 Biološka fiksacija spojin Biološka fiksacija spojin je proces, pri katerem mikroorganizmi vgradijo atmosferske pline v svojo biomaso.Poznanih je več načinov fiksacij: fiksacija kisika, dušika, CO2 in vodika. 1.1.6.5 Volatilizacija Volatilizacija ali uplinjanje je proces, ki je nasproten fiksaciji spojine. Zaradi metabolizma mikroorganizmov se tvori veliko različnih plinov npr. CO2, CH4, N2, N2O, H2S, NH3, H2, O2. V nekaterih primerih mikrobno producirani plini determinirajo lokalno atmosfero. Zaradi delovanja mikroorganizmov pride v atmosfero veliko toplogrednih plinov (N2O, CH4). Po drugi strani pa


4

zaradi delovanja mikroorganizmov v atmosfero pridejo tudi plini, ki zmanjšujejo učinek tople grede npr. DMS. 1.1.6.6 Formiranje depozitov Geološki depoziti nastajajo zaradi oksidacij, redukcij, abiotskih reakcij mikrobnih produktov ali akumulacije celičnih ostankov (npr. žveplovi depoziti, nafta, premog). 1.1.6.7 Produkcija organskih kelatov, biodostopnost Tvorba organskih kislin, nitratne kisline, žveplove kisline, ogljikove kisline iz sproščenega CO2, lahko dramatično poveča dostopnost nekaterih elementov (npr. fosforja), pretvorba netopnega feri železa v fero železo, ali Mn4

+ do Mn2+. Seveda pa lahko zaradi delovanja mikroorganizmov

pride do zmanjšane dostopnosti za določene elemente (npr. nastanek amonija dvigne pH, kar omogoča spontano precipitacijo železa in Mn). 1.1.6.8 Izotopna frakcionacija V naravi obstaja običajno več izotopov. Če mikroorganizem preferenčno uporablja en izotop potem bo izotopna sestava v biološkem materialu drugačna od izotopne sestave v naravnem materialu. To dejstvo lahko izkoriščamo za določanje izvora materiala (npr. organski vs. anorganski). 1.1.7 Prehranjevalni spleti Mikroroganizmi skupaj s makroorganizmi skrbijo za pretok snovi skozi ekosistem. Običajno pretok snovi skozi ekosistem ni linearen, ne poteka v obliki pregranjevalnih verig. Osnovo prehranjevalnega spleta v vsakem ekosistemu predstavljajo mikroorganizmi. Velik del primarno sintetizirane snovi gre skozi mikrobno prehranjevalno zanko (~ 50 %). 1.1.8 Mikrobna prehranjevalna zanka Mikrobna prehranjevalna zanka predstavlja skupek vseh mikrobnih procesov v nekem okolju. Organska snov, ki je asimilirana v mikrobni celici je lahko plen bakteriovorov in tako preide v višje trofične nivoje. V kolikor mikrobna celica propade je remineralizirana in tako energija ostaja v mikrobni prehranjevalni zanki. Remineralizacija je omejena z učinkovitostjo izrabe organskega materiala. Noben organski material ne more biti 100 % izkoriščen. Zaradi tega del energije kot toplota zapušča ekosistem in je potrebno mikrobno zanko stalno napajati z novim organskim materialom. Večina tega materiala pride iz primarnih producentov (partikulatni in raztopljeni material), del pa z razgradnjo sekundarnih producentov in njihovih ekskrementov. Neto efekt mikrobne zanke je poraba organskega materiala in recikliranje nutrientov. Zaradi recikliranja mikrobna zanka omogoča učinkovito izrabo energije v ekosistemu. Mikrobna zanka je preko protozojev sklopljena z višjimi trofičnimi nivoji. V kolikor se poveča remineralizacija mikrobnih celic (npr. virusi) lahko prihaja do razklopa mikrobne zanke z višjimi trofičnimi nivoji, kar se pozna pri delovanju celotnega ekosistema.


5

1.2 MERITVE V MIKROBNI EKOLOGIJI Metrologija je veda, ki se ukvarja s kvaliteto meritev. Meritve v mikrobni ekologiji, še zlasti tiste o ogroženosti antropogenega okolja, igrajo pomembno vlogo v hitro razvijajoči se družbi in so osnova za številne pomembne družbene odločitve. Na podlagi teh odločitev se sestavlja nacionalna in mednarodna zakonodaja, ki posledično vpliva na trgovino, pravo, medicino in okolje. Zaradi tega je potrebno zagotoviti takšno tehnologijo raziskovanja v mikrobni ekologiji, ki omogoča visko kvaliteto dobljenih rezultatov. Glavni problemi pri meritvah bioloških vzorcev so: ocena napake meritve, ponovljivost meritve in stabilnost vzorca. Ocena napake meritve je pri bioloških vzorcih vsaj tako pomembna kot izmerjena vrednost, saj je poznano, da so biološki vzorci zelo variabilni. Oceno napake meritev največkrat podajamo s: standardno deviacijo, standardno deviacijo sredine, intervalom zaupanja, χ2 statistiko (ujemanje meritve s teoretičnim modelom). �Obnovi znanje o oceni eksperimentalnih napak iz statistike. Opozorilo! Zelo priporočljivo je na vse opombe z znakom � odgovoriti. Neodgovarjanje se po izkušnjah pozna pri oceni za kolokvij. Drugi problem, ki se pojavlja pri meritvah bioloških sistemov je stabilnost vzorca. Za razliko od ocene za napako meritve, ki jo lahko izračunamo, moramo stabilnost vzorca dokazati (rezultata izmerjena v času to in in času tn se morata poljubno malo razlikovati). Zaradi tega je potrebno voditi dobro urejen dnevnik raziskav, kjer je vsaka sprememba na vzorcu zabeležena. Zahteva po stabilnem vzorcu nedvomno predstavlja glavni problem meritev v bioloških sistemih, saj se vzorec največkrat spreminja že v času meritev. Poleg tega pri meritvah v mikrobni ekologiji ni pomembno samo kako in kaj merimo ampak tudi kje in kdaj merimo (v naravi, laboratoriju, znotraj celice, v raztopini, v začetku replikacijskega cikla, na koncu replikacijskega cikla). Tretji problem pri meritvah v bioloških sistemih je ponovljivost meritev. Pogoji, ki se lahko spreminjajo in vplivajo na ponovljivost meritev so: metoda in princip meritve, izvajalec meritve, merilni instrument, referenčni standardi, lokacija, razvojni stadij biološkega materiala, staranje biološkega materiala, nebiološke spremembe na vzorcih. V mikrobni ekologiji se srečujemo s fizikalnimi, kemijskimi, biološkimi in mikrobiološkimi meritvami. Skupno vsem merilnim tehnikam je to, da prihaja pri meritvah do napak. Napake meritev lahko razdelimo v dve skupini: naključne in sistematične napake. V skupino naključnih napak sodijo napake, kjer so vrednosti bolj ali manj simetrično razporejene okrog povprečja. Pri sistematičnih napakah pa gre za sistematičen odmik od merilne vrednosti. Sistematične napake meritev so v glavnem posledica: - instrumentalnih in tehničnih faktorjev (merilne naprave, analitične metode, vzorčenje) - človeških faktorjev (izobrazba, praktične izkušnje, malomarnost, nepazljivost) - okoljskih faktorjev (temperatura, pritisk, vlažnost, kontaminacija) � Razmisli, kje uporabljamo statistiko (pri naključnih ali pri sistematičnih napakah meritev).


6

1.2.1 Napake zaradi merilnih naprav: Napake zaradi merilnih instrumentov lahko odpravimo tako, da izboljšamo analitično opremo ali pa uporabljamo alternativne bolj natančne analitične metode. Merilna oprema zahteva vzdrževanje in umerjanje. Umerjanje merilne naprave pomeni zagotavljanje optimalnih pogojev za merjenje. Pri umerjanju so upoštevani postopki za čimbolj optimalno nastavitev aparata. Npr. uporaba standarda za 1 kg pri umerjanju tehtnice. Pri standardizaciji merilne naprave uporabljamo ustrezne standarde za izbrano meritev (interni, zunanji standardi) in izberemo ustreznen matematičen opis umeritvene krivulje. � Ali znaš opisati postopek za interno standardizacijo? 1.2.2 Napake zaradi neprimerne rabe analitične metode: Izbira ustrezne analitične metode je ena izmed najpomembnejših odločitev v vsakem laboratoriju. Analitično metodo je potrebno ovrednotiti - validirati. Proces validacije vključuje več postopkov. Pri validaciji je potrebno pregledati ali je izbrana analitična metoda poleg detekcije čistih vzorcev ustrezna tudi za detekcijo naravnih vzorcev. Preveriti je potrebno: meje za občutljivost in območje v katerem lahko opravljamo meritve; selektivnost izbrane analitične metode in robustnost analitične metode. Eksperimentalno je potrebno dokazati, da se rezultati meritev časovno invariantni (nespremenljivi). Potrebno je dokazati kvantitativno odkrivljivost referenčnih standardov. Rezultate je potrebno primerjati z neodvisno validirano metodo ter jih primerjati z rezultati, ki so dobljeni neodvisno v drugem laboratoriju. 1.2.3 Napake pri vzorčenju: Informacija o številu in vrstni sestavi mikroorganizmov v mikrobni združbi je osnova za razumevanje strukturnih sprememb in posledično funkcioniranja ekosistema. Žal je z obstoječo tehnologijo raziskovanja naravni sistem v veliki večini primerov preveč kompleksen za in situ raziskave. Zaradi tega za proučevanje sestave mikrobne združbe in njene aktivnosti v naravnih okoljih največkrat uporabljamo čim bolj reprezentativne vzorce. Reprezentativni vzorec pomeni takšen vzorec, ki pokaže gostoto mikroorganizmov in njihovo različnost v vzorčenem okolju. Ker pa je razporeditev mikroorganizmov v naravnih okoljih največkrat nehomogena to zelo omeji interpretacijo dobljenih rezultatov (rezultati veljajo samo za izbrani vzorec). Vzorčenje predstavlja prvo imed štirih stopenj v raziskovalnem procesu: vzorčenje, obdelava vzorca, analiza vzorca, interpretacija rezultatov. � Razmisli, ali je naslednja trditev smiselna. Vzorčenje je običajno ena izmed bolj zanemarjenih faz v raziskovalnem procesu. Glede na čas, ki ga vložimo v obdelavo vzorca, analizo vzorca in interpretacijo dobljenih rezultatov je investicija v slabo izbran vzorec zelo draga! V splošnem ni dobrih pravil glede števila, frekvence in velikosti vzorcev. Zlasti pri obsežnejših in dolgotrajnih raziskavah se velikokrat zgodi, da vzorci niso vedno odvzeti na enak način (isto število, frekvenca in velikost). Zaradi tega je zelo pomembno da vodimo dober dnevnik vzorčenja v katerega vpisujemo podrobne podatke o pogojih, opremi in postopkih pri vzorčenju. Zelo


7

smiselno je, da pri tako zahtevnem opravilu kot je vzorčenje izdelamo jasne in dobro dokumentirane protokole, kar zmanjšuje možnost za improviziranje. Izbira vzorčnih mest in način vzorčenja je v prvi vrsti odvisna od hipoteze, ki jo poizkušamo dokazati. V tej fazi raziskovanja je primerno posvetovanje s statistikom glede načina in frekvence vzorčenja. Za izbrano vzorčno mesto, velikost vzorca in frekvenco vzorčenja je potrebno podati razloge, ki so statistične ali raziskovalne narave. Potrebno je določiti vpliv vzorčnega mesta na dobljene podatke (npr. vpliv nadmorske višine, salinitete, pH, virov kontaminacije). V nekaterih primerih je potrebno opraviti določene meritve na mestu vzorčenja (npr. meritve pH in temperature). Ker so mikroorganizmi dobro prilagojeni na posebnosti v okolju prihaja do številnih tehničnih težave pri vzorčenju in transportu v laboratorij. Npr. obligatni barofilni mikroorganizmi ne prenesejo atmosferskega pritiska. Če hočemo proučevati takšne mikroorganizme je potrebno med vzorčenjem, transportom, shranjevanjem in obdelavo vzorcev ohranjati visok pritisk. V kolikor tega ne izvajamo, so dobljeni rezultati neuporabni, ne glede na količino vloženega dela. Na podobne težave naletimo pri študiju striktnih anaerobov, psihrofilov, acidofilov in ekstremnih termofilov. � Razmisli kakšne tehnične postopke bi uporabil pri vzorčenju, študiju in shranjevanju omenjenih skupin mikroorganizmov. 1.2.4 Splošna pravila pri vzorčenju mikrobioloških vzorcev: - pred vzorčenjem je potrebno dobro organizirati način zbiranja, transportiranja, shranjevanja in

označevanja vzorcev - potrebno je redno umerjanje in validiranje merilnih naprav, ki jih uporabljamo na terenu (pH

meter, termometer, oksimeter) - vzorce hranimo v čistih in sterilnih posodah - med vzorčenjem in transportom preprečujemo mikrobiološke spremembe in kontaminacijo na

vzorcih (npr., uporaba azida ali formalina) � Razmisli, kako bi izmeril mikrobno aktivnost izbrane vrste mikroorganizmov v naravnih sistemih.


8

1.2.5 Primeri izračunavanja eksperimentalnih napak 1. V standardnem vzorcu z 20 ppm amonijskega dušika smo z avtoanalizatorjem izmerili naslednje vrednosti za amonijski ion (ppm): 19.4, 19.5, 19.6, 19.8, 20.1 in 20.3. Izračunaj srednjo vrednost za meritev, mediano, standardno deviacijo, varianco, razpršenost meritve, povprečni odklon od sredine, relativno standardno deviacijo, koeficient variacije, absolutno napako in relativno napako meritve. Preglednica 1: Vrednosti za amonij, odmik eksperimentalnih vrednosti od srednje vrednosti in kvadrati odmika od sredine. NH4

+ (ppm) odmik od sredine │xi - x │

kvadrat razlike (xi - x )2

19.4 0.38 0.1444 19.5 0.28 0.0784 19.6 0.18 0.0324 19.8 0.02 0.0004 20.1 0.32 0.1024 20.3 0.52 0.2704 ∑xi = 118.7 ∑│xi - x │= 1.70 ∑(xi - x )2 = 0.6284

Sredina = x = 118.7/6 = 19.78 ≈ 19.8 ppm NH4

+

Mediana = 2

8.196.19 +

= 19.7 ppm NH4+

Standardna deviacija = s = 1

)( 2

−∑ −

N

xxi

= 16

6284.0

− = 0.354 ≈ 0.35 ppm NH4+

Varianca = s2 = 1

)( 2

−∑ −

N

xxi

= 16

6284.0

− = 0.1257 ≈ 0.13 ppm NH4+

Razpršenost meritev = w = 20.3 – 19.4 = 0.9 ppm NH4

+

Povprečen odklon od sredine = N

xxi∑ −

= 6

70.1

= 0.283 ≈ 0.28 ppm NH4+

Relativna standardna deviacija = x

s

x 1000 = 78.19

354.0

x 1000 = 17.9 ≈ 18 ppm NH4+

Koeficient variacije = CV = x

s

x 100 % = 78.19

354.0

x 100 % = 1.8 %


9

Absolutna napaka = 19.78 – 20.00 = -0.22 ≈ 0.2 ppm NH4+

Relativna napaka = 00.20

00.2078.19 −

x 100 % = -1.1 % 2. Primerjali smo podatke o koncentraciji amonijskega dušika (µg/g zračno suhih tal) za dve časovni točki v inkubaciji. Ali naslednji podatki potrjujejo domnevo, da je koncentracija amonijskega dušika v omenjenem časovnem intervalu različna? koncentracija amonija v času t1: 4.0, 4.6 koncentracija amonija v času t2: 4.5, 5.3, 5.5, 5.0, 4.9

2

0.46.41

+=x

x 108 = 4.3

5

9.40.55.53.55.42

++++=x

x 108 = 5.0

21 xx − = -0.7

221

22122

−+

−+−= ∑ ∑

NN

xxxxs

iji )()(

21

2121

NN

NNstxx

+⋅±=−

kjer je t statistična vrednost parametra za izbrani nivo zaupanja, s je standardna deviacija in N1,2 je število meritev v času t1 in t2. Preglednica 2: Vrednosti statističnega parametra t pri različnih stopnjah zaupanja. stopnje prostosti

90 % nivo zaupanja

95 %

99 % 1 6.31 12.7 63.7 2 2.92 4.3 9.92 3 2.35 3.18 5.84 4 2.13 2.78 4.60 5 2.02 2.57 4.03 6 1.94 2.45 3.71 7 1.90 2.36 3.50 8 1.86 2.31 3.36 9 1.83 2.26 3.25 10 1.81 2.23 3.17 ∞ 1.64 1.96 2.58


10

Pri 90 % zaupanju velja x2 - x1 = ±2.02 x 0.39 x 52

52

x

+

= ±0.66

pri 95 % zaupanju velja x2 - x1 = ± 2.57 x 0.39 x 52

52

x

+

= ± 0.84

pri 99 % zaupanju velja x2 - x1 = ± 4.03 x 0.39 x 52

52

x

+

= ± 1.32 Glede na to, da je eksperimentalna razlika sredine med vzorčenjem v času t1 in času t2 enaka 0.7, lahko s 90 % verjetnostjo trdimo da je število v času t2 različno od števila v času t1, medtem ko tega ne moremo trditi s 95 in 99 % verjetnostjo. Ker je tudi pri 90 % intervalu zaupanja razlika med 0.7 in 0.66 zelo majhna je zelo verjetno, da se povprečji za vzorčenji v času t1 in t2

statistično ne razlikujeta. Alternativno lahko izračunamo vrednost za t statistiko iz zgornjih formul in jo primerjamo s t vrednostjo iz tabele. V kolikor je t izračunani manjši od tabelaričnega med vzorcema ni statističnih razlik. Če je izračunani t večji od vrednosti t v tabeli pa obstajajo statistično signifikantne razlike med srednjima vrednostima vzorca. Ko podajamo analitske podatke je potrebno poudariti, da je numerični rezultat zelo malo vreden, če ne podamo tudi podatka o napaki meritve oziroma o točnosti dobljenega podatka. Obstajajo trije načini kako podajamo podatke: 1. podamo srednjo vrednost ± mejo zaupnja (npr. pri 95 ali 99 % intervalu zaupanja) 2. podamo srednjo vrednost ± standardno deviacijo 3. podamo srednjo vrednost ± koeficient variacije 4. podamo srednjo vrednost z ustreznim številom signifikantnih števil Najbolj zaželjeni sta prvi dve metodi prikazovanja podatkov. V kolikor prikazujemo podatke za standardno deviacijo ali s koeficientom variacije je potrebno podati tudi število podatkov na osnovi katerih je bila standardna deviacija dobljena.


