LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SPORA

Senin, 9 Maret 2015

Kelompok IV

Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama NPM

Wilda Sholihaturrabiah 260110130159

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

PEWARNAAN SPORA

1. Tujuan

Mengamati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur

pewarnaan spora (pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi-

reaksi kimia yang terjadi daam prosedur tersebut.

2. Prinsip

a. Pewarnaan Spora

Beberapa sel bakteri memiliki struktur yang aktif berupa sel vegetatif

dan struktur yang pasif yaitu spora. Spora selain merupakan struktur

yang inaktif juga dapat tahan terhadap kondisi yang kurang

menguntungkan bagi tumbuhan. Spora sepertinya halnya sel vegetatif

dapat diwarnai sehingga dapat diamati lebih seksama. Teknik

pewarnaannya adalah pewarnaan differensial, yaitu menggunakan lebih

dari pewarna, yang hasilnya dapat membedakan spora dari sel vegetatif.

b. Penetrasi zat warna

Penembusan zat warna ke dalam sel bakteri

c. Impermeabilitas Spora

Dinding spora bersifat impermeabel, tetapi zat-zat warna dapat diserap

kedalamnya dengan jalan memanaskan preparat. Sifat impermeabel ini

mencegah dekolorisasi spora oleh alkohol bila diperlakukan dalam

waktu yang sama seperti pada dekolorisasi sel-sel vegetatif

d. Teknik aseptis

Proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari

mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang percobaan

berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan.

Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi

3. Teori Dasar

Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa

karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun

biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam

keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud

dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat

pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran,

bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat

pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan

hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri

atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan

Whleer, 1998).

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk

pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :

- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.

- Fiksasi olesan pada kaca objek.

- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian

larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik

secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung

(melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan

untuk (Suriawiria, 1985) :

- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun

fungi.

- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam

jasad.

- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat

fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya,

tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi

dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton

yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama

dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna

yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan

malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin.

Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda

pada sel vegetatifnya (Fardiaz, 1992).

Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari

degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang

diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek

merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan

agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi

dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif

secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi.

Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya

mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria,

2005).

Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu, setelah

diwarnai oleh suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat kuat senyawa

pewarna. Untuk pewarnaan selanjutnya, cat tersebut (misalnya safranin) sel spora

tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. Akhirnya warna

bakteri spora adalah hijau. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan

pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai oleh malachite, sel

vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena

ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif

mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah

merah muda dari safranin (Assani, 1994).

4. Alat dan Bahan

a. Alat

i. Bak pewarna

ii. Botol semprot

iii. Kaca obyek

iv. Kapas

v. Kertas Saring

vi. Mikroskop

vii. Ose

viii. Pembakar Spirtus

b. Bahan

i. Sampel Bacillus

subtilis

ii. Zat warna karbol

fukhsin dan

metilen blue

iii. NaCl fisiologis

iv. H2SO4 1%

v. Alkohol 70%

vi. Air suling

vii. Minyak celup

c. Gambar Alat

Bak Pewarna

Botol Semprot

Kaca Obyek

Kapas

Kertas Saring

Mikroskop

Ose

5. Prosedur

Prosedur pertama yang dilakukan adalah pembuatan suspensi bakteri.

Suspensi bakteri dibuat terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis yang

ditambah dengan pewarna karbol fukhsin dengan perbandingan 1:1 dalam

tabung reaksi. Campuran tersebut dipanaskan dalam pemanas air bersuhu 800C

selama 10 menit dan dijaga jangan sampai mendidih atau kering. Kemudian

kaca obyek yang bersih disediakan dan ditandai menggunakan spidol untuk

memperjelas daerah olesan. Suspensi bakteri diambil menggunakan ose dan

dioleskan pada kaca objek pada daerah yang telah ditandai. Penyiapan olesan

dilakukan secara aseptis. Olesan digenangi olesan H2S04 1% selama 2 detik,

lalu cuci dengan air suling. Kemudian olesan digenangi dengan pewarna

tandingan biru metilen selama 5 menit, zat warna yang berlebih dibuang dan

preparat dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. Pada

preparat diteteskan sedikit minyak imersi, lalu diamati di bawah mikroskop.

