1

UNIVERZITA P.J. ŠAFÁRIKA V KOŠICIACH

PRÍRODOVEDECKÁ FAKULTA

KATEDRA GENETIKY

MOLEKULÁRNE MARKERY A ICH VYUŽITIE PRI ŠTÚDIU

REPRODUKČNEJ DIVERZITY HYPERICUM PERFORATUM L.

Písomná práca k dizertačnej skúške

ŠKOLITE Ľ: DOKTORAND : PROF. RNDR. EVA ČELLÁROVÁ , CSC. MGR. JÁN KOŠUTH

KOŠICE 2002

2

OBSAH

POUŽITÉ SKRATKY 4

1. ÚVOD 5

2. HYPERICUM PERFORATUM L. 6

2.1 Základná charakteristika 6

2.2 Sekundárne metabolity Hypericum perforatum 7

2.2.1 NAFTODIANTRÓNY (HYPERICÍN, PSEUDOHYPERICÍN) 9

2.3 Účinky sekundárnych metabolitov Hypericum perforatum 11

2.4 In vitro kultivácia a produkcia sekundárnych metabolitov 13

2.5 Rozmnožovanie Hypericum perforatum 15

3. APOMIXIA 18

3.1 Apomixia a sexualita 19

3.2 Gametofytická apomixia 20

3.2.1 DIPLOSPÓRICKÁ APOMIXIA 21

3.2.2 APOSPÓRICKÁ APOMIXIA 22

3.3 Sporofytická apomixia 24

3.4 Dedičnosť apomixie 25

3.4.1 GENETICKÁ KONTROLA GAMETOFYTICKEJ APOMIXIE 25

3.4.1.1 Apomeióza (Apospória, Diplospória) 26

3.4.1.2 Partenogenéza 27

3.4.1.3 Vývin endospermu 28

3.4.2 GENETICKÁ KONTROLA SPOROFYTICKEJ APOMIXIE 29

3.5 Regulácia apomiktických procesov. 30

3.5.1 APOMIXIA A POLYPLOIDIA 30

3.5.2 GENÓMOVÝ IMPRINTING 32

3.6 Molekulárne markery pri štúdiu apomixie 34

4. GENETICKÉ MARKERY 36

4.1 Morfologické markery 36

4.2 Molekulárne markery 36

4.2.1 MARKERY ZALOŽENÉ NA POLYMORFIZME PROTEÍNOV 37

4.2.2 MARKERY ZALOŽENÉ NA POLYMORFIZME DNA 37

3

4.2.2.1 Markery a metódy založené na hybridizácii nukleových kyselín 38

4.2.2.1.1 RFLP 38

4.2.2.1.2 DNA-fingerprinting 39

4.2.2.1.3 DGGE 39

4.2.2.2 Markery a metódy založené na PCR 39

4.2.2.2.1 RAPD 40

4.2.2.2.2 AP-PCR 40

4.2.2.2.3 DAF 40

4.2.2.2.4 RAMPO 41

4.2.2.2.5 SSR a ISSR 41

4.2.2.2.6 CAPS 41

4.2.2.2.7 STS 41

4.2.2.2.8 EST 42

4.2.2.2.9 SCAR 42

4.2.2.2.10 AFLP 42

5. ZÁVER 44

6. TÉZY DOKTORANDSKEJ DIZERTAČNEJ PRÁCE 45

7. LITERATÚRA 46

POUŽITÉ SKRATKY

TDZ 1-fenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) močovina CYP3A4 cytochróm P450-3A4 monooxigenáza PXR pregnane X receptor GABA gamma-aminobutyric acid MCMV Murine cytomegalovirus HIV Human immunodeficiency virus FCSS Flow Cytometric Seed Screen ASGR Apospory-specific genomic region fis Fertilization Independend Seed mae MEDEA fie Fertilization Independend Endosperm PcG Polycomb Gens DDM Decrease in DNA Methylation PCR Polymerse Chain Reaction PAGE Polyakrylamidová gélová elektrogoréza RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism VNTR Variable Number Tandem Repeat DGGE Denaturating Gradient Gel Electrophopresis MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary Primered PCR DAF DNA Amplification Fingerprinting RAMPO Random Amplified Microsatelite Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STR Short Tandem Repeats ISSR Inter Simple Sequence Repeats CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence STS Sequence Tagged Sites EST Expressed Sequence Tag SCAR Sequence Characterized Amplified Regions AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

5

1. ÚVOD

V posledných rokoch opäť vzrástol záujem o liečivá prírodného pôvodu získavané z

liečivých rastlín. Vyše 40 % liečiv predpisovaných vo vyspelých krajinách tvoria látky

prírodného pôvodu.

Medzi tieto farmaceuticky dôležité prírodné liečivá patrí aj rastlinná droga Hypericum

perforatum a extrakty z nej pripravené. Hypericum perforatum sa používa v ľudovom

liečiteľstve už viac ako 2000 rokov. Obsahuje široké spektrum farmaceuticky významných

látok s protizápalovými, spazmolytickými, antibiotickými, sedatívnymi, antivírusovými a

antineoplastickými účinkami. V súčasnosti sú liečivá z Hypericum perforatum značne

využívané v Nemecku pre liečbu depresie, kde sú predpisované približne 20 krát častejšie ako

syntetické antidepresíva.

Produkcia týchto látok závisí vo veľkej miere na dostupnosti z prírodných stanovíšť.

Cieľom pestovateľských a šľachtiteľských programov je selekcia genotypov s vysokým

dôležitých farmaceuticky účinných látok. Vhodnou alternatívou pre produkciu týchto látok,

resp. pre rozšírenie genetickej variability s následnou fixáciou výhodných čŕt by mohli byť

rastlinné bunkové kultúry.

Nezanedbateľnou vlastnosťou v procese selekcie a kultivácie je aj spôsob

rozmnožovania. Pri Hypericum perforatum bola identifikovaná veľká diverzita možných

reprodukčných ciest v dôsledku fakultatívne apomiktického spôsobu rozmnožovania. Tomuto

fenoménu, ktorý umožňuje klonálnu produkciu potomstva prostredníctvom semien sa venuje

v posledných rokoch veľká pozornosť. Je študovaná dedičnosť tejto vlastnosti a sú hľadané

gény za ňu zodpovedné. Izolácia týchto génov a ich prenos do ďalších rastlín by potom

umožnili neustále množenie akéhokoľvek hybridného genotypu.

K štúdiu apomiktického rozmnožovania ako aj k izolácii génov apomixie prispievajú vo

veľkej miere molekulárno-biologické metódy štúdia rastlinného genómu. Markery nimi

generované umožňujú rýchlu a jednoduchú identifikáciu pôvodu potomstva pri rôznych

kríženiach.

6

2. HYPERICUM PERFORATUM L.

Ľubovník bodkovaný (Hypericum

perforatum L., obr. 1), zástupca kozmopolitého

rodu Hypericum, ktorý zahŕňa viac ako 400

druhov rozdelených do 31 sekcií (Robson

1981), je v oblastiach jeho prirodzeného

rozšírenia (Európa, Ázia až severozápadná

Čína, Malá Ázia, severozápadná India a

severná Afrika) považovaný za divorastúcu

rastlinu a liečivú bylinu, ale aj nebezpečnú

agresívnu burinu v oblastiach zavlečenia

(severná Amerika, Austrália, Južná Afrika a

Južná Amerika (Campbell a Delfosse 1984).

Ako liečivá bylina je bohatým zdrojom mnohých farmaceuticky významný látok.

2.1 Základná charakteristika

Ľubovník bodkovaný je dvojročná až trváca bylina veľmi premenlivého vzhľadu. Byľ

krátko plazivá až priama s vyniknutými hlavnými lištami. Listy sú krížmo sediace, protistojné

široko vajcovité až čiarkovité. Kvety obojpohlavné, pravidelné, štvor- až päť-početné,

vytvárajú súkvetia z voľných až mierne nahustených vidlíc. Vrchný semenník s troma

čnelkami je obklopený trojzväzkovými tyčinkami. Kališné lístky kopijovité až podlhovasto

vajcovité na vrchole špicaté, celistvookrajové alebo drobno zúbkaté. Korunné lupienky

zlatožlté (Zelený 1982). Pre Hypericum perforatum je typická prítomnosť rozličných typov

sekrečných štruktúr pre biologicky aktívne látky, a to priesvitné žliazky alebo exkrečné

nádržky schizogénneho pôvodu, tmavé noduly a sekrečné kanáliky. Na rozdiel od

priesvitných žliazok, ktoré sú roztrúsené po celom povrchu listov a kvetných obalov, tmavé

noduly vykazujú selektívnu distribúciu na okrajoch listov, kališných lístkov a korunných

lupienkov. Ukázalo sa, že súkvetia sú najbohatšie na tieto noduly. Zatiaľ čo priesvitné žliazky

pozostávajú z otvorenej dutinky, v ktorej sa akumulujú olejovité látky (predovšetkým éterický

olej), tmavé noduly predstavujú komplexné mnohobunkové útvary podobné žľazám, v

ktorých sa hromadí a pravdepodobne aj syntetizuje hypericín a jeho deriváty (Curtis a Lersten

Obr. 1 Hypericum perforatum L.