11

1.3 PLINSKA KROMATOGRAFIJA Plinska kromatografija je ena izmed najbolj pomembnih tehnik v mikrobni ekologiji in jo bomo na vajah večkrat uporabljali. Kromatografija je analitska tehnika, kjer se komponente iz vzorca ločujejo na osnovi prerazporejanja vzorca med dve fazi, ki se ne mešata. Ena od faz je stacionarna (tekoča ali trdna), medtem ko je druga mobilna (plinasta ali tekoča). Plinska kromatografija je v mikrobni ekologiji zelo uporabna tehnika, saj omogoča ločevanje, identifikacijo in kvantifikacijo snovi, ki so hlapne ali jih lahko uplinimo pri temperaturah do 450 oC. Ločevanje komponent iz vzorca temelji na razlikah v njihovi hitrosti adsorbcije oziroma porazdelitvi komponent med mobilno in stacionarno fazo. Hitrost potovanja po koloni je odvisna od časa, ki ga molekula prebije v mobilni fazi. � Na osnovi fizikalnega stanja mobilne in stacionarne faze v kromatografskih kolonah je možnih devet različnih kombinacij. Katere od teh kombinacij lahko z današnjo tehnologijo uporabimo v kromatografiji? 1.3.1 Aparatura Na voljo so številni različni plinski kromatografi, vsi pa so grajeni iz naslednjih ključnih komponent: injektor, kolona, peč za vzdrževanje in programiranje temperature kolone, detektor, oprema za procesiranje signala (rekorder, integrator, PC) ter nosilni plin. Aparaturi lahko dodamo zbiralno posodo za plin, ki je vgrajena v kopel iz suhega ledu in acetona. Plin se v tej kopeli kondenzira, kar omogoča analizo s pomočjo infra rdeče spektroskopije, ali pa masne spektrometrije. 1.3.2 Nosilni plin Uporabljamo tiste pline, ki se ne vežejo na stacionarno fazo. Pogosto rabimo: He, H2, N2, Ar in tudi mešanice (Ar-CH4). Izbira plina je odvisna od vrste vzorca in detektorja. Pretok plina je običajno v mejah od 10 do 400 ml/min, odvisen pa je od uporabljene kolone, vrste vzorca, željene ločljivosti. 1.3.3 Kolone Ločimo polnjene in kapilarne kolone. Polnjene kolone so običajno spiralno zvite cevi iz bakra, jekla ali stekla napolnjene s stacionarno fazo ali inertnim nosilcem, ki je prevlečen s tekočo stacionarno fazo. Najpogosteje so v rabi polnjene kolone dožine od 0,5 m do 5 m, premera 1/8 inče. Za preparativne namene uporabimo kolone z večjim premerom. Kapilarne kolone ne vsebujejo polnila, stacionarna faza je nanešena na notranjo steno kapilare. Premer kapilare je 0,2 do 0,4 mm, dolžina pa od 10 do 100 m. Prednost teh kolon je izredno velika ločljivost in kratek čas analize. Pomankljivost kapilarnih kolon pa je analiza majhnih količin vzorca. Tržišče ponuja širok izbor nosilcev, stacionarnih in tekočih faz kot tudi že pripravljenih polnjenih in kapilarnih kolon. Pogosto rabljeni trdni nosilci so: kromosorbi (diatomejska zemlja), porapaki (polimeri stirena z divinilbenzenom) in molekularna sita (sintetični polimeri). Izbiramo lahko med različnimi velikostmi delcev (npr. od 60 do 120 mesh (št. lukenj / inčo2 (1 cm = 0,3937 inče))). Pogosto uporabljene tekoče faze so: etilenglikol in derivati skvalena ter silikonov. Kolone lahko napolnimo tudi sami. Pri tem postopku izrabljeni material odstranimo. Kolono operemo z etilnim alkoholom in po potrebi kolono silaniziramo. Kolono napolnimo z novim materialom,


12

tako da material nanašamo v kolono ob rahlem tresenju kolone. Na ta način omogočimo enakomerno pakiranje stacionarne faze. Učinkovitost kromatografske kolone je določena s številom teoretskih podov

222 1

116

+

−

=k

kRN

αα

kjer je N število teoretskih podov kolone, R je ločljivost, α je selektivnostni faktor, k je faktor zmogljivosti kolone. Večje število teoretskih podov pomeni bolj učinkovito delovanje kolone. V kromatografiji se vedno odločamo med čim krajšim časom elucije in čim večjo ločljivostjo. Elucijski čas tR pri katerem dobimo željeno ločljivost R je podan s

+

−

=2

322 )1(

1

16

k

k

u

HRtR

αα

kjer je H višina teoretskega poda, u pa je linearna hitrost mobilne faze. Iz formule je razvidno, da povečevanje pretoka nosilnega plina skozi kolono pri ostalih nespremenjenih pogojih skrajšuje retencijski čas. Preglednica 3: Pomembnejše formule pri kromatografiji. tM je čas potovanja nezadržanih spojin, (tR)A in (tR)B sta retencijska časa spojine A in B, WA in WB je širina vrha spojine A in spojine B, L je dolžina kolone, F je hitrost pretoka nosilne faze, VS je volumen stacionarne faze, CM in CS sta koncentraciji spojine v mobilni in stacionarni fazi, R je ločljivost vrhov, N je število teoretskih podov, H je višina teoretskega poda. definicija alternativni zapis linearna hitrost mobilne faze

Mt

Lu=

volumen mobilne faze VM = tMF zmogljivostni faktor kolone

M

MR

t

ttk

−=

M

S

V

KVk =

porazdelitveni koeficient

S

M

V

kVK =

M

S

C

CK =

selektivnostni faktor kolone

MAR

MBR

tt

tt

−−

=)(

)(α

A

B

A

B

K

K

k

k==α

ločljivost

BA

ARBR

WW

ttR

+−

=)()(2

+

−=

k

kNR

1

1

4 αα

število teoretskih podov 2

=W

tN

R

222 1

116

+

−

=k

kRN

αα

Višina teoretskega poda H = L/N retencijski čas

2

322 )1(

1

16

k

k

u

HRtR

+

−

=αα


13

1.3.4 Detektorji Detektor zazna spremembe v sestavi iztekajočega plina, ne identificira pa komponent. V uporabi so: plamensko ionizacijski detektor (FID), detektor za termalno prevodnost (TCD) in “electron capture” detektor (ECD). Pri FID detektorju vzorec vodimo iz kolone v plamen, ki ga vzdržujemo s kontroliranim izgorevanjem vodika v zraku. V tem plamenu snovi iz vzorca zgorijo, pri čemer nastajajo ionske oblike spojine, ki se zbirajo na kolektorski elektrodi. Signal, ki ga daje tok ionov ojačamo in vodimo do rekorderja. FID se odziva na praktično vse organske snovi. Meja detekcije ogljikovodikov je v območju ng. TCD detektor meri toplotno prevodnost plinov. Iz kolone teče vzorec preko električnih elementov - uporov v obliki filamentov ali termistorjev, ki so termostatirani in napajani s šibkim tokom. Komponente iz vzorca povzročijo spremembo toplotne prevodnosti nosilnega plina, kar spremeni temperaturo filamentov in s tem spremembo njihove upornosti. Ker je absolutno merjenje toplotne prevodnosti težavno, je problem merjenja rešen z diferencialno metodo. Pari filamentov so povezani v Wheatstonov most. En krak mostu je stalno v stiku z nosilnim plinom - referenčni kanal, drugi krak mostu pa je v stiku znosilnim plinom in komponentami vzorca. Sprememba sestave plina, ki izstopa iz kolone (prisotnost komponent iz vzorca) poruši uporovno ravnotežje Wheatstonovega mostu, kar zaznamo kot spremembo napetosti. Načeloma je TCD uporaben za analizo vseh snovi, ki imajo toplotno prevodnost različno od nosilnega plina. TCD detektor je manj občutljiv kot FID. Uporablja se za analizo H2, N2, CO2, O2, N2O in H2S. ECD detektor zaznava spremembe stalnega toka elektronov med elektrodama, ki ga vzdržuje vir β-sevanja (npr. 63Ni), ki je nameščen v ionizacijski komori. β + N2 →N2

+ + e- Komponente iz vzorca vežejo elektrone in tvorijo stabilne ione in nekateri ioni lahko dalje reagirajo z nabitim nosilnim plinom. Komponenta (X) + e- → X- X- + N2

+ →nenabiti produkti Te reakcije povzročijo spremembo stalnega toka elektronov, kar detektiramo kot spremembo signala. Danes so dosegljivi tudi nekateri ECD detektorji, ki ne vsebujejo radionuklidov. Mnoge za mikrobiologa pomembne substance ne vežejo elektronov in jih tako ni mogoče zaznati z ECD (ogljikovodiki, alkoholi, aldehidi), visoko afiniteto do elektronov pa imajo organske snovi, ki vsebujejo halogene elemente ali kisik.


14

1.3.5 Meritev CO2 in N2O

Meritev količine proizvedenega CO2 na vzorcih iz vaje 1 bomo opravili na plinskem kromatografu Hewlett Packard 5890A. Aparat pripravimo za delo, kot je opisano v kratkih navodilih za uporabo kromatografa, ki jih najdeš ob kromatografu. Ko je plinski kromatograf stabiliziran ga umerimo s pomočjo zunanjega standarda z znano koncentracijo CO2. Plin vzorči kot je opisano v navodilih, ki so priložena kromatografu.

Nastavitev kromatografa:

- Porapak QS kolona 180 cm,

- temperatura kolone 50 °C,

- temperatura injektorja in detektorja 100 °C,

- nosilni plin He,

- pretok nosilnega plina 20ml/min,

- TCD detektor

- integrator Hewlett Packard 3392A

Iz meritev CO2 v plinski fazi izračunamo celotno količino nastalega CO2 v posodi z upoštevanjem raztopljenega CO2 v tekoči fazi:

M = Cg · (Vg + Vl · α) M - celotna količina CO2 v posodi (ml) Cg - izmerjena koncentracija CO2 v plinski fazi (npr: 2 % kot 2/100 ali 5 ppm kot 5/1000000) Vg - volumen plinske faze (ml) V

l - volumen tekoče faze (ml)

α - Bunsenov koeficient topnosti plinov v vodi predstavlja volumen (mL) plina pri 0 °C in 760 mm Hg, ki ga adsorbira 1 mL vode.

Vaja 1: Topnost plinov v vodi Grafično prikaži temperaturno odvisnost topnosti plinov in razmisli, kakšen vpliv ima to na mikrobne procese in procese, ki potekajo znotraj višjih organizmov. Preglednica 4: Bunsenovi koeficienti (α) za pline

°C H2 NO N

2O N

2 O

2 CH

4 CO

2 C

2H

4

0 0,0219 - - 0,0238 0,0491 0,0573 1,727 -

5 0,0206 0,0646 1,06 0,0211 0,043 0,0495 1,423 -

10 0,0196 0,0575 0,882 0,0189 0,0382 0,0433 1,194 0,152

15 0,0188 0,0517 0,743 0,0172 0,0343 0,0384 1,015 0,134

20 0,0181 0,047 0,632 0,0157 0,0311 0,0342 0,873 0,118

25 0,0175 0,0431 0,544 0,0146 0,0285 0,031 0,758 0,106

30 0,017 0,0399 0,472 0,0136 0,0263 0,0285 0,666 0,0964

35 0,0167 0,0372 0,414 0,0128 0,0245 0,0262 0,59 0,0877


15

2 OGLJIK 2.1 KOMPLETNOST OKOLJA IN RAZGRADNJA ORGANSKEGA MATERIALA VAJA 1: Eksperimentalni model za proučevanje razgradnje celuloze Heterotrofni mikrobi z razgradnjo organskih monomerov in polimerov pridobivajo potrebno energijo za rast in izgradnjo osnovnih celičnih gradbenih elementov, ostala hranila pa lahko vstopajo v biosintetske poti v obliki vodotopnih anorganskih snovi. Od vrste energetskega metabolizma (fermentacija, dihanje) je odvisno prerazporejanje ogljika iz razgrajevane snovi v novo sintetizirano biomaso in ostale končne produkte. Preglednica 5: Delež ogljika iz organskega materiala, ki je prerazporejen v novonastalo mikrobno biomaso (MB-C), CO2 (CO2-C) in ogljik vgrajen v topne organske produkte, ki zapuščajo mikrobno celico, pri različnih vrstah energetskega metabolizma. Prerazporejanje ogljika (%) Energetska pot Končni prevzemnik

elektronov MB-C CO2-C topni organski

produkti Dihanje s kisikom O2 50 50 / Nitratno dihanje NO3

- 38 62 / Sulfatno dihanje SO4

2- 10 90 / Metanogeneza CO2 10 90 / Fermentacija / 1 - 3 10 -15 80 – 85 Suha masa živih celic je sestavljena iz elementov v naslednjih povprečnih vrednostih: vodik (60.1 %), kisik (25.1 %), ogljik (10.0 %), dušik (2.3 %), kalcij (2.2 %), fosfor (0.1 %), žveplo (0.1 %), klor (0.03 %), kalij (0.04 %), natrij (0.07 %), magnezij (0.01 %), silicij (0.0009 %), železo (18 µM), baker (16 µM), cink (15 µM), selen (1.6 µM), jod (40 nM), nikelj (20 nM), molibden (7 nM), krom (4 nM), mangan (1 nM) in kobalt (0.1 nM). Povprečne statistične vrednosti glavnih hranil v bakterijski celici so v razmerju:

C : N : P : S = 100 : 20 : 1,2 : 1 Razgradnja mikrobom dostopne organske snovi, ki je vezana na rast celic je možna samo v primeru, ko so vsi potrebni elementi v prisotni v okolju v biološko dostopnih oblikah. Znižana koncentracija nujno potrebnega elementa omejuje rast in razgradnjo organskega substrata (omejujoč dejavnik). Odsotnost elementa onemogoči rast in razgradnjo organskega substrata. � Razmisli, kako je rast mikroorganizma korelirana z omejujočim dejavnikom in kako z neomejujočim dejavnikom okolja.


