ANTIOKSIDANSIOKSIDANSI

Oksidacijski stresi antioksidansi

•Zrak sadrži 21% kisika, O2

• Životinje, biljke i aerobne bakterije trebaju kisik za stvaranje energije (ATP)

•Kisik je toksičan za sve žive oblike, bilo anaerobne ili aerobne

•Život na Zemlji postoji u sprezi s antioksidacijskim staničnim sustavom koji zamjenjuje i uklanja produkte oksidacijskog stresa u in vivo sustavima

Kisik i oksidacijski stres

Slobodni radikali i antioksidansi

• Što su slobodni radikali?• Što su reaktivni kisikovi i dušikovi spojevi (reactive

oxigen species, ROS i reactive nitrogen species, RNS)

• Jesu li ROS/RNS uvijek opasni?• Dobro poznati pojam „ oksidacijski stres“ – što je to?• Poremećaji vezani uz oksidacijski stres• Markeri oksidacijskog stresa• Antioksidansi

Slobodni radikali – što su to?

• čestice s nesparenim elektronom (može biti atom, ion ili molekula)

• nastaju homolitičkim cijepanjem veze

HO-OH HO· + ·OH

• nastoje postići ravnotežno stanje, te reagiraju s elektronom najbliže molekule

• većina biomolekula nisu radikali

Slobodni radikali

• kemičar

tijekom tridesetih - postojanje superoksida• biokemičar

tijekom šezdesetih - otkriće superoksid-dizmutaze (SOD)

• liječnikslobodni radikali dovode se u vezu s mnogim poremećajima

Povećano stvaranje slobodnih radikala uPovećano stvaranje slobodnih radikala urazličitim stanjimarazličitim stanjima

AIDS

Akutni respiratorni sindrom

Starenje

Alkoholizam

Alzheimerova bolest

Ateroskleroza

Diabetes

Karcinom

Hipertenzija

Preopterećenje željezom

Infarkt miokarda

Parkinsonova bolest

Terapija zračenjem

Moždani udar

Vježbanje

ROS (reaktivni kisikovi spojevi)

Slobodni radikali

superoksid, O2· -

hidroksilni radikal, OH ·

peroksilni radikal, ROO ·

alkoksilni radikal, RO ·

hidroperoksilni radikal, HO2

·

Spojevi koji nisu slobodni radikali

vodikov-peroksid, H2O2

hipokloritna kiselina, HClO

ozon, O3

singletni kisik, 1O2

Kisik nije molekula koja izravno izaziva oksidacijski stres, ali je prekursor svih ROS.

Hidroksilni radikal, HO .

•najreaktivnija poznata ROS vrsta •nastaje reakcijom H2O2 s reduciranim željezom ili bakrom (Fentonova reakcija).

Fe2+ + H2O2 + H+ Fe3+ + H2O + HO.

Cu+ + H2O2+ H+ Cu2+ + H2O + HO.

•hidroksilni radikali mogu reagirati kao inicijatori autooksidacije lipida, mogu izazvati i oštećenje proteina, nukleinskih kiselina, ugljikohidrata te drugih organskih molekula ukoliko dolazi do sinteze u njihovoj blizini.

HO. + H-X H2O + X.

•vodikov peroksid je jaki oksidans, međutim pri staničnim uvjetima reakcija njegovog raspada ide vrlo sporo bez metalnog katalizatora

•vrlo male količine redoks-aktivnih metalnih iona mogu katalizirati oksidacijske reakcije H2O2

Fe2+ + H2O2 + H+ Fe3+ + H2O + HO.

Vodikov peroksid se ne smatra opasnim spojem ukoliko nema prisutnih metalnih iona, poglavito Fe2+/3+.

Vodikov peroksid, H2O2

RNS (reaktivni dušikovi spojevi)

Slobodni radikali

dušikov-(II)- oksid, NO .

dušikov-(IV)-oksid, NO2 .

