Odgovori na pitanja

• 1. Probajte odgovoriti po čemu se GMO biljke dobivene CRISPR-Cas9 razlikuju do „klasičnih“ GMO biljaka? Koja bi opcija bila bolja i zašto?

• - mogu se napraviti male promjene unutar gena što podsjeća na „prirodne, spontane” mutacije, nema „tragova” u genomskoj DNA (geni za otpornost na antibiotik) i teško ih je otkriti!

• 2. Pronađite nova rješenja/ideje koje se predlažu za suzbijanje malarije korištenjem tehnike CRISPR-Cas9.

• -ima jako puno ideja. Koriste se „gene drive” konstrukti kojima se geni šire nemendelovim nasljeđivanjem a dizajniraju se da „napadaju” neki gen od izbora – recimo gen doublesex – ženke budu sterilne. Napravljeni su i komarci bez gena FREP1, gena potrebnog za preživljavanje parazita u probavilu komarca i sazriju da stadija kad se mogu širiti u ljude. Međutim komarci bez gena FREP1 imaju sporiji razvoj do odrasle jedinke, manje se hrane krvlju kada imaju mogućnost za to i odlagat će manje jaja. Ideja je probati ovaj gen inaktivirati kod odraslih komaraca. Rade se i rješenja protiv virusa - da komarci eksprimiraju antitijelo koje ih štiti od denge virusa ili komarci u kojima će se aktivirati toksin ako bude inficiran nekim virusom (dengue, zika, žuta groznica...) i ubije komarca.

• 3. Što je zlatna riža?

- Ova riža ima dodana 3 gena za sintezu beta karotena (provitamin A) i ideja je bila da pomogne u prehrani ljudi koji se hrane isključivo rižom i da im se nadoknadi manjak vitamina A. U 2018 FDA je dozvolio uzgoj i potvrdio da je sigurna za prehranu u SAD i Kanadi, a 2019 je dobijena dozvola za prehranu ljudi u Filipinima, ali nema dozvolu za uzgoj.

Biotehnologija

Porijeklo• Ono što smatramo pod biotehnologijom vjerojatno je započelo s

agronomijom – čuvanje hrane sušenjem, soljenjem i zaslađivanjem

• Proizvodnja fermentiranog pića (razne vrste alkohola), kruha i sira ljudima su poznati već tisućama godina

• Danas se moderna biotehnologija zasniva na genetičkom i staničnom inženjerstvu i mogućnosti primjene su ogromne

• slijede najzanimljiviji primjeri iz biotehnologije

Primjena biotehnologije

• U agronomiji – uzgoj biljaka otpornih na štetnike, sušu, salinitet, hranjivije biljke

• U kemijskoj industriji – proizvodnja etanola, limunske kiseline, acetona, enzima, antibiotika

• U medicini – pametni lijekovi, bolja dijagnostika, personalizirana i regenerativna medicina, genska terapija

• U proizvodnji hrane – proizvodnja fermentirane hrane, vina i drugih pića

• U veterini – proizvodnja vakcina, kontrola rasploda i uzgoj stoke

• Za okoliš – čišćenje okoliša od teških metala, bioremedijacija tla i vode zagađenih toksičnim spojevima

Bioetanol• Etanol je važno industrijsko otapalo i početni materijal u sintezi organskih spojeva poput etilena i

polietilena

• U mnogim zemljama etanol se dodaje kao biogorivo za benzin gdje zauzima 10-15% volumena

• Kao početni izvor ugljika koristi se saharoza (molasa) u Brazilu ili kukuruzni škrob u SAD što je problem jer se kukuruz koristi kao hrana ljudi i stoke

• Najvažniji organizam u proizvodnji etanola je pekarski kvasac Saccharomyces cerevisiae koji ne može početi od škroba već od glukoze – potrebno je prvo depolimerizirati škrob

• Za proizvodnju bioetanola koriste se fed-batch bioreaktori – šećer se dodaje postupno kad stanice završe log fazu, a reakcija se zaustavlja kad je udio etanola 8% jer se zaustavlja metabolizam kvasca

• Etanol se zatim izolira destilacijom

• Sa stajališta zaštite okoliša, bioetanol kao gorivo ima

značajne prednosti pred fosilnim gorivima jer manje zagađuje,

manje izaziva požare, predstavja obnovljivi izvor energije.