16

Vlogo različnih dejavnikov okolja pri razgradnji organske snovi bomo testirali v poenostavljenih laboratorijskih modelnih sistemih. Modelna snov bo celulozni material v obliki filter papirja. Ta material je naravnega izvora, vendar dodatno čiščen, tako da razen ogljika ne vsebuje drugih biogenih elementov. Testni material bomo inkubirali v prisotnosti in odsotnosti hranil ter v prisotnosti oz. odsotnosti kompleksne mikrobne združbe. Vzorci bodo inkubirani več tednov aerobno, pri 28 oC, v temi. Meritve produkcije CO2 med inkubacijo in izguba teže bodo pokazatelji razgradnje testnega materiala. Izvedba in variante Znano količino zračno suhega filter papirja (10 cm x 10 cm, ~1 g suhe snovi) inkubiramo v 500 ml serumskih steklenicah, tako da je papir delno potopljen v vodi oz. različno popolni raztopini nutrientov. Vsako varianto izvedemo v treh ponovitvah. Variante: A: celuloza + 50 ml deionizirane vode + 1 ml inokuluma B: celuloza + 45 ml vode + 5 ml raztopine soli (Winogradsky) + 1 ml inokuluma C: celuloza + 40 ml vode + 5 ml raztopine soli + 5 ml raztopine (NH4)2SO4 + 1 ml inokuluma D: celuloza + 35 ml vode + 5 ml raztopine soli + 5 ml raztopine (NH4)2SO4

+ 5 ml raztopine glukoze + 1 ml inokuluma E: enako gojišče kot D vendar brez dodane celuloze F: enako gojišče kot C, vendar z 1 ml celulolitične kulture (Cellulomonas uda DSM 20108)

G: enako gojišče kot C, ki ga avtoklaviramo H : enako gojišče kot C, zamenjana atmosfera z N2 I: celuloza + sveža zemlja + inkubacija v laboratorijskih razmerah J: celuloza + inkubacija in-situ - zakoplješ jo v zemljo približno 5-10 cm pod površje

(pripravi natančen načrt mesta zakopa celuloze, da jo boš po inkubaciji našel). Inokulum: suspenzija tal (10g tal v 90 ml 0,9 % raztopine NaCl, stresaj 1 uro, za inokulum uporabi supernatant). raztopina (NH4)2SO4 : 9,43 mg (NH4)2SO4/ml raztopina glukoze: 10 mg glukoze/ml Osnovna raztopina soli po Winogradskem K2HPO4 5,0 g MgSO4·7H2O 5,0 g NaCl 2,5 g Fe2 SO4· 7H2 O 50,0 mg MnSO4· 4H2O 50,0 mg deionizirana voda 1000,0 ml


17

Serumske steklenice zapri z gumijastimi zamaški in inkubiraj v temi pri 28 oC. Da zagotoviš aerobne razmere med inkubacijo tedensko izmenjaj plinsko fazo, po predhodni meritvi CO2 s plinsko kromatografijo. Odčitavanje rezultatov: Po nekaj tedenski inkubaciji ugotovi skupno količino nastalega CO2 v posamezni varianti. Po končanem eksperimentu stehtaj zračno posušen ostanek celuloznega materiala in odštej maso dodanih soli v posameznih variantah. Iz dobljenih količin izračunaj razliko med začetno maso dodane celuloze in maso ostanka celuloznega materiala. Na osnovi izmerjene količine proizvedenega CO2 in spremembe teže celuloznega materiala izračunaj delež mineraliziranega in delež presnovljenega celuloznega materiala (organsko vezanega ogljika). V prvem približku privzamemo, da je testni material čisti polimer glukoze (C6H10O5)n . Izračun ponovite z upoštevanjem teoretsko prerazporejanje ogljika pri mikrobni razgradnji organskega materiala pri dihanju s kisikom. Primerjajte dobljene rezultate iz meritev in teoretskega razporejanja. Preglednica 6: Razlika v teži zračno suhega filter papirja (z.s.s.) med težo na začetku in koncu inkubacije ter količina sproščenega CO2 pri različnih variantah razgradnje filter papirja. Začetna Končna % CO2 v plinski fazi Vzorec teža snovi teža snovi (dnevi inkubacije) mg z.s.s. mg z.s.s.

A B C D E F G H


18

Slika 1: Primer - Grafični prikaz nastajanja ogljikovega dioksida v eksperimentalnih variantah Izračun:


19

2.2 IZKORISTEK PORABE ORGANSKEGA SUBSTRATA V ODVISNOSTI OD FAKTORJEV OKOLJA VAJA 2: Eksperimentalni model porabe škroba in glukoze v okolju Organski substrat je za heterotrofne mikrobe vir energije in vir ogljika kot gradbenega elementa celice. Od tipa energetskega metabolizma je odvisno prerazporejanje substratnega C v metabolne produkte in v novosintetizirano biomaso udeleženega mikroba (glej tabelo pri vaji Kompletnost okolja). V eksperimentalnem rastnem modelu s kompleksno mikrobno združbo bomo ugotavljali prirast mikrobne biomase pri razgradnji škroba v odvisnosti od dostopnosti za kisik. � Obnovi biokemijsko znanje o aerobnem in anaerobnem metabolizmu biopolimerov. Gojišče z vsemi potrebnimi hranili za rast heterotrofov in organskim substratom v obliki škroba ali glukoze bomo inokulirali s kompleksno združbo talnih mikrobov. Inkubacija v prisotnosti ali odsotnosti kisika bo trajala do popolne porabe substrata. Po končani inkubaciji bomo kvantificirali mikrobno biomaso in izračunali izkoristek porabe organskega substrata. � Katere predpostavke bomo upoštevali pri interpretaciji rezultatov? Eksperimentalne variante: A. aerobna razgradnja škroba V 250 ml erlenmajerico odmerimo 38 ml vode + 5 ml raztopine soli po Winogradskem + 1 ml raztopine (NH4)2SO4 (47,2 mg/ml) + 5 ml raztopine škroba (50,0 mg/ml) + 50 µl raztopine mikroelementov + 1 ml suspenzije travniških tal. Posodo pokrijemo z Al-folijo (da omogočimo izmenjavo plinov). Inkubiramo aerobno na stresalniku (100 rpm), v temi, pri 28 oC, do porabe škroba. B. anaerobna razgradnja škroba V 160 ml penicilinko odmerimo 38 ml vode + 5 ml raztopine soli po Winogradskem + 1 ml raztopine (NH4)2SO4 (47,2 mg/ml) + 5 ml raztopine škroba (50,0 mg/ml) + 50 µl raztopine mikroelementov + 1 ml suspenzije travniških tal. Posodo plinotesno zamašimo z gumijastim zamaškom. Atmosfero zraka v penicilinki izmenjamo z atmosfero N2 s trikratnim vakumiranjem in polnjenjem z N2. Inkubiramo anaerobno na stresalniku (100 rpm), v temi, pri 28 oC do porabe substrata. C. aerobna poraba glukoze Enako kot varianta A. Namesto 5 ml raztopine škroba dodamo 5 ml raztopine glukoze (50 mg/ml). D - anaerobna poraba glukoze Enako kot varianta B. Namesto 5 ml raztopine škroba dodamo 5 ml raztopine glukoze (50 mg/ml).


20

Odčitavanje rezultatov: 1. Kvalitativno določanje škroba v gojišču z jodovico V vzorcih (0,5 ml), ki jih odvzemamo v nekajdnevnih intervalih pri variantah A in B ugotavljamo prisotnost škroba z barvno reakcijo z jodovico. Pojav modre obarvanosti vzorca po dodatku nekaj kapljic jodovice pomeni prisotnost škroba. 2. Kvalitativno določanje glukoze v gojišču (Molishev test) V nekaj dnevnih intervalih odvzemi približno 1 ml vzorca iz variant C in D in dodaj 3 kapljice 5 % 1-naftola v etanolu. Premešaj in previdno ob steni epruvete podplasti z 1 ml koncentrirane H2SO4. Pozitivna reakcija je pojav vijolične barve na stiku obeh raztopin. 3. Določanje mikrobne biomase Ko je porabljen ves organski substrat določimo količino novo sintetizirane mikrobne biomase v vsaki varianti z merjenjem celičnega proteina z biuretno reakcijo. Postopek za biuretno reakcijo: - kulturo homogeniziraj z ultraturaksom - celice iz 30 ml kulture požanji s centrifugo: 15 000 RPM , 10 min - celice v usedku operi s 5 ml 0,9 % NaCl in ponovno centrifugiraj - usedek resuspendiraj v 3 ml 0,9 % NaCl - 1 mL (aerobna inkubacija) oziroma 2 mL (anaerobna inkubacija) suspenzije odpipetiraj v 10ml

stekleno centrifugirko; vzporedno delaj slepo probo, ki vsebuje 2 ml H2O - dodaj 1 ml 3N NaOH - segrevaj 5 min v vodni kopeli pri 100 oC - ohladi - dodaj 1 ml 2,5 % CuSO4 - inkubiraj 5 min pri sobni T - centrifugiraj 10 min pri 3000 RPM - izmeri absorbanco supernatanta pri A555 proti slepi probi - na osnovi umeritvene krivulje za serumski albumin določi količino proteina v vzorcu Iz podatkov o novonastali biomasi in porabljeni količini substrata izračunaj energetski izplen - donos biomase med rastjo mikrobne združbe v prisotnosti in v odsotnosti kisika.


21

Preglednica 7: Izračun prirasta biomasnega proteina (BMP), biomase (BM) in ogljika v biomasi BM-C iz porabljenega substrata. BMP/ml BMP/mg BM/mg BM/mmol BM/mg-C BM-C / mg-C Škrob aerobno

Škrob anaerobno

Glukoza aerobno

Glukoza anaerobno

Pomembni odnosi:

C ≈ 50 % suhe BM proteini ≈ 50 % suhe BM

Izračun: V sistemu 50 mL gojišča Odvzamemo 30 mL gojišča Skoncentriramo na 5 mL=suspenzija 1 (S1) Operemo na 3 mL= suspenzija 2 (S2) Odvzamemo po 1 mL za oksično Odvzamemo po 2 mL za anoksično Določimo koncentracijo proteinov [mg-P/mL S2] mg P/ mL gojišča = (mg P/ mLS2) * (mL S2/ mL odvzetega gojišča)


22

2.3 VELIKOST ZDRUŽBE IN DELEŽ AMILOLITIČNIH MIKROBOV V VZORCIH TAL IN VODE Škrob je polisaharid, ki se akumulira v različnih delih rastlin kot rezervna energetska snov. Grajen je iz amiloze, kjer so glukozne enote povezane v linearno verigo z α-(1-4) vezmi in amilopektina, kjer so poleg glukoznih enot v linearnih verigah α-(1-4) prisotne tudi razvejitve verig z vezjo α-(1-6). Amiloza je v vodi topna, medtem ko je amilopektin v vodi netopen. � Razmisli, kakšna je sekundarna struktura amiloze in amilopektina in kakšne posledice ima to za razgradnjo škroba. V naravnih okoljih je razgradnja škroba predvsem biotične narave. Prva stopnja razgradnje je depolimerizacija, kjer se z aktivnostjo več različnih ekso in endo glukozidaz sproščajo glukozni ostanki. Ta stopnja razgradnje še ne omogoča rasti udeleženih mikrobov. Šele z oksidacijo monomerov v energetskem metabolizmu celice se v organski snovi nakopičena energija preveže v oblike, ki omogočajo energetsko napajanje rastnega procesa. � Obnovi zanje o katabolnem in anabolnem metabolizmu celice. Ali znaš iz intermediatov pri razgradnji škroba sestaviti glavne celične komponente? VAJA 3: Velikost združbe amilolitičnih mikrooorganizmov v vzorcih vode in tal Pri konstantnih faktorjih okolja je razgradnja snovi proporcionalna velikosti udeležene mikrobne populacije. Tako je velikost populacije amilolitičnih mikrobov v vzorcu mera za amilolitični potencial vzorca. Velikost amilolitične populacije mikrobov v vzorcu lahko izmerimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN). Predpostavke pri oceni velikosti združbe z MPN metodo: - eksperimentalni sistem pripravimo tako, da za različne amilolitične mikroorganizme limitni

faktor predstavlja dostopna energija. - mikroorganizmi, ki poleg amiloze za rast potrebujejo še kateri drugi vir energije ne prispevajo

bistveno k amilolitični sposobnosti izbranega okolja - maksimalna hitrost rasti amilolitičnih mikroorganizmov (µmax) ne vpliva na oceno za velikost

združbe - ocena za velikost združbe ni odvisna od saturacijske konstane (Ks) amilolitičnih

mikroorganizmov � Ali te predpostavke vedno držijo? Razloži. Tekoče selektivno gojišče z amilozo kot edinim virom energije in ogljika nacepimo z razredčitvami vzorca v osmih ponovitvah. Po inkubaciji ugotavljamo porabo škroba z jodovim reagentom (lugol).


23

Gojišče za amilolite: razt. soli (Winogradsky) 50ml talni ekstrakt 10ml Amiloza 1,5g NH4NO3 1,0g razt. mikroelementov 1ml deionizirana voda 1000ml

Gojišče pripravimo v 250 mL erlenmajericah in avtoklaviramo 15 min pri 121 oC. Na mikrotitrske plošče sterilno prenesemo po 180 µL ohlajenega gojišča in shranimo na 4 oC do uporabe. Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- travniška tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- rečna voda 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- ustekleničena voda 100 do konca mikrotitrske plošče

- rečni sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- morski sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče

Nacepljanje: V sterilno stekleno petrijevko prelij del vzorca in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 20 µL (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi vzorec in ga prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče s tekočim selektivnim gojiščem z amilozo. Odvrzi nastavke, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi nastavke. � Kakšna je ta redčitvena vrsta? V čem se razlikuje od klasične priprave (serija sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke raztopine), kjer po 1 ml vzorca oz. razredčitve nacepiš v tekoče selektivno gojišče za amilolitične mikrobe)? Inkubacija: aerobna, v temi, vlažna komora, pri 28 oC, več tednov. Odčitavanje: V vsako jamico mikrotitrske plošče dodaj kapljico jodovice (lugol). Modra obarvanost pomeni prisotnost škroba (negativni primeri). Negativni test z jodovico pokaže pozitivne primere, to je nacepljena gojišča, v katerih je ves škrob porabljen (ni modre obarvanosti). Iz razporeda + in - znakov ugotovimo karakteristično število mikroorganizmov in s pomočjo tabel najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu tal. Alternativno lahko na svetovnem spletu poiščeš kalkulator MPN (dodatna informacija: uporablja ga tudi,,Food and Drugs Administration’’, ZDA). � Kaj nam pove podatek o velikost amilolitične populacije iz naravnega vzorca o delovanju naravnega sistema?


24

Preglednica 8: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z mikrotirske plošče.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

VAJA 4: Delež amilolitičnih mikrobov v mikrobni združbi Agarizirano diferencialno gojišče s peptonsko osnovo ter dodatkom škroba (8 g Nutrient broth, 10 g škroba, 15 g agarja / 1000 mL) omogoča rast širokega spektra heterotrofnih mikrobov. Test z jodovico pokaže kolonije amilolitičnih mikrobov. Nacepljanje: Pripravi serijo sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke raztopine) za nacepljanje z razmazom inokuluma po agariziranem diferencialnem gojišču. Nacepi po 0.1 ml razredčitev 10-3 do 10-6 pri talnih in sedimentnih vzorcih, razredčitev 10-1 do 10-4 pri vzorcu rečne vode in 100 do 10-3 pri vzorcu ustekleničene vode. Nacepljene plošče inkubiramo 7 dni v temi pri 28 oC. Odčitavanje: Plošče prelijemo z jodovico (lugolom). Okrog kolonij, ki so porabile škrob v gojišču se pojavi svetlina (ni modre obarvanosti), kar omogoči ločevanje kolonij amilolitičnih mikrobov od kolonij neamilolitičnih mikroorganizmov. S preštevanjem vseh kolonij na ploščah ugotovimo skupno število heterotrofov; s preštevanjem kolonij s svetlinami pa število amilolitičnih mikrobov. Uporabi samo števne plošče. Rezultat izrazi kot delež amilolitičnih mikrobov v vzorcih. � Razmisli, na osnovi katere predpostavke lahko podatek o številu aerobnih mineralizatorjev dušika interpretiramo tudi kot število heterotrofov? Glej vaja Amonifikacija.


25

Preglednica 9: Število amilolitičnih mikrobov na gram zračno suhih tal oziroma ml vzorca v različnih naravnih okoljih.