Spojevi koji nisu slobodni radikali

nitrozil, NO+

nitritna kiselina, HNO2

peroksinitrit, ONOO -

alkilperoksinitrit, ROONO

Jesu li ROS/RNS uvijek opasni?

Posljedice djelovanja ROS Regulacija

-rasta stanica -diferenciranja stanica -apoptoze i nekroze

Aktivacija -prijenosa signala -proliferacije stanica

Smanjena učinkovitost -DNA polimeraze -popravljanja DNA

Oksidacijsko oštećenje proteina

Promjena stresom induciranih proteina

i gena

Lipidna peroksidacija

ROS

Pogreške u replikaciji

Promjena konformacije DNA

MUTACIJA

Kemijske promjene u bazama

Uloga NO. u metabolizmu

• u stanicama vaskularnog endotela djeluje vazodilatacijski i regulira krvni

tlak

• u SŽS-u kao neurotransmiter djeluje na više funkcija, uključujući

pamćenje

• na periferiji djeluje preko neadrenergičnih nekolinergičnih živaca

regulirajući funkcije raznih organa

• stvara se u makrofagima njihovom aktivacijom i djeluje citotoksično na

bakterije, gljivice, protozoe i tumorske stanice

• nadzire i sprječava agregaciju trombocita

• sudjeluje u patogenezi septičkog šoka, upalama i hiperdinamičkom

stanju ciroze

Uloga O2· - u metabolizmu

Superoksid nastao djelovanjem NADPH oksidaze i njegov derivat, peroksinitrit, imaju ulogu u regulaciji krvnog tlaka

Dio je citotoksičnog mehanizma pojedinih stanica imunološkog sustava

Poremećaj ravnoteže između stvaranja i eliminacije ROS uzrokuje

Oksidacijski stres

Oksidacijski stres nastaje kao posljedica 3 čimbenika:

1) povećano stvaranje oksidansa2) smanjenje antioksidacijske zaštite3) neuspješan popravak oštećenja

Glavni izvori slobodnih radikala Enzimi ili/i koenzimi s flavinskim strukturama,

hemski koenzimi, enzimi koji sadrže Cu i Fe u aktivnom središtu

-reakcije prijenosa elektrona

1. respiratorni lanac u mitohondriju: uglavnom superoksid, a zatim H2O2

Uloga kisika u respiracijskom procesu

O2.-

O2.-

Glavni izvori slobodnih radikala

2. posebne stanice (leukociti, makrofagi i dr.)

stvaranje superoksida putem NADPH-oksidaze

superoksid može reagirati s vodikom i stvoriti vodikov peroksid a potom i hipokloritnu kiselinu

H2O2 + Cl- + H+ = HClO + H2O

2

Glavni izvori slobodnih radikala

3. endoplazmatski retikulum

(citokrom P- 450)

4. oksidacija hemoglobina

glutation

Štetan učinak slobodnih radikala

Oksidacijsko oštećenje DNA

Oštećenje

• disocijacija šećernih komponenti

• modifikacija baza• pucanje prstena

Posljedica

• pogreške pri translaciji• inhibicija sinteze

proteina• mutacije• kancerogeneza

Oksidacija DNA baze: oksidacija gvanina s OH•

HN

N N

N

H2N

O

R

HN

N N

N•

H2N

O

R

OH

H

HN

NN

N•

H2N

O

R

OH

H

HN

N N

HN

H2N

O

R

O

gvan(oz)in

FAPy-gvanin

HN

NN

N

H2N

O

R

OH

8-OH-gvanin

oksidacijsko otvaranje prstena

redukcija

OH•

Oksidativna oštećenja lipida

Oštećenje

• lipidna peroksidacija• oksidacija lipoproteina

Posljedica

• promjena u fluidnosti i permabilnosti membrana

• utjecaj na integrirane enzime

• stvaranje reaktivnih metabolita (malondialdehida (MDA), 4-hidroksinonenala (HNE), izoprostana i drugih produkata lipidne peroksidacije

Lipidna peroksidacija: inicijacija i propagacija

Linolna kiselina (18:2)

Konjugirani dien

Peroksilni radikal

Lipidni hidroperoksid

R

R

H

H

H

HEtan

LH

R

R

R

R

OO•

R +HOO

••

Aldehid

Eliminacija vodika( inicijacija)OH•-

O2

LH

Konjugacija diena

Adicija kisika

O

Adicija vodika(propagacija)

Fentonova reakcijaFe(II)

O

HH +

•

Fragmentacija

Alkoksilni radikal

H

H •

Oksidacijski stres i ateroskleroza

• povećana lipidna peroksidacija povećava rizik od razvoja ateroskleroze i drugih upalnih bolesti

• oksidirani lipidi u lipoproteinima niske gustoće (LDL) potiču ulazak LDL-a i kolesterola u stanice endotela

• stvaranje plaka povazano je s oksidacijskim stresom i porastom GSSG

• porast GSSG uvjetuje stvaranje superoksidnog aniona i H2O2

• H2O2 potiče agregaciju trombocita

Oksidacijsko oštećenje proteina

Oštećenje

• agregacija, fragmentacija i raspad

• modifikacija funkcionalnih skupina

Posljedica

• promjene u enzimskoj aktivnosti, ionskom transportu

Opći tipovi oksidacijske modifikacije proteina

• oksidacija sumpora (disulfidi)• proteinski karbonili (postranični aldehidi, ketoni)• hidroperoksilni derivati alifatskih aminokiselina• aminokiselinske interkonverzije (npr., His to

Asn; Pro to OH-Pro)• aminokiselinski oksidacijski produkti (npr., p-

hidrokisfenilacetaldehid) • disocijacija peptidnih veza

Markeri oksidacijskog stresa

Detekcija slobodnih radikala

• vrlo komplicirano, zbog kemijskih i fizikalnih svojstava (kratak poluživot)

DPPH; 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidrat stabilan radikal

Detekcija produkata oksidacijskog stresa

Markeri oksidacijskog stresa

Markeri lipidne peroksidacije:

malondialdehid (MDA), konjugirani dieni, 4-hidroksinonenal

(HNE), izoprostani

Markeri oksidativnog oštećenja proteina:

proteinski hidroperoksidi, proteinski karbonili

Markeri oksidativnog oštećenja DNA:

modificirani nukleozidi

Kako djeluju antioksidansi

1) izravno enzimskom katalizom uklanjaju ROS-SOD, GSHPx, CAT

2) reagiraju sa slobodnim radikalima, pretvaraju ih u neradikale dajući im elektron a sami postaju slabo reaktivni radikali-vitamin C, vitamin E

3) kelatiraju ione željeza i bakra-transferin, metalotioneini

4) štite biomolekule od oštećenja drugim mehanizmima-proteini toplinskog stresa (heat shock proteins, HSP)

Antioksidansi

1. Endogeni antioksidansi

• enzimi (citokrom c, SOD, GSHPx, katalaza)

• neenzimatski antioksidansi

• - u membranama ( -tokoferol, -karoten, koenzim Q 10)

- izvan membrana (askorbat, transferin, bilirubin)

2. Egzogeni antioksidansi

• hvatači slobodnih radikala („scavengers“, mimetici SOD)

• prijelazni elementi (Se, Zn)

Enzimski obrambeni sustav

Superoksid-dizmutaze

Aktivno mjesto goveđe SOD (CuZnSOD) leži u šupljini koju tvore dvije petlje. Aktivno mjesto sadrži jedan bakrov i jedan cinkov ion, premoštene imidazolnim prstenom His61. Bakar je koordiniran sa sljedeća tri histidinska liganda i molekulom vode, dok je cink koordiniran s dva histidina i aspartatom.

Superoksid-dizmutaze

2O2. - + 2H+ H2O2 + O2

SOD - nalazi se u svim stanicama koje metaboliziraju kisik

3 vrste SOD:

1) mitohondrijska (Mn SOD)2) citosolna (CuZn SOD)3) izvanstanična (EcSOD)

potrebni različiti kofaktori (metali)

Glutation-peroksidaze (GSHPx)(Se)

Eliminacija hidroperoksida i H2O2

2 GSH + ROOH GSSH + H2O + ROH

2 GSH + HOOH GSSG + 2 H2O

• citosolna i mitohodrijska GSHPx

• izvanstanična GSHPx

• fosfolipid-hidroperoksidna GSHPx

Enzim koristi glutation kao donor elektrona za obnovu reduciranog oblika selenocisteina

Glutation-reduktaza (GR)

Obnavljanje reduciranog oblika glutationa (GSH)

GSSH + 2 H+ + 2 e- 2 GSH

O

OH

NH2

NH

O

NH

O

O

OHSH

O

OH

NH2

NH

O

NH

O

O

OHS

O

OH

NH2

NH

O

NH

O

O

OHS Glutathiondisulfid

(GSSG)

Glutathion (GSH)

H2O2

2 H2O

Katalaza (CAT)(Fe)

2 H2O2 2 H2O + O2

Prilikom uobičajenog stvaranja peroksida (putem hemoglobina i SOD-a) veću aktivnost pokazuje GPx, dok se katalaza uključuje pri većem stvaranju peroksida

peroksisomi, mitohondriji hepatocita, eritrociti

katalaza

Fentonova reakcija

Neenzimski obrambeni sustav

Visokomolekularni antioksidansi (vezuju ione željeza ili bakra)

• transferin• ceruloplazmin• feritin• haptoglobin• hemopeksin• albumin• metalotioneini

Niskomolekularni antioksidansi

Askorbat (vitamin C)

• redukcijsko sredstvo• sinteza kolagena, karnitina,

neurotransmitera• povećava apsorpciju Fe • regeneracija tokoferilnog

radikala• ponekad prooksidans

Tokoferoli (vitamin E)8 izomera

lokaliziran u membranama; zaštita od oštećenja

Askorbinska kiselina i njezini metaboliti

L-askorbat Semidehidro-askorbatni radikal

dehidroaskorbinska kiselina

O

O OH

OCH

CH2

OH

OH

H

O

O OH

OCH

CH2

OH

OH

O

O O

OCH

CH2

OH

OH

O

O O

OCH

CH2

OH

OH

L-Ascorbat Semidehydro-ascorbatradikal

Dehydroascorbinsäuree-

askorbinska kiselina askorbilni radikal dehidroaskorbinska kiselina

polifenoli, npr. flavonoidi

Niskomolekularni antioksidansi

Niskomolekularni antioksidansi

• ubikinon (koenzim Q)

prijenosnik elektrona u respiratornom lancu

kooperacija sa tokoferolom

• karotenoidi: lutein, -karoten, vitamin A

odstranjivanje radikala s lipida

Niskomolekularni antioksidansi

• glutation (GSH, GSSG)

važan redoks sustav u stanicama sisavaca (1-10 mmol/l)

2 GSH GSSG + 2e- + 2H+

eliminacija ROS, stabilizacija redukcijskih oblika (SH-skupine, regeneracija tokoferola i askorbata)

supstrat glutation-peroksidaze

Niskomolekularni antioksidansi

liponska kiselina

regeneracija tokoferola i askorbata

melatonin

lipofilan; hvatač hidroksilnih radikala

Niskomolekularni antioksidansi

• mokraćna kiselina (urati)

• bilirubin

Metali s antioksidacijskom ulogom

SelenUtječe na resorpciju vitamina E, dio je selenoproteina

CinkStabilizira staničnu membranu, povećava imunitetFe i Cu antagonist