7

1990, Čellárová a kol. 1994, Fornasiero a kol. 1998, Liu a Hu 1999, Briskin a Gawienowski

2001, Ciccarelli a kol. 2001).

Hypericum perforatum je veľmi polymorfný druh, hlavne čo sa týka veľkosti rastlín,

tvaru listov, veľkosti kvetných orgánov a hustoty priesvitných a tmavých žliazok. Existuje

množstvo foriem, variet a poddruhov Hypericum perforatum. Morfotypy sú stabilné počas

kultivácie (Mártonfi a kol. 1996a), hoci in vitro regeneráciou vzniká morfologicky variabilná

populácia (Čellárová a kol. 1992).

Hypericum perforatum je tetraploid (2n = 4x =32) so základným chromozómovým

číslom x = 8 (Robson 1981, Murín 1997), ale vyskytujú sa aj diploidné 2n =16 (úzkolisté) a

občas aj hexaploidné 2n = 48 formy. Karyotyp zostavila Brutovská a kol. (2000b).

Chromozómy sú ťažko počítateľné, pretože sú veľmi malé (0,78-1,52 µm), väčšinou

morfologicky nerozlíšiteľné, metacentrické a submetacentrické, veľmi podobné Hypericum

erectum a Hypericum pseudopetiolatum. Podstatne ľahšou a rýchlejšou metódou na určenie

ploidie je určenie množstva DNA v jadre metódou prietokovej cytometrie. Hypericum

perforatum patrí medzi rastliny s malým nukleárny genómom. Obsah DNA v jadre je

2C = 1,55 pg u Hypericum perforatum (2n = 4x = 32, Brutovská a kol. 1998).

Predpokladanými pôvodcami Hypericum perforatum sú diploidy Hypericum maculatum

CRANTZ a Hypericum attenuatum CHOISY (2n = 2x = 16), (Robson 1981, Campbell a

Delfosse 1984). Vzhľadom na najnovšie poznatky o značnej divergencii tvorby semien a

koexistenciu viacerých reprodukčných dráh, dokonca aj v jednej rastline, je určenie

evolučných aspektov veľmi zložité. Najnovšie Brutovská a kol. (2000a) vyslovili na základe

výsledkov fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH) rDNA oblastí (5S a 25S-rDNA)

predpoklad, že Hypericum perforatum sa mohlo vyvinúť aj autopolyploidizáciou Hypericum

maculatum, alebo nejakého ich blízkeho spoločného predka.

2.2 Sekundárne metabolity Hypericum perforatum

Hypericum perforatum sa využíva ako liečivá rastlina už viac ako 2000 rokov. Na

prípravu extraktov sa používa surová droga, herba hyperici, ktorá pozostáva z nadzemnej

časti Hypericum perforatum zbieranej tesne pred kvitnutím alebo počas kvitnutia. Bolo

identifikovaných približne 7 skupín biologicky aktívnych látok (fenylpropány, flavonolové

deriváty, biflavóny, proantocyaníny, xantóny, floroglucinoly, a naftodiantróny, obr. 2) z

Hypericum perforatum. Okrem toho boli v extraktoch z herba hyperici detekované taníny,

8

niektoré aminokyseliny a zložky éterického oleja (Čellárová a kol. 1995, Nahrstedt a

Butterweck 1997).

Hlavnú zložku suchej surovej drogy tvoria biogeneticky príbuzné fenylpropány (hlavne

kyselina chlorogénová, kyselina kávová), flavonolové glykozidy a ich aglykóny

(predovšetkým quercetín, hyperozid, rutín, izokvercitrín, kvercitrín), biflavóny (I3,II8

biapigenín a I3’,II8 biapigenín) a oligomérne proantocyanidíny. Xantóny a naftodiantróny sa

zvyčajne vyskytujú v menšom množstve (menej ako 1 %). Floroglucinoly môžu presiahnuť

5 % v čerstvej byline (Čellárová a kol. 1995, Mártonfi a kol. 1996b, Nahrstedt a Butterweck

1997, Jürgenliemk a Nahrstedt 2002).

Surová droga vykazuje variabilitu v obsahu jednotlivých látok, čo je ovplyvnené

predovšetkým vnútrodruhovou variabilitou, ekologickými faktormi, časom zberu

a spracovaním rastlinného materiálu (Southwell a Campbell 1991, Čellárová a kol. 1994,

Büter a kol. 1998). Obsah sekundárnych metabolitov v prvom roku kultivácie je významne

nižší (12-83 %) ako nasledujúci. Genetické faktory taktiež výrazne ovplyvňujú rastlinný

výnos, ako aj obsah sekundárnych metabolitov počas kultivácie Hypericum perforatum. Bol

pozorovaný významný vplyv genotypu na produkciu rôznych sekundárnych metabolitov

(flavonoidy, naftodiantróny a floroglucinoly), zatiaľ čo vplyv prostredia bol menej zreteľný.

Preto dostupnosť geneticky kvalitnejšieho rastlinného materiálu sa považuje za kľúčový

faktor pre úspešnú poľnú produkciu s vysokými výnosmi v budúcnosti (Büter a kol. 1998).

Hoci sú dostupné literárne zdroje o obsahových látkach (predovšetkým

naftodiantrónoch), autori sa zvyčajne zmieňujú o obsahu v celkovej suchej droge, bez

známeho pomeru jednotlivých častí (Southwell a Campbell 1991). Zastúpenie jednotlivých

sekundárnych metabolitov v jednotlivých častiach kvetu je rôzne. Flavonolové glykozidy sú

najviac zastúpené v kališných lístkoch a korunných lupienkoch, rutín v kalichu a tyčinkách a

biflavonoid 3,8’’biapigenín predovšetkým v tyčinkách a okvetí. Naftodiantróny sa akumulujú

v tyčinkách a korunných lupienkoch. Acylfloroglucinoly boli prítomné vo veľkom množstve

v piestiku (Repčák a Mártonfi 1997). Počas ontogenézy kvetu sa zastúpenie jednotlivých

sekundárnych metabolitov mení, čo súvisí aj so zväčšovaním, resp. odkvitaním jednotlivých

častí, v ktorých sa predovšetkým akumulujú. Obsah hypericínu a pseudohypericínu postupne s

procesmi rozvíjania kvetu a odkvitaním klesá. Obsah hyperforínu a adhyperforínu je počas

prvých fáz stabilný a prudko sa zvyšuje v odkvitnutých kvetoch. Pôvodne vysoký obsah

biapigenínu v púčikoch sa vo fázach kvitnutia a odkvitania znižuje. Dynamika obsahu

quercetínových glykozidov hyperozidu, izokvercetínu a kvercitrínu ukazuje na zvyšovanie

9

obsahu pri rozkvitaní a jeho znižovanie pri odkvitaní (Mártonfi a Repčák 1994, Tekeľová a

kol. 2000). Zaujímavým pozorovaním bola neprítomnosť rutínu vo vzorkách. Rovnako

rastliny bez rutínu pozoroval Umek a kol. (1999) aj Mártonfi a kol. (2001).

OH O

O

R

O

O

CH3OH

OH OH

OH CH3R

OH OHO

O

CH3OH

OH OH

OH CH3R

OH OHO

Hyperforín R=HAdhyperforín R=CH3

Protopseudohypericín R=OHPseudohypericín R=H

Protohypericín R=OHHypericín R=H

Obr. 2 Štruktúra hypericínov a acylfloroglucinolov Hypericum perforatum

2.2.1 Naftodiantróny (hypericín, pseudohypericín)

Pretože naftodiantróny hypericín a pseudohypericín významne prispievajú k

terapeutickým účinkom Hypericum perforatum, ich množstvo v rastlinnom materiáli

predstavuje významný faktor pri určení efektívnosti tohto liečiva. Viacerí autori sa zvyčajne

zmieňujú o obsahu hypericínov, čo predstavuje celkový obsah hypericínu, pseudohypericínu a

ich protoforiem. Variabilita v koncentrácii hypericínov vo vzorkách Hypericum perforatum

môže byť ovplyvnená genotypom, ale aj ekologickými podmienkami, vývinovou fázou,

pomerom jednotlivých rastlinných častí a pletív v droge (kvet, listy, stonka), časom zberu,

sušením a skladovaním rastlinného materiálu (Bombardelli a Marazzoni 1995, Jensen a kol.

1995, Walker a kol. 2001). Boli pozorované rozdiely v obsahu hypericínov v rámci rôznych

morfotypov. Koncentrácia hypericínov v listoch úzkolistého typu (Hypericum perforatum

subsp. angustifolium) je dva až trikrát vyššia ako u širokolistého typu (Hypericum perforatum

subsp. perforatum, Southwell a Campbell 1991, Southwell a Bourke 2001). Koncentrácia

hypericínov v rastline sa znižuje v poradí: kvet a kvetný púčik, vrchné listy, spodné listy,

vedľajšia stonka a hlavná stonka. Obsah hypericínu koreluje s hustotou žliazok. Množstvo

hypericínov sa mení zo zimného minima až po letné maximum (Southwell a Campbell 1991).