Št. amilolitov Št. heterotrofov Št. kolonij amilolitov Št. vseh mikrobov

(metoda MPN) (metoda MPN) (na ploščah) (na ploščah)

žč

obdelovana tla

travniška tla

rečna voda

ustekleničena voda

rečni sediment

morski sediment

Iz vaje Amonifikacija


26

2.4 MIKROBNA BIOMASA Mikroorganizmi so pomembna komponenta organskega materiala v vseh ekosistemih. Mikrobna biomasa je zelo dinamična komponenta, ki v povprečju predstavlja 1-3 % celotnega C in 5 % skupnega dušika. Ker mikrobi opravljajo procese, ki so ključnega pomena za funkcioniranje ekosistema (npr. kroženje elementov), je velikost in aktivnost biomase pomemben parameter pri študiju pretoka energije v ekosistemu. Z razpoložljivo analitiko je eksperimentalno določanje skupne mikrobne biomase »in situ« trenutno nemogoče. Mikrobno biomaso lahko določamo v laboratoriju. Kljub temu, da obstaja več metod za določanje skupne mikrobne biomase v kompleksnih vzorcih so te metode večinoma pomankljive. Za določanje mikrobne biomase uporabljamo: - fumigacijsko-inkubacijsko metodo - fumigacijsko ekstrakcijsko metodo - s substratom inducirano respiracijsko metodo - analizo ATP S substratom inducirana respiracija (SIR) V aerobnih razmerah so večinski produkti mikrobne respiracijske presnove organskega ogljika, CO2, H2O in novonastala biomasa. Produkcija CO2 je lahko mera za hitrost respiracije. Metodo sta razvila Anderson in Domsch za potrebe hitrega določevanja mikrobno biomasnega C v talnih vzorcih. Avtorja sta odkrila, da bakterijska respiracija že v nekaj minutah po dodatku mikrobom dostopnega substrata doseže maksimalno aktivnost. Količina CO2/h je konstantna od 6 do 8 ur po dodatku substrata, nato pa količina CO2 začne naraščati zaradi nastanka nove biomase. Začetna hitrosti respiracije po dodatku substrata v vzorec (npr. glukoze, asparigina, škroba) je mera za skupno mikrobno biomaso tal, ki raste na izbranem substratu. Metoda ne daje absolutnih vrednosti za biomaso, rezultate pa lahko uporabimo za relativne primerjave. Avtorja sta ugotovila značilno visoko korelacijo (R2 = 0,96) med rezultati te metode in fumigacijske metode določanja biomase. Pri 22 oC tako velja, da je 1 ml CO2/h ekvivalenten 40 mg mikrobno biomasnega C. � Razmisli zakaj se fumigacijska metoda za določanje biomase uporablja kot referenčna metoda? Predpostavke na katerih temelji SIR metoda za določanje biomase: - SIR odziv različnih mikroorganizmov je konstanten - po dodatku substrata začne večina talnih mikroorganizmov z respiracijo - glukoza je primeren substrat za indukcijo maksimalnega efekta - delež mikroorganizmov, ki ne metabolizirajo glukoze je majhen - pred dodatkom substrata je večina mikroorganizmov v fazi mirovanja oziroma v stacionarni fazi � Ali so omenjene predpostavke smiselne? V novejšem času so meritve s substratom inducirane respiracije uporabljene za opis mikrobne združbe. V primeru, da opravimo SIR meritve za več različnih substratov dobimo SIR profil


27

mikrobne združbe v vzorcu. Za vsak uporabljeni substrat je potrebno določiti optimalno koncentracijo substrata. SIR metoda omogoča enostavno in hitro vrednotenje metabolne raznolikosti mikrobnih združb ter vrednotenje spreminjanja strukture mikrobnih združb v odvisnosti od spreminjanja okolja. Bistvena prednost SIR metode pred ostalimi metodami za vrednotenje biomase je ta, da ni potrebna izolacija in gojenje mikroorganizmov. � Razmisli, kako bi uporabil SIR metodo za opis mikrobne združbe. VAJA 5: S substratom inducirana respiracija (SIR) vzorca tal Substratno inducirano respiracijo določamo v vzorcu svežih tal. Iz vzorca tal odstrani rastlinske ostanke. Vzorec zemlje (50 g tal) dodaj v 125 ml serumsko steklenico in vmešaj predpisano količino substrata. Tla naj bodo primerno navlažena (~ 55 % WHC). Vzorce plinotesno zapri in v enournih razmikih meri nastali CO2 s plinskim kromatografom. Variante:

A: 50 g tal (kontrola) B: 50 g tal + 1 g glukoze C: 50 g tal + 1 ml CH3Cl + 1 g glukoze D: 50 g tal + 1 g škroba + 1 g glukoze E: 50 g tal + 1 g glukoze + 60 ml H2O F: 50 g tal + 1 ml rastlinskega gnojila G: 50 g tal + 1 ml rastlinskega gnojila + 1 g glukoze

Preglednica 10: Produkcija CO2 pri vzorcih tal iz različnih eksperimantalnih variantah. Varianta Začetni

% CO2 % CO2 po eni uri

% CO2 po dveh urah

% CO2 po treh urah

A B C D E F G

Grafično predočite potek naraščanja koncentracij CO2 za vse variante v enotah: µg CO2-C / g suhih tal h. Upoštevajte v vodi raztopljeni CO2 in iz ustreznih variant izračunaj velikost mikrobne biomase za obravnavani vzorec. � Razmislite, zakaj morate od respiracije v eksperimentalni varianti odšteti respiracijo v kontrolni varianti, ko delate s svežimi vzorci tal. Izračun:


28

2.5 METAN OKSIDIRAJOČE BAKTERIJE (MOB) Oksidacija metana lahko poteka tako aerobno kot anaerobno, vendar je poznavanje slednjega procesa, ki naj bi ga opravljale arheje slabše. Aerobne metan oksidirajoče bakterije (MOB) igrajo pomembno vlogo v globalnem kroženju metana, saj bi se brez njihove aktivnosti 60-90 % v tleh proizvedenega metana izločilo v atmosfero. Metan oksidirajoče bakterije neposredno zmanjšujejo toplogredni potencial okolja. MOB tipa I (γ-proteobakterije) so sposobne rasti zgolj pri nizkih koncentracijah metana (200 ppm), medtem ko MOB tipa II (α-proteobakterije) rastejo zgolj pri višjih koncentracijah metana v zraku. Znano je, da višja vsebnost vode v tleh in povišana temperatura tal vplivata na strukturo in aktivnost MOB, vendar je kumulativen učinek obeh manjši od učinka vode oziroma temperature posebej. � Kako si razlagaš ugotovitev, da je skupen učinek dejavnikov v okolju pogosto manjši od učinka posameznega dejavnika? VAJA 6: Velikost združbe metan oksidirajočih bakterij Velikost te združbe v vzorcu lahko izmerimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN). Tekoče mineralno gojišče nacepimo z ustreznimi razredčitvami vzorca v osmih ponovitvah. Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost motnosti.

Mineralno gojišče za metan oksidirajoče bakterije: NaH2PO4 · 2 H2O 0,35 g KH2PO4 0,34 g NH4Cl 0,54 g MgSO4 · 7H2O 0,39 g CaCl2 (0,2 M) 0,5 mL elementi v sledeh 1 mL deionizirana voda 1000 mL pH 6,8 Gojišče pripravimo v 250 mL erlenmajericah in avtoklaviramo 15 min pri 121 oC. Na mikrotitrske plošče sterilno prenesemo po 100 µL ohlajenega gojišča in shranimo na 4 oC do uporabe. Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- travniška tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - morski sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečni sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečna voda 100 do konca mikrotitrske plošče - ustekleničena voda 100 do konca mikrotitrske plošče


29

Nacepljanje: V sterilno stekleno petrijevko prelij del vzorca in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 33 µL (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi vzorec in ga prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče s tekočim mineralnim gojiščem. Odvrzi nastavke, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino inokuliranih luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi nastavke. Za ta eksperiment je potrebno identično inokulirati dve mikrotitrski plošči. Inkubacija: Kontrolno mikrotitrsko ploščo inkubiraj v stekleni posodi v prisotnosti zraka in zračne koncentracije metana (1,8 ppm), pri temperaturi 28 oC, 4 tedne. Drugo, eksperimentalno mikrotirsko ploščo inkubiraj v drugi stekleni posodi, v katero boš skozi septo dodal 20 % volumna posode čistega metana s 50 mL brizgo. � Kakšna je koncentracija metana v tem primeru? Odčitavanje: Motne cone na dnu mikrotitrske plošče kažejo pozitivne primere rasti heterotrofnih bakterij v kontrolni plošči oziroma metan oksidirajočih bakterij v eksperimentalni. Iz razporeda + in - znakov ugotovi karakteristično število in s pomočjo tabel odčitaj najbolj verjetno število mikrobov. Šele razlika ugotovljenih najbolj verjetnih števil med eksperimentalno in kontrolno ploščo poda najbolj verjetno število bakterij udeleženih pri oksidaciji metana v izbranem vzorcu iz okolja. Tabeli 11 in 12 : Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z eksperimentalne in kontrolne mikrotitrske plošče. Eksperimentalna :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Kontrolna :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H


30

Preglednica 13: Število metan oksidirajočih bakterij na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij.

Število mikrobov (Metoda MPN) Obdelovana tla Travniška tla Morski sediment rečni sediment Rečna voda Ustekleničena voda


31

3. ŽVEPLO 3.1 MINERALIZACIJA ŽVEPLA Pri mineralizaciji organskega ogljika prihaja do sproščanja mineralnih oblik žvepla. V aerobnih pogojih je končni produkt mineralizacije žvepla nastanek sulfata. V anaerobnih pogojih je končni produkt mineralizacije H2S ali dimetilsulfid, poleg tega pa lahko prihaja tudi do tvorbe različnih merkaptanov. Del mineraliziranega žvepla se takoj porabi za sintezo nove biomase v procesu imobilizacije žvepla. Mikroorganizmi poleg sulfata lahko sprejemajo žveplo v različnih mineralnih oblikah: hiposulfat, tiosulfat, persulfat, sulfid, elementarno žveplo, sulfit, tetrationat in tiocianat. Poleg tega pa lahko mikroorganizmi sprejemajo žveplo tudi v organski obliki kot cistein, cistin, sulfooksalat in metionin. Žveplo, ki se sprosti v okolje predstavlja višek žvepla za rastne potrebe udeleženih mikrobov. Delež mineraliziranega žvepla, ki se sprosti v okolje je podobno kot pri mineralizaciji dušika odvisen od C : S razmerja v razgrajevani organski snovi in razmerja C : S v mikrobni celici. � Na žveplu so možne tako biološke kot kemijske spremembe. Pri katerih pogojih so biološke reakcije favorizirane? Pri izrabi organskih žveplovih snovi se mineralno žveplo sprošča v okolje v obliki merkaptanov, dimetilsulfida in H2S. Predvsem H2S je močno reaktiven in reagira s kovinami v slabo topne ali netopne sulfide. To lastnost izkoriščamo pri identifikaciji anaerobne mineralizacije žvepla. VAJA 7: Velikost mikrobne združbe anaerobnih mineralizatorjev organskega žvepla Tekoče gojišče, ki vsebuje organsko vezano žveplo (cistein) in železov amon citrat nacepimo z razredčitvami vzorca v treh ponovitvah (Metoda MPN). Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost črne oborine železovega sulfida. Gojišče za mineralizatorje žvepla: NH4Cl 1,00g K2HPO4 0,50g CaCl2 · 2H2O 0,13g Na-laktat 50 % 6,20ml cistein 1,00g Fe-amonijski citrat 0,50g talni ekstrakt 20ml deionizirana voda 1000ml

Gojišče pripravimo v 250 mL erlenmajericah in avtoklaviramo 20 min pri 110 oC.


32

Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do 10-5

- travniška tla 10-1 do 10-5 - morski sediment 10-1 do 10-5 - rečni sediment 10-1 do 10-5 - rečna voda 100 do 10-4

- ustekleničena voda 100 do 10-3 Nacepljanje: Pripravimo serijo sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke) do navedenih najvišjih razredčitev za posamezni vzorec. Po 1 ml vzorca oz. vsake razredčitve nacepimo v treh ponovitvah v pripravljeno tekoče selektivno gojišče z organskim žveplom. Inkubacija: V anaerobnih razmerah (anaerobni lonec z atmosfero N2) , pri temperaturi 28 oC, nekaj tednov. Odčitavanje: prisotnost črne oborine železovega sulfida kaže pozitivne primere. Iz razporeda + in - znakov ugotovimo karakteristično število in s pomočjo tabel najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu, ki anaerobno mineralizirajo žveplo v anaerobiozi do H2S. Preglednica 14: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z epruvet.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

Preglednica 15: Število mineralizatorjev žvepla na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij.

Število mikrobov (Metoda MPN) Obdelovana tla Travniška tla Morski sediment rečni sediment Rečna voda Ustekleničena voda


33

3.2 REDUKCIJA SULFATOV V anaerobnih razmerah skupina striktno anaerobnih bakterij (sulfatni respiratorji) izrablja sulfat kot prevzemnik elektronov (dihanje s sulfatom). Sulfat se pri tem procesu reducira do H2S. Vir elektronov so nizkomolekularne organske kisline (npr. acetat, laktat, etanol) in tudi H2. VAJA 8: Velikost združbe sulfatnih respiratorjev Tekoče gojišče z laktatom, železovim amon citratom in sulfatom nacepimo z razredčitvami vzorca v treh ponovitvah (Metoda MPN). Ob nacepljanju dodamo v vsako epruveto risalni žebljiček, ki smo ga predhodno ožgali nad plamenom. Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost črne oborine železovega sulfida. Gojišče za sulfatne respiratorje: NH4Cl 1,00 g

K2HPO4 0,50 g

MgSO4 · 7H2O 4,10 g

CaCl2· 2H2O 0, 13 g

Na-laktat (50 %) 6,20 ml Deionizirana voda 1000 ml

Gojišče je pripravljeno po 10 ml v epruvetah 16 x 160 mm in avtoklavirano 20 min pri 110 oC. Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do 10-5

- travniška tla 10-1 do 10-5 - morski sediment 10-1 do 10-5 - rečni sediment 10-1 do 10-5 - rečna voda 100 do 10-4

- ustekleničena voda 100 do 10-3 Nacepljanje: Pripravi serijo sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke) do navedenih najvišjih razredčitev za posamezni vzorec. Po 1 ml vzorca oz. vsake razredčitve nacepi v treh ponovitvah v pripravljeno tekoče selektivno gojišče s sulfatom in laktatom. V vsako epruveto aseptično dodaj risalni žebljiček, ki si ga predhodno ožgal v plamenu in ohladil. Inkubacija: V anaerobnih razmerah (anaerobni lonec z atmosfero N2), pri temperaturi 28 ºC, nekaj tednov. � Razmisli ali da merjenje velikosti mikrobne združbe z gojitveno metodo absoluten podatek o velikosti združbe?


34

Odčitavanje: Pojav črne oborine železovega sulfida na žebljičku kaže pozitivne primere. Iz razporeda + in - znakov ugotovi karakteristično število in s pomočjo tabel najbolj verjetno število sulfatnih respiratorjev v vzorcu. Preglednica 16: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z epruvet.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

VAJA 9: Vpliv kisika na sulfatno respiracijo Gojišče enake sestave kot pri vaji 1 nacepi s suspenzijo tal. Varianti: A. 50 ml gojišča v 250 ml erlenmajerici, 1 ml suspenzije tal, 2 ožgana risalna žebljička. Inkubacija: aerobno na stresalniku pri 28 oC, v temi; nekaj tednov, 2 ožgana risalna žebljička. B. 50 ml gojišča v 150 ml serumski steklenici, 1 ml suspenzije tal. Inkubacija: anaerobno - plinska faza v steklenici je N2 - na stresalniku pri 28 ºC, v temi; nekaj tednov Odčitavanje: Po nekaj tednih opazuj pojavljanje črne oborine fero sulfida. Primerjaj dobljeni rezultat z rezultati podobnih testov pri denitrifikaciji. Slika 2: Grafično prikažite vpliv prisotnosti / odsotnosti kisika na proces sulfatne respiracije


35

VAJA 10: Sulfatna respiracija v sedimentu V morski vodi je sulfatni ion prisoten v visoki koncentraciji (~30 mM) zato ni pričakovati omejujoče vloge tega iona za sulfatno respiracijo v anaerobnih morskih sedimentih. Nasprotno, količina sulfata je v sladkih vodah nizka, zato je sulfat lahko omejujoči dejavnik za sulfatno respiracijo v sladkovodnih sedimentih. Drugi omejujoč dejavnik tega procesa je v naravnih okoljih lahko tudi donor elektronov – organska snov. Morebitno omejujočo vlogo energetskega substrata in/ali prevzemnika elektronov lahko preverimo z opazovanjem in kvantifikacijo sulfatne respiracije v vzorcih sedimenta, ki jih obogatimo z laktatom kot modelnim energetskim virom in sulfatom kot prevzemnikom elektronov. Priprava, obogatitev in inkubacija vzorcev: Vzorce morskega in ločeno sladkovodnega sedimenta (po 50g) zatehtaj v pet 130 ml infuzijskih steklenic in dodaj po 20 ml morske oz. sladke vode. Variante:

A: kontrola - brez obogatitev B: 1 ml 50 % raztopine Na-laktata, C: 1 ml raztopine Na2SO4 (85,2 mg Na2SO4/ml), D: 1 ml 50 % raztopine Na-laktata in 1 ml raztopine Na2SO4 (85,2 mg Na2SO4/ml), E: varianta D brez zamenjane atmosfere (prisotnost kisika)

Steklenice zamaši z gumijastimi zamaški in Al pokrovčki, zračno atmosfero pa zamenjaj z atmosfero N2, razen v varianti E. Vzorce inkubiramo nekaj tednov pri 28 ºC v temi. Odčitavanje: Opazuj in primerjaj obarvanost obogatenih vzorcev glede na kontrolne vzorce. Produkt sulfatne respiracije je H2S, ki reagira s kovinami v temno obarvane kovinske sulfide. Preglednica 17: Število sulfatnih respiratorjev na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij. Število mikrobov (Metoda MPN) Obdelovana tla Travniška tla Morski sediment rečni sediment Rečna voda Ustekleničena voda


36

Preglednica 18: Sulfatna respiracija v morskem in rečnem sedimentu Variante morski sediment rečni sediment A B C D E

Slika 3: Primer rezultatov eksperimenta komplementacije okolja za sulfatne respiratorje v vzorcih rečnega in morskega sedimenta.


