INSTITUTO POLITCNICO NACIONALEscuela Nacional de Ciencias BiolgicasCARACTERIZACIN FENOTPICA Y FSICA DE ADN RECOMBINANTEGonzlez Judd Pablo MiguelHernndez Acatitla Edwin ArturoGrupo: 5QV1 Seccin: 1Equipo: 5

Objetivos: Obtener ADN de doble cadena de cualquiera de los plsmidos pUC19, pBS o pCR2.1TOPO (recombinantes y no recombinantes). Obtener clulas competentes de Escherichia coli y transformarlas. Diferenciar un vector recombinante de uno no recombinante por pruebas fenotpicas y por pruebas de restriccin.

Materiales y mtodos:Confrntese el manual de laboratorio EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA, para revisar el protocolo seguido en la realizacin de la prctica, el cual se sigui como se cita (cfr. Referencias bibliogrficas) excepcin hecha de la obtencin de clulas competentes, que por motivos de tiempo, fue realizada por los profesores del laboratorio de gentica microbiana, quienes, cabe sealarse proporcionaron tambin todos los cultivos y soluciones con las que se trabaj.El ADN plasmdico recombinante aislado, fue del plsmido pCR2.1TOPO y el no recombinante del plsmido pCR2.1TOPO-ape.

Resultados:Habiendo realizado la extraccin de ambos plsmidos; recombinante y no recombinante, individualmente, a partir de clulas de Escherichia coli DH10 por el mtodo de la lisis alcalina, segn el protocolo indicado, el ADN obtenido se utiliz para la transformacin de E. coli. y para el anlisis por restriccin del mismo, obtenindose los resultados expuestos a continuacin:Cuadro n 1: Efecto de la transformacin de clulas de E. coli DH10 con plsmidos recombinantes y no recombinantes sobre el desarrollo y el fenotipo del cultivo.MedioCepa sembradacrecimientoColor de las colonias*

Luria DH10 competentes++++Blancas

L-APDH10 competentes+Blancas

L-APDH10+pCR2.1-TOPO++Azules

L-APDH10+pCR2.1-TOPO+++Azules

L-APDH10+pCR2.1-TOPO-ape+Blancas

L-APDH10+pCR2.1-TOPO -ape++Blancas

Tras la transformacin del cultivo con el ADN plasmdico, se adicion al cultivo bacteriano IPTG y X-gal, para evidenciar la naturaleza de las clulas transformadas, lo cual se puso de manifiesto cultivando stas, en placas con medio rico. *El color de las colonias se refiere al color, que en su caso se produjo por la reaccin cromognica entre en cultivo y el complejo IPTG/X-gal, en las colonias de un cultivo, esto referente a la mayora de las colonias, no a su totalidad.

Para el anlisis por restriccin, tras la digestin, con las enzimas de restriccin BamH1 Y EcoR1, se corri una electroforesis en gel de agarosa al 1%, en el que se corri simultneamente, a las muestras, un marcador de peso molecular (ADN del bacterifago , digerido con HindIII), cuya relacin, tamao-corrimiento en el gel, se muestra en el cuadro n 2 y que fue usado como marco de referencia para la determinacin del tamao de los fragmentos del ADN plasmdico tras la restriccin.

Cuadro n 2: Tamao y distancias recorridas por los fragmentos de restriccin (con Hind III) del bacterifago en electroforesis en gel de agarosa al 1%BandaTamao (pb)Log del tamaoDistancia (cm)

123,1304.364

29,4163.974.5

36,5573.815

44,3613.636

52,3223.367.2

62,0273.307.5

7564

8125

De acuerdo a la bibliografa, el ADN del bacterifago tratado con Hind III, exhibe 8 bandas, correspondientes a 8 fragmentos de ADN, de distintos tamaos, sin embargo, se detectaron en el anlisis por electroforesis, solo 6 de estos, cuyos resultados son los que se exponen.Respecto al anlisis propiamente, de los fragmentos obtenidos por restriccin de los plsmidos aislados, se muestran los resultados en el cuadro n 3, el gel resultante del anlisis por electroforesis, se ilustra, como tal, en la figura 1. Aunque cabe resaltarse, que el obtenido por nuestro equipo no pudo ser utilizado, por lo que se exponen resultados facilitados por el equipo 6 del mismo grupo de trabajo (el electroferograma obtenido por nuestro equipo, se adjunta en el anexo 1).