Slika preuzeta iz: http://www.dupontelastomers.com/autofocus/a4/af4.asp?article=biofuels

Proizvodnja vina• Alkoholna pića su se neovisno razvila u gotovo svim kulturama na svijetu

• Vino se proizvodi iz grožđa koje je fermentirano pomoću kvasca. Ovisno koje se vino proizvodi (bijelo ili crno) razlikuju se međukoraci u proizvodnji

• Ovisno o zemlji i pravilima, fermentacija se može zaustaviti dodavanjem CaCO3 ili SO2. Također se zaustavlja smeđenje (oksidacija) vina, poboljšava okus i suprimira rast bakterija i plijesni

• Fermentacija može trajati od nekoliko dana do nekoliko mjeseci ovisno o vrsti vina i temperaturi skladištenja

• Šampanjac se proizvodi od kvalitetnih vina dodavanjem 1-3% saharoze i kulture kvasca

• Rakija se proizvodi destilacijom od ekstrakata šećera iz žitarica, povrća ili voća. Udio alkohola iznosi između 30-60 %. Poznati alkoholi su viski, konjak, rum, tekila, vodka…

Proizvodnja piva

• Pivo je najstarije i najraširenije alkoholno piće. Proizvodi se fermentacijom slada (dodavanjem kvasca) u prisustvu ekstrakata hmelja koji daje gorki ukus

• Udio alkohola između 2 do 18 % a sazrijevanje se provodi u bačvama u podrumima na temperaturi od 0 °C kroz nekoliko tjedana. Poslije se pivo filtrira i pasterizira.

• Postoje razne vrste piva koje ovisi o duljini fermentacije, početnom materijalu... (tamno, svijetlo)

• Uvode se mnoge inovacije u proizvodnji, primjerice koriste se rekombinantni sojevi kvasca

https://www.pivovara-medvedgrad.hr/proces-proizvodnje/#vrenje

https://www.pivovara-medvedgrad.hr/proces-proizvodnje/#vrenje

Enzimi u deterdžentima

• Prije 100 godina je Otto Roehm prvi uveo enzime gušterače u deterdžent kako bi se bolje uklonile mrlje od krvi, jaja, kakaa, trave…

• Kloniranjem i proteinskim inženjerstvom dobile su se poboljšane verzije proteaza, a uveli su se drugi enzimi poput lipaza, amilaza, celulaza

• Enzimi u deterdžentima moraju biti stabilni aktivni na temperaturama 30 – 90 °C

https://www.statnews.com/sponsor/2018/02/22/clean-laundry-enzyme-science/

Antitijela

• To su specifični zaštitni proteini koji kruže u krvi i limfi kralježnjaka

• Nastaju kad B-limfociti dođu u kontakt s antigenima (strani proteini, polisaharidi i lipopolisaharidi koji su dijelovi virusa, mikroorganizama i drugih patogena)

• U autoimunim bolestima vlastiti proteini se prepoznaju kao „strani”

• Antitijela spadaju u imunoglobuline i mogu se razvrstati u 5 grupa (IgG, IgM, IgA, IgE i IgD). IgG je najčešći u serumu

• Primjena: u dijagnostici i terapiji ljudskih bolesti

• U liječenju se daju parenteralno

• U dijagnostici poznati primjer je test na trudnoću!

https://www.youtube.com/watch?v=jc2_iBZ9r_k

https://www.youtube.com/watch?v=jc2_iBZ9r_k

Terapeutska antitijela i vakcine

• Terapeutska antitijela su među najuspješnijim rekombinantnim proteinima u kliničkoj upotrebi

• Uglavnom se koriste u terapiji tumora i upalnih bolesti poput Kronove bolesti, reumatoidni artritis... (Bevazicumab ili Avastin ili Infliximab ili Remicade)

• Antitijela mogu biti kimerna ili „humanizirana” ili ljudska

• Kao privremena zaštita od mikroorganizama (virusa, bakterija ili toksina) mogu se dodati specifična antitijela (pasivna imunizacija)

• za doživotnu zaštitu potrebno je stimulirati imunosni sustav da proizvede antitijela (aktivna imunizacija) – proizvodnja B limfocita

• Kao vakcine se koriste oslabljeni virusi, ili antigeni dijelovi mikroorganizama koji nisu patogeni

• Još uvijek ne postoje vakcine za sve bolesti (tropske bolesti, SIDA) – COVID19!

• Najpoznatija cjepiva su protiv rubeole, polio, ospice, pertusis, tuberkuloza, kolera

Vakcine

• Vakcine su se nekad proizvodile u pilećim jajima, a danas se koristi kultura animalnih stanica

• Dodavali su se inaktivirani ili atenuirani virusi

• Danas se razvijaju tehnike rekombinantnih vakcina, transgeničnih biljaka (imunizacija hranom!) i DNA vakcina – još su u počecima

• Vakcina protiv hepatitisa B – prva rekombinantna vakcina

• 2006 FDA odobrila rekombinantnu vakcinu protiv HPV

Farmakogenomika• Svaki pacijent ima drugačiji odgovor na isti lijek – razlog

za veliko kliničko istraživanje na rizike i nuspojava za pojedinačnog pacijenta

• Ideja je istražiti sve polimorfizme kod ljudi prema kojima bi doktor odlučivao o individualnoj terapiji

• Djelovanje lijeka na cilj – poznat je primjer lijeka Trastuzumab ili Herceptin, terapeutsko antitijelo protiv raka dojke

• Aktivan je samo u 1/3 pacijenata koji eksprimirajureceptor Her2 – ciljni protein

• Također je dobro pogledati polimorfizme za gene dihidropirimidin-dehidrogenazu (DPD) i UDP-glukuronosiltransferazu (UGT1A1) prije primjene kemoterapije. Ako su ovi geni neaktivni, kemoterapija može biti s prejakim nuspojavama jer će detoksikacija biti spora Slika preuzeta iz: DOI:https://doi.org/10.1016/S1470-2045(02)00676-9

https://www.youtube.com/watch?time_continue=5&v=pMePYwKw_o4&feature=emb_logo

https://vimeo.com/12434125

https://www.youtube.com/watch?time_continue=5&v=pMePYwKw_o4&feature=emb_logohttps://vimeo.com/12434125

Antibiotici - primjeri• Najpoznatiji -laktamski antibiotici su penicilini i cefalosporini – jako su efikasni,

niske su toksičnosti i lako se industrijski dorade od početnih spojeva (antibiotici druge i treće generacije)

• Biosintetski put sinteze ovih antibiotika (njihovi geni) su klonirani i eksperimentalno modificirani genetičkim inženjerstvom. Za uzgoj se koristi Penicillinum chrysogenum uzgojen u bioreaktorima.

• -laktamski antibiotici sprječavaju povezivanje peptida tijekom sinteze staničnog zida bakterija (mureina)

• Streptomicin spada u aminoglikozide (tu spada jako puno antibiotika poput kanamicin, gentamicin, tobramicin..) ali je toksičan, nekad se koristio za liječenje tuberkuloze. Dosta se koriste u agronomiji. Biosinteza ide u 24 koraka, treba 33 proteina, a genski kluster (skupina gena) se nalazi u genomu Streptomyces griseus

• Tetraciklini – početni spoj je oksitetraciklin i za njegovu sintezu su potrebna 22gena iz bakterije Streptomyces rimosus – koristi se kao antibiotik širokog spektra za ljude i hranjenje životinja

• Makrolidni antibiotici – tu spada azitromicin (sumamed) – niska toksičnost i često se koriste u pedijatriji

Proizvodnja antibiotika• Tradicionalno otkrivanje antibiotika ide na način da se testiraju kemikalije koje inhibiraju

rast bakterija – ako je to otkriveno – antibiotik se pročišćava i otkriva mu se kemijska struktura

• Danas su razvijene modernije metode otkrivanja

• Za proizvodnju antibiotika potrebno je povećati prinos jer su antibiotici sekundarni metaboliti i stoga prisutni u malim količinama

• Tehnikama genetičkog inženjerstva mogu se postići jako velika povećanja

• Zbog komplicirane kemijske sinteze antibiotika, većina ih se proizvodi fermentacijom u bioreaktorima

• Da bi se spriječila katabolička represija, nutrienti se dodaju u stacionarnoj fazi rasta (fed-batch fermentation)

• Antibiotici se pročišćavaju organskim otapalima i često su ekstracelularni produkti

Antibiotici

Danas je veliki problem otpornost na antibiotik, a otpornost se otkriva korištenjem disk difuzijskog testa (lijevo) i E-testa (desno) Određuje se zona inhibicije i minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)

Inzulin

• Inzulin je polipeptidni hormon koji regulira količine glukoze u krvi. Sintetizira se u stanicama gušterače u obliku preproinzulina

• Koristi se za ličenje dijabetesa mellitusa

• Do 1982. inzulin se pripremao ekstrakcijom gušterače životinja. Iz jedne krave se moglo ekstrahirati dovoljno inzulina za 10 dana terapije! Problem su bile i alergijske reakcije

• Danas se proizvodi ljudski rekombinantni inzulin u E. coli i kvascu S. cerevisiaefermentacijom. On je stabilniji i ima produženu aktivnost i sporije se otpušta

• Ljudski inzulin je prvi rekombinantni lijek koji je odobrio FDA

• Sekvenca inzulina otkrivena 1955

Hormon rasta• Hormon rasta (somatotropin) se sintetizira u epifizi i modulira veliki broj metaboličkih

funkcija

• Ljudski hormon rasta se daje djeci kod koje je smanjena sinteza ovog hormona, a ako odrasli koriste dolazi do sinteze mišića na račun masti - bodybuilding

• Iz sličnih razloga se hormoni rasta daju u prehranu životinja – veća sinteza mlijeka i za debljanje svinja. Goveđi i svinjski hormon rasta ne uzrokuju anabolički efekt u ljudi

• U proizvodnji lososa, gen za hormon rasta je stavljen iza jakog promotora – narastu 3-10 puta veći

• U početku se hormon rasta ekstrahirao, a od 1984. se proizvodi genetičkim inženjerstvom u E. coli u bioreaktoru.

Faktori zgrušavanja• Prilikom oštećenja krvnih žila nastaju krvni ugrušci da bi spriječili krvarenje –

homeostaza

• Većini pacijenata oboljelih od hemofilije (postoje 3 tipa) nedostaje faktor zgrušavanja VIII (glikoprotein) čiji gen se nalazi na kromosomu X

• Od 1964 faktori zgrušavanja su izolirani iz krvi donora, ali zbog opasnosti od virusne infekcije se odustalo koja je moguća iz zaražene krvi

• Od 1992. proizvode se rekombinantni faktori VIII i IX. Zbog glikozilacije koriste se animalne stanice u kulturi.

• Prinos dobivenog proteina je mali i cijena proizvodnje visoka

Bioinformatika• Danas postoje mnogi korisni bioinformatički alati kako imenovati gene, metaboličke puteve,

transkripcijske faktore, povezati specifični fenotip s genetičkim markerima ...

• Za imenovanje gena – potrebno je odbaciti DNA koja ne kodira za protein, predvidjeti ulogu gena i povezati ulogu gena s biološkom ulogom u organizmu

• Glavni alat za predviđanje biološke uloge je BLAST (Basic Local Alignememnt Search Tool) koji uspoređuje sekvence DNA sa sekvencama u bazi podataka (GeneBank) i predviđa ulogu na temelju homologije

Bioinformatika

• KEGG – Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes – nastoji opisati cijele stanice i organizme koristeći bioinformatičke alate – organizmi se mogu i međusobno uspoređivati koristeći KEGG orthology sustav

• Ostali poznati algoritmi: FANTOM; BRENDA; ENCODE

Razvoji novih biotehnologija

• Zanimljiva i vrlo unosna je nova industrija hrane bez mesa bazirana samo na biljkama – bio hrana i veganska hrana u kojoj se ne smije koristiti mlijeko i jaja

• Za zadaću:

• 1. Istražite kako je moguće biljnu hranu obogatiti proteinima i koje se nove ideje razvijaju da smanji udio mesa u ljudskoj prehrani

• 2. Jesu li ta rješenja dugoročno dobra za zdravlje ljudi ili ne i za okoliš?

• 3. Istražite u kojem se slučaju kao genska terapija za liječenje neplodnosti koristi metoda „tri roditelja” i malo ju opišite.