37

4 DUŠIK 4.1 MINERALIZACIJA DUŠIKA V naravnih okoljih je v raztopini zaloga mineralnega ionskega dušika običajno skromna. Kljub nizkim koncentracijam mineralnega dušika v naravnih sistemih predstavljajo mineralne oblike glavni vir dušika za napajanje primarne produkcije in rasti številnih heterotrofnih mikrobov. Najpomembnejši vir dušika za obnavljanje mineralne zaloge je organska snov. V organski snovi je praktično ves dušik vezan v reducirani obliki. Med mikrobno razgradnjo organskih dušikovih snovi se dušik sprošča v okolje brez dodatne redoks spremembe, to je v obliki amonijevega iona. Proces mineralizacije dušika včasih imenjujemo tudi amonifikacija. Glavni dejavnik procesa so heterotrofni mikrobi. Proces je značilen tako za aerobna kot tudi anaerobna okolja. organski-N � NH

4+

Primarna tarča mikrobov pri razgradnji organske snovi je ogljik, ki predstavlja vir energije in metabolnih intermediatov. Mineralizacija organskega dušika in ostalih elementov je običajno posledica mineralizacije ogljika. Del mineralnega dušika se takoj porabi za sintezo nove biomase v procesu imobilizacije dušika. Mineralni dušik, ki se sprosti v okolje, predstavlja višek dušika za rastne potrebe udeleženega mikroba. Količina sproščenega anorganskega N je odvisna od razmerja C : N v razgrajevani organski snovi in C : N razmerja v mikrobni celici. Koncentracija amonija v raztopini pa ni odvisna samo od mineralizacije in imobilizacije temveč tudi od fiksacije N2, nitrifikacije, disimilativne redukcije nitrata do amonija, vezave na organske in mineralne koloide, volatilizacije. Večina teh procesov lahko poteka hkrati in so med seboj povezani. � Razmisli kako bi matematično opisal spreminjanje koncentracije amonija v raztopini glede na čas. Kako bi rešil tak sistem diferencialnih enačb v stacionarnem stanju? VAJA 11: Velikost združbe amonifikatorjev Pri konstantnih faktorjih okolja je amonifikacija proporcionalna velikosti udeležene mikrobne združbe. Velikost združbe mikrobov v vzorcu, ki sprošča amonijski dušik iz razgrajevane organske snovi, je mera za amonifikacijsko sposobnost vzorca. Velikost te združbe v vzorcu lahko izmerimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN) ob uporabi gojišč z modelnimi organskimi dušikovimi spojinami. Tekoče selektivno gojišče z argininom kot edinim virom energije, ogljika in dušika nacepimo z ustreznimi razredčitvami vzorca v osmih ponovitvah. Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost amonijskega dušika v gojiščih z Neslerjevim reagentom.


38

Gojišče za amonifikatorje: razt. soli (Winogradsky) 50ml Arginin 0,2g razt. mikroelementov 1ml deionizirana voda 1000ml

Gojišče pripravimo v 250 mL erlenmajericah in avtoklaviramo 15 min pri 121 oC. Na mikrotitrske plošče sterilno prenesemo po 180 µL ohlajenega gojišča in shranimo na 4 oC do uporabe. Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- travniška tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - morski sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečni sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečna voda 100 do konca mikrotitrske plošče - ustekleničena voda 100 do konca mikrotitrske plošče Nacepljanje: V sterilno stekleno petrijevko prelij del vzorca in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 20 µL (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi vzorec in ga prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče s tekočim selektivnim gojiščem z argininom. Odvrzi nastavke, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi nastavke. Petrijevko s suspenzijo vzorca potrebujete za inokulacijo vseh ostalih MPN v sklopu teh vaj. Inkubacija: V prisotnosti zraka, pri temperaturi 28 ºC, 7 dni do nekaj tednov. Odčitavanje: Z Nesslerjevim reagentom dokazujemo pojavljanje amonijevega iona. V vsako jamico mikrotitrske plošče dodaj nekaj kapljic Nesslerjevega reagenta. Pojav oranžne obarvanosti oz. oranžne oborine dokazuje prisotnost amonijevega iona v vzorcu, to je pozitivne primere. Iz razporeda + in - znakov ugotovi karakteristično število in s pomočjo tabel ali kalkulatorja MPN odčitaj najbolj verjetno število mikrobov, ki so udeleženi v mineralizaciji argininskega N. Podatek pokaže velikost mikrobne združbe za mineralizacijo organskega N iz arginina v izbranem vzorcu tal. Preglednica 40: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z mikrotirske plošče.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H


39

VAJA 12: Vpliv kisika in razmerja C:N organske snovi na kapaciteto za mineralizacijo dušika Metoda temelji na merjenju količine sproščenega amonijskega in nitratnega dušika med inkubacijo vzorca pri 28 oC v laboratorijskih razmerah. Priprava vzorcev: Zatehtajte štirikrat po 10 g zračno suhih in zdrobljenih tal, iz katerih so odstranjeni kamenčki in vidne tkivne strukture v 150 mL infuzijske steklenice in jih zmešajte s 30 g kremenčevega peska. Zmes navlažite s 6 ml destilirane vode. Razredčitev vzorca s kremenčevim peskom omogoči vzdrževanje aerobnih razmer med inkubacijo. Posode pokrij z Al folijo. Vzorce inkubiraj 7 - 30 dni v temi pri temperaturi 28 oC. Pri vsaki varianti shranite po dva pripravljena vzorca tal pri -20 oC za vrednotenje začetnega stanja. Variante: A. kapaciteta za mineralizacijo N v aerobnih razmerah B. kapaciteta za mineralizacijo N v anaerobnih razmerah Vse pripravljene infuzijske steklenice zapri z gumijastim zamaškom in jim zamenjaj atmosfero z N2. C. obogatitev - glukoza - 50 mg/10 g tal. Glukozo zamešaj v vzorec suhih tal. Vzorec tal navlaži s 6 ml deionizirane vode. D. obogatitev - mleta slama - 50 mg/10 g tal. Mleti rastlinski ostanek zamešaj v vzorce suhih tal. Vzorec tal navlaži s 6 ml deionizirane vode. E. obogatitev - žagovina bukve - 50 mg/10 g tal. Mleti rastlinski ostanek zamešaj v vzorce suhih tal. Vzorec tal navlaži s 6 ml deionizirane vode. F. obogatitev - zelena biomasa - 50 mg/10 g tal. Sesekljan rastlinski ostanek zamešaj v vzorce suhih tal. Vzorec tal navlaži s 6 ml deionizirane vode. G. obogatitev - mrtva kultura – 6 ml avtoklavirane kulture bakterij zamešaj v vzorec suhih tal. Ta raztopina obenem služi za navlažitev vzorca suhih tal. H. obogatitev - pepton - 50 mg/10 g tal. Pepton zamešaj v vzorec suhih tal. Vzorec tal navlaži s 6 ml deionizirane vode. Analiza vzorcev: Po končani inkubaciji vzorce prelij s 100 ml 2N KCl in stresaj na stresalniku 1 uro. Suspenzijo filtriraj ali centrifugiraj in v filtratu oz. supernatantu izmeri količino amonijskega dušika in nitratnega ter nitritnega dušika.


40

Rezultati:


41

VAJA13: Določanje NH4+-N in (NO3

-+NO2-)-N

Ionske mineralne oblike dušika določimo z mikrodestilacijsko metodo. V destilacijsko bučko pipetiramo od 1 do 20 ml vzorca, odvisno od pričakovane vsebnosti ionov, in dopolnemo z destilirano vodo do 20 ml. Slepi vzorec vsebuje 20 ml destilirane vode. Vzorec naalkalimo z žganim MgO (cca. 0,3g) in destiliramo z vodno paro. Destilat, ki vsebuje amonijev dušik, lovimo v predložko s 5 ml raztopine borove kisline z dvojnim indikatorjem dokler volumen tekočine doseže oznako 30 ml (frakcija 1). Prekinemo dotok pare v destilacijsko bučko in zamenjamo predložko z borovo kislino. V destilacijsko bučko dodamo cca. 0,3g Devardove litine skozi stranski rokav in ponovno vzpostavimo pretok pare v destilacijsko bučko. Z destilacijo nadaljujemo dokler ne dobimo v predložki 30 ml destilata (frakcija 2). Frakcija 2 vsebuje amonijev N, ki smo ga ob predhodni redukciji dobili iz nitrata in nitrita v vzorcu (redukcija z Devardovo litino). Količino amonijevega N v destilatih (frakcija 1 in ločeno frakcija 2) določimo s titracijo z 0,005 N H2SO4 do barvnega preskoka iz zelene v rožnato. Ekvivalent za izračun količine amonija ter nitrata in nitrita 1 ml 0,005 N H2SO4 = 70 µg NH4

+-N (frakcija 1), oziroma = 70 µg (NO3

-+NO2-)-N (frakcija 2)

Izračun (primer za vajo pod II.1) : Koncentracija: NH4

+-N ali (NO3-+NO2

-)-N

vzorcaml

slepavzorecSOmlHgg

⋅⋅⋅−

=1070)(

/42

µ

kjer je 10 faktor razredčitve vzorca. Obseg neto mineralizacije je enak

t

AAN

ot−=∆ min

kjer je At skupni mineralni dušik (NH4

++NO3-+NO2

-)-N po času t dni inkubacije in Ao je skupni mineralni dušik (NH4

+NO3-+NO2

-)-N na začetku inkubacije. V tabeli prikaži začetna in končna stanja založenosti vzorcev z mineralnimi ionskimi oblikami dušika (NH4

+-N in (NO3-+NO2

-)-N) ter izračunane hitrosti neto mineralizacije. Primerjaj obseg mineralizacije v odvisnosti od eksperimentalno spreminjanih dejavnikov okolja.


42

Kolorimetrično določanje amonija Reagenti: 1. Barvni reagent. V 1000 ml deionizirane vode raztopi 34g Na-salicilata + 25g Na-citrata + 25g Na-tartrata + 0,12g Na-nitroprusida 2. Alkalna raztopina hipoklorida. V 1000 ml deionizirane vode raztopi 30g NaOH + 10ml Na-hipoklorita (>5 % aktivnega klora). 3. Osnovni standard: 1000 mg N/l. V 1000 ml deionizirane vode raztopi 4,719g amonijevega sulfata. 4. Amonijski delovni standardi: 0, 5, 10, 15, 20, 25 mg N/l Postopek: - v epruveto 16 x 160mm dodaj 1 ml vzorca - slepi vzorec vsebuje 1ml vode - dodaj 5ml barvnega reagenta - dobro premešaj (Vortex) - dodaj 5ml alkalne raztopine hipoklorita - dobro premešaj (Vortex) - inkubiraj 15 min v vodni kopeli pri 38 oC - izmerieri absorbenco pri 660 nm proti slepi - na osnovi umeritvene krivulje odčitaj vsebnost amonijskega N v vzorcu


43

Preglednica 20: Število amonifikatorjev na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij.

Št. mikrobov (Metoda MPN) obdelovana tla travniška tla morski sediment rečni sediment rečna voda ustekleničena voda

Slika 4: Prikaz rezultatov izračuna mineralizacije za varianti A in B.


44

Preglednica 21: Vrednosti NH4-N in (NO3+NO2)-N v kontrolnih (-20°C) ter eksperimentalnih variantah vzorcev tal pri vaji mineralizacija dušika Kontrolna (-20°°°°C) NH4-N (NO3+NO2)-N mineralni N tla aerobno tla aerobno tla anaerobno tla anaerobno Glukoza Glukoza Slama Slama Bukev Bukev Zelena biomasa Zelena Biomasa Kultura Kultura Pepton Pepton

eksperimentalna NH4-N (NO3+NO2)-N mineralni N tla aerobno tla aerobno tla anaerobno tla anaerobno Glukoza Glukoza Slama Slama Bukev Bukev Zelena biomasa Zelena Biomasa Kultura Kultura Pepton Pepton


45

Preglednica 22: Mineralizacija organskega dušika v variantah pri vzorcu obdelovanih tal. Mineralizacija (∆ (mineralizirani dušik) = mineralni dušik na koncu inkubacije – mineralni dušik na začetku inkubacije (iz zmrznjenih vzorcev)) ∆ NH4-N ∆ (NO3+NO2)-N ∆ (mineralizirani N) tla aerobno tla aerobno tla anaerobno tla anaerobno Glukoza Glukoza Slama Slama Bukev Bukev Zelena biomasa Zelena Biomasa Kultura Kultura Pepton Pepton

Slika 5: Prikaz rezultatov mineralizacije po obogatitvi tal z modelnimi snovmi. Na vajah pridobljene podatke (NH4-N, (NO3+NO2)-N ter mineralni-N) preračunajte in prikažite tudi začetna stanja za vse modelne snovi.


46

4.2 NITRIFIKACIJA Pri nitrifikaciji ločimo dva procesa, nitritacija in nitratacija. NH4

+ je v procesu nitritacije mikrobno oksidiran do NO2

-. To transformacijo lahko opravijo bakterije iz rodu Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira in Nitrosolobus.

NH4+ + 1½O2 → NO2

- + 2H+ + H2O (∆G = - 277.2 kJ/mol) NO2

- je v nevtralnih tleh v procesu nitratacije oksidiran do NO3-. Udeležene so bakterije iz rodov

Nitrobacter in Nitrococus.