10

Dostupnosť dusíka v pôde môže mať významný vplyv na produkciu týchto látok. Znižovanie

množstva dostupného dusíka až na 1/20 kontrolnej hladiny vedie k zvýšeniu produkcie

hypericínov 2,4 až 3,3 násobne, pričom nie je ovplyvnený vzájomný pomer množstiev

hypericínu a pseudohypericínu. Hoci Southwell a Campbell (1991) pozorovali koreláciu

medzi počtom tmavých žliazok a množstvom hypericínu, nebola pozorovaná významná

zmena množstva žliazok pri takto zvýšenej produkcii hypericínov (Briskin a kol. 2000).

Zvýšená svetelná intenzita má za následok zvyšovanie hladiny celkového hypericínu

produkovaného v listoch pri súčasnom zvýšení množstva počtu tmavých žliazok v novo sa

formujúcich listoch. V tomto ohľade bola pozorovaná lineárna závislosť medzi počtom

žliazok a hladinou celkového hypericínu v listoch. Oba tieto vplyvy na zvýšenie množstva

hypericínov sa zdajú byť nezávislé (Briskin a Gawienowski 2001). Pozorovanie, že zvýšenie

intenzity svetla vedie ku zvýšeniu hypericínov v listoch môže byť vysvetlené v zmysle

zvýšeného množstva uhlíka dostupného pre biosyntézu týchto zlúčenín v porovnaní s

potrebami pre rast rastliny. Zvýšenie počtu tmavých žliazok na list pri zvýšenej intenzite

svetla môže naznačovať dodatočný fotomorfogenetický účinok svetla na vývin tmavých

žliazok. Rovnako, vplyv na množstvo tmavých žliazok, a teda aj množstvo produkovaného a

akumulovaného hypericínu, má aj prítomnosť cytokinínov (1-fenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)

močovina, TDZ) v médiu počas in vitro kultivácie. Prídavok cytokinínov v médiu stimuloval

viac ako 2,5 násobne tvorbu žliazok po celom povrchu novovytvorených listov (Smith a kol.

2002 ).

Hoci bola dokázaná akumulácia hypericínov v tmavých žliazkach (Briskin a

Gawienowski 2001), o mieste ich syntézy a o biosyntetickej dráhe týchto látok u vyšších

rastlín sa vie iba málo. Hypericíny sú pravdepodobne produktmi antranoidného metabolizmu

syntetizované polyketidovou biosyntetickou cestu (Dewick 1997). Je známe, že tieto

fotodynamické pigmenty sú pôvod v emodín antróne, ktorý je dimerizovaný a ďalej

oxidovaný na hypericín (1,3,4,6,8,13-hexahydroxy-10,11-dimetylfenantro-[1,10,9,8-opgra]-

perylen-7,14-dión, obr. 3). V niektorých hubách (Aspergillus, Penicillium) a niektorých

vyšších rastlinách (Rhamus frangula, Rumex alpinus) vzniká oktaketid emodín lineárnou

kondenzáciou a cyklizáciou jednej molekuly acetylCoA a siedmych molekúl malonylCoA

(Leistner 1971, Dewick 1997). Protoformy, protohypericín, protopseudohypericín sú

konvertované účinkom svetla na hypericín a pseudohypericín (Poutaraud a kol. 2001).

11

O

OH

OH OH

O

OH

OH OH

OH

OH OHO

O

O

OH

OH OH

OH

OH OHO

O

OH

OH OH

OH

OH OHO

O

OH

OH OH

OH

OH OHO

O

O

O

emodin antron

protohypericínhypericín

Obr. 3 Biosyntéza hypericínu (Dewick 1997)

2.3 Účinky sekundárnych metabolitov Hypericum perforatum

Liečivá bylina Hypericum perforatum sa už tradične používa ako vonkajšie

protizápalové liečivo pre ošetrovanie opuchov, rôznych poranení a popálenín (Bombardelli a

Marazzoni 1995), ale predovšetkým ako antidepresívum.

Extrakt z Hypericum perforatum je účinný proti niektorým gram-pozitívnym baktériám

a baktérii Staphyloccocus aureus rezistentnej na methycilin, ale nie je účinný proti ďalším

skúmaným gram-negatívnym bakteriám (Reichling a kol. 2001). V poslednej dobe sa zvyšuje

záujem o túto liečivú rastlinu, hlavne kvôli pozorovaným antidepresívnym a antivírusovým

účinkom jeho extraktu. Hoci v súčasnosti je tento extrakt jedným z najviac študovaných

prírodných liečiv a je úspešne používaný ako antidepresívum, účinná látka a mechanizmu

účinku sú stále vecou skúmania a vedeckých diskusií. Viaceré štúdie predpokladajú, že tento

antidepresívny účinok je sprostredkovaný aktiváciou serotonínového, norepinefrínového a

dopamínového systému (Chatterjee a kol. 1998, Calapai a kol. 2001, Müller a kol. 2001).

Za posledné dve dekády použitie extraktu Hypericum perforatum pre liečbu depresie

prešlo serióznym vedeckým výskumom a jeho účinnosť bola potvrdená vo vedeckých

12

štúdiách a klinických pokusoch porovnávajúcich ho s placebom a účinkami syntetických

antidepresív. Čo sa týka bezpečnosti a toleratibility, štúdie potvrdili, že preparáty z

Hypericum perforatum sú bezpečnejšie a lepšie tolerované ako syntetické preparáty s výrazne

menším množstvom vedľajších účinkov. V štúdiách porovnávajúcich účinky extraktu

Hypericum perforatum s placebom bola miera odozvy na Hypericum perforatum výrazne

vyššia ako na placebo. Účinok rastlinného extraktu z Hypericum perforatum v porovnaní s

účinkom syntetických antidepresív (napr. imipramín) pri liečbe slabej až miernej depresie je

ekvivalentný a pacienti ho lepšie znášajú (Woelk 2000, McIntyre 2000, Kasper 2001).

Hypericum perforatum teda môže byť považovaný ako efektívne liečivo ľahkej až miernej

depresie a malé vedľajšie účinky sú jeho hlavnou výhodou v antidepresívnej liečbe. Pri

použití Hypericum perforatum treba brať do úvahy aj interakcie s inými liečivami. Aj

prírodné liečivá môžu významne ovplyvniť účinok klasických liečiv. Pacienti by mali preto

byť informovaní, že prírodný nemusí znamenať neškodný. Extrakt Hypericum perforatum

mení aktivitu niektorých enzýmov. Aktivuje cytochróm P450-3A4 monooxigenázu, CYP3A4,

zložku cytochróm P450 enzýmového systému, ktorý je potrebný pri metabolizme viac ako

50 % liečiv. Tým sa znižuje terapeutické množstvo niektorých liečiv ako sú napr. cyklosporín,

digoxín, orálne antikonceptíva a indinavir (Barone a kol. 2000, Biffignandi a Bilia 2000,

Moore a kol. 2000). Za tento účinok je pravdepodobne zodpovedný hyperforín, ktorý sa viaže

na jadrový receptor (pregnane X receptor, PXR) regulujúci expresiu CYP3A4 (Moore a kol.

2000).

V súvislosti s popísanými antidepresívnymi účinkami najviac študovanými

sekundárnymi metabolitmi sú hyperforín a fotodynamické pigmenty hypericín a jeho deriváty

(protohypericín, protopseudohypericín a pseudohypericín). Hyperforín je považovaný za

hlavnú antidepresívnu zložku. Inhibuje v in vitro aj in vivo testovacích systémoch príjem

serotonínu, dopamínu, noradrenalínu, GABA a L-Glutamátu, čo pravdepodobne predstavuje

hlavný mechanizmus antidepresívneho účinku (Chatterjee a kol. 1998, Gambarana a kol.

2001, Müller a kol. 2001). Na druhej strane, iné pokusy favorizujú účinok naftodiantrónov

(Butterweck a kol. 1997, 1998). Ďalšími predpokladanými látkami spôsobujúcimi tento efekt

sú aj xantóny a flavonoidy (Bombardelli a Marazzoni 1995, Butterweck a kol. 2000). Simmen

a kol. (2001) študovali in vitro farmakologické účinky celkového extraktu aj jednotlivých

zložiek (hypericíny, hyperforín, protocyaníny a biflavonoidy) na rozličné CNS receptory

pravdepodobne zapojené v sprostredkovaní antidepresívnych účinkov. Na základe schopnosti

inhibície rôznych testovaných zložiek extraktu na tieto receptory sa predpokladá aditívny

13

alebo synergický účinok viacerých zlúčenín zodpovedných za antidepresívne účinky

Hypericum perforatum.

Medzi ďalšie významné funkcie hypericínu a hyperforínu patrí aj protinádorový účinok.