Cuadro n 3. Tamao y distancias recorridas por cada plsmido y sus respectivos fragmentos de restriccin (con EcoR1 y BamH1)ADN/TratamientoFragmentosDistancia (cm)Log del tamaoTamao del fragmento (pb)

pCR2.1-TOPO/BamH116.53.553548

pCR2.1-TOPO/Eco R116.53.553548

pCR2.1-TOPO163.634265

27.33.382398

pCR2.1-TOPO-ape/ BamH1163.634265

pCR2.1-TOPO-ape/ EcoR115.93.553548

pCR2.1-TOPO-ape14.14.31995

25.33.75011

36.63.53162

Figura n 1. Gel obtenido en el anlisis por electroforesis, de los plsmidos y los plsmidos tratados con enzimas de restriccin.El llenado de los pozos se hizo, en el orden siguiente: 1.pCR2.1Topo/BamH1 2.pCR2.1Topo/EcoR1 3.pCR2.1Topo. 4.Marcador de peso molecular 5.pCR2.1Topo-ape/BamH1 6.pCR2.1Topo-ape/EcoR1 7. pCR2.1Topo-ape. Para el revelado de trat el gel con bromuro de etidio, en el regulador de corrimiento, para luego exponerlo a luz ultravioleta.

El tamao de los fragmentos de restriccin obtenidos de cada plsmido se obtuvo por interpolacin sobre un grfico construido por correlacin Log. del tamao-Distancia recorrida en el gel con respecto a los fragmentos del bacterifago (cfr. Cuadro n 2), este constituye la figura n 2.

Figura n 2.Relacin tamao-corrimiento por cada plsmido y sus respectivos fragmentos de restriccin (con EcoR1 y BamH1), respecto al digerido de , con HindIII.

Discusin de resultados:Con los datos anteriores puede analizarse el trabajo realizado respecto al trabajo mismo, segn la concordancia de los datos obtenidos y con respecto a los objetivos, es decir respecto a la posibilidad de obtener ADN, de los plsmidos y a diferenciarlos fenotpica y fsicamente, como recombinante y como no recombinante, as como a la transformacin de E. coli, todas operaciones que se concretaron y que de una u otra forma podran hablar de una prctica exitosa.Sin embargo de manera particular conviene hacer algunas consideraciones, por ejemplo, respecto a la obtencin del ADN, donde la tcnica siempre que sea comprendida y por lo tanto aplicada al pie de la letra no presenta gran dificultad operativa, por lo que los errores que pudieran presentarse difcilmente pudieran achacarse al operario, a menos claro, que este no se hubiera familiarizado de antemano con la tcnica, no la comprendiera o fuese en extremo descuidado. Lo cual parece haberse cumplido, dado que, al analizar por electroforesis las muestras correspondientes al plsmido estas, exhibieron ms de una banda que era lo esperado, al no haberse tratado con enzimas de restriccin, lo que permite pensar o en su degradacin o en la formacin de isoformas durante la extraccin, opcin ms factible porque el ADN siempre se manipul con guantes para evitar su contacto con nucleasas y se trabaj en general en frio, para que an ante una enzima, esta estuviera inactivada por las bajas temperaturas., as la fuerza mecnica durante la extraccin puede considerarse, fue demasiada, por lo que parte de los plsmidos extrados, pasaron de su forma superenrrollada a una circular laxa y para el caso particular de la muestra de pCR2.1-Topo-ape, incluso a una lineal (presencia de 3 bandas).Esto pudiera corregirse una vez identificado el error, repitiendo en el futuro la extraccin con precauciones mucho mayores. Respecto a la cantidad de ADN obtenida, si bien, no se determin con exactitud, esta fue suficiente, como para procesar las muestras, tanto por restriccin como por transformacin, respecto a la pureza que tampoco se determin con exactitud se apreciaba la presencia, casi constante de ARN, como bandas muy ligeras y de gran corrimiento, con una marcada fluorescencia en el UV, este ARN, si bien no interfiri, casi nunca (vase adelante) con los resultados, habla de deficiencias en la extraccin. Misma que dado lo anterior, podra hacerse siguiendo algn otro mtodo, como el Quick Gene (Desarrollado por Fujifilm Ltd, para su uso en el llamado Kit S), en el que se usen RNAsas, para obtener ADN de alta pureza.Otros factores de variacin que pudieran introducirse en la tcnica sera la preparacin y el manejo de los reactivos de la extraccin, algunos de los cuales son lbiles o sensibles como el SDS (solucin II BD) que no debe de almacenarse a bajas temperaturas porque en tales condiciones precipita, igualmente si el pH o la concentracin de los reactivos no se ajustara, se introduciran variaciones que podran hacer de la extraccin ineficiente, dejando protenas que al asociarse con el ADN, interferirn en su corrimiento electrofortico.Respecto a la transformacin de las bacterias los resultados obtenidos son congruente con lo esperado puesto que las clulas competentes por si solas, crecen considerablemente (control positivo), mientras que con el plsmido crecen en menor medida, pero en medios con ampicilina., lo que habla en 1 lugar de una transformacin exitosa, puesto que para que la cepa utilizada creciera en tales medios debera adquirir una resistencia ante la ampicilina, la cual estaba contenida tambin en el plsmido.Aqu conviene mencionarse que el control negativo, las clulas competentes sobre medio con ampicilina, crecieron, aunque en mucho menor medida que cualquier otro cultivo, lo cual es un resultado anmalo, atribuible a una contaminacin ambiental, o por parte del operario con bacterias resistentes a la ampicilina y al menos en apariencia de la misma especie, otra posibilidad que explique estos resultados es una mutacin, por la que algunas de las clulas del cultivo original, a lo largo de las resiembras o de manipulaciones inadecuadas, haya adquirido una resistencia, cuestin, no tan poco probable dado que la cepa en cuestin Es F- RecA1, por lo que es capaz de adquirir por conjugacin o por recombinacin genes ajenos, aunque para afirmar esto debieran de conducirse algunas pruebas adicionales dado que si esto ocurri sera esperable que otro equipo exhibiera estos resultados, as que por el momento la conclusin ms factible, habla de una contaminacin.Los dems resultados permanecen congruentes a lo esperado puesto que las clulas con pCR2.1-TOPO exhiben su carcter de recombinantes al generar color fruto de la degradacin del X-gal, (favorecido por el falso inductor de la galactosidasa el IPTG, vase el mecanismo de la reaccin cromognica en el anexo 2.), mientras que las clulas conteniendo a pCR2.1-TOPO-ape, no lo hacen al estar en medio de gen de la galactosidasa el inserto -ape-, correspondiente al gen de la aminopeptidasa de Ustilago maydis. Igual congruencia con un proceso de transformacin, exhibe el hecho de que se aprecien ms colonias donde se inocul ms ADN, es decir a mayor ADN agregado, hubo un mayor nmero de clulas transformadas.Esto habla adems de la adecuada formacin de competentes, por tratamiento con cloruro de calcio y choque trmico, lo que valida la metodologa utilizada, al menos en este punto.Ahora bien, con respecto a la restriccin no se obtuvieron resultados como los esperados, en todas las determinaciones, primero por que como equipo de trabajo las condiciones de electroforesis fueron inadecuadas y el ADN, fue expulsado del gel, tras un tiempo prolongado de corrimiento, cuestin que se puede corregir, siguiendo la banda del regulador de carga de color azul en su primera porcin, la menos densa, en lugar de la segunda, que puede ir por arriba del ADN, en el corrimiento. Con respecto al gel que se analiz a falta del nuestro aparecieron, como se dijo ya bandas respectivas a las isoformas del plsmido, mientras que para las muestras tratadas con ECOR1 donde se esperaban 2 bandas, no se apreci, ms que una salo que sugiere que en las condiciones de trabajo, la enzima no realiz ms que un corte, que linealiz al ADN, este corte que es el mismo se espera de BamH1, permite corroborar que el plsmido en cuestin es el de inters pCR2.1-Topo porque su tamao calculado, se aproxima a las 3.9Kb reportadas para el mismo, donde el tamao calculado fue de 3.5 Kb., sin embargo, para la muestra de pCR2.1-Topo-ape, se esperaba un tamao de unas 5Kb, que no fue exhibido, lo que puede deberse a que el fragmento ms corto del inserto, que si pudo haber sido cortado se sali del gel o fue enmascarado por el ARN abundante (no se muestra en la imagen). Solo las muestras tratadas con BamH1, corroboran parcialmente los datos esperados al mostrar en el gel una sola banda, correspondiente a que BamH1, solo realiza un corte en el ADN, que lo linealiza y que para pCR2.1-Topo muestra el tamao de casi 4 Kb del plsmido mientras que para pCR2.1-Topo muestra tambin un solo fragmento pero de mayor tamao 4.2Kb.Con los tamaos aproximados debe de tenerse cuidado, de hacer conclusiones categricas pues la conducta del digerido de , no es adecuada para usarse como una curva tipo, pues sus fragmentos no crecen a intervalos constantes de tamao, ni se comportan en la grfica de forma lineal (el ajuste a la linealidad, tampoco es adecuado, pues al hacerlo el coeficiente de correlacin R es igual a 0.9339, cuando analticamente se recomienda, que para hacer correlaciones R sea igual o mayor a 0.995), as es que se mantienen los tamaos como aproximaciones, y si se quisiera determinar estos con exactitud convendra utilizar marcadores sintticos de peso molecular o recurrir a tcnicas fisicoqumicas.En general, este anlisis debiera de repetirse prestando especial cuidado a las condiciones del corrimiento entre ellas el voltaje aplicado, su homogeneidad sobre el gel y el tiempo de corrimiento.A este mismo respecto la electroforesis esta aparecer como una tcnica poderosa de anlisis, siempre que se elijan las condiciones ptimas para cada anlisis, por lo que tanto la concentracin de agarosa en el gel, como el voltaje y el tiempo sean adecuados y estos aunque se refieran en la literatura se comprueben experimentalmente, algunas acotaciones se han hecho ya, al hablar de la restriccin.Por lo dems, los errores introducidos en las determinaciones, por los instrumentos y equipos seran muy difciles de detectar dado que las magnitudes de medida utilizadas escapan a la percepcin humana, sin embargo, estos errores pudieran evitarse dando al equipo su mantenimiento preventivo y cuidando al mximo las condiciones de trabajo, para usarlo de la mejor manera.Como perspectivas de este trabajo sera interesante el aislar plsmidos distintos y caracterizarlos de la misma forma en que se hizo en la prctica, para saber si todo el ADN recombinante se comporta de la misma manera, aqu mismo sera importante el poder aplicar la metodologa de extraccin de ADN plasmdico en otras prcticas, pues como se dijo ya, reviste algunos problemas como la obtencin de isoformas del mismo, por lo que la prctica permitira mejorar la tcnica y con el tiempo proponer una tcnica modificada, que permita obtener ADN plasmdico, de alta calidad y en las mximas concentraciones posibles. Igualmente sera conveniente el repetir los experimentos de restriccin con una mezcla de BamH1 y EcoR1 y con enzimas distintas a las probadas, para construir un perfil de restriccin ms completo e incluso hacer un mapeo de los genes de inters o del inserto en el caso de pCR2.1-Topo-ape. Igualmente el expresar todos los resultados de la transformacin en trminos cuantitativos permitira hacer comparaciones fiables y conclusiones de tipo estadstico. Lo mismo aplica para la extraccin de ADN, que convendra, para comparar, expresar en trminos de pureza y cantidad obtenida.Finalmente:La presente prctica puede verse como el culmine del curso experimental de gentica microbiana, pues para su realizacin, se integraron muchos de los conocimientos y tcnicas revisadas a lo largo del curso, en ella se pretendi aislar y caracterizar el ADN recombinante, molcula quimrica que si bien basada en ADN natural, ha sido modificada por el hombre, y que en la actualidad goza de una importancia enorme, por permitir, al insertarse en otros organismos el obtener mltiples productos de inters industrial (especialmente farmacutico), as mismo, el manejo de las tcnicas de trabajo con esta molcula ha permitido, avances enormes en las ciencias de la vida y la salud al permitir la caracterizacin de las especies biolgicas y la descripcin detallada de muchas de sus funciones genticas y metablicas, sin embargos y aunque no es objetivo de la prctica, cabe sealarse, las precauciones que en el futuro y desde el presente se habr de adoptar, para evitar la liberacin al medio ambiente de ADN y/o organismos genticamente modificados, lo cual podra causar graves daos ecolgicos al alterar la biodiversidad por introduccin de nuevas especies y desplazamiento de otras, quizs an no conocidas por el hombre.As los conocimientos experimentales aqu adquiridos, no sern suficientes a menos que cuenten con un respaldo terico-metodolgico, fundamentado en la biotica, que permita el decidir el mejor aprovechamiento de los conocimientos actuales en materia de gentica (en palabras de Santiago Ramn y Cajal: Para la ciencia los medios son casi nada y el hombre, lo es casi todo).

Conclusiones: Se obtuvo ADN de doble cadena de pCR2.1TOPO y pCR2.1TOPO-ape (plsmidos recombinantes y no recombinantes). Esto por el mtodo de lisis alcalina y con la generacin de isoformas. Se obtuvo y trabaj con clulas competentes de Escherichia coli, mismas que fueron transformadas a bacterias ampicilina resistentes con el ADN del plsmidos, igualmente para las transformadas con pCR2.1TOPO-ape se comprob la presencia de un inserto que inhabilita la capacidad de degradar la galactosa. Con lo anterior se pudo diferenciar un vector recombinante, en este caso pCR2.1TOPO de uno no recombinante pCR2.1TOPO-ape por pruebas fenotpicas y por pruebas de restriccin.

Referencias bibliogrficas:

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2) Gonzlez de Buitrago TCNICAS Y MTODOS DE LABORATORIO CLNICO, 2 ed. Ed. Masson, 2005, Espaa.

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4) J.G. y N. Sherman.: MICROBIOLOGY A LABORATORY MANUAL. Cappuccino Benjamin/Cummings Inc. U.S.A. 1992.

5) Jimnez Snchez A. Jimnez Martnez J. GENTICA MICOBIANA, Ed. Sntesis. 1998. Espaa.

6) Karp G. BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR: CONCEPTOS Y EXPERIMENTOS, 6 ed. Ed. Mc Graw Hill, 2011, Mxico.

7) Lodish et Al. BIOLOGA CELULAR MOLECULAR Ed. Mdica Panamericana, 3 edicin. 2007. Argentina.

8) Sigma life sciences. MICROBIOLOGY MANUAL. Sigma-Aldrich corporation. 3th edition, 2009, U.S.A.

9) Tortora MICROBIOLOGY AN INTRODUCCIN. Ed. Benjamin Cummings, 9th edition, 2006, U.S.A.

10) Watson JD et Al. BIOLOGA MOLECULAR DEL GEN. Ed. Mdica Panamericana, 5 edicin 2006. Argentina.

11) http://www.unicartagena.edu.co/librose/LABORATORIO%20N%C2%BA7%20AISLAMIENTO%20E%20IDENTIFICACION%20DEL%20DNA.pdf sitio pblico en internet consultado el 1/IX/11 a las 23:55 hrs.

ANEXO N 1. Gel de electroforesis obtenido por el equipo 5.

Figura n 3. Gel obtenido en el anlisis por electroforesis, de los plsmidos y los plsmidos tratados con enzimas de restriccin.El llenado de los pozos se hizo, en el orden siguiente: 1.pCR2.1Topo/BamH1 2.pCR2.1Topo/EcoR1 3.pCR2.1Topo. 4. pCR2.1Topo-ape/BamH1 5.pCR2.1Topo-ape/EcoR1 6.pCR2.1Topo-ape 7.Marcador de peso molecular.

ANEXO N 2.Reaccin cromognica del X-gal

Figura n 4. Reaccin cromognica entre el X-gal y la beta galactosidasa, cuando esta es inducida por el IPTG.EL X-gal, anlogo a la galactosa, es degradado por la beta-galactosidasa, cuando esta es inducida por el IPTG, quien no reacciona con estas, generando al compuesto 1, que copula con otra molcula del mismo compuesto, generando al compuesto 2, de color azul. As puede evaluarse la sntesis de beta-galactosidasa, en un cultivo de clulas con un operon lac funcional o su no sntesis si alguno de los genes de dicho operon estn interrumpidos por algn inserto como es el caso del inserto ape- en pCR2.1-TOPO-ape.