BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-------------------------------

NGUYỄN TUẤN ANH

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT

BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC

ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC

Hà Nội 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

--------------------------------

NGUYỄN TUẤN ANH

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT

BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC

ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỌC

MÃ SỐ: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH

Hà Nội 2019

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích hàm lượng và cấu

trúc của hoạt chất Boterzomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u

tuỷ xương” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn của TS.Đặng Thị Tuyết Anh.

Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào. Các kết

quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành,

trích dẫn, tính toán và đánh giá.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội

dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2019

HỌC VIÊN

Nguyễn Tuấn Anh

ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Đặng Thị Tuyết Anh Phó

phòng Hóa Dược - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt

Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em

hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị và đồng nghiệp phòng Hóa

dược - Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo

mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành tốt luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hoá Học ,tập thể các thầy

cô, anh chị và các bạn tại Viện Hoá Học đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt

quá trình hoàn thành luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn

thành luận văn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến đề tài chương trình Hoá Dược Mã số:

CNHD.ĐT.076/17-19 để em có thể tham gia và thực hiện luận văn này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Tuấn Anh

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB ................................................................ 2

1.1.1 Cấu trúc hoá học .......................................................................................................... 2

1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib ......................................................................................... 2

1.2TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG

TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI ......................................................................... 3

1.2.1 Phương pháp sắc ký cột ............................................................................................. 3

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................... 6

1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ............................................... 8

1.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) ....................................................................... 9

1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ................................................... 10

1.3.1 Tính đặc hiệu .............................................................................................................. 10

1.3.2 Độ chính xác ............................................................................................................... 10

1.3.3. Độ đúng ...................................................................................................................... 11

1.4.4. khoảng tuyến tính ..................................................................................................... 11

1.4.5. Miền giá trị ................................................................................................................ 12

1.4.6. Giới hạn phát hiện .................................................................................................... 13

1.4.7. Giới hạn định lượng ................................................................................................. 13

CHƯƠNG II ........................................................................................................ 15

THỰC NGHIỆM ................................................................................................. 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................ 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 15

2.2.1Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp ............................................................ 15

2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc ............................................................................ 18

2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại ..................................................... 18

iv

2.2.2.2 Phương pháp phổ MS ....................................................................... 19

2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR .................................................................... 19

2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC ............................................... 19

2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký .................................................. 19

2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu ................................................................................... 19

2.2.3.3 Tính thích hợp của hệ thống ............................................................. 20

2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và miền giá trị .................................................... 20

2.2.3.5 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp .............................. 20

2.2.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng ..................................... 21

2.2.3.7 Độ chính xác ..................................................................................... 21

2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................ 22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 23

3.1 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BORTEZOMIB ............................. 23

3.1.1 Xác định cấu trúc của hợp chất 2 .......................................................................... 23

3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 3 .................................................................................. 24

3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất 4 .................................................................................. 25

3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất Bortezomib 5 ........................................................... 26

3.2 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BORTEZOMIB ........................ 29

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................... 29

3.2.2 Khoảng tuyến tính ..................................................................................................... 30

3.2.3 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp................................................. 31

3.4.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ......................................................... 32

3.4.5 Độ chính xác ............................................................................................................... 33

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 36

PHỤ LỤC ............................................................................................................ 39

v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên gọi

IR Infrared Spectrometry

MS Mass Spectrometry

NMR Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy

13C-NMR 13C-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocoy

HPLC High-performance Liquid Chromatography

LDA lithium diisopropylamide

THF Tetrahydrofuran

MECN Acetonitrile

MeOH Methanol

EtOAc Ethyl acetate

EDCI 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide

HBTU 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-

tetramethyluronium hexafluorophosphate

TBTU 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-

tetramethyluronium tetrafluoroborate

TFA Trifluoroacetic acid

HOBt Hydroxybenzotriazole

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột ................................................ 4

Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng ............................................................ 5

Hình 3: Cách tính giá trị Rf ........................................................................................ 6

Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................................... 7

Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib ............................................................ 16

Hình 6: 1H-NMR của hợp chất 2 .............................................................................. 23

Hình 7: Phổ 13C- NMR của chất 2 ............................................................................ 24

Hình 8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 ....................................................................... 24

Hình 9: Phổ IR của hợp chất 4 ................................................................................. 25

Hình 10: Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 ..................................................................... 26

Hình 11: Phổ FTIR của hợp chất 5 ........................................................................... 26

Hình 12: Phổ 1H-NMR của hợp chất 5 ..................................................................... 27

Hình 13: Phổ 13C NMR của hợp chất 5 .................................................................... 28

Hình 14: Phổ HRMS của hợp chất Bortezomib ....................................................... 28

Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Bortezomib và diện tích

pic ............................................................................................................................. 31

Hình 16: Sắc ký đồ HPLC của Bortezomib tại điều kiện tối ưu chất chuẩn ............ 34

Hình 17: Sắc ký HPLC của Bortezomib mẫu tổng hợp ........................................... 34

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống .................................... 29

Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Bortezomib ......................... 30

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của Bortezomib.................................. 31

Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại tạo LOD .......................................... 32

Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của Bortezomib ................................ 33

1

MỞ ĐẦU

Bortezomib có tên thương mại là velcade là thuốc kháng ung thư thế hệ

mới được dùng trong điều trị bệnh đa u tuỷ xương, đa u tuỷ là bệnh ung thư của

tương bào trong tuỷ xương. Bệnh chiếm khoảng 10% tổng số các ca bệnh máu

ác tính trên toàn thế giới, với khoảng 15.200 trường hợp mắc mới mỗi năm,

đứng hàng thứ 2 trong số các bệnh máu ác tính, chi phí điều trị bệnh đa u tuỷ

xương ở Việt Nam bằng thuốc bortezomib(velcade) nhập ngoại là rất đắt giá của

1 lọ Velcade 3,5 mg xuất xứ từ Bỉ có giá khoảng 25 triệu đồng / lọ (3,5 mg), từ

Pháp - khoảng 22 triệu đồng / lọ 3,5 mg và từ Ấn Độ - khoảng 14 triệu đồng.

Ở nước ta hiện nay, trong quá trình tìm hiểu chưa có nghiên cứu nào về

việc tổng hợp và phân tích định lượng của bortezomib được công bố, chính vì

vậy đề tài đã nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp sản phẩm bortezomib dựa

vào các ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tổng hợp công bố trên thế

giới nhằm mục đích tạo điều kiện cho bệnh nhân sử dụng thuốc với giá thành rẻ

hơn. Tuy nhiên, để đánh giá độ tinh khiết và hàm lượng sản phẩm bortezomib

tổng hợp được chúng tôi đã xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC ghép

đầu dò UV. Theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “ phân tích

hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất Bortezomib tổng hợp được làm nguyên

liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương” với mục tiêu như sau:

1. Cải tiến quy trình tổng hợp Bortezomib làm nguyên liệu thuốc điều trị

bênh đa U tuỷ xương

2. Xây dựng phương pháp xác định cấu trúc Bortezomib

3. Xác định hàm lượng của bortezomib bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao ghép detector UV

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB

1.1.1 Cấu trúc hoá học

Tên IUPAC: (R)-3-methyl-1-((S)-3-phenyl-2-(pyrazine-2-carboxamido)

propanamido) butylboronic acid

Công thức phân tử: C19H25BN4O4

Khối lượng phân tử: 238.237g.mol-1

1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib

Bortezomib là chất ức chế thuận nghịch hoạt động giống chymotrypsin

có thể ức chế các proteasome 25S của tế bào động vật có vú. bortezomib ngăn

chặn sự phân giải protein ảnh hưởng đến dòng thác tín hiệu bên trong tế bào,

dẫn đến chết tế bào [1-4].

Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy rằng bortezomib là thuốc độc

tính tế bào đối với nhiều loại tế bào ung thư khác nhau. Các nghiên cứu lâm

sàng bao gồm nhiều bệnh nhân trên toàn thế giới đã xác nhận hiệu quả và tính

năng của Bortezomib trong điều trị cho bệnh đa u tủy. Bortezomib giúp đẩy

lùi bệnh một phần hoặc hoàn toàn trong 30-50% các trường hợp. 20% Các

3

trường hợp không đáp ứng bortezomib đơn thuần có thể đáp ứng với điều trị

phối hợp bortezomib với dexamethason hoặc melphalan và prednisone

Ngoài ra, Bortezomib (Velcade) cũng được dùng để điều trị cho bệnh

nhân u lympho tế bào mantle đã nhận được ít nhất 1 đợt điều trị trước đó.

Nghiên cứu mới đây của các nhà nghiên cứu Hy Lạp công bố trên tạp chí

Arthritis & Rheumatism của Trường ĐH Thấp khớp học Hoa Kỳ (ACR) [5] cho

thấy thuốc sinh học bortezomib (Velcade) có thể trở thành thuốc điều trị viêm

khớp dạng thấp có triển vọng.

1.2 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ

DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

1.2.1 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp

phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể

triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.

Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực

của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột

chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá

trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố

tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.

Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong

4 giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô

và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.

Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách

nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi. Sau khi đưa chất hấp phụ lên cột,

rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không

được để khô dung môi trong cột.

4

Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân

tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đưa

chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách

lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…

Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà

áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở

đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích.

Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột

1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình ):

Chuẩn bị bản mỏng:Bản mỏng được bảo quản trong bình hút ẩm. Dùng

bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đường chấm chất phân tích (cách mép dưới của

bản mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của

bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm

và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).

Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet

chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải

5

đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó

hiện vết bằng thuốc thử.

Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và

đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung môi với

tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung

môi. Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở

trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không

đổi. Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô

bản mỏng rồi hiện vết.

Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng

254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2).

Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng

Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254,

kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm. Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong

nghiên cứu dược liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu

quả cao.

Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha

động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là

chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng

nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ

dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy

theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử

6

trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với

những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di

chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng

dịch chuyển của dung môi (Hình 3). Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf.

Hình 3: Cách tính giá trị Rf

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao: (High-performance liquid chromatography);

viết tắt: HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định

lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để

đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua

một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần

trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng

của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần

khì mà chúng chảy ra khỏi cột

7

.

Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC

HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên

cứu, pháp lý và y dược [6].

Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên

quan tới hấp phụ. HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và

hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của

các thành phần trong mẫu. Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra

khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ. Chất lỏng bị nén

là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha

động". Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình

phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần

trong mẫu và chất hấp phụ ở cột.

Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu

nhỏ đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao. Khi phân

tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân

tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với

nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như

8

không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong

khoa học và công nghiệp [7-11].

1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại

nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử

dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có

momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có

thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân

có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [12].

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho

các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt

nhân 1H thì:

)(10. 6 ppmo

xTMS

Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt

nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.

Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa

một các tổng quát như sau:

)(10. 6 ppmo

xchuan

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân

mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao

quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C

trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến

chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học

9

của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu

hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [13].

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học ta biết được loại proton nào có mặt

trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12

ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không

tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có

thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu

cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở

cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc

vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn

giữa các tương tác [13].

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp

phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết

luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [12].

1.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử

trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau đó

phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa vào

phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên

cứu. [10,14].

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân

tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được

cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số

10

quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu

khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.

1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

1.3.1 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định

chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt

của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,…)

có trong mẫu thử.

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: Sắc

ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê

với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng,

mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời

gian lưu chất chuẩn [15-18].

1.3.2 Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử

riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất

cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện. Độ chính xác cũng

còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với giá

trị trung bình [15-18].

Phương pháp xác định

Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị

của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng

tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.

Yêu cầu Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích

mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt

trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở

11

giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng

nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [19].

1.3.3. Độ đúng

Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm

thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một

mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [15-18]. Độ đúng bị ảnh hưởng bởi

sai số hệ thống.

Phương pháp xác định Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định

lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy

trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau). Đại lượng đặc

trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau:

Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lượng hoạt chất thu hồi

x 100 % Lượng hoạt chất thêm vào

Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được

µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.

Yêu cầu Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình

xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục

hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [15,16]. Tỷ lệ phục hồi càng

gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.

1.4.4. khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả

của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại

lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).

Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, khoảng tuyến tính được biểu thị bằng

phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2 [15-18]

12

Phương pháp xác định

- Khoảng tuyến tính cần được khảo sát ở khoảng 10 (ít nhất 5 [16, 18]

hoặc 6 [15, 17]) mức nồng độ khác nhau.

- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của

phương pháp. Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. Khi thẩm định

phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo ít nhất 3 lần [15].để kiểm tra độ lặp của

các nồng độ chuẩn.

Đánh giá khoảng tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp:

trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính

thích hợp của phương trình

Yêu cầu Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,90 ≤ R2 ≤ 1 [16].

1.4.5. Miền giá trị

Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và

nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ

nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất

tuyến tính của phương pháp [15-18]. Miền giá trị thường được biểu thị bằng

khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ này vẫn còn sự phụ thuộc tuyến tính giữa

giá trị đo được và nồng độ [15-18].

Phương pháp xác định

Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định.

Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính

có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không. Yêu cầu Với quy trình định

lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của miền giá trị là phải đạt 80% –

120% nồng độ của mẫu thử [15-18].

13

1.4.6. Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất

của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải

xác định chính xác hàm lượng [15-18].

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định

bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ

nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn

phát hiện được.

- Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp

dụng với quy trình có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử

tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD

là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3.

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 3,3 × SD

a

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng

SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa

vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng.

1.4.7. Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp

nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ

chính xác phù hợp [15-18].

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác:

LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập

mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định

vẫn định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được.

14

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương

pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu

được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng độ

mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.

Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 10 x SD

a

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào

độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ

15

CHƯƠNG II

THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua

của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ).Bột silicagel cho sắc ký cột 100 - 200

mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silicagel đế nhôm Art. 5554 DC - Alufolien

Kiesel 60 F254 (Merck).Chất chuẩn bortezomib, các dung môi ACN, Axit formic

để chạy sắc ký HPLC đều của hãng Merch, độ tinh khiết trên 99%.

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Để xác nhận cấu trúc chúng tôi tiến hành bằng các phương pháp được sử

dụng trên các thiết bị sau: Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo

trên máy Gallenkamp của Anh, Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR

(125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500

MHz, Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett Packard

Mass Spectrometer 5989 MS hoặc LC- MSD- Trap- SL, Hệ thống HPLC - DAD

3000 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) trang bị bốn bơm cao áp và bộ tiêm mẫu tự

động. Cột sắc ký RP-C18( kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích thước hạt 3m)

thiết bị xử lý tín hiệu là hệ thống máy vi tính với hệ điều hành Microsoft

Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản

7.1.2.1478.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp

Mẫu bortezomib tổng hợp được chuẩn bị bằng cách tiến hành tìm hiểu

những ưu và nhược điểm các phương pháp nghiên cứu của một số tác giả và

phương pháp tổng hợp sau:

16

- Tổng hợp bortezomib đi từ pinanediol boronic este[20].

- Tổng hợp bortezomib từ N-pyrazinoyl-L-phenylalanine[21].

- Tổng hợp bortezomib bằng phương pháp Ellman[22].

- Tổng hợp bortezomib anhydride từ pinacol 2-methylpropane-1-

boronate[23].

Từ các kết quả nghiên cứu bước đầu của nhóm tác giả, nhận thấy rằng

mỗi phương pháp tổng hợp bortezomib đều có ưu điểm và nhược điểm nhất

định. Các phương pháp tổng hợp bortezomib đã được công bố cho thấy, để tổng

hợp bortezomib phải thực hiện qua phản ứng Matteson tổng hợp muối ammoni

chlorid trong điều kiện nhiệt độ rất thấp (dưới -20oC). Đây là vấn đề khó khăn

khi thực hiện để nâng quy mô, hiệu suất. Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề

xuất quy trình đơn giản qua 4 bước phản ứng phù hợp với quy mô nghiên cứu tại

phòng thí nghiệm và điều kiện tại Việt Nam như hinh 5.Từ đó mẫu bortezomib

tổng hợp được dùng làm nguyên liệu để phân tích xác định cấu trúc và xây dựng

phương pháp xác định hàm lượng.

Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib

17

Quy trình tổng hợp chất 2: (1R)-(S)-pinanediol 1-ammonium

trifluoroacetate-3-methylbutane-l-boronate 1 (100mg, 1mmol) được hòa tan

trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (60mg, 1,2 mmol),

HOBt (42mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5mmol) và

Boc-L-phenylalanine (70 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng

được khuấy ở nhiệt độ 0oC 12 giờ. Sau đó, loại bỏ diclometan ở áp suất thấp,

thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat. Pha hữu cơ được rửa lần lượt với

nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL), dung dịch

K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL). Mỗi pha nước được chiết lại

2 lần bằng etyl axetat. Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối

natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất 2 dưới

dạng chất bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm

2 sạch với hiệu suất phản ứng là 80%.

Quy trình tổng hợp chất 3: hợp chất 2 (200mg, 1mmol) được hòa tan

trong 5ml CH2Cl2 ở nhiệt độ 0oC, sau đó TFA (3mmol) được nhỏ giọt từ từ vào

bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC trong 3h. Sau đó,

loại bỏ diclometan ở áp suất thấp, thêm dung môi toluen, cô quay phản ứng để

loại bỏ dung môi triệt để. Sản phẩm sau khi cô quay có dạng bột trắng là muối 3

(hiệu suất 90%) được sử dụng cho phản ứng tiếp theo mà không cần tinh chế.

Quy trình tổng hợp chất 4: Muối ammonium chloride 3 (100mg, 1mmol)

được hòa tan trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (51mg,

1,2 mmol), HOBt (36mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5

mmol) và pyrazine-2-carboxylic acid (27 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng. Hỗn

hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC 12 giờ. Sau đó, loại bỏ diclometan ở

áp suất thấp, thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat. Pha hữu cơ được rửa

lần lượt với nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL),

18

dung dịch K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL). Mỗi pha nước

được chiết lại 2 lần bằng etyl axetat. Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan

bằng muối natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất

4 dưới dạng chất bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được

sản phẩm 4 sạch với hiệu suất phản ứng là 85%.

Quy trình tổng hợp hợp chất Bortezomib 5: N-(2-pyrazinecarbonyl)-L-

phenylalanine-L-leucine borate 4 (100 mg, 1 mmol) được hòa tan bằng

MeOH (0,4ml) trong bình cầu đáy tròn. Sau đó thêm isobutyl boronic acid

(35 mg, 1,8 mmol) trong hexan (0,4ml), acid HCl 1N (0,3 ml) được nhỏ giọt

từ từ vào và hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 4h. Hỗn

hợp phản ứng được chia làm 2 lớp riêng biệt, sau phản ứng được chiết với

hexan (30ml x 3 lần). Phân lớp MeOH cô quay loại dung môi, thêm NaOH

2N để trung hòa đến pH = 6-6,5 và được chiết bằng EtOAc (30ml x 3 lần).

Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối natri sulfat, lọc và loại

bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất bortezomib 5 dưới dạng chất

bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm

bortezomib 5 (44 mg) sạch với hiệu suất phản ứng là 60%.

2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc

2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại

Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch

ta tiến hành đem đo phổ hồng ngoại bằng cách trộn mẫu Bortezomib thật đồng

đều với KBr theo tỉ lệ 1:10 hoặc 1:100 rồi ép thành viên mỏng hầu như trong

suốt bằng máy ép thuỷ lực sau đó tiền hành đo phổ trên thiết bị FT-IR spectrum

TWO DTGS tại phòng Hoá Dược – Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và

công nghệ Việt Nam.

19

2.2.2.2 Phương pháp phổ MS

Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch

ta tiến hành đem đo phổ HR-MS tại Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và

công nghệ Việt Nam.

2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR

Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch

ta tiến hành đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR .Mẫu bortezomib được hoà tan trong

dung môi CDCl3 sau đó cho mẫu được hoà tan vào ống NMR và tiến hành đặt

đo trên máy thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân phân giải cao tại Viện Hoá Học –

Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC

2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký

Dựa trên cơ sở tham khảo một số tài liệu định lượng bortezomib bằng

phương pháp HPLC [7,24] và có một số thay đổi nhỏ, đã chọn ra được điều

kiện như sau: Pha tĩnh cột sắc ký RP-C18( kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích

thước hạt 3m), pha động Methanol:H2O:Acid formic tỉ lệ 63:37:0,1 thể tích

tiêm mẫu 20 μl, tốc độ dòng 1 ml/phút, thời gian sắc ký 10 phút, nhiệt độ cột

được duy trì ở 350C bước sóng 270nm.

2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu

Dung môi Acetonitril dùng làm mẫu trắng, pha dung dịch thử gốc bằng

cách cân chính xác 25 mg Bortezomib vào bình định mức 50 ml tương ứng với

nồng độ định lượng là 100%, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu và

lắc đều.Dung dịch thử được xác định bằng cách hút chính xác 5 ml dung dịch

trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua

màng lọc 0,45 µm.

20

Để xác định dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 25 mg Bortezomib

chuẩn vào bình định mức 50 ml hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi

Acetonitril lắc đều. Sau đó pha dung dịch chuẩn bằng cách hút chính xác 5 ml

dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc

đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

2.2.3.3 Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký tiêm lặp lại 6 lần dung

dịch chuẩn. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic Bortezomib giữa các lần

tiêm lặp lại ≤ 2,0 %. Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ

thống sắc ký.

2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và miền giá trị

Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng dung môi pha mẫu để thu được

các dung dịch chuẩn có nồng độ Bortezomib biến thiên trong khoảng 0,025 –

0,075 mg/ml Bortezomib (tương ứng 50 – 150 % nồng độ định lượng). Tiêm các

dung dịch này vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Tiến hành phân tích các

mẫu, xác định phương trình hồi quy giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic

tín hiệu. Xác đinh giá trị R2.

Khoảng xác định được suy ra từ kết quả độ đúng và độ tuyến tính (Từ giá

trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).

2.2.3.5 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp

Sử dụng dung dịch chuẩn ở phần chuẩn bị mẫu ta chuẩn bị các mẫu thử

sau mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu thử.

+ Dung dịch mẫu 80 %: Cân chính xác khoảng 20 mg Bortezomib chuẩn

vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc

đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung

môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

21

+ Dung dịch mẫu 100 %: Cân chính xác khoảng 25 mg Bortezomib chuẩn

vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc

đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung

môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

+ Dung dịch mẫu 120 %: Cân chính xác khoảng 30 mg Bortezomib chuẩn

vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc

đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung

môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

2.2.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện được xác định bằng cách pha loãng dần dung dịch

chuẩn Bortezomib đến khi tỷ lệ tín hiệu thu được gấp khoảng 3 lần độ nhiễu

đường nền.

Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được

xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.

Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch thu được, ghi lại các sắc ký đồ và xác

định RSD của diện tích píc.

2.2.3.7 Độ chính xác

Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt với giá trị thực khi

lặp lại quy trình phân tích nhiều lần. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ đúng.

Độ lặp lại: Acetonitril được sử dụng làm dung dịch chuẩn.Pha dung dịch

thử bằng cách cân chính xác 25 mg mẫu bortezomib tổng hợp vào bình định

mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Hút chính

xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa

đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Hàm lượng (%) của Bortezomib (C19H25BN4O4) tính theo chế phẩm đã

làm khô được tính theo công thức:

22

Trong đó:

ST: Diện tích pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch thử

SC: Diện tích pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn

C: Nồng độ Bortezomib trong mẫu chuẩn (mg/ml)

mT: Lượng cân mẫu thử (mg)

a: Hàm lượng nước trong chế phẩm (%)

Tiến hành định lượng phân tích 6 mẫu bortezomib dung dịch thử độc

lập.Xác định hàm lượng các hoạt chất có trong các mẫu thử theo trung bình diện

tích pic Bortezomib của dung dịch chuẩn .Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ

lệch chuẩn tương đối RSD (%) giữa giá trị các lần định lượng

2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu

Để xử lý số liệu kết quả của các giá trị đo được qua mỗi lần đo. Dùng toán

thống kê để xử lý số liệu các kết quả với phần mềm Microsoft Excel 2010. Một

số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả:

- Gía tri trung bình:

- Độ lệch chuẩn:

- Độ lệch chuẩn tương đối:

23

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BORTEZOMIB

Hợp chất được xác định cấu trúc bằng phương pháp đo phổ khối , phổ

hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR.

3.1.1 Xác định cấu trúc của hợp chất 2

Hình 6: 1H-NMR của hợp chất 2

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 2 xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng

của 46 proton bao gồm tín hiệu đặc trưng 5 proton vòng thơm, 24 proton của 8

nhóm methyl cộng hưởng tại δH = 1,40 (s, 15H); 1,28 (s, 3H); 0,82 (s, 9H). 2

proton của nhóm –NH cộng hưởng tại δH = 6,04 (s, brs 1H,); 5,01 (s, brs 1H,).

24

Hình 7: Phổ 13C- NMR của chất 2

Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 2 xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng

của 29 nguyên tử Cacbon bao gồm tín hiệu đặc trưng của nhóm cacbonyl δC

171,7; 5 nhóm methine sp (δC 136,6; 129,4; 129,3; 128,6; 125,8); 4 nhóm

methine (δC 40,1; 39,6; 38,8; 38,4); 3 nhóm methylen (38,1; 37,5; 35,6); 8 nhóm

methyl δC (28,6; 28,2 27,1; 25,3; 25,3; 24,0; 23,0; 21,9) và 2 cacbon bậc 4

3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 3

Hình 8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 3

25

Trên phổ IR cũng được thể hiện các tín hiệu đặc trưng λ= 3323cm-1

(NH); λ= 2929cm-1 (-CH); λ=1692; 1648cm-1 (C=O); 1499; 1367; 1282; 1250;

1170; 1030; 744; 699 cm-1.

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 3 xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng

của 39 proton bao gồm tín hiệu đặc trưng 5 proton vòng thơm, 15 proton của 5

nhóm methyl cộng hưởng tại δH = 1,35 (s, 3H); 1,27 (s, 3H); 0,82 (s, 6H), 0,76

(s, 3H) 1 proton của nhóm –NH cộng hưởng tại δH = 6,81 (s, brs 1H,); 3 nhóm

methylen δH = (4,25 (m, 2H); 3,23-3,20 (m, 2H); 1,39-1,36 (m, 2H)), 6 nhóm

R1–CH-R2 (3,11 (t, 1H, J = 6,5 Hz); 2,32-2,27 (m, 1H); 2,18-2,16 (m, 1H); 2,00

(t, 1H, J = 5,5 Hz); 1,89-1,88 (m, 1H); 1,78 (d, 1H, J = 11,0 Hz))

3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất 4

Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm 4 sạch với hiệu

suất phản ứng là 85%

4000 4503500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

100

79

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

cm-1

%T

1651.80cm-1

1520.03cm-1

2927.86cm-11374.68cm-1

3333.78cm-1

1020.35cm-11238.56cm-1

1280.79cm-1

1122.84cm-1

1466.75cm-1

700.10cm-11077.74cm-1

744.45cm-11727.39cm-1 923.28cm-1

3785.70cm-1

1738.37

1579.08

1453.67

2953.56

2870.18

Hình 9: Phổ IR của hợp chất 4

Trên phổ IR cũng được thể hiện các tín hiệu đặc trưng λ= 3333cm-1 (NH);

λ= 2929cm-1 (-CH); λ=1727; 1651cm-1 (C=O);

26

Hình 10: Phổ 1H-NMR của hợp chất 4

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 4 xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng

của 40 proton bao gồm tín hiệu đặc trưng 8 proton vòng thơm, 15 proton của 5

nhóm methyl cộng hưởng tại δH = 1,38 (s, 3H); 1,28 (s, 3H); 0,84 (s,

6H);0,81(s,3H).2 proton của nhóm –NH cộng hưởng tại δH = 8,36 (d, 1H, J =

8,0 Hz); 7,23-7,20 (m, 1H)

3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất Bortezomib 5

Cấu trúc của sản phẩm bortezomib 5 đã được chứng minh bằng phổ IR,

1H-NMR, 13C-NMR, HPLC, HRMS. Trên phổ IR của sản phẩm 1 xuất hiện một

số tín hiệu đặc trưng của một số nhóm chức có mặt trong phân tử.

4000 4503500 3000 2500 2000 1500 1000 500

100

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

cm-1

%T

1516.28cm-1

1682.58cm-1

1403.92cm-1

2954.57cm-1

1020.79cm-1

1294.06cm-1

1153.20cm-1

1201.33cm-1

701.81cm-1

3321.23cm-1

754.18cm-1

2870.27

2927.99

3204.243385.66

Hình 11: Phổ FTIR của hợp chất 5

27

Trên Phổ IR Tín hiệu hấp thụ tại 3385 cm-1 đặc trưng cho nhóm -OH, tín

hiệu hấp thụ tại 3204 cm-1 đặc trưng cho nhóm -NH, tín hiệu hấp thụ tại 1682

cm-1 đặc trưng cho nhóm carbonyl (C=O).Ngoài ra còn xuất hiện các dao động

hóa trị của liên kết C=C vòng thơm tại 1516 và 1403 cm-1, các dao động biến

dạng của liên kết C-O tại 1153 cm-1.

Hình 12: Phổ 1H-NMR của hợp chất 5

Trên phổ 1H NMR của chất 1 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu đặc trưng của

các proton có mặt trong phân tử. Tám tín hiệu proton của vòng thơm cộng

hưởng tại vị trí 9,14-7,27 ppm. Tín hiệu proton của trong CHNH cho một tín

hiệu multiple tại vị trí 4,83-4,80ppm.Sáu proton của nhóm -CH3 cộng hưởng tại

vị trí 0,86 -0,81.

28

Hình 13: Phổ 13C NMR của hợp chất 5

Phổ 13C NMR của sản phẩm 5 cũng xuất hiện đầy đủ 19 nguyên tử carbon

có mặt trong phân tử.

A1 #4371 RT: 19.50 AV: 1 NL: 7.00E5T: FTMS + p ESI Full ms [50.0000-750.0000]

384.5 384.6 384.7 384.8 384.9 385.0 385.1 385.2 385.3 385.4 385.5 385.6 385.7 385.8 385.9

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

385.2928

Hình 14: Phổ HRMS của hợp chất Bortezomib 5

29

Trên phổ HRMS của hợp chất cho pic ion [M+H]+ m/z = 385,2928 phù

hợp với công thức phân tử của bortezomib là C19H25BN4O4. Qua các dữ kiện vừa

phân tích IR, NMR, MS cho phép xác định cấu trúc của sản phẩm 5 là phù hợp

với các kết quả đã nghiên cứu trước.

3.2 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BORTEZOMIB

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống

Kết quả hiển thị trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện các pic có thời

gian lưu tương ứng với thời gian của pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch

chuẩn .

Trên sắc ký đồ dung dịch thử cho pic thời gian lưu tương ứng với thời

gian lưu của pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn (khoảng 7,7%)

Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống

Stt Thời gian lưu

(phút) Diện tích pic

1 7,763 1194,2

2 7,771 1198,7

3 7,776 1193,5

4 7,768 1199,8

5 7,766 1184,0

6 7,754 1191,5

TB 7,766 1193,6

RSD (%) 0,10 0,48

Nhận xét: RSDthời gian lưu < 1,0 %; RSDdiện tích pic < 2,0 % đáp ứng đúng yêu

cầu độ đặc hiệu cho thấy hệ thống phù hợp để định lượng Bortezomib trong mẫu

tổng hợp

30

3.2.2 Khoảng tuyến tính

Kết quả khảo sát sự tương quan giữa y (diện tích pic Bortezomib) và x

(nồng độ Bortezomib) bằng phương pháp bình phương tối thiểu, kết quả cho

thấy: hệ số r2 = 0,9997 (=> r = 0,9998 ≥ r = 0,998); chứng tỏ có sự tương quan

tuyến tính giữa nồng độ Bortezomib và diện tích pic tương ứng.

Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Bortezomib

Stt % so với

định lượng

Thể tích dung

dịch chuẩn

gốc

Bortezomib

(ml)

Bình

định

mức

(ml)

Nồng độ

Bortezomib

(mg/ml)

Diện tích pic

Bortezomib

1 50 1 20 0,0254 589,3

2 80 4 50 0,0406 951,6

3 100 5 50 0,0507 1193,6

4 120 3 25 0,0609 1441,6

5 150 3 20 0,0761 1779,3

Hệ số tương quan r 0,9998

Hệ số góc 23544,6069

Hệ số chắn (intercept) 3,7476

% Y 0,31 %

Tiến hành xây dựng đường chuẩn bortezomib bằng excel ta được phương

trình đường chuẩn như hình 15

31

Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Bortezomib

và diện tích pic

3.2.3 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp

Mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu thử cho kết quả trong bảng sau:

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của Bortezomib

Mẫu

Lượng

chuẩn

Bortezomi

b thêm vào

(mg)

Diện tích pic

Bortezomib

Lượng

Bortezomib

tìm lại

(mg)

% Thu hồi

80% 21,03 984,0 21,13 100,5 TB:99,9

%

RSD:0,7

%

80% 20,41 942,2 20,23 99,1

80% 20,14 939,5 20,17 100,2

100% 25,46 1185,3 25,45 100,0 TB:99,7

%

RSD:0,3

%

100% 25,41 1181,7 25,37 99,9

100% 25,73 1190,2 25,56 99,3

120% 31,35 1475,3 31,68 101,0 TB:100,%

RSD:0,8

%

120% 30,07 1395,0 29,95 99,6

120% 30,45 1410,4 30,29 99,5

TB (%) 99,9

RSD (%) 0,61

32

Nhận xét: % thu hồi trong khoảng 98,0 % – 102,0 % với RSD =0,61% < 2 %

Khẳng định Phương pháp định lượng Bortezomib trong mẫu tổng hợp đạt yêu cầu về

độ đúng. Sự tương quan tuyến tính giữ nồng độ và diện tích pic trong khoảng nồng

độ Bortezomib từ 0,025 – 0,075 mg/ml ) tương ứng nồng độ Bortezomib bằng 50%

đến 150% so với nồng độ định lượng. Kết quả này cho thấy tại nồng độ Bortezomib

bằng 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng có độ đúng, độ lặp lại tốt và nằm

trong khoảng tuyến tính. Như vậy khoảng xác định của phương pháp là trong giới

hạn từ 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng

3.4.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện được xác định tại dung dịch chuẩn có nồng độ ≈ 1,25

µg/ml cho đáp ứng píc gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền. Tiến hành sắc ký

6 lần dung dịch cho kết quả độ lặp lại của diện tích pic của dung dịch có nồng

độ ở mức giới hạn phát hiện được ghi trong bảng 4.

Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại tạo LOD

STT Thời gian lưu

(phút) Diện tích pic S/N

1 7,848 30,6 3,0

2 7,718 34,5 3,1

3 7,748 33,1 3,1

4 7,775 28,9 3,3

5 7,847 32,0 3,1

6 7,805 34,1 3,1

T.bình 7,790 32,2 3,1

RSD

(%) 0,680 6,69 (< 10%)

=> LOD ≈ 1,25 µg/ml và LOQ = 1,25 x 3,3 ≈ 3,75 µg/ml.

33

3.4.5 Độ chính xác

Để đánh giá hàm lượng bortezomib chính xác nhất chúng tôi tiến hành

đánh giá độ lặp lại bằng cách tiêm 6 mẫu thử trên sắc ký cho kết quả số liệu ở

bảng 5:

Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của Bortezomib

stt Lượng cân chuẩn: 25 mg

Diện tích pic TB mẫu chuẩn: 1250,1

Lượng cân

mẫu thử

(mg)

Diện tích

pic % Hàm lượng

1 25,71 1253,9 98,6

2 25,03 1248,4 100,8

3 25,01 1214,7 98,2

4 25,04 1218,2 98,5

5 25,39 1229,6 97,9

6 25,11 1231,1 99,1

Kết quả định lượng trung bình (n = 6):

98,9 %

RSD (n=12): 1,07 %

Nhận xét: RSD (n=6) ≤ 3,0 % => Phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại.

Qui trình phân đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác

định, độ đúng, độ lặp lại, thích hợp để định tính, định lượng nguyên liệu

Bortezomib trong mẫu tổng hợp

34

Hình 16: Sắc ký đồ HPLC của Bortezomib tại điều kiện tối ưu chất chuẩn

Hình 17: Sắc ký HPLC của Bortezomib mẫu tổng hợp

35

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết Luận:

Sau thời gian thực hiện luận văn này đã thu được các kết quả nghiên cứu

như sau:

1. Đã xây dựng được quy trình cải tiến tổng hợp bortezomib đạt hàm

lượng 98,9% qua 4 bước phản ứng phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam

2. Dựa vào các phương pháp phân tích hoá lý hiện đại đã xác định được

cấu trúc của hợp chất bortezomib và các sản phẩm trung gian

3. Đã thẩm định quy trình định lượng bortezomib bằng phương pháp

HPLC với đầu dò UV-Vis tại bước sóng 270nm. Quy trình định lượng đạt tính

tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ đúng, khảo sát được tính tuyến

tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp.

Kiến Nghị:

1. Mở rộng nghiên cứu chuyên sâu hơn về tổng hợp bortezomib nhằm đạt

hiệu suất cao hơn góp phần giảm chi phí điều trị hơn nữa cho bệnh nhân

2. Mở rộng đối tượng nghiên cứu, có thể xác định hàm lượng của các

dược phẩm khác bằng phương pháp HPLC

36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bross, P. F.; Kane, R.; Farrell, A. T.; Abraham, S.; Benson, K.; Brower, M.

E.; Bradley, S.; Gobburu, J. V.; Goheer, A.; Lee, S.-L.; Leighton, J.; Liang, C.

Y.; Lostritto, R. T.; McGuinn, W. D.; Morse, D. E.; Rahman, A.; Rosario, L. A.;

Verbois, S. L.; Williams, G.; Wang, Y.-C.; Pazdur, R. Clin. Cancer Res. 2004,

10, 3954-3964.

2. Bonvini, P.; Zorzi, E.; Basso, G.; Rosolen, A. Leukemia 2007, 21, 838-842.

3. Kisselev, A. F.; Goldberg, A. L. Chem. Biol. 2001, 8, 739-758.

4. Adams, J. Proteasome Inhibitors in Cancer Therapy, Humana: Totowa, NJ,

2004, 17-38.

5. Yannaki, E.; Papadopoulou, A.; Athanasiou, E.; Kaloyannidis, P.; Paraskeva,

A.; Bougiouklis, D.; Palladas, P.; Yiangou, M.; Anagnostopoulos, A. Arthritis

Rheum. 2010, 62, 3277-33288.

6. Gerber, F; Krummen, M; Potgeter, H; Roth, A; Siffrin, C; Spoendlin, C.

“Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid

chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic columns in

pharmaceutical development and production working under current good

manufacturing practice”. Journal of Chromatography A 1 036 ( 2):133.

(2004). PMID 15146913. doi:10.1016/j.chroma.2004.02.056

7. Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế "Kiểm nghiệm dược phẩm", NXB Y học,

(2005), 68-110.

8. Bùi Xuân Vững "Cơ sở Hóa phân tích Định lượng", Trường Đại học Sư phạm

Đà Nẵng. (2012),

37

9. Bilal Yilmaz Emrah Alkan "Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and

UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in

Pharmaceutical Preparations", Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4). (2015),

10. McGeer Patrick L, Schulzer Michael, et al. "Arthritis and antiinflammatory

agents as possible protective factors for Alzheimer's disease A review of 17

epidemiologic studies", Neurology, (1996), 47(2), 425- 432.

11. Vikrant Kokane and Sonali Naik "Formulation and evaluation of topical

flurbiprofen gel using different gelling agents", World Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, (2014), 3(9), 654-663.

12. Mei Chenghan, Li Bin, et al. "Liquid chromatography-tandem mass

spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its

application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography (2015), B,

993, 69-74.

13. Meister Sabrina, Zlatev Iavor, et al. "Nanoparticulate flurbiprofen reduces

amyloid-β 42 generation in an in vitro blood–brain barrier model", Alzheimer's

research & therapy, (2013), 5(6), 51.

14. Murray Kermit K, Boyd Robert K, et al. (2013), "Definitions of terms

relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations)", Pure and Applied

Chemistry, (2013), 85(7), 1515-1609.

15. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm ,"Thẩm định phương pháp

trong phân tích hoá học và vi sinh vật",NXB Khoa học và Kỹ thuật, (2010),

10-59.

16. Bộ Y tế ,"Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học)", Nhà xuất

bản giáo dục Việt Nam, (2012), 135-184.

38

17. Smith Graeme ,"European Medicines Agency guideline on

bioanalytical method validation: what more is there to say?", Bioanalysis,

(2012), 4(8), 865-868.

18. Use The International Council for Harmonisation of Technical Requirements

for Pharmaceuticals for Human ,"Validation of analytical procedures: text and

methodology", Q2(R1), (2005), 6-13.

19. PGS.TS. Trần Tử An "Hóa phân tích, Phân tích dụng cụ", Nhà xuất bản Y

học, tập 2.(2007).

20. Adams, J.; ma, Y.; Stein, R.; Baevsky, M.; Grenier, L.; Plamondon, L.

Patent US 5780454, 1998.

21. Ivanov, A. S.; Zhalina, A. A.; Shishnov, S. V. Teterhedron 2009, 65,

7105- 7108

22. Pickersgill, I. F.; Bishop, J. E.; Koellner, C.; Gomez, J. -M.; Geiser, A.; Hett,

R. Patent US 7714159 B2, 2010.

23. Henschke, J. P.; Xie, A.; Chen, Y. F. Patent US 0289699 A1, 2012.

24. Albert KS, Gillespie WR, et al. "Determination of flurbiprofen in human

serum by reverse‐phase high‐performance liquid chromatography with

fluorescence detection", Journal of pharmaceutical sciences, 73(12), 1823-1825,

(1984).

39

PHỤ LỤC

Phụ Lục 1: Phổ 1H NMR của chất 2

40

Phụ Lục 2: Phổ 13C- NMR của chất 2

Phụ Lục 3: Phổ MS của chất 2

4000 4503500 3000 2500 2000 1500 1000 500

100

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

cm-1

%T

1516.28cm-1

1682.58cm-1

1403.92cm-1

2954.57cm-1

1020.79cm-1

1294.06cm-1

1153.20cm-1

1201.33cm-1

701.81cm-1

3321.23cm-1

754.18cm-1

2870.27

2927.99

3204.243385.66

Phụ Lục 4: Phổ FTIR của chất 2

41

Phụ Lục 5: Phổ 1H NMR của chất 3

4000 4503500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

100

79

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

cm-1

%T

1170.24cm-1

1648.58cm-1

1367.77cm-1

2929.19cm-1

1693.24cm-1

1499.50cm-1

1250.34cm-13323.25cm-1

1282.76cm-1

1453.95cm-1

699.28cm-1

1030.15cm-1

1078.10cm-1

2870.98

2955.49

3030.62

1124.19

1054.80

746.17

1531.01

Phụ Lục 6: Phổ FTIR của chất 3

42

Phụ Lục 7: Phổ 1H của hợp chất 4

4000 4503500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

100

79

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

cm-1

%T

1651.80cm-1

1520.03cm-1

2927.86cm-11374.68cm-1

3333.78cm-1

1020.35cm-11238.56cm-1

1280.79cm-1

1122.84cm-1

1466.75cm-1

700.10cm-11077.74cm-1

744.45cm-11727.39cm-1 923.28cm-1

3785.70cm-1

1738.37

1579.08

1453.67

2953.56

2870.18

Phụ Lục 8: Phổ FTIR của chất 4

43

4000 4503500 3000 2500 2000 1500 1000 500

100

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

cm-1

%T

1516.28cm-1

1682.58cm-1

1403.92cm-1

2954.57cm-1

1020.79cm-1

1294.06cm-1

1153.20cm-1

1201.33cm-1

701.81cm-1

3321.23cm-1

754.18cm-1

2870.27

2927.99

3204.243385.66

Phụ Lục 9: Phổ FTIR của hợp chất 5

Phụ Lục 10: Phổ 1H-NMR của hợp chất 5

44

Phụ Lục 11: Phổ 13C của hợp chất 5 A1 #4371 RT: 19.50 AV: 1 NL: 7.00E5T: FTMS + p ESI Full ms [50.0000-750.0000]

384.5 384.6 384.7 384.8 384.9 385.0 385.1 385.2 385.3 385.4 385.5 385.6 385.7 385.8 385.9

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

385.2928

Phụ Lục 12: Phổ MS của hợp chất 5

45

Phụ Lục 13: Phổ HPLC của mẫu chuẩn Bortezomib

Phụ Lục 14: Phổ HPLC của mẫu Bortezomib tổng hợp

46