Zdá sa, že hyperforín je aktívny proti širokému spektru rakovinových buniek a nebola

pozorovaná jeho vážna toxicita. Hyperforín indukuje apoptózu prostredníctvom

mitochondriami sprostredkovanej cesty (Schempp a kol. 2002a). Fotoaktivovaný hypericín a

pseudohypericín aktivujú apoptózu v neoplastických bunkových líniách, zatiaľ čo

neaktivované pigmenty nemali v rovnakých dávkach žiadny efekt. Cytotoxický účinok

pseudohypricínu predstavuje síce len polovicu účinku hypericínu, ale jeho účinok by sa mal

počas terapie extraktmi Hypericum perforatum brať do úvahy, pretože jeho množstvo v droge

je v porovnaní s množstvom hypericínu dvojnásobné (Schempp a kol. 2002b).

Fotoaktivovaný hypericín taktiež inaktivuje niektoré vírusy, ako sú napr. Murine

cytomegalovirus (MCMV ), Sindbis virus, Human immunodeficiency virus typ 1 (HIV-1 ) a

ďalšie (Meruelo a kol. 1988, Hudson a kol. 1991).

2.4 In vitro kultivácia a produkcia sekundárnych metabolitov

V dôsledku známych antidepresívnych a antivírusových účinkov extraktov z Hypericum

perforatum sa zvyšuje využitie tejto rastlinnej drogy počas posledných niekoľkých rokov.

Ako výsledok tohto potenciálu ako farmakodynamickej látky, bol vyvinutý in vitro systém pre

túto rastlinu (Čellárová a kol. 1992, Pretto Santarém 2000). Bunkové in vitro kultúry sú

vhodným experimentálnym systémom pre produkciu biomasy, rozšírenie genetickej

variability a štúdium biosyntetickej kapacity a biosyntetických dráh.

Informácie o produkcii farmakologicky dôležitých látok prostredníctvom in vitro kultúr

tohto druhu sú stále zriedkavé. Bola popísaná tvorba a variabilita množstva hypericínov u

regenerantov a kultúr diferencovaných výhonkov Hypericum perforatum (Zdunek a

Alfermann 1992, Čellárová a kol. 1995). Kartnig a kol. (1996) pozoroval produkciu rôznych

sekundárnych metabolitov (hypericín, pseudohypericín, rutín, hyperozid, izokvercitrín,

kvercitrín, kvercetín, I3,II8-biapigenín, I3’,II8-biapigenín) v bunkových kultúrach 7 druhov

rodu Hypericum, (Hypericum perforatum L, H. maculatum Crantz, H. tomentosum L., H.

bithynicum Boiss, H.glandulosum Ait., H. balearicum L., H. olympicum L.). Vo všetkých

kultúrach (okrem H. olympicum) pozorovali produkciu flavonoidov a hypericínov. Množstvo

sledovaných látok sa líšilo v závislosti od druhu.. Vo všeobecnosti však obsah

14

pseudohypericínu vysoko prevyšoval množstvo hypericínu. Nebola pozorovaná korelácia

medzi rýchlosťou rastu kultúry a produkciou hypericínov a flavonoidov. Významná pozitívna

korelácia bola pozorovaná medzi obsahom hypericínu a pseudohypericínu, amentoflavónom

(I3’,II8-biapigenin) a sumou mono- a biflavonoidov. Pozitívna korelácia bola pozorovaná

medzi amentoflavónom a rutínom, hyperozidom a kvercetínom a medzi I3, II8-biapigenínom

a amentoflavónom.

Množstvo produkovaných hypericínov v bunkových kultúrach Hypericum perforatum

závisí od stupňa diferenciácie. Kirakosyan a kol. (2000b) detekovali iba stopové množstvá

hypericínu a pseudohypericínu v kaluse odvodeného z tyčiniek. Počas ďalšej diferenciácie a

regenerácie pozorovali vývin početných mnohobunkových štruktúr a hypericínové noduly

v novo sa formujúcich regenerovaných listoch s celkovým obsahom hypericínu

a pseudohypericínu v diferencovaných listoch významne vyšším ako v intaktnom pletive.

Celkové množstvo hypericínu a pseudohypericínu v rôznych bunkových štruktúrach koreluje

so stupňom bunkovej diferenciácie a dosahuje svoju najvyššiu hodnotu počas listovej

morfogénezy. Kalus a bunkové suspenzné kultúry boli schopné produkcie hypericínov, ale

táto schopnosť bola exprimovaná iba v komplexných multikomponentných bunkových

systémoch. Produkciu hypericínov v bunkových kultúrach možno zvýšiť použitím rozličných

elicítorov. Pôsobením polysacharidu mannan stimulovali Kirakosyan a kol. (2000a)

produkciu hypericínov v kultúrach diferencovaných výhonkov. Množstvo produkovaného

pseudohypericínu na takto zvýšilo na takmer 4-násobok a hypericínu na takmer 2-násobok.

Rovnakí autori požitím kúskov korku ako elicítora indukovali syntézu pseudohypericínu až na

3-násobok (Kirakosyan a kol. 2001). Walker a kol. (2002) použili ako elicítor jasmonát a

kultiváciu v tme, ktoré v bunkových suspenzných kultúrach dramaticky indukovali tvorbu

hypericínu. Už samotnou kultiváciou v tme (bez elicítora) sa množstvo produkovaného

hypericínu zvýšilo 2,4-násobne. Množstvo hypericínu v elicitovaných kultúrach

kultivovaných v tme bolo viac ako 3,5-násobne vyššie ako v rovnako elicitovaných kultúrach

kultivovaných na svetle. Celkovo, množstvo hypericínu produkovaného v elicitovaných

kultúrach v tme bolo viac ako 6-násobkom množstva v neelicitovaných kultúrach na svetle.

Dias a kol. (1998) detekovali a kvantifikovali množstvo flavonoidov v kaluse

Hypericum perforatum. V kalusových a suspenzných kultúrach sa tvoria a akumulujú rôzne

oxidované xantóny. Ich množstvo je ovplyvnené použitým médiom, prítomnosťou rastových

regulátorov a intenzitou iradiácie (Schmidt a kol. 2000, Dias a kol. 2001).

15

2.5 Rozmnožovanie Hypericum perforatum

Hypericum perforatum je fakultatívny apomikt typu Hieracium. Noack (1939)

pozoroval vývin normálneho redukovaného zárodočného miešku (typu Polygonum) iba v 3 %

pozorovaných vajíčok. Vo väčšine vajíčok (97 %) vznikal apospórický zárodočný miešok s

neredukovaným počtom chromozómov. Materská bunka megaspóry vstupuje do meiózy, ale

vo väčšine prípadov počas vývinu takýto zárodočný miešok degeneruje. Mitotickým delením

somatickej bunky nucela v jeho blízkosti vzniká apomiktický zárodočný miešok. Vo

všeobecnosti nie je jasné, či degenerácia normálneho zárodočného mieška je následok jeho

neschopnosti prežiť alebo výsledok konkurencie s aposporickým zárodočným mieškom

(Mogie 1992, Brutovská a kol. 1998). Výsledný neredukovaný apomiktický zárodočný

miešok má rovnakú štruktúru ako redukovaný. Partenogenetický vývin embrya a semena sa

spúšťa oplodnením centrálneho jadra zárodočného mieška a vývinom endospermu

(pseudogamia). Bez opelenia nedôjde k jeho oplodneniu, nevytvorí sa funkčný endosperm,

embryo degeneruje a nevzniká fertilné semeno (Noack 1939, Brutovská a kol. 1998).

Metódou prietokovej cytometrie semien však Matzk a kol. (2001) ojedinele identifikovali aj

semená s autonómne vzniknutým endospermom. Brutovská a kol. (1998) nepotvrdila

Noackom pozorovanú vysokú frekvenciu tvorby apospórických zárodočných mieškov (97 %).

Krížením tetraploidnej samičej rastliny s diploidnou vzniklo 81 % pentaploidov (2n = 4x+1x,

BIII hybridy), 12 % tetraploidov (2n = 4x+0x, apomiktické rastliny) a 7 % triploidov

(2n = 2x+1x, BII hybridy). Teda „len“ 93 % semien (BIII hybridy a apomikty) vzniklo z

apospórických iniciál. Celé potomstvo vzniknuté samoopelením bolo tetraploidné. Pri

samoopelení však nemožno odlíšiť apomikticky vzniknuté potomstvo (2n = 4x+0x) a

sexuálne vzniknuté BII hybridy (2n = 2x+2x). Neprítomnosť hexaploidov (BIII hybridov) v

potomstve naznačuje, že pri samoopelení je pravdepodobne príliš neskoro na prerastanie

peľového zrnka do apospórického zárodočného mieška, ktorý pri niektorých apomiktoch v

čase zrelosti vlastného peľu už dosahuje zrelosť vďaka predčasnému vývinu (Martinez a kol.