NO2- + ½O2 → NO3

- (∆G = - 71.4 kJ/mol) Hitrost nitrifikacije je v naravnih okoljih predvsem odvisna od temperature, pH in preskrbljenosti s kisikom. Proces nitratacije je znatno bolj občutljiv za spremembe faktorjev okolja. Npr., če so tla alkalna ali pa je amonij prisoten v visokih koncentracijah, lahko prihaja do akumulacije nitrita. Akumulacija nitrita v tleh lahko povzroči velike naravovarstvene probleme. Namreč tako nitrit kot nitrat se zaradi negativnega naboja lahko izpirata iz talnega sistema in prideta v podtalnico (talni koloidi so večinoma negativno nabiti). VAJA 14: Velikost mikrobne združbe nitrifikatorjev Obseg in hitrost nitrifikacije sta v veliki meri odvisna od velikosti udeležene združbe mikrobov, ki so sposobni oksidacije amonija. Velikost združbe mikrobov v vzorcu lahko izmerimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN). Tekoče gojišče z amonijem kot virom energije nacepimo z razredčitvami vzorca v osmih ponovitvah. Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost nitrita in nitrata. Reagent za določevanje nitrita vsebuje sulfanilamid in naftiletilendiamin (SA + NEDA), ki v reakciji z nitritom daje rdeče obarvano azo spojino. Nitrat lahko s pomočjo cinka reduciramo do nitrita, ki ga določimo s SA + NEDA reagentom. Gojišče za nitrifikatorje: (NH4)2SO4 (5,0g/100ml) 10 ml

CaCl2 x 2H2O (1,34g/100ml) 1.0 ml MgSO4 x 7H2O (4,0g/100ml) 1.0 ml Bromothymol blue (0,04g/100ml) 5.0 ml KH2PO4 (0,2 M) 7.5 ml Kelirano Fe 1.0 ml Mikroelementi 1.0 ml deionizirana voda 1000,0 ml


47

Pred avtoklaviranjem uravnamo še pH z 2 % K2CO3 na 7,0 – 7,2. Gojišče pripravimo v 250 mL erlenmajericah in avtoklaviramo 20 min pri 121oC. Na mikrotitrske plošče sterilno prenesemo po 180 µL ohlajenega gojišča in shranimo na 4 oC do uporabe. Vzorci in razredčitve: - obogatena kultura nitrifikat. 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- travniška tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - morski sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečni sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče

- rečna voda 100 do konca mikrotitrske plošče - ustekleničena voda 100 do konca mikrotitrske plošče Nacepljanje: V sterilno stekleno petrijevko prelij del vzorca in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 40 µL (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi vzorec in ga prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče s tekočim selektivnim gojiščem. Odvrzi nastavke, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi nastavke. Kakšna je ta redčitvena vrsta? V čem se razlikuje od klasične priprave (serija sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke raztopine), kjer po 1 ml vzorca oz. razredčitve nacepiš v tekoče selektivno gojišče)? Inkubacija: V aerobnih razmerah, pri temperaturi 28 oC, 4 - 5 tednov. Odčitavanje: z reagentom, ki vsebuje SA + NEDA dokaži pojavljanje nitrita in nitrata (po predhodni redukciji nitrata v nitrit s Zn v prahu). V vsako jamico mikrotitrske plošče dodaj nekaj kapljic reagenta. Rdeča obarvanost dokazuje prisotnost nitrita. Pozitivni primeri so nacepitve, ki vsebujejo nitrit in nitrat. Iz razporeda + in - znakov ugotovi karakteristično število in s pomočjo tabel najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu, ki so sposobni nitrifikacije. Preglednica 23: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z mikrotirske plošče.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H


48

VAJA 15: Vpliv pH na nitrifikacijo Enako gojišče kot pri vaji 1 z ustreznim pH (pH 2 in pH 10 pripravi z dodatkom 1 N HCl oziroma 1N NaOH). V gojišča s pH 2, pH 7 in pH 10 nacepi po 1 ml suspenzije tal in aerobno inkubiraj pri 28 oC od 4 - 5 tednov. Po končani inkubaciji kvalitativno preveri prisotnost nitrita s SA + NEDA reagentom in nitrata po predhodni redukciji s Zn. Pozitivni primeri kažejo rdečo obarvanost po dodatku reagenta.

Slika 6: Grafično prikažite vpliv pH na nitrifikacijo VAJA 16: Vpliv aeriranja na nitrifikacijo Enako gojišče kot pri vaji 1. V gojišče nacepi po 1 ml suspenzije tal in aerobno inkubiraj pri 28 oC od 4 - 5 tednov. Vzorce za anaerobno inkubacijo pripravi tako, da dodaš v gojišče 1 ml suspenzije tal, penicilinko plinotesno zapri in zamenjaj atmosfero s He ali N2 ter inkubiraj pri 28 oC 4 - 5 tednov. Po končani inkubaciji kvalitativno preveri nastanek nitrita z reagentom SA + NEDA in nitrata po predhodni redukciji s Zn. Pozitivni primeri kažejo rdečo obarvanost po dodatku reagentov. Slika 7: Grafično prikažite vpliv prisotnosti / odsotnosti kisika na nitrifikacijo.


49

VAJA 17: Vpliv dodane obogatene kulture nitrifikatorjev na proces nitrifikacije v tleh Vzorec(10 g) zračno suhih in zdrobljenih tal, presejanih skozi sito s premerom odprtin 2 mm, iz katerega si odstranil kamenčke in vidne tkivne strukture zmešaj s 30 g kremenčevega peska in prenesi v 150 ml infuzijske steklenice. Tla navlaži s 6 ml raztopine (NH4)2SO4 (200 ppm NH4-N). Razredčitev vzorca s kremenčevim peskom omogoči vzdrževanje aerobnih razmer med inkubacijo. Pri vaji uporabljamo destruktiven način vzorčenja (za vsak inkubacijski čas pripravimo ločen vzorec). Steklenice pokrij z Al folijo. Vzorce inkubiraj 0, 5, 9, 14, 21 in 28 dni v temi pri temperaturi 28 oC. Občasno kontroliraj vlažnost tal (s pomočjo teže vzorca) in po potrebi dodaj deionizirano vodo. Po končani inkubaciji vzorce prelij s 94 ml 2N KCl in stresaj na stresalniku 1 uro. Suspenzijo filtriraj ali centrifugiraj in v filtratu oz. supernatantu izmeri količino amonijskega dušika, nitratnega dušika in nitritnega dušika. Rezultate prikaži grafično. Na x os nanašamo čas, na y1 in y2 osi pa koncentracije amonijskega dušika oziroma nitratnega in nitritnega dušika. Varianta A (K): 10 g zračno suhih tal + 30 g kremenčevega peska + 6 ml raztopine

(NH4)2SO4 (200 ppm NH4-N) Varianta B (K+I): 10 g zračno suhih tal + 30 g kremenčevega peska + 6 ml obogatene kulture

nitrifikatorjev z dodatkom raztopine (NH4)2SO4 (200 ppm NH4-N) Varianta C (A): 10 g zračno suhih tal + 30 g kremenčevega peska + 6 ml raztopine

(NH4)2SO4 (200 ppm NH4-N), (avtoklaviramo pri 121 oC za 30 min) Varianta D (A+I): 10 g zračno suhih tal + 30 g kremenčevega peska (avtoklaviramo pri 121

oC za 30 min). Po avtoklaviranju dodamo 6 ml obogatene kulture nitrifikatorjev z dodatkom raztopine (NH4)2SO4 (200 ppm NH4-N)

Slika 8: Primer - Vpliv dodane obogatene kulture nitrifikatorjev na proces nitrifikacije v tleh


50

Preglednica 24: Število nitrifikatorjev na g zračno suhih tal oziroma na ml vzorca iz različnih naravnih okolij. Število mikrobov (metoda MPN) obdelovana tla travniška tla morski sediment rečni sediment rečna voda ustekleničena voda

Preglednica 25: Spremembe mineralnega dušika med 28 dnevno inkubacijo pri kontrolnem vzorcu tal (Varianta A).

čas inkubacije (dnevi) NH4-N (NO3 + NO2)-N ∆ (mineralni)-N 0 5 9 14 21 28 Preglednica 26: Spremembe mineralnega dušika med 28 dnevno inkubacijo pri kontrolnem vzorcu tal z dodano mešano kulturo nitrifikatorjev (Varianta B). čas inkubacije (dnevi) NH4-N (NO3 + NO2)-N ∆ (mineralni)-N 0 5 9 14 21 28 Preglednica 27: Spremembe mineralnega dušika med 28 dnevno inkubacijo pri avtoklaviranem vzorcu tal (Varianta C). čas inkubacije (dnevi) NH4-N (NO3 + NO2)-N ∆ (mineralni)-N 0 5 9 14 21 28


51

Preglednica 28: Spremembe mineralnega dušika med 28 dnevno inkubacijo pri avtoklaviranem vzorcu tal z dodano kulturo nitrifikatorjev (Varianta D). čas inkubacije (dnevi) NH4-N (NO3 + NO2)-N ∆ (mineralni)-N 0 5 9 14 21 28


52

4.3 DISIMILATIVNA REDUKCIJA NITRATA IN DENITRIFIKACIJA Pri disimilativni redukciji nitrata ločimo dva procesa, disimilativna redukcija nitrata do amonija (DRNA) in denitrifikacija. Številne fakultativno anaerobne bakterije reducirajo nitrat do amonijevega iona, ki se izloča v okolje. Proces imenujemo disimilativna redukcija nitrata do amonija, včasih tudi nitratna amonifikacija. Proces se uveljavlja v okoljih s striktno in dolgotrajno anaerobiozo (npr. sedimenti), zanemarljiv pa je v talnih in vodnih okoljih, kjer se status kisika relativno hitro spreminja. V tem procesu samo nekatere stopnje redukcije nitrata omogočajo oksidativno fosforilacijo. Večina udeleženih bakterij pa ima fermentativne sposobnosti. Ožja skupina fakultativno anaerobnih bakterij v odsotnosti kisika lahko izrablja nitrat kot končni prevzemnik elektronov, ki ga reducira do plinskih produktov (N2O in/ali N2). Proces je poimenovan denitrifikacija in omogoča rast denitrifikacijskih bakterij. Večina denitrifikacijskih bakterij je heterotrofov. V naravnih okoljih so ključni abiotski regulatorji uveljavljanja nitratne amonifikacije in denitrifikacije: prosti kisik, dostopna organska snov in koncentracija nitrata. � Ali so poleg bioloških možne tudi kemijske transformacije na nitratu? Razloži. VAJA 18: Velikost mikrobne združbe anaerobnih bakterij in denitrifikatorjev Obseg in hitrost disimilativne porabe nitrata je odvisen od velikosti udeležene združbe denitrifikatorjev. Velikost združbe denitrifikatorjev je eden izmed pokazateljev denitrifikacijske sposobnosti vzorca. Velikost združbe mikrobov v vzorcu lahko izmerimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN) ob uporabi gojišča z nitratom, modelnim organskim donorjem elektronov (acetat, sukcinat, NB (nutrient broth) ter NB (Nutrient broth) kot virom amonijske oblike dušika, ki inhibira asimilativno porabo nitrata v anaerobnih razmerah. Velikost združbe anaerobnih bakterij lahko sočasno ovrednotimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN) v istem eksperimentu. Tekoče gojišče z nitratom ter acetatom, sukcinatom in NB (Nutrient broth) kot viri energije in ogljika nacepimo z razredčitvami vzorca v osmih ponovitvah. Po inkubaciji najprej določimo obseg združbe anaerobnih bakterij z ugotavljanjem motnosti na dnu mikrotirskih plošč. Šele nato določimo prisotnost nitrita, ki je prvi in edini prosti ionski intermediat disimilativne presnove nitrata. Reagent za določevanje nitrita vsebuje sulfanilamid (SA) in naftiletilendiamin (NEDA) in v reakciji z nitritom daje rdeče obarvano azo spojino.


53

Gojišče za denitrifikatorje: NB (Nutrient broth, Difco) 1 g

KNO3 0,5 g Na - acetat 0,5 g

Na - sukcinat 0,5 g MgSO4·7H2O 1 g

CaCl2 0,05 K2HPO4 0,14 g KH2PO4 0,02 g

deionizirana voda 1000ml Gojišče (pH 6,5) pripravimo v 250 mL erlenmajericah in avtoklaviramo 15 min pri 121 oC. Na mikrotitrske plošče sterilno prenesemo po 180 µL ohlajenega gojišča in shranimo na 4oC. Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - travniška tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - morski sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečni sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečna voda 100 do konca mikrotitrske plošče - ustekleničena voda 100 do konca mikrotitrske plošče Nacepljanje: V sterilno stekleno petrijevko prelij del vzorca in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 30 µL (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi vzorec in ga prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče s tekočim selektivnim gojiščem za denitrifikatorje. Odvrzi nastavke, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi nastavke. Inkubacija: V anaerobnem loncu z N2 atmosfero, pri 28 oC, od 7 dni do nekaj tednov. Odčitavanje: Z reagentom (SA+NEDA), ki vsebuje sulafanilamid (SA) in naftiletilendiamin (NEDA) dokaži pojavljanje nitrita oz. neporabljeni nitrat (po predhodni redukciji nitrata v nitrit s Zn v prahu). V vsako jamico mikrotitrske plošče dodaj kapljico reagenta. Rdeča obarvanost dokazuje prisotnost nitrita. V primerih, ko nitrit ni prisoten, preveri še prisotnost nitrata. Pozitivni primeri so jamice, ki vsebujejo nitrit, ter tiste, v katerih ni niti nitrita niti nitrata. Iz razporeda + in - znakov ugotovi karakteristično število in s pomočjo tabel najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu, ki so sposobni disimilativne porabe nitrata. � Razmisli o zgoraj navedeni trditvi:’’ Pozitivni primeri so jamice, ki vsebujejo nitrit in epruvete, v katerih ni niti nitrita niti nitrata.’’ Ali to omogoča ločevanje disimilativne redukcije nitrata do amonija (DRNA) od denitrifikacije. Kako bi določil velikost denitrifikacijske mikrobne združbe in kako DRNA?


54

Preglednica 29: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z mikrotirske plošče.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

VAJA 19: Vpliv aeriranja in organske snovi pri denitrifikaciji Gojišče enake sestave kot pri vaji 1 nacepimo s suspenzijo tal (kompleksni inokulum) in inkubiramo v aerobnih razmerah ali anaerobno. Variante: A: 50 ml gojišča v 250 ml erlenmajerici cepimo z 1ml suspenzije tal in pokrijemo z Al folijo. Inkubacija: “aerobna” na stresalniku (100 rpm), v temi pri 28 oC. B. 50 ml gojišča v 150 ml penicilinki, ki je zamašena plinotesno z gumijastim zamaškom in Al

pokrovčkom, nacepimo z 1 ml suspenzije tal (10-1) s pomočjo injekcijske brizge. Atmosfero zraka v steklenici zamenjamo z atmosfero N2 ali He na aparatu za izmenjavo atmosfere z vakumiranjem.

Inkubacija: anaerobna, plinsko fazo v steklenici zamenjamo z N2 ali He. Inkubiramo na stresalniku (100 rpm), v temi pri 28 oC. Odčitavanje: Z reagentom, ki vsebuje sulfanilamid in naftiletilendiamin dokaži pojavljanje nitrita oz. neporabljeni nitrat (po predhodni redukciji nitrata v nitrit s Zn v prahu). V penicilinke in erlenmajerice dodaj kapljico reagenta. Rdeča obarvanost dokazuje prisotnost nitrita. V primerih, ko nitrit ni prisoten, preveri še prisotnost nitrata. Pozitivni primeri so epruvete, ki vsebujejo nitrit in epruvete, v katerih ni niti nitrita niti nitrata. Slika 9: Grafično prikažite vpliv prisotnosti / odsotnosti kisika na proces denitrifikacije.


55

VAJA 20: Ugotavljanje kapacitete vzorca za denitrifikacijo z merjenjem N2O Metoda temelji na merjenju produkcije N2O v vzorcih, ki so inkubirani ob acetilenu. Acetilen blokira denitrifikacijo na stopnji N2O. Eksperiment izvedemo v treh ponovitvah. Variante: A. V infuzijsko steklenico (130 ml) zatehtaj 30 g zračno suhih tal, dodaj 15 mL dH2O in

plinotesno zapri z gumijastim zamaškom in Al pokrovčkom. Zamenjaj 10 % zračne faze z acetilenom in inkubiraj pri 28 oC.

B. V infuzijsko steklenico (130 ml) zatehtaj 30 g zračno suhih tal, dodaj 15 mL dH2O in

plinotesno zapri z gumijastim zamaškom in Al pokrovčkom. Atmosfero v steklenici najprej zamenjaj s He ali N2. Ko si atmosfero zamenjal s He ali N2 s siringo odvzemi 10 % (v/v) plinske faze in vzorcu dodaj enak volumen acetilena. Vzorec inkubiraj v temi pri 28 oC.

C. Vzorec zračno suhih tal (30 g) prenesi v infuzijsko steklenico (130 ml), obogati s 100 µg

nitratnega-N/g zračno suhih tal - dodaj 5 ml raztopine KNO3 (433 mg KNO3/100 ml) in navlaži še s 10 ml destilirane vode. Atmosfero v steklenici najprej zamenjaj s He ali N2. Ko si atmosfera zamenjal s He ali N2 s siringo odvzami 10 % (v/v) plinske faze in vzorcu dodaj enak volumen acetilena. Vzorec inkubiraj v temi pri 28 oC.

D. Vzorec zračno suhih tal (30 g) prenesi v infuzijsko steklenico (130 ml), obogati z virom

ogljika (180 µg glukoznega-C/g zračno suhih tal) - dodaj 5 ml raztopine glukoze (270 mg glukoze/100ml) in dodatno navlaži s 10 ml destilirane vode. Atmosfero v steklenici najprej zamenjaj s He ali N2. Ko si atmosfero zamenjal s He ali N2 s siringo odvzami 10 % (v/v) plinske faze in vzorcu dodaj enak volumen acetilena. Vzorec inkubiraj v temi pri 28 oC.

E. Vzorec zračno suhih tal (30 g) zatehtaj v infuzijsko steklenico (130 ml), obogati s 100 µg

nitratnega-N/g - dodaj 5 ml raztopine KNO3 (433 mg KNO3/100 ml) in z virom ogljika (180 µg glukoznega-C/g zračno suhih tal) - dodaj 5 ml raztopine glukoze (270 mg glukoze/100ml) in dodatno navlaži z 5 ml destilirane vode. Atmosfero v steklenici najprej zamenjaj s He ali N2. Ko si atmosfero zamenjal s He ali N2 s siringo odvzemi 10 % (v/v) plinske faze in vzorcu dodaj enak volumen acetilena. Vzorec inkubiraj 14 dni v temi pri 28 oC.