Pengamatan dimulai dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti

dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Hasil pengamatan digambar dan

diberi keterangan.

Spirtus

6. Hasil Pengamatan

Bakteri Bacillus subtilis

7. Pembahasan

Praktikum kali ini bertujuan untuk mengamati endospora bakteri

dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora (pewarnaan Klein).

Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi daam prosedur

tersebut. Dimana zat pewarna yang digunakan yaitu karbol fukhsin dan

pewarna tandingannya yaitu metilen blue.

Penyiapan suspensi bakteri dibuat dengan mencampurkan campuran

biakan bakteri Bacillus subtilis dan NaCl fisiologis dengan pewarna karbol

fukhsin dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1:1. Perbandingan ini agar

seluruh bakteri dapat menyerap zat warna dengan baik. Setelah itu campuran

tersebut dipanaskan dengan suhu 80oC. Bakteri Bacillus subtilis merupakan

bakteri gram positif sehingga untuk mengidentifikasinya diperlukan pewarnaan

diferensial. Tetapi pewarnaan biasa saja tidak cukup untuk mengidentifikasi

B.subtilis yang memiliki endospora sehingga diperlukan pemanasan.

Pemanasan ini ditujukan untuk meningkatkan daya penetrasi bakteri terhadap

zat warna dengan cara membuka pori-pori bakteri karena bakteri berspora

mempunyai dinding yang tebal dan relatif sukar ditembus sehingga tidak

mudah diwarnai dengan teknik pewarnaan pada umumnya. Teknik pewarnaan

spora ini disebut juga sebagai pewarnaan khusus.

Selanjutnya dibuat olesan bakteri. Untuk membuat olesan bakteri,

disiapkan kaca obyek yang sebelumnya telah direndam dengan larutan etanol

agar bebas dari lemak. Kaca obyek kemudian dikeringkan dan bagian

bawahnya ditandai dengan spidol untuk membuat daerah pengolesan.

Selanjutnya, digunakan ose untuk memindahkan bakteri dari tabung reaksi ke

atas kaca obyek. Sebelum ose dicelupkan pada suspense bakteri, terlebih dahulu

ose disterilkan dengan cara memanaskan kawat ose dengan nyala api.

Tujuannya adalah agar tidak ada bakteri kontaminan yang berasal dari alat-alat

yang digunakan. Metode sterilisasi ini merupakan bagian dari teknik aseptis,

yaitu proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba

kontaminan. Teknik ini diterapkan untuk seluruh alat dan bahan yang

digunakan dalam pembuatan preparasi. Setelah ose disterilkan, ose dibiarkan

mendingin dengan bantuan udara. Tujuan pendinginan ini adalah agar bakteri

yang nanti diambil dengan ose tidak mati karena suhu kawat yang terlalu panas.

Setelah ose dan kaca obyek siap digunakan, dibuat olesan suspensi

bakteri dengan mencelupkan ose pada sampel suspensi bakteri dan

mengoleskannya pada kaca obyek yang sebelumnya telah ditandai. Proses

pembuatan olesan selalu dilakukan di dekat api. Hal ini bertujuan untuk

mencegah adanya bakteri kontaminan selama proses tersebut. Olesan dibuat

tidak terlalu tebal agar bakteri tidak menumpuk dan agar lebih mudah

mengeringkannya. Setelah itu, kaca obyek difiksasi dengan cara

melewatkannya di atas nyala api sekitar tiga kali. Kaca obyek hanya dilewatkan

agar bakteri pada olesan yang telah dibuat tidak mati karena suhu yang terlalu

panas. Tujuan dari fiksasi ini adalah pelekatan bakteri supaya pada saat

pembilasan, bakteri tersebut tidak ikut hilang terbawa air. Selain itu fiksasi juga

berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami

lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan

pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan

sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya.