1994). Peľ apomiktických rastlín je zvyčajne dobrej kvality. Viabilita peľu diploidov aj

tetraploidov Hypericum perforatum je vysoká, približne 83%. Klíčivosť peľu diploidných

rastlín je zvyčajne oveľa vyššia (86%) ako tetraploidných (38%), (Brutovská a kol. 1998).

Keďže v potomstve voľne opelených rastlín je vysoká variabilita v počte chromozómov, čo

indikuje prítomnosť fakultatívnej apomixie (apomikty, BII aj BIII hybridy), Brutovská a kol.

(1998) predpokladajú, že rozhodujúci faktor v reprodukčnom procese je prítomnosť fertilného

peľu v čase zrelosti zárodočného mieška (vajcovej bunky). Takisto pri opelení diploidným

16

peľom frekvencia BIII hybridov bola až 81 %. čo je spôsobené aj vyššou klíčivosťou peľu z

diploida v porovnaní s peľom tetraploida.

Keďže jednoduché stanovenie počtu chromozómov potomstva nepostačuje na

hodnotenie spôsobu reprodukcie u fakultatívne apomiktických rastlín a odlíšenie spôsobu

vzniku potomkov, využívajú sa zdĺhavé a pracné mnohonásobné mikrodisekcie semenníkov a

testy potomstiev. Pomerne jednoduchú metódu, FCSS (Flow Cytometric Seed Screen), na

odlíšenie spôsobu vzniku semena popísali Matzk a kol. (2000). Táto metóda je založená na

určení ploidie embrya a endospermu v semene prietokovou cytometriou. V závislosti od toho,

či je zárodočný miešok redukovaný alebo nie a či je vajcová bunka alebo/a centrálne jadro

oplodnené redukovaným peľom diploida alebo tetraploida, vzniká semeno s rozdielnou

ploidiou embrya a endospermu. Takto možno odlíšiť napr. aj apomiktické a sexuálne

vzniknuté potomstvo pri samoopelení. Pomer obsahu DNA embrya a endospermu v

apomiktickom semene je 4x:10x a u sexuálne vzniknutého 4x:6x. Reprodukčná biológia

Hypericum perforatum sa ukázala byť veľmi variabilná. Pomocou FCSS bolo pozorovaných

11 rozličných ciest reprodukcie u Hypericum perforatum. Dokonca bolo identifikované aj

semeno, ktoré vzniklo z dvoch rôznych zárodočných mieškov (endosperm z apospórického a

embryo z redukovaného zárodočného mieška). Matzk a kol. (2001) identifikovali veľkú

väčšinu (108) zo 113 testovaných vzoriek Hypericum perforatum pochádzajúcich z

prírodných lokalít ako fakultatívne apomiktickú. Obe nimi testované diploidné vzorky

pochádzajúce z in vitro kultúr selektovaných na našom pracovisku predstavovali potomstvo

vzniknuté obligátne sexuálne a tri tetraploidné vzorky identifikovali obligátne apomiktické.

V reprodukčnom procese teda môžu nastať tieto hlavné typy reprodukcie:

1. sexuálne rozmnožovanie → dvojité oplodnenie redukovaného zárodočného

mieška, vznikajú tak BII hybridy

2. apospória – pseudogamické oplodnenie centrálneho jadra apospórického

zárodočného mieška a partenogenetický vývoj vajcovej bunky

– dvojité oplodnenie neredukovaného, apospórického zárodočného

mieška, tvorba BIII hybridov

3. partenogenetický vývin

17

Pre štúdium reprodukcie boli použité aj RFLP a RAPD markery. Pomocou rDNA sondy

bol dokázaný prenos materského fragmentu do prevažnej väčšiny potomstva. Na druhej strane

však detekovaný polymorfizmus naznačuje možnú sexuálnu rekombináciu u niektorých

sexuálne vzniknutých potomkov (Halušková a Čellárová 1997). Ako veľmi vhodná metóda

pre rozlišovanie medzi identickými a neidentickými (t.j. medzi apomikticky a sexuálne

vzniknutým) jedincami sa javí aj RAPD analýza. Arnholdt-Schmitt (2000) pomocou 6

náhodných primerov identifikovala prevládajúci spôsob rozmnožovania pri 80-100 %

potomstva, ktoré si zachovávalo identický amplifikačný profil materskej rastliny. Len pri

jednej vzorke, bol v potomstve 20 % rastlín identifikovaný polymorfný fragment naznačujúci

odlišný spôsob reprodukcie. Rovnako Steck a kol. (2001) pomocou RAPD primerov

identifikovala prevažujúci apomiktický spôsob rozmnožovania pri reciprokých krížení

rôznych jedincov Hypericum perforatum. Iba v prípade jedného kríženia identifikovali

13,3 % jedincov ako sexuálne odvodené potomstvo. 127 z 260 testovaných primerov

vykazovalo polymorfizmy medzi rodičovskými genotypmi, preto sa táto metóda javí veľmi

vhodnou pre genetické štúdie s týmto druhom.

18

3. APOMIXIA

Apomixia alebo nepohlavné rozmnožovanie semenami, je prirodzený spôsob

rozmnožovania, v dôsledku ktorého vzniká potomstvo, ktoré je geneticky identické s

materskou rastlinou. Využite apomixie v produkcii agronomicky významných plodín by

mohlo mať nesmierny význam v mnohých aspektoch. Šľachtenie s využitím apomixie by

umožňovalo neobmedzené množenie a fixáciu akéhokoľvek elitného-hybridného genotypu

počas nasledujúcich generácií prostredníctvom semien, produkciu geneticky uniformných

semien bez potreby izolácie, tvorbu hybridných genotypov lepšie adaptovaných pre konkrétne

dané abiotické a biotické podmienky a ľahšie množenie nových medzidruhových hybridov.

Uľahčilo by sa tým aj využitie a množenie transformantov. Hemizygotné vlohy by mohli byť

100% prenášané do semenného potomstva bez potreby inbrídingu na dosiahnutie

transgénnych homozygotov. Pretože takéto transformanty a somaklony môžu vykazovať

nižšiu sterilitu, ktorá je často dôsledkom narušenej meiózy, apomiktické rozmnožovanie by

mohlo umožniť jeho ďalšie šírenie (Vielle-Calzada a kol. 1996).

Viac ako 300 druhov z viac ako 35 rastlinných čeľadí (Tab.1.) sa rozmnožuje

apomikticky. Z toho je iba niekoľko druhov agronomicky významných – niektoré krmoviny,

Citrus sp., jablko, mango a orchidey. Apomikticky vzdialení príbuzní boli identifikovaní pre

viaceré dôležité jednoklíčnolistové druhy ako Pennisetum glaucum a Zea mays (Richards

1986, Hanna a Bashaw 1987, Asker a Jerling 1992).

Tab. 1 Počet apomiktických druhov v rozličných čeľadiach kvitnúcich rastlín (Richards 1986)

Čeľaď Počet apomiktických druhov

Prevládajúci typ apomixie

Poaceae 95 Pseudogamická apospória

Asteraceae 69 Autonomná diplospória

Rosaceae 68 Pseudogamická apospória

Urticaceae 9 Diplospória

Liliaceae 7 Adventitívna embryonia

Rutaceae 7 Adventitívna embryonia

28 iných čeľadí 53 Adventitívna embryonia

19

3.1 Apomixia a sexualita

Životný cyklus rastlín je charakteristický striedaním generácií medzi diploidným

sporofytom a haploidným gametofytom. Sporofyt produkuje meioticky haploidné spóry

(sporogenéza), ktoré dávajú vznik gametofytu. Diferencovaný gametofyt potom produkuje v

procese gametogenézy gaméty (samčie spermatické a samičie vajcové bunky). Gametofyt

krytosemenných rastlín (Angiospermae) je do značnej miery redukovaný a je súčasťou

špecializovaných orgánov kvetu. Samčí gametofyt (peľ alebo mikrogametofyt) sa vyvíja v

tyčinkách (anther). Samičí gametofyt (zárodočný miešok alebo megagametofyt) sa zasa

vyvíja v piestiku (pistillum) a je súčasťou vajíčka (ovulum). Pri pohlavnom rozmnožovaní,

oplodnením splývajú haploidné gaméty za vzniku nového diploidného sporofytu. Typické je

dvojité oplodnenie za vzniku diploidného embrya a triploidného endospermu (Reiser a

Fischer 1993). Pri nepohlavnom, apomiktickom rozmnožovaní sú niektoré vývinové kroky

vynechané alebo narušené. Pre apomixiu je typické, že dochádza ku predčasnej iniciácii

nasledujúcich vývinových krokov pred dokončením predchádzajúcich, čím dochádza k

vynechaniu niektorých krokov pohlavného rozmnožovania – gaméty sa tvoria bez meiózy a

embryo vzniká bez oplodnenia (Grimanelli a kol. 2001a, Spillane a kol. 2001). Prepnutie z

normálnej, pohlavnej cesty rozmnožovania na apomiktickú teda zahŕňa:

– vynechanie meiózy (bunky zárodočného mieška nie sú redukované, APOMEIÓZA)

– vývin embrya nezávisle od oplodnenia (PARTENOGENÉZA)

– iniciácia tvorby funkčného endospermu (buď AUTONÓMNE alebo oplodnením

centrálneho jadra zárodočného mieška – PSEUDOGAMIA)

Tieto základné podmienky spĺňa množstvo apomiktov. U rôznych apomiktov existuje

veľké množstvo mechanizmov na dosiahnutie apomixie (obr. 4), ale niektoré vlastnosti sú

spoločné:

– väčšina, ak nie všetky apomikty sú polyploidy (boli identifikovaní aj diploidní

apomiktickí zástupcovia, pravdepodobne polyhaploidy (viď. kapitola 2.5.1.).