Po končani inkubaciji odvzemi iz vsake variante 0,5 ml vzorca plinske faze z injekcijsko brizgo in ga analiziraj na vsebnost N2O s plinskim kromatografom. Konfiguracija kromatografa: kolona - Porapak Q (1.8 m x 1/8 inče), detektor - TCD, nosilni plin He (20 ml/min); temperatura: injektor 80 oC, kolona 50 oC in detektor 80 oC. Umeritev aparata opravimo z znanimi koncentaracijami N2O v He (1 %, 5 %, 10 %). Volumen plinske faze v penicilinkah določi po končani inkubaciji. Penicilinke napolni z vodo in s tehtanjem ugotovi volumen porabljene vode (1 g vode = 1 ml vode = 1 ml plinske faze). Iz rezultatov meritev produkcije N2O izračunaj kapacitete za denitrifikacijo (µg N2O-N / g vzorca) in hitrost denitrifikacije vzorca (µg N2O-N / g h) pri posameznih variantah. Primerjaj variante in ugotovi vplive posameznih faktorjev.


56

Preglednica 30: Število denitrifikatorjev in anaerobnih bakterij na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij.

Število mikrobov (Metoda MPN)

denitrifikatorji Anaerobi obdelovana tla

travniška tla

morski sediment

rečni sediment

rečna voda

ustekleničena voda

Preglednica 31: Denitrifikacijski potencial merjen z N2O. Variante (% N2O) Produkcija (% N2O / dan) A B C D E

Slika 10: Grafično prikažite dobljene rezultate denitrifikacijskega potenciala tal.


57

5 IZBRANA POGLAVJA V MIKROBNI EKOLOGIJI 5.1 POMNOŽEVANJE OKOLJSKIH VZORCEV DNA Z VERIŽNO REAKCIJO S POLIMERAZO (PCR) � Podrobno obnovi svoje poznavanje delovanja PCR ! � Katere inhibitorne snovi so lahko prisotne v vzorcih DNA iz okolja? (Poiščite literaturo na to temo). VAJA 21: Raztapljanje in priprava začetnih oligonukleotidov Prejeli smo vsebino dveh sintetiziranih začetnih oligonukleotidov. Na oznakah piše: Prvi začetni oligonukleotid: 5’- CAG GAA ACA GCT ATG ACC - 3’

količina koncentracija (v 1 mL) 11 pmol / µL dolžina (bp) 18

2,3 OD volumen za 100 pmol/µL 109 uL % GC 50

60 µg molekulska masa 5502 g/mol

10,9 nmol Tm (şC) 53,7

Drugi začetni oligonukleotid: 5’ – TGT AAA ACG ACG GCC AGT – 3’

količina koncentracija (v 1 mL) 21 pmol / µL dolžina (bp) 18

4,3 OD volumen za 100 pmol/uL 206 µL % GC 50

114 µg molekulska masa 5533 g/mol

20,6 nmol Tm (şC) 53,7

V kakšnih volumnih boš raztopil vsebino epic, če so končne željene koncentracije raztopljenih začetnih oligonukleotidov naslednje: Preglednica 32: Raztapljanje začetnih oligonukleotidov do različnih končnih koncentracij

končna koncentracija dodani volumen MQ

100 pmol / µL

66 pmol / µL

50 pmol / µL

30 pmol / µL

20 pmol / µL

15 pmol / µL

10 pmol / µL


58

VAJA 22: Temperatura taljenja začetnih oligonukleotidov Izračunaj temperaturo taljenja (Tm) obeh zgoraj navedenih ter dveh poljubno sestavljenih začetnih oligonukleotidov na dva načina. Uporabi spodnji formuli: Formula 1: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Formula 2: Tm = 81,5 + 16,6 log [K+] + 0,41 (% GC) – 675 / N kjer K+ predstavlja koncentracijo monovalentnih kationov in N predstavlja dolžino začetnega oligonukleotida. Za K+ uporabi vrednosti 1 M, 500 mM, 200 mM, 100 mM, 50 mM. Rezultate za oba zgoraj navedena ter dva poljubno sestavljena oligonukleotida vpiši v spodnjo tabelo ter jih prikaži grafično. Preglednica 33: Odvisnost Tm od koncentracije monovalentnih kationov.

K+ Tm Tm Tm Tm

1 M

500 mM

200 mM

100 mM

50 mM

Slika 11: Odvisnost temperature taljenja oligonukleotidov od koncentracije monovalentnih kationov


59

� Razmisli, kje je razlog za razlike v izračunanih Tm. � Razmisli zakaj se v mikrobni ekologiji pogosto uporabljajo degenerirani začetni oligonukleotidi. VAJA 23: Izračun sestave PCR Osnovni reagenti PCR: Sestavina Začetne koncentracije Končne koncentracije MgCl2 25 mM 1,5-3,5 mM dNTP 10 mM 0,2 mM – 4mM začetni oligonukleotid 1 100 µM 0,5-10 µM začetni oligonukleotid 2 100 µM 0,5-10 µM pufer 10x 1 x miliQ polimeraza Taq 10 U / µL 0,2-4 U DNA 100 ng / µL 0,1 –500 ng Volumske variante: 25 µL 50 µL 100 µL Najpogosteje uporabljani ojačevalci PCR Ojačevalec: Končne koncentracije v PCR: BSA 100-1000 ng/ µL Dimetil sulfoksid (DMSO) 0,1-5 % Tween 20 0,1-3 % Triton X-100 0,01-1 % gen 32 bakteriofaga T4 5 µg / mL – 30 µg/mL gelatin 0,01-1 % polietilen glikol (PEG) 1-15 % glicerol 5-20 % MgCl2 1,5-4,5 mM Temperatura prileganja 40-70 ˚C Čas prileganja 15-120 sek Izračunaj pet različnih mešanic PCR z dodatki po lastni izbiri (koncentracije sestavin in dodatkov, volumen PCR).


60

Preglednica 34: Sestave različnih PCR

sestavine

skupni volumen

PCR začetna

koncentracija

končna koncentracija

v PCR

volumen dodan v PCR 1





VAJA 24. Ločevanje DNA na agaroznih gelih Za določanje velikosti fragmentov izolirane DNA in uspešnosti PCR uporabljamo gelsko elektroforezo. Fragmente velikosti 200 bp – 4 kb najpogosteje ločujemo na 1,5 % agaroznih gelih v pufru TBE (10x TBE: 890 mM Tris, 890 mM borova kislina, 20 mM EDTA). Kako boste pripravili 10x TBE iz osnovnih sestavin? Kako boste pripravili 1x TBE?


61

5.2 ADSORPCIJA MIKROORGANIZMOV NA TRDNO PODLAGO Na večino površin, ki so potopljene v vodi za več kot 1 uro se adsorbirajo mikroorganizmi. Združbo pritrjenih mikroorganizmov sestavljajo avtotrofi in heterotrofi. V novejši literaturi se za združbe mikroorganizmov, ki so adsorbirani na površino uveljavlja izraz biofilmi. Mikroorganizmi se lahko pritrdijo na različne podlage: kamen (epilition), les (epiksilon), zelene rastline (epifiton), sediment (epipelon), površine medicinskih implantov, stene črevesja, zobno sklenino, interfazo med tekočino in zrakom. Poleg fizikalno-kemijskih parametrov površine in mikroorganizma so pomembne tudi genetske adaptacije mikroorganizmov za življenje na površini. � Delež atomov, molekul in koloidov (mikrob lahko smatramo kot živ koloidni delec), ki se adsorbira na trdno površino je proporcionalen deležu delcev v raztopini. Ali poznaš matematično zvezo? Biofilme proučujemo z različnimi tehnikami: molekularno filogenetske tehnike, mikroelektrode, konfokalna laserska mikroskopija, sipanje X žarkov, vrstična elektronska mikroskopija, transmisijska elektronska mikroskopija, elektroforezna mobilnost, masna spektrometrija, uporaba radioaktivno označenih mikroorganizmov. � Ali poznaš fizikalni princip omenjenih tehnik? Na adsorpcijo mikroorganizmov vpliva: hrapavost substrata, hidrodinamika, kemijska sestava substratna, ionska jakost raztopine, mobilnost mikrobov, površinska napetost, hidrofobnost, prosta površinska energija. � Obnovi znanje o spremembi proste energije površine pri adsorpciji koloidov na površino. Adsorpcija mikroorganizma na površino največkrat predstavlja selekcijsko prednost. Po drugi strani, pa lahko povzroča tudi veliko gospodarsko škodo, saj mikrobne aktivnosti na površini praviloma zmanjšujejo življensko dobo materialov kot so les, kovine, guma, nekateri plastični materiali in izolacijski materiali. Gospodarsko škodljiva aktivnost adsorbiranih mikroorganizmov je zlasti problematična na površinah, ki so v stalnem stiku z vodo, oziroma v prostorih z visoko relativno vlažnostjo. Pri teh površinah prihaja do korozije, trohnobe, povečane hidrodinamične upornosti in splošnnega zmanjševanja uporabnosti materialov. V glavnem se za preprečevanje škode zaradi aktivnosti mikroorganizmov adsorbiranih na površini uporabljajo premazi in barve, ki vsebujejo toksične materiale, kot so Hg, Pb, Cr, Cd, V, Sb, Sn, Mo in Cu. Glavna pomankljivost takšnih pristopov je v tem, da prihaja do počasnega izpiranja težkih kovin v okolje, kar povzroča naravovarstvene probleme. Poleg tega se uporabljajo različna oksidativna sredstva (npr. klor, brom, ozon), ki oksidirajo ekstracelularne polimere. Alternativen pristop je uporaba različnih repelentov, ki v prvi vrsti preprečujejo kolonizacijo mikroorganizmov na površino materialov (npr. akril amidi, tanini, benzoati). Adsorpcijo mikroorganizmov na trdno podalgo lahko koristno izrabimo pri čiščenju odpadnih vod, npr. uporaba biodiskov.


62

VAJA 25: Adsorpcija mikrobov na minerale glin V tri 250 ml erlenmajerice zatehtaj v vsako po 3 g vermikulita ali bentonita in dodaj 50 ml fiziološke raztopine, ter avtoklaviraj na 121 oC za 30 min. Po končanem avtoklaviranju dodaj 10 ml čiste kulture (ki jo imaš na razpolago). Po eni minuti, 30 min in 60 min inkubacije stresaj vsako erlenmajerico posebaj 5 min na orbitalnem stresalniku. Po končanem stresanju odpipetiraj 1 ml supernatanta, pripravi razredčitve supernatanta in po 0.1 ml ustrezne razredčitve nacepi na trdno PKE gojišče. Za ovrednotenje začetnega stanja nacepi na gojišče tudi ustrezne razredčitve inokuluma. Plošče inkubiraj na 28 oC do pojava kolonij. Preštej kolonije in grafično prikaži zmanjšanje števila bakterij v raztopini. Iz grafa izračunaj hitrost adsorpcije bakterij na vermikuli ali bentonitt. Preglednica 35: Število kolonij v raztopini po adsorpciji na vermikulit.

čas (minute) Število mikrobov (CFU) 0 1 30 60

VAJA 26: Opazovanje adsorpcije mikroorganizmov na steklo Mikroskopsko preglej stekelca, ki so bila izpostavljena rečnemu toku za 1 oziroma 2 ure. Rezultate primerjaj s čistim mikroskopskim stekelcem. Pred opazovanjem preparat pazljivo speri pod tekočo vodo, tako da odstraniš večje delce, ki so se adsorbirali na steklo. Stekelce previdno popivnaj s staničevino, da odstraniš neadsorbirane mikroorganizme. V kolikor je ločljivost slaba preparate obarvaj z metilenskim modrim tako, da preparat posušiš na sobni temperaturi in ga fiksiraš nad plamenom gorilnika. Fiksiran preparat prelij z raztopino metilensko modrega barvila za pet minut. Višek barvila speri pod curkom tekoče vode. Posuši s staničevino in preparat opazuj pod mikroskopom s pomočjo imerzijskega olja. Skiciraj mikroorganizme, ki si jih opazil.


63

5.3 MATEMATIČNI MODELI V MIKROBNI EKOLOGIJI Kot pri vsaki znanstveni disciplini tudi v ekologiji matematiko uporabljamo za opis procesov, napoved odziva sistema in boljše razumevanje delovanja sistema. 5.3.1 Matematični opis homogenih sistemov Pri homogenih sistemih nas zanima kako se masna bilanca sistema spreminja po času. Ločimo termodinamsko zaprte in odprte homogene sisteme. 5.3.1.1 Termodinamsko zaprti sistemi (batch sistemi) Pri teh sistemih ne prihaja do izmenjave snovi in energije med okoljem in sistemom. V večini primerov gre za močno poenostavljene modele, ki nimajo velike napovedne moči. Takšne modele je relativno enostavno razširiti na bolj uporabne modele za odprte sisteme. Najbolj enostavna enečba za rast mikrobne populacije je

Xdt

dXµ=

kjer je µ specifična hitrost rasti mikrobne populacije s koncentracijo X. Tako zapisana enečba izključuje vsakršne interakcije z abiotično in biotično komponento okolja. � Pri tem modelnem sistemu smo predpostavili, da je specifična hitrost rasti mikrobne populacije konstantna. Ali ta predpostavka drži? 5.3.1.2 Termodinamsko odprti sistemi (kemostat) Pri teh sistemih prihaja do izmenjave snovi in energije med sistemom in okolico. Največkrat se pri takšnih sistemih v prvem približku upošteva pretok snovi manj pa pretok energije. Izjemo predstavljajo veliki biotehnološki reaktorji, kjer je produkcija toplote lahko zelo velika. Za primer, ko ni vnosa biomase v sistem in ni propada biomase v sistemu lahko zapišemo

XV

fX

dt

dX−=µ

kjer je f pretok snovi skozi sistem, V pa volumen sistema. V kolikor imamo kemostat je hitrost razredčevanja D = f/V.


64

5.3.2 Matematični opis heterogenih sistemov Pri heterogenih sistemih se gostota populacije spreminja glede na čas in razdaljo od izbrane referenčne točke. Heterogeni sistemi so najbolj pogosti sistemi v naravi. Npr. adsorpcija mikroorganizmov na trdno podlago. Populacija mikroorganizmov v takih sistemih je največkrat odvisna od koncentracije omejujočega hranila, S, ki je v sistemu porabljen za rast mikroorganizmov. Zaradi tega se ustvari gradient omejujočega dejavnika v naravnem sistemu. Koncentracija omejujočega hranila v naravnem okolju je podana s pomočjo prvega in drugega Fickovega zakona in je odvisna od aktivnosti mikroorganizmov

z

Sq

z

SD

t

S

∂

∂−

∂

∂=

∂

∂2

2

kjer je z linearni gradient vzolž z osi, D disperzijski koeficient, q povprečni pretok tekočine, q pa je specifična hitrost rasti mikrobne populacije. Omenjena enčba je za razliko od prejšnjih parcialna diferencialna enačba (odvisna je od dveh spremenljivk z in t). Reševanje parcialnih diferencialnih enačb je matematično zahtevno. 5.3.3 Matematični opis mikrobne rastne kinetike 5.3.3.1 Mikrobna rastna kinetika brez interakcije med mikrobi Največkrat sistem poenostavimo do stopnje, ko je rast mikroba odvisna samo od količine substrata, ki ga ima mikroorganizem na voljo (Monojeva kinetika).

SK

S

+=

maxµµ

kjer je µ hitrost rasti, S je količina substrata in K je koncentracija substrata, ko je µ = ˝ µmax. 5.3.3.2 Mikrobna kinetika v prisotnosti interakcij med mikrobi Za n vrst v ekosistemu je splošna enačba za interakcije med mikrobi

∑=

+=n

j

XXiXdt

dXjijii

i

1

βα

kjer sta α in β konstanti. V primeru interakcije med dvema vrstama lahko zapišemo

dX1/dt = α1X1 + β12X1X2 + β11X12

dX2/dt = α2X2 + β21X1X2 + β22X2

2


65

Predznak pred koeficientom je odvisen od vrste interakcije med mikrobi. � Razmisli, kakšni so predznaki pred koeficienti, če gre za logistično vrsto rasti, predatorstvo, komenzualizem in amenzalizem, kompeticijo, neutralizem. Če takšne enačbe lineariziramo v bližini ravnotežja ali stacionarnega stanja potem dobimo

Xdt

dX⋅=A

kjer je A matrika stabilnosti sistema. Minimalni pogoj za stabilnost takšnega sistema je, da so vse lastne vrednosti matirčnega sistema negativne. Poleg tega morajo biti tudi vsi diagonalni elementi stabilnostne matrike negativni. Nediagonalni elementi stabilnostne matrike predstavljajo interakcije med mikrobi. 5.3.4 Najbolj pogosti matematični modeli v mikrobni ekologiji: - model neomejene rasti v zaprtem sistemu - model rasti v odvisnosti od gostote populacije v zaprtem sistemu - model Lotka-Volterra v zaprtem sistemu - model kompeticije v odprtem sistemu - model neutralizma v odprtem sistemu - model kompeticije v odprtem sistemu - model predacije v odprtem sistemu - model komenzualizma v odprtem sistemu - model porabe substrata v heterogenem odprtem sistemu � Ali znaš matematično opisati omenjene modele? 5.3.5 Matematična analiza modelov: 5.3.5.1 Analitične metode. Analitične metode pri analizi modelov uporabljamo povsod tam, kjer je možno linearne diferencialne enačbe analitično rešiti. Za reševanje diferencialnih enačb uporabljamo standardne rešitve integralov v matematičnih priročnikih, npr. Bronstein-Mendelejev. 5.3.5.2 Analiza stacionarnih stanj sistema. To metodo uporabimo v primeru, ko imamo sistem nelinearnih diferencialnih enačb ki jih ne moremo rešiti analitično. Večina enačb, ki opisujejo dogajanje v naravnih sistemih je nelinearnih. Najbolj enostavna metoda v tem primeru je metoda stacionarnega stanja. Ta metoda je uporabna samo za termodinamsko odprte sisteme. Stacionarno stanje sistema definiramo kot stanje sistema, ko se odvisna spremenljivka ne spreminja po času, npr. dX/dt = 0.


66

5.3.5.3 Numerične aproksimacije. Ta način uporabimo v primeru, ko analitična rešitev enačb ni poznana. Pri tem uporabljamo različne aritmetične operacije za numerične aproksimacije diferencialnih enačb. Na tržišču obstajajo različni računalniški programski paketi za numerično aproksimacijo rešitev. Težava pri numeričnih aproksimacijah je ta, da moramo poznati vrednosti za vse koeficiente, ki nastopajo v diferencialnih enačbah. Pri večini nelineranih sistemov enačb je numerična aproksimacija kritično odvisna od začetne vrednosti koeficientov. Že relativno majhna sprememba vrednosti koeficientov lahko povzroči kvalitativno različno obnašanje sistema, npr. osciliranje sistema. Žal, koeficienti običajno niso poznani in zaradi tega je potrebno numerične rešitve optimizirati. Optimizacijo predstavljajo vsi postopki, ki numerično rešitev čim bolj približajo teoretskemu modelu. Največkrat postopamo tako, da s poizkušanjem ugotovimo kateri od koeficientov je najbolj občutljiv za numerično rešitev sistema in ga poizkušamo minimizirati (opazujemo spreminaje χ2 statistike; težimo za čim nižjo vrednostjo χ2). Ko smo minimizirali en parameter naredimo isto z ostalimi, dokler ne pridemo do globalnega minimuma oziroma stabilnega stacionarnega stanja sistema. 5.3.5.4 Analiza stabilnosti sistema. Ko smo sitem diferencialnih enač uspeli rešiti analitično ali numerično je potrebno ugotoviti, kako stabilna je rešitev. Analiza stabilnosti sistema opiše obnašanje sistema v bližini ravnotežja, oziroma stacionarnega stanja. Nekateri sistemi imajo lahko več stacionarnih stanj. Bistvo analize je linearizacija diferencialnih enačb v bližini stacionarnih stanj sistema. Linearne diferencialne enačbe lahko analitično rešimo. Takšna analiza nam pove ali je opazovani sistem po povzročenem odmiku od ravnovesnega stanja stabilen in se bo vrnil s karakterističnim časo t v stacionarno stanje ali pa je sistem nestabilen in se po odmiku iz stacionarnega stanja začne obnašati kaotično ali pa celo katastrofično. VAJA 27: Primer simuliranja eksperimentalnih podatkov z ustreznim matematičnim modelom s pomočjo programa Microsof Excel 5.0 Eksperimentalno smo ugotovili, da število mikroorganizmov v raztopini upada po dodatku v raztopino z minerali glin. Zanima nas ali lahko popišemo kinetiko upada s pomočjo matematičnih modelov za kemijsko kinetiko 0, 1 ali 2 reda.

Preglednica 36: Eksperimentalni podatki za fiksacijo Alcaligenes spp. na vermikulit.

Čas (min) CFU/ml x 106 0 4.0 � 0.3 10 2.8 � 0.4 30 1.1 � 1.3 60 0.4 � 0.4 120 0.2 � 0.2


67

Navodila za preverjanje kinetike adsorpcije mikroorganizmov na vermikulit:

1. Odpri Excel 5.0 ali novejše verzije.

2. V kolono A in B vnesi eksperimentalne podatke. Začni v celici A19, kjer vpišeš Čas. V celico B19 vpiši CFU x 106. Nato v celic0 A20 in B20 vnesi eksperimentalne podatke. V kolono B ne vnašaj potenc in standardne deviacije!

3. V koloni C vpiši v celici C18 in C19 Kinetika reda 0. Nato v celico C20 vnesi formulo za kinetiko reda 0. Ko si vnesel formulo kopiraj formulo v celice C21:C24. V celico K1 vpiši Parametri z mastnim tiskom. V celico K2 vpiši Kinetika reda 0. V celico K3 vpiši kz= ter nato v celico L3 vnesi konstanto za kinetiko reda 0, z vrednostjo 0.03. V Celico K4 vpiši Cz= in v celico L4 vpiši 5.0. V celico K5 vpiši SSRz=.

4. V koloni D vpiši v celici D18 in D19 Kinetika reda 1. Nato v celico D20 vnesi formulo za kinetiko reda 1. Ko si vnesel formulo kopiraj formulo v celice D21:D24. V celico K8 vpiši Kinetika reda 1. V celico K9 vpiši kf = ter nato v celico L9 vnesi konstanto za kinetiko reda 1 z vrednostjo 0.02. V Celico K10 vpiši Cf= in v celico L10 vpiši 5.0. V celico K11 vpiši SSRf=.

5. V kolono E vpiši v celici E18 in E19 Kinetika reda 2. Nato v celico E20 vnesi formulo za kinetiko reda 2. Ko si vnesel formulo kopiraj formulo v celice E21:E24. V celico K13 vpiši Kinetika reda 2. V celico K14 vpiši ks= ter nato v celico L14 vnesi konstanto za kinetiko reda 2, z vrednostjo 0.01. V Celico K15 vpiši Cf= in v celico L15 vpiši 5.0. V celico K16 vpiši SSRs =.

6. V kolono F vpiši v celico F19 SSRz. Nato v celico F20 vnesi naslednjo formulo =(C20-B20)^2 in jo kopiraj v celice F21:F24.

7. V kolonoG vpiši v celico G19 SSRf. Nato v celico G20 vnesi naslednjo formulo =(D20-B20)^2 in jo kopiraj v celice G21:G24.

8. V kolono H vpiši v celico H19 SSRs. Nato v celico H20 vnesi naslednjo formulo =(E20-B20)^2 in jo kopiraj v celice H21:H24.

9. V celio E26 vpiši Vsota kvadratov razlik in nato v celico F26 vnesi formulo =SUM(F20:F24). Enako naredi vsote še za G in H kolono.

10. V celice L5, L11 in L16 vnesi naslednje formule =F26, =G26 in =H26. Tabelo s parametri za ugotavljanje kinetike uokviri.

11. Izdelaj graf odvisnosti adsorpcije mikroorganizmov glede na čas inkubacije in ga postavi v celice A2:F15. Bodi pozoren na enote, legendo naslov!

12. V izdelan graf vstavi še podatke za teoretične vrednosti pri kinetiki reda 0, 1 in 2 in jih poveži s črtami različnih barv.

13. Spreminjaj podatek v celici L3 ter opazuj spremembe. Poizkušaj se čim bolj približati eksperimentalnim podatkom. Ko si dobil krivuljo, ki se najbolje prilega podatkom poizkusi še s spreminjanjem celice L4. Kvaliteta fita je podana s SSRz (vsoto kvadratov razlik), ki mora biti čim manjša.

14. Ko si dobil najboljše prileganje za kinetiko reda 0, poizkušaj na enak način dobiti še najboljši fit za kinetiko reda 1 in kinetiko reda 2.


68

15. Ročno prilagajanje podatkom lahko v Ecelu zamenjamo z avtomatskim programom Excel Solver. Excel Solver je matematično orodje v Excelu, ki poizkuša zmanjšati razliko kvadratov na minimum. Pri tem spreminja vrednosti Cz in kz. Postopek je iterativen. Pri vsakem koraku Excel Solver izračuna nove vrednosti za matematično funkcijo in primerja razliko kvadratov s prejšnjo vrednostjo. Postopek se ponavlja dokler Excel Solver ne doseže minimuma. Da narediš opisano izberi v Tools oknu Solver. Označi Target Cell in nato klikni na celico v Excel dokumentu, ki jo želiš minimizirati (npr. celica L5). Označi By Changing Cells in vnesi parametre, ki jih želiš spreminjati (npr. kz in Cz v celicah L3 in L4. Izberi gumb min. Klikni na Options in izberi Show Iteration Results, kar ti omogoča, da slediš poteku simulacije. Odkljukaj Quadric Estimates, Forward Derivatives, Newton Search in klikni OK. Nazadnje klikni Solve, da začneš simulacijo. Excel se običasno ustavi med simulacijo ter grafično prikaže dobljeno rešitev. V kolikor nisi zadovoljen z rešitvijo pritisni Continue, dokler ni dosežen minimum.

16. Na eneak način ponovi korak 15 za kinetiko prvega in drugega reda.

17. Ugotovi katera kinetika najbolje popiše eksperimenalne podatke.

18. Označi celotno Excelovo stran in jo kopiraj na nov prazen list.

19. Med koloni B in C dodaj novo kolono z ukazom Insert/Column.

20. V celici C18 in C19 vpiši Standardna deviacija in nato v celice C20:C24 vpiši ustrezne vrednosti za standardno deviacijo.

21. Exsperimentalnim podatkom dodaj grafične vrednosti za napako. Klikni na eksperimentalno točko v grafu, ko so eksperimentalne točke označene odpri pogovorno okno Format/Selected Data Series/Y Error Bars. Označi Custom in nato za + in – napako označi vrednosti za standardno napako. Klikni OK.

22. Prilagodi formule v celicah G20, H20 in I20, tako da upoštevaš uteži na podatkih, kar narediš tako da formule deliš s (standardno deviacijo)2. Na ta način si zmanjšal pomen tistih podatkov, ki imajo veliko standardno deviacijo (veliko eksperimentalno napako).

23. Poišči najboljšo rešitev s funkcijo Solver.

24. Povečaj vrednost za eksperimentalni podatek z največjo standardno deviacijo za 2x in poišči optimalno rešitev.

25. Povečaj vrednost za eksperimentalni podatek z najmanjšo standardno deviacijo za 2x in poišči optimalno rešitev.

26. Ugotovi kako eksperimentalna napaka vpliva na izid fitanja.

27. Poišči konstante adsorpcije, začetne vrednosti in ustrezen model za opis kinetike vezave mikroorganizmov na minerale vermikulita za mikroorganizme, ki si jih preizkušal na vajah.


69

6 PRILOGE:

Raztopina mikroelementov (pH 7):

nitrilo triocetna kislina 1,5 g

MgSO4 · 7H2O 3 g

MnSO4 · 2H2O 0,5 g

NaCl 1 g

FeSO4 · 7H2O 0,1 g

CoSO4 · 7H2O 0,18 g

CaCl2· 2H2O 0,1 g

ZnSO4 · 7H2O 0,18 g

CuSO4 · 5H2O 0,01 g

KAl(SO4)2 · 12H2O 0,02 g

H3BO3 0,01 g

Na2MoO4 · 2H2O 0,01 g

NiCl2· 6H2O 0,025 g

Na2SeO4 · 5H2O 0,3 g

deionizirana voda 1000 mL

Uporaba: 1 mL / 1000 mL gojišča

Mc Crady-jeva preglednica za 3 replikacije v MPN

Karakter. št. Karakter. št. Karakter. št.

št. mikrob. št. mikrob. št. mikrob.

000 0.0 201 1.4 302 6.5

001 0.3 202 2.0 310 4.5

010 0.3 210 1.5 311 7.5

011 0.6 211 2.0 312 11.5

020 0.6 212 3.0 313 16.0

100 0.4 220 2.0 320 9.5

101 0.7 221 3.0 321 15.0

102 1.1 222 3.5 322 20.0

110 0.7 223 4.0 323 30.0

111 1.1 230 3.0 330 25.0

120 1.1 231 3.5 331 45.0

121 1.5 232 4.0 332 110.0

130 1.6 300 2.5 333 140.0

200 0.9 301 4.0


70

Preglednica BAM-MPN z makroji za kompleksne replikacije in redčitvena razmerja MPN.


71

Preglednica računala za določanje velikosti inokuluma za trdne vzorce (tla, sediment) pri izračunu MPN za BAM-MPN.


72

Preglednica računala za določanje velikosti inokuluma za tekoče vzorce (tla, sediment) pri izračunu MPN za BAM-MPN.


73

7 LITERATURA Alexander M. 1977. Introduction to soil microbiology. New York, John Wiley & Sons: 455 str. Atlas R.M. , Bartha R. 1998. Microbial ecology: Fundamentals and applications. 4th ed. Menlo

Park, Benjamin-Cumming Science Publishing: 694 str. Atlas R.M. 2005. Handbook of media for environmental microbiology. 2nd ed. Broken Sound

Parkway, CRC Press: 673 str. Bazin M., Menell A. 1990. Mathematical methods in microbial ecology. V: Methods in

microbiology. Grigorova R., Norris J.R. (eds.). London, Academic Press. 22: 125-179. Burlage R.S., Atlas R., Stahl D., Geesey G., Sayler G. 1998. Techniques in microbial ecology.

Oxford, Oxford University Press: 468 str. Cappuccino J.G., Sherman N. 1996. Microbiology: A laboratory manual. 4th ed. Menlo Park, The

Benjamin-Cummings Publishing Company: 477 str. Davis R.H. 2003. The microbial models of molecular biology: From genes to genomes

New York, Oxford University Press: 353 str. Franklin R.B., Mills A.L. 2007. The spatial distribution of microbes in the environment.

Dordrecht, Springer: 339 str. Gerhard P., Murray R.G.E., Wood W.A., Krieg N.R. 1994. Methods for general and molecular

bacteriology. Washington, ASM Press: 791 str. Hurst C.J., Knudsen G.R., McInerney M.J., Stetzenbach L.D., Walter M.V. 1997. Manual of

environmental microbiology. Washington, ASM Press: 894 str. Kassem A., Nannipieri P. 1995. Methods in applied soil microbiology and biochemistry. London,

Academic Press: 576 str. Lawrence J.R., Korber, D.R., Wolfaardt, G.M., Caldwell, D. E. 1995. Behavioral strategies of

surface-colonizing bacteria. Advances in microbial ecology, 14:1-59 Levin P. 2006. Mikrobna aktivnost in struktura denitrifikatorjev v tleh Ljubljanskega barja.

Diplomsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije: 63 str.

Nannipieri P., Smalla K. 2006. Nucleic acids and proteins in soil. Berlin, Springer –Verlag: 468

str. Paul E.A. 2007. Soil microbiology, ecology, and biochemistry. 3d ed. Oxford, Academic Press:

535 str.


74

Paulson D. S. 2008. Biostatistics and microbiology: A survival manual. New York, Springer-

Verlag: 216 str. Phillips J.A., Brock T.D. 1991. Laboratory manual. 6th ed. New Jersey, Prentice Hall: 234 str. Repič D. 2008. Aktivnost in številčnost mikrobne združbe v različnih globinah barjanskih tal.

Diplomsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije: 58 str.

Smith M.J. 1975. Models in ecology. London, Cambridge University Press: 401 str. Varma A., Oelmüller, R. 2007. Advanced techniques in soil microbiology. Berlin, Springer-

Verlag: 427 str. Zajec N. 2004. Vpliv okoljskih dejavnikov na aktivnost in pestrost mikrobne združbe v

Barjanskih tleh. Diplomsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije:47 str.

Documents

PRAKTIKUM IZ MIKROBNE EKOLOGIJE - bf.uni-lj.si · Stopar, D., Stres, B. , Mahne I. Praktikum iz mikrobne ekologije za študente mikrobiologije. Univerza v Ljubljani, Biotehniška