Setelah preparat difiksasi, preparat tersebut digenangi larutan H2SO4 1

% selama 2 detik. H2SO4 berperan untuk mengecilkan kembali pori-pori bakteri

agar saat pencucian pewarna fukhsin tetap terjerap dan tidak luntur. Dalam

penambahan H2SO4 ini tidak boleh terlalu lama atau terlalu banyak karena akan

mempengaruhi hasil pengamatan pada mikroskop. Selanjutnya preparat

digenangi pewarna metilen blue selama 5 menit. Metilen blue berperan sebagai

pewarna tandingan yang akan mewarnai badan vegetatif dari bakteri. Badan

vegetatif ini tidak dapat menahan pewarna utama karena ikatannya tidak kuat

sehingga ketika diwarnai dengan pewarna yang berbeda badan vegetatif

tersebut akan menyerap pewarna tandingan. Setelah 5 menit, pewarna yang

berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling secara perlahan kemudian

dikeringkang menggunakan kertas saring.

Preparat yang sudah siap kemudian diamati dibawah mikroskop dan

dicari fokusnya secara perlahan. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran

paling kecil yaitu 10X dan dicoba hingga perbesaran 100x.

Dalam percobaan ini, spora dari bakteri Bacillus subtilis tidak dapat

diamati. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa hal, pertama karena pewarna

fukhsin belum terpenetrasi dengan sempurna, kedua kurangnya pengocokkan

suspensi bakteri sehingga bisa saja bakteri yang terambil adalah bakteri yang

tidak menyerap pewarna fukhsin dengan sempurna. Penyebab lainnya yaitu

pemberian H2SO4 yang tidak tepat sehingga mempengaruhi pengamatan.

8. Kesimpulan

Endospora pada bakteri dapat diamati melalui pewarnaan spora

(pewarnaan Klein) tetapi hasil pengamatan dapat dipengaruhi oleh reaksi-reaksi

kimia yang dilibatkan seperti daya penetrasi zat warna.

9. Daftar Pustaka

Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia, Jakarta.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta

Michael J. Pelczar & E.C.S. Chan, 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Edisi 1

Jakarta :.Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press)

Suriawiria, U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung : Penerbit

Angkasa.

Volk and Whleer, 1998. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Senin, 9 Maret 2015

Kelompok IV

Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama NPM

Wilda Sholihaturrabiah 260110130159

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

PEWARNAAN TAHAN ASAM

1. Tujuan

Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam, dengan

menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (pewarnaan Zielh-Neelsen).

Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur

tersebut.

2. Prinsip

a. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih dari satu

warna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan

dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid

kompleksyang tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam

b. Penetrasi Zat Warna

Penembusan zat warna ke dalam sel bakteri

c. Impermeabilitas Dinding Sel Bakteri Tahan Asam

Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan

bahankimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses

pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam

sehingga bakteritersebut sidebut bakteri tahan asam

d. Pemanasan

Pemansan pada bakteri tahan asam diperlukan untuk memuaikan

dinding sel bakteri agar zat warna dapat masuk ke dalam sel bakteri

3. Teori Dasar

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya

sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi

harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri

tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu

dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen

pada manusia contohnya adalahMycobacterium tuberculosis.

Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita

TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna

merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan

kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan

(Pelczar dan Chan, 1988).

Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri

yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang

tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa

mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain

Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae,

Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium

tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit

tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri

tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan

pernafasan (Syahrurachman, 1994).

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna

karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-

alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Bakteri tahan

asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon

(C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri

dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60%

dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium

tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia

meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah

bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat

tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan

Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Syahrurachman,

1994).

Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan

kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok

bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna

pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol

asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang

tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi

dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay,

1994).

4. Alat dan Bahan

a. Alat

i. Bak pewarna

ii. Botol semprot

iii. Kaca obyek

iv. Kapas

v. Kertas Saring

vi. Mikroskop

vii. Ose

viii. Pembakar Spirtus

b. Bahan

i. Suspensi bakteri

saprofit

ii. Zat warna karbol

fukhsin dan

metilen blue

iii. Asam alkohol

(3%HCl dalam

alkohol 95%)

iv. Alkohol 70%

v. Air suling

vi. Minyak celup

c. Gambar Alat

Bak Pewarna

Botol Semprot

Kaca Obyek

Kapas

Kertas Saring

Mikroskop

Ose

5. Prosedur

Suspensi bakteri Mycobacterium tuberculosis dibuat. Kaca obyek

disiapkan, lalu ditetesi alkohol 70% dan digosok dengan kapas hingga bebas

lemak. Buat daerah pengolesan pada kaca obyek dengan menggunakan spidol.

Olesan dibuat diatas kaca obyek dengan ose yang sudah disterilkan dengan api.

Kemudian preparat digenangi dengan pewarna karbol fuksin selama 5 menit,

sambil dipanaskan di atas penangas air. Preparat dijaga jangan sampai terlalu

panas, mendidih atau kering. Lalu, buang zat warna yang berlebih, dan preparat

dibilas dengan air suling. Preparat dibilas dengan zat pemucat alkohol asam

selama 15 detik atau sampai belakang olesan bewarna merah muda pucat.

Selanjutnya, preparat digenangi dengan pewarna tandingan biru metilen selama

2 menit, zat warna dibuang yang berlebih, lalu dibilas dengan air suling dan

dikeringkan dengan kertas saring. Minyak imersi diteteskan sebanyak 1 tetes

pada preparat, lalu pengamatan dilakukan dibawah mikroskop cahaya. Dimulai

dengan dengan perbesaran 10X, kemudian diganti dengan perbesaran 100X.

Hasilnya diamati dan digambar.

Spirtus

6. Hasil Pengamatan

Bakteri Mycobacterioum tuberculosis

7. Pembahasan

Praktikum kali ini bertujuan untuk mengamati dua kelompok bakteri,

yaitu bakteri tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan

asam (pewarnaan Zielh-Neelsen) dan memahami setiap langkah dan reaksi-

reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. Dimana zat pewarna yang

digunakan yaitu karbol fukhsin dan pewarna tandingannya yaitu metilen blue.

Selanjutnya dibuat olesan bakteri. Untuk membuat olesan bakteri,

disiapkan kaca obyek yang sebelumnya telah direndam dengan larutan etanol

agar bebas dari lemak. Kaca obyek kemudian dikeringkan dan bagian

bawahnya ditandai dengan spidol untuk membuat daerah pengolesan.

Selanjutnya, digunakan ose untuk memindahkan bakteri dari tabung reaksi ke

atas kaca obyek. Sebelum ose dicelupkan pada suspense bakteri, terlebih dahulu

ose disterilkan dengan cara memanaskan kawat ose dengan nyala api.

Tujuannya adalah agar tidak ada bakteri kontaminan yang berasal dari alat-alat

yang digunakan. Metode sterilisasi ini merupakan bagian dari teknik aseptis,

yaitu proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba

kontaminan. Teknik ini diterapkan untuk seluruh alat dan bahan yang

digunakan dalam pembuatan preparasi. Setelah ose disterilkan, ose dibiarkan

mendingin dengan bantuan udara. Tujuan pendinginan ini adalah agar bakteri

yang nanti diambil dengan ose tidak mati karena suhu kawat yang terlalu panas.

Setelah ose dan kaca obyek siap digunakan, dibuat olesan suspensi

bakteri dengan mencelupkan ose pada sampel suspensi bakteri dan

mengoleskannya pada kaca obyek yang sebelumnya telah ditandai. Proses

pembuatan olesan selalu dilakukan di dekat api. Hal ini bertujuan untuk

mencegah adanya bakteri kontaminan selama proses tersebut. Olesan dibuat

tidak terlalu tebal agar bakteri tidak menumpuk dan agar lebih mudah

mengeringkannya. Setelah itu, kaca obyek difiksasi dengan cara

melewatkannya di atas nyala api sekitar tiga kali. Kaca obyek hanya dilewatkan

agar bakteri pada olesan yang telah dibuat tidak mati karena suhu yang terlalu

panas. Tujuan dari fiksasi ini adalah pelekatan bakteri supaya pada saat

pembilasan, bakteri tersebut tidak ikut hilang terbawa air. Selain itu fiksasi juga

berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami

lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan

pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan

sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya.

Setelah preparat difiksasi, dilakukan proses pewarnaan. Untuk

menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam dan bakteri tidak

tahan asam harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Preparat kemudian

digenangi dengan pewarna karbol fukhsin selama 5 menit sambil dipanaskan

diatas penangas air. Preparat dijaga agar tidak terlalu panas, mendidih atau

mengering. Pada umumnya, bakteri tahan asam merupakan bakteri yang lapisan

paling luar selnya terdiri dari lapisan lilin, sehingga menyebabkan zat warna

sukar masuk ke dalam sel bakteri sehingga untuk mewarnainya maka lapisan

lilin pada sel itu harus dihilangkan, yaitu dengan cara pemanasan yang

dimaksudkan supaya lilinnya meleleh, sehingga sel tersebut bisa dengan mudah

menerima zat warna. Karbol fukhsin, basa yang dilarutkan dalam suatu

campuran phenol-alkohol-air berperan sebagai pewarna utama (primary dye).

Pewarna berlebih dibuang kemudian dibilas dengan air suling secara peralahan.

Selanjutnya preparat dibilas dengan zat pemucat atau agen dekolorisasi asam

alkohol yang terdiri dari 3% asam klorida dan dan alkohol 95% selama 15 detik

sampai latar belakang olesan berwarna merah muda pucat. Selain sukar

menerima zat warna, bakteri tahan asam juga sukar menyerap bahan penghilang

zat warna (pencuci), sehingga walaupun dicuci dengan larutan asam alkohol

encer, sel bakteri ini akan tetap mengikat zat warna yang telah masuk dan tidak

terdekolorisasi.

Selanjutnya preparat digenangi pewarna metilen blue selama 2 menit.

Metilen blue berperan sebagai pewarna tandingan. Pewarna yang berlebih

dibilas dengan air suling secara perlahan dan kemudian dikeringkan dengan

kertas saring. Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna merah dari

pewarna primer dan sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena

larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin

dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna dan bakteri akan menyerap

pewarna tandingan yaitu pewarna metilen blue.

Preparat yang sudah siap kemudian diamati dibawah mikroskop dan

dicari fokusnya secara perlahan. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran

paling kecil yaitu 10X dan dicoba hingga perbesaran 100x.

Dalam percobaan ini, perlakuan prosedural seperti yang tertera diatas

tidak dilakukan oleh praktikan karena bakteri yag digunakan terlalu beresiko.

8. Kesimpulan

Bakteri tahan asam dapat diidentifikasi melalui pewarnaan tahan asam

(pewarnaan Zielh-Neelsen) dan dapat dipahami melalui reaksi-reaksi kimia

yang terjadi, yaitu bakteri tahan asam dapat mempertahankan pewarna primer

walaupun telah dicuci dengan agen dekolorosisasi dalam hal ini adalah asam

alkohol. Sedangkan bakteri tidak tahan asam tidak dapat mempertahankan

warna primer dan akan terdekolorisasi oleh senyawa kimia asam alkohol dan

mudah menyerap pewarna tandingan.

9. Daftar Pustaka

Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga

Grafindo Persada.

Michael J. Pelczar & E.C.S. Chan, 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Edisi 1

Jakarta :Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press)

Syahrurachman, A,1994. Mikrobiologi Kedokteran, Edisi Revisi.Jakarta: Bina

Rupa Aksara