– apomixia ovplyvňuje iba samičí vývinový program, zatiaľ čo samčie gaméty sú naďalej

produkované meiózou (mikrosporogenéza nie je pozmenená)

– apomikty sú prevažne fakultatívne, v zmysle, že časť potomstva v rámci tej istej rastliny

naďalej vzniká pohlavným rozmnožovaním. Obligátne apomikty sa naproti tomu

rozmnožujú iba apomikticky a ich potomstvo je čisto materského typu. Miera apomixie

u fakultatívne apomiktických druhov môže byť ovplyvnená viacerými podmienkami ako

20

sú genetické pozadie rodičov a podmienky vonkajšieho prostredia, napr. fotoperióda

alebo teplota (Nogler 1984a, 1995, Bashaw a Hanna 1990, Naumova a Hayward 1999).

Apomikty sa pravdepodobne vyvinuli z pohlavne sa rozmnožujúcich predkov.

Apomixia u nich ale neeliminuje pohlavné rozmnožovanie, preto môžu vznikať okrem

apomiktického potomstva aj tzv. "aberanty" alebo pohlavné „off typy“(Nogler 1984a):

– BII hybridy (oplodnením vajcovej bunky redukovaného zárodočného mieška),

– BIII hybridy (oplodnením vajcovej bunky neredukovaného zárodočného mieška) a

– polyhaploidy (partenogenetickým vývinom vajcovej bunky redukovaného zárodočného

mieška).

Apomiktické rozmnožovanie javí značnú variabilitu vývinových procesov (Asker a

Jerling 1992, Crane 2001, Grimanelli a kol. 2001a, Spillane a kol. 2001), na základe ktorých

možno apomixiu ďalej rozdeliť na dva základné typy, sporofytickú a gametofytickú.

Sporofytická apomixia je iniciovaná v neskorých fázach vývinu vajíčka, zvyčajne v zrelých

vajíčkach. Embryo vzniká mitotickým delením priamo zo somatickej bunky vajíčka

(sporofytu), bez tvorby megagametogytu (zárodočného mieška). Naproti tomu iniciácia

gametofytickej apomixie nastáva skoro počas vývinu vajíčka, v čase diferenciácie materskej

bunky megaspóry a embryo sa tvorí partenogeneticky v neredukovanom zárodočnom miešku.

3.2 Gametofytická apomixia

Pri gametofytickej apomixii vzniká semeno a embryo partenogeneticky z buniek

neredukovaného gametofytu (zárodočného mieška). Tento môže vznikať prinajmenšom

deviatimi spôsobmi (Crane 2001). V závislosti, z akých buniek vzniká takýto neredukovaný

gametofyt rozlišujeme diplospórickú apomixiu – gametofyt vzniká z neredukovanej

megaspóry, diplospória) a apospórickú apomixiu – gametofyt vzniká zo sporofytickej bunky

vajíčka, apospória (Koltunow 1993, Grimanelli a kol. 2001a).

21

3.2.1 Diplospórická apomixia

Diplospórických apomiktov je podstatne menej ako apospórických. Najvýznamnejšie z

nich sú niektoré druhy rodov Poa, Eragrostis, Calamagrostis, Taraxacum a Ixeris, Tripsacum

dactyloides a Elymus rectisetus (Bashaw a Hanna 1990).

Neredukovaný megagametofyt pri diplospórickej apomixii vzniká z megaspóry, ktorá

nevzniká redukčným delením. Rozpoznávame viaceré typy diplospórických zárodočných

mieškov (Nogler 1984a, Koltunow 1993, Grimanelli a kol. 2001a).

Pri zárodočnom miešku typu Taraxacum a Ixeris je meiotické delenie materskej bunky

megaspóry v určitom štádiu inhibované neznámym mechanizmom a nedochádza ku redukcii

megasóry, z ktorej vzniká neredukovaný zárodočný miešok (meiotická diplospória). Materská

bunka megaspóry zárodočného mieška typu Antenaria ani nevstupuje do meiózy, resp.

meióza je inhibovaná vo veľmi skorom cytologicky nerozlíšiteľnom štádiu, výsledkom čoho

je opäť neredukovaný zárodočný miešok (mitotická diplospória). Jedine zárodočný miešok

typu Allium-odurum vzniká z normálne meioticky odvodenej magaspóry. Tomuto deleniu

však predchádza endomitóza. Endomitóza prebieha aj v bunkách nucela, ktoré sa tak stávajú

endopolyploidné (Crane 2001).

Keďže diplospórický zárodočný miešok vzniká delením neredukovanej megaspóry,

sexuálny a diplospórický proces nemôžu prebiehať súčasne v jednom vajíčku. Vo vajíčkach

diplosporických apomiktov sa teda zvyčajne vyvíja iba jeden zárodočný miešok (Bashaw a

Hanna 1990). V prípade pentaploidného Paspalum minus však môžu v jednom vajíčku

koexistovať diplospórický a apospórický zárodočný miešok. Bonilla a Quarin (1997)

pozorovali u tejto rastliny v blízkosti diplospórického zárodočného mieška vznik jedného až

troch apomiktických zárodočných mieškov. Zrelý diplospórický zárodočný miešok je vo

väčšine prípadov nerozlíšiteľný od sexuálne odvodeného, t.j. má rovnaké usporiadanie buniek

a bunky majú rovnaké úlohy ako pri normálnom, redukovanom zárodočnom miešku (Bashaw

a Hanna 1990). Vývin embrya prebieha partenogeneticky. U diplospórických apomiktov je

veľmi častý autonómny vývin endospermu z neoplodného centrálneho jadra zárodočného

mieška, predovšetkým u zástupcov Compositae. Niektoré diplosporické trávy (Elymus, Poa,

Eragostis a Tripsacum) však pre vývin endospermu potrebujú opelenie a endosperm sa vyvíja

pseudogamicky (Bashaw a Hanna 1990). Zvyčajne dochádza iba k oplodneniu centrálneho

jadra za tvorby endospermu bez oplodnenia neredukovanej vajcovej bunky. V prípade Poa a

Tripsacum je oplodnenie vajcovej bunky znemožnené predčasným partenogenetickým

vývinom embrya ešte pred otvorením kvetu (Asker a Jerling 1992).

22

3.2.2 Apospórická apomixia

Apospórický zárodočný miešok sa formuje zo somatických buniek vajíčka,

apospórických iniciál. Sú nimi predovšetkým bunky nucela, ale u určitých druhov sa môže

apospórický zárodočný miešok formovať aj z buniek integumentu alebo iných somatických

buniek steny vajíčka. Apospóricke iniciály napodobňujú pohlavné materské bunky

megaspóry, nedochádza však k redukčnému deleniu a vznikajúci apospórický zárodočný

miešok nie je redukovaný (Bashaw a Hanna 1990). Na rozdiel od diplospórických vajíčok, v

apospórických môže koexistovať sexuálny a apospórický vývinový proces. Apospórická

apomixia sa vyskytuje napr. u niektorých zástupcov rodu Panicum, Ranunculus, Hieracium,

Hypericum, Poa, Paspalum a Cenchrus.

Vývin apospórického zárodočného mieška sa zvyčajne začína v čase meiotickej

magasporogenézy normálneho zárodočného mieška. V jeho blízkosti sa môže diferencovať

jedna alebo viac apospórických iniciál. To, že apospórické iniciály sa diferencujú zvyčajne v

blízkosti sexuálneho zárodočného mieška naznačuje, že pravdepodobne dochádza k rozšíreniu

signálu iniciujúceho vznik materskej bunky megaspóry na väčší okruh buniek, alebo je

narušená kontrola obmedzujúca diferenciáciu viacerých materských buniek measpór (Nogler

1984a, Koltunow 1993). Apomikticky vzniknuté zárodočné miešky (typ Hieracium), napr. pri

Poa pratensis, sa verne podobajú redukovaným. Pri iných (typ Pannicum), napr. pri

Paspalum dilatatum, tvorí apomiktický zárodočný miešok iný počet buniek (Bashaw a Hanna

1990). Pre partenogenetický vývin embrya je však predurčená iba jedna bunka, neredukovaná

vajcová bunka. Apospórické zárodočné miešky sa vyvíjajú zvyčajne rýchlejšie, čo je

dôsledkom skrátenia vývinového programu vynechaním meiotického delenia. Pravdepodobne

v dôsledku vývinu apospórického zárodočného mieška môže dochádzať ku predčasnému

ukončeniu vývinu a degenerácii redukovaného zárodočného mieška ešte pred začatím

megasporo- alebo megagametogenézy. Ak sa ale apospórické iniciály diferencujú neskôr, t.j.

v čase, keď je tvorba redukovaného zárodočného mieška relatívne pokročilá, môžu sa

diferencovať oba typy zárodočných mieškov a koexistovať v jednom vajíčku (Nogler 1984a,

Koltunow 1993).

S výnimkou apomiktov rodu Hieracium je autonómny vývin endospermu zriedkavý. Pre

vznik endospermu sa teda vyžaduje opelenie, t.j. vzniká pseudogamicky (Asker a Jerling

1992). V prípade, že je vo vajíčku viacero zárodočných mieškov, dochádza k oplodneniu

centrálneho jadra zárodočného mieška s najvýhodnejšou pozíciou. Ak je takýmto zárodočným

mieškom normálny, redukovaný zárodočný miešok, dochádza k dvojitému oplodneniu.

23

Zriedka môže dojsť aj k dvojitému oplodneniu apospórického zárodočného mieška za vzniku

BIII hybridného embrya. K oplodneniu vajcovej bunky neredukovaného zárodočného mieška

však zvyčajne nedochádza v dôsledku predčasného (partenogenetického) vývinu embrya

predchádzajúcemu opeleniu, alebo je oplodneniu zabránené tvorbou bunkovej steny vajcovej

bunky (Asker a Jerling 1992). Skoré opelenie predchádzajúce otvoreniu kvetu pri Paspalum

notatum umožňuje vyššiu frekvenciu tvorby BIII hybridov, zatiaľ čo pri normálnych

podmienkach je takáto rastlina čisto apomiktická (Martinez a kol. 1994). Opačným prípadom

je jeden z hybridných genotypov Ranunculus auricomus, pri ktorom je partenogenetický

vývin neredukovaného vajíčka značne oddialený, čo umožňuje vysokú mieru tvorby BIII

hybridov (Nogler 1995).

Obr. 4 Vznik semena gametofytickou apomixiou (Grimanelli a kol. 2001a).

Diplospória – typ Antenaria (a), typ Taraxacum (b), typ Allium (c). Apospória – typ Panicum (d), typ Hieracium (e)

24

3.3 Sporofytická apomixia

Sporofytická apomixia (resp. adventívna embryónia) predstavuje tvorbu adventívnych

embryí priamo z buniek pletív vajíčka mimo zárodočného mieška. Adventívne embryá

vznikajú zvyčajne z buniek nucela alebo zriedkavejšie z vnútorného integumentu (Koltunow

1993, Spillane a kol. 2001). Sporofytická apomixia je rozšírená v 52 rastlinných čeľadiach

(Carman 1997). Adventívne apomikty sú obyčajne diploidné, na rozdiel od rastlín

rozmnožujúcich sa gametofytickou apomixou, ktoré sú zvyčajne polyploidné (Asker a Jerling

1992).

Klasický modelový systém nucelárnej embryónie predstavuje Citrus sp., u ktorého je

tento spôsob rozmnožovania najlepšie preštudovaný. Pohlavný proces rozmnožovania nie je

vôbec narušený a uskutočňuje sa v tom istom vajíčku súbežne s rastom a vývinom

adventívneho embrya. Vajcová bunka a centrálne jadro redukovaného zárodočného mieška

môžu byť oplodnené za tvorby zygotického embrya a endospermu. Vývin adventívnych

embryí potom závisí od takto vzniknutého endospermu. Ich tvorba je iniciovaná z

jednotlivých buniek nucela (resp. integumentu) – embryocytov v oblasti obklopujúcej

vyvíjajúci sa sexuálny zárodočný miešok. Mechanizmy, ktoré špecifikujú iba niektoré

bunky pre diferenciáciu na embryocyt a iniciujú takúto embryogenézu nie sú známe

(Koltunow a kol. 1996, Naumova a Vielle-Calzada 2001). Prvá morfologická diferenciácia

embryocytu nastáva po iniciácii megagametogenézy (Naumova a Vielle-Calzada 2001).

Prvé delenie nucelárnych iniciál sa objavuje približne v čase prvého delenia zygoty.

Delením embryocytu prerastá nucelárne embryo do zárodočného mieška. Často je rast

zygotického embrya pomalší v porovnaní s aktívnym rastom nucelárneho embrya a takéto

embryo môže, ale nemusí v dôsledku kompetície s adventívnymi embryami dokončiť svoj

vývin až po vznik semena. Výsledok nucelárnej embryónie je polyembryonické semeno,

ktoré obsahuje embryá v rozličnom štádiu zrelosti, z ktorých mnohé môžu vyklíčiť na

životaschopné klíčence. Nucelárne embryá sú ale iniciované nezávisle od opelenia. Vyvíjajú

sa v oplodnených aj neoplodnených vajíčkach, teda existuje pravdepodobne všeobecný

signál spúšťajúci vývin nucelárnych embryí nezávisle na oplodnení (Koltunow 1993).

25

3.4 Dedičnosť apomixie

Hoci sa už dávno vie, že apomixia je dedičná a geneticky determinovaná vlastnosť, jej

molekulárna podstata je stále slabo objasnená. Genetické štúdie vo veľkej miere závisia na

krížení a segregácii znakov v dôsledku meiotickej rekombinácie. Klonálny spôsob

rozmnožovania, polyploidia a vysoko heterozygotny charakter apomiktov však sťažujú takéto

štúdium (Grossniklaus a kol. 2001, Sherwood 2001, Spillane a kol. 2001). Pretože však

väčšina apomiktov produkuje normálny redukovaný peľ, tento môže byť využitý v rámci

krížení so sexuálne sa rozmnožujúcimi zástupcami agamických komplexov, prípadne pri

medzidruhovom krížení s blízko príbuznými druhmi, najlepšie rovnakej ploidie, aby sa

predišlo narušenej meióze a sterilite potomstva (Sherwood 2001), lebo vznik fertilného peľu

je podmienkou pre ďalšie kontinuálne kríženie (Ozias-Akins a kol. 1993). Vysoká

heterozygotnosť apomiktov však vedie pri krížení k vysokej variabilite potomstva. Aby sa

definoval spôsob rozmnožovania a jeho dedičnosť, je potrebné determinovať pomer pohlavne

a apomikticky sa rozmnožujúcich rastlín v potomstve hybridnej F1 populácie a v potomstvách

spätných krížení. V neposlednej miere je potrebné embryologické hodnotenie potomstva na

potvrdenie apomiktických mechanizmov (Nogler 1984a).

Komplexita vývinových procesov zahrnutých v tvorbe apomiktických semien

predpokladala multigénnu kontrolu. Súčasné pokroky v štúdiu gametofytickej apomixie,

predovšetkým u niektorých tráv vedú k predpokladu, že jej kontrola u týchto druhov môže

byť relatívne jednoduchá. Genetické analýzy spôsobu rozmnožovania a tvorba genetických

máp úsekov genómu, ktoré pravdepodobne riadia apomixiu dokonca ukázali, že u niektorých

duhov existuje apospórický špecifický úsek génomu – ASGR (apospory-specific genomic

region, Ozias-Akins a kol. 1998), ktorý prispieva k tejto vlastnosti segregujúcej ako jeden

lokus (Pessino a kol. 1999).

3.4.1 Genetická kontrola gametofytickej apomixie

Najlepšie informácie o štúdiu dedičnosti apomixie možno dosiahnuť, ak sú jej tri hlavné

komponenty, apomeióza, partenogenéza a iniciácia tvorby endospermu, analyzované

osobitne, ideálne v segregujúcich potomstvách z krížení blízko príbuzných druhov. Najnovšie

štúdie s niektorými apomiktami ukazujú, že na rozdiel od predchádzajúcich štúdií, kde

apomeióza a partenogenéza boli uvádzané ako kosegregujúce, tieto elementy apomixie môžu

byť kontrolované rozličnými lokusmi (Spillane a kol. 2001). V súčasnosti sa zdá, že expresia

26

aposporickej apomixie si vyžaduje dominantný gén alebo väzbovú skupinu a určitú úlohu

zohráva aj vplyv dávky, aditivita, recesívna letalita a modifikujúce gény. Pri diplosporickej

apomixií sa rovnako predpokladá regulácia dominantnou väzbovou skupinou s modifikátormi

(Sherwood 2001).

3.4.1.1 Apomeióza (Apospória, Diplospória)

Autori skorších štúdií s apospórickými druhmi Panicum maximum (Savidan 1982) a

Ranunculus auricomus (Nogler 1984b) predpokladajú, že apospória pri týchto druhoch je

kontrolovaná jedným dominantným faktorom s dedičnosťou v intenciách Mendlových

zákonov. Viaceré súčasné výskumy ukázali, že kontrola apospórie aj diplospórie viacerých

druhov zodpovedá rovnakému modelu dedičnosti (Tab. 1, Grimanelli a kol. 2001a,

Grossniklaus a kol. 2001, Spillane a kol. 2001). Táto neočakávaná jednoduchosť bola

potvrdená pri apospórických zástupcoch rodu Hieracium (Bicknell a kol. 2000), Brachiaria

decumbens (Pessino a kol. 1997, 1998), Paspalum squamulatum (Ozias-Akins a kol. 1993,

1998, Gustine a kol. 1997), Cenchrus ciliaris (Sherwood a kol. 1994), ako aj diplospórických

Tripsacum dactyloides (Leblanc a kol. 1995b, Grimanelli a kol. 1998a), Erigeron annuus

(Noyes a Riesenberg 2000) a Taraxacum sp. (Mogie 1992, van Dijk a kol. 1999). Tieto

pozorovania sú často interpretované ako dôkaz monogénnej dedičnosti, hoci taýto dominantný

faktor môže predstavovať akúkoľvek genetickú konštitúciu od jedného génu, skupiny génov

vo väzbe až celý chromozóm. Podľa tohto modelu tieto apomiktické druhy majú genetickú

konštitúciu Aaaa (resp. Aaa). Teda okrem dominantnej alely pre apomeiózu nesú aj viaceré

recesívne alely pre pohlavné rozmnožovanie. Tieto predstavujú potenciál pre pohlavné

rozmnožovanie, viac alebo menej reprimovaný, čo vysvetľuje výskyt fakultatívnej apomixie.

Rovnako obmedzená penetrancia faktoru pre apomixiu prispieva ku koexistencii oboch

spôsobov rozmnožovania prevažnej väčšiny apomiktov (Grossniklaus a kol. 2001).

Tento jednolokusový model segregácie bol podložený izoláciou molekulárnych

markerov viazaných s predpokladaným lokusom pre apomixiu pri viacerých druhoch (Tab. 1).

Vo všetkých prípadoch, keď to bolo testované, bola zistená silná supresia rekombinácie v

oblasti lokusu pre apomeiózu. Napr. bola zistená silná kosegregácia väčšieho množstva

markerov apospórického Pennisetum squamulatum (Ozias-Akins a kol. 1998) a

diplospórického Erigeron annuus (Noyes a Riesenberg 2000). Komparatívnym mapovaním

apomiktických lokusov tráv ako sú Brachiaria decumbens (Pessino a kol. 1998), Tripsacum

dactyloides (Grimanelli a kol. 1998a) a Paspalum simplex (Pupilli a kol. 2001), pri ktorých je

27

apomixia vždy dedená ako 1 znak sa ukázalo, že úsek, ktorý reguluje apomixiu je pri týchto

druhoch rozdielny (t.j. nehomologický). To by mohlo znamenať, že apomixia so svojimi

rôznymi formami, pravdepodobne vznikla pri rôznych druhoch tráv účinkom rozdielnych

genetických lokusov (Grimanelli a kol. 2001a). Markery, ktoré boli lokalizované pri sexuálne

sa rozmnožujúcich zástupcoch na úseku 15-40 cM, pri týchto apomiktoch striktne

kosegregovali. Pri zástupcoch rodu Pennisetum, markery viazané na apospóriu apomiktických

druhov neboli detekované v sexuálne sa rozmnožujúcich príbuzných druhoch (Ozias-Akins a

kol. 1998, Roche a kol. 1999). To naznačuje, že markery spojené s lokusom apomeiózy sú

buď hemizygotné alebo značne sa odlišujúce od sexuálnych homológov. Jednou z možností je

aj to, že nadbytočný chromatín formujúci sa ako výsledok medzidruhového kríženia, sa môže

podieľať pri tvorbe gametofytickej apomixie (Roche a kol. 2001).

Tab. 2 Dedičnosť elementov gametofytickej apomixie (apomeiózy a partenogenézy) u zástupcov čeľadí Ranunculaceae, Poacea a Compositae (Grossniklaus a kol. 2001)

Druh Typ Apomeiózy Čeľaď

Predpokladaný genotyp

Najbližší viazaný molekulárny marker

Dôkaz o obmedzení rekombinácie Literatúra

Apomeióza Ranunculus auricomus Apospória Ranunculaceae Aaaa – – Nogler, 1984b Panicum maximum Apospória Poaceae Aaaa – – Savidan, 1982 Pennisetum squamulatum Apospória Poaceae Aaaa 0 cM Áno Ozias-Akins a kol., 1998 Brachiaria decumbens Apospória Poaceae Aaaa 1.2 cM ? Pessino a kol., 1998 Paspalum simplex Apospória Poaceae Aaaa 0 cM Áno Pupilli a kol.., 2001 Hieracium piloselloides Apospória Compositae Aaa – – Bicknell a kol., 2000 Hieracium aurantiacum Apospória Compositae Aaa – – Bicknell a kol., 2000 Tripsacum dactyloides Diplospória Poaceae Aaaa 0 cM Áno Grimanelli a kol., 1998a, 1998b Erigeron annuus Diplospória Compositae Aaa 0 cM Áno Noyes a Rieseberg, 2000 Taraxacum officinale Diplospória Compositae Aaa 4.4 cM ? van Dijk a kol. 1999

Partenogenéza Poa pratensis Apospória Poaceae Pppp 6.6 cM ? Barcaccia a kol., 1998 Erigeron annuus Diplospória Compositae Ppp 7.3 cM Nie Noyes a Rieseberg, 2000

Genetické modely dedičnosti sú založené na základe segregácií jednotlivých komponentov pri krížení pohlavne sa rozmnožujúcich a apomiktických jedincov, vo väčšine prípadov podporených kosegregáciou úzko viazaných molekulárnych markerov. Vzdialenosť medzi lokusom apomixie a úzko viazaným markerom je udaná v centimorganoch (cM), (–), neštudované, (?), nepresvedčivé výsledky

3.4.1.2 Partenogenéza

Kontrola partenogenézy a molekulárny mechanizmus spúšťajúci partenogenézu rastlín a

živočíchov sú stále nejasné (Spillane a kol. 2001). V kontraste s apomeiózou, dedičnosti

partenogenetického vývinu embrya sa nevenovala taká pozornosť ako kontrole a dedičnosti

apomeiózy a je iba málo pochopená, sčasti aj kvôli historickým dôvodom, kedy

partenogenéza nebola považovaná za samostatnú, geneticky determinovanú črtu (Nogler

1984a, Asker a Jerling 1992, Mogie 1992).

28

Súčasné genetické štúdie predpokladajú jednoduchú kontrolu partenogenézy. Viacerí

autori (Savidan 1982, Nogler 1984b, Mogie 1992, Leblanc a Savidan 1994) nepredpokladajú

špecifické gény pre partenogenézu, ktorá má byť iba pleiotropným následkom apomeiózy,

takže celý proces závisí iba od kontroly apomeiózy alebo sú oba tieto komponenty pod

spoločnou genetickou kontrolou jedného hlavného regulačného génu resp. génového koplexu

viacerých tesne viazaných génov, pri ktorých nedochádza k rekombinácií. Dedičnosť

partenogenézy je striktne viazaná na lokus apomeiózy Ranunculus auricomus (Nogler 1984b),

Panicum maximum (Savidan 1982), Hieracium sp. (Bicknell a kol. 2000) a Paspalum simplex

(Cáceres a kol. 2001). Avšak súčasné výsledky s inými apomiktickými taxónmi ukazujú, že

apomeióza a partenogenéza môžu segregovať nezávisle. Pri diplospórických (Taraxacum

officinale, Erigeron annuus) aj apospórických druhoch (Poa pratensis, Hypericum sp.) boli

identifikovaní rekombinanti v daných lokusoch (Barcaccia a kol. 1997, 1998; van Dijk a kol.

1999, Matzk a kol. 2000, Noyes a Riesenberg 2000, Albertiny a kol. 2001, van Baarlen a kol.

2002). Pri Erigeron annuus na rozdiel od lokusu kontrolujúceho diplospóriu, kde nedochádza

k rekombinácií, nebolo pozorované žiadne obmedzenie rekombinácie v oblasti lokusu pre

partenogenézu (Noyes a Riesenberg 2000). Lokus riadiaci partenogenézu Poa pratensis je

pod silnou genetickou kontrolou. Sexuálne sa rozmnožujúce rastliny nemajú alely pre

partenogenézu, zatiaľ čo polyploidné apomiktické sú heterozygótne s jednou alebo viacerými

dominantnými alelami (Matzk a kol. 1991).

3.4.1.3 Vývin endospermu

Na rozdiel od prvých dvoch kľúčových komponentov apomixie (apomeióza a

partenogenéza), vývin endospermu apomiktických druhov bol braný do úvahy iba zriedka.

Správny vývin endospermu je rovnako dôležitý pre apomiktické, ako aj pohlavne sa

rozmnožujúce druhy, hoci tieto procesy sa pri oboch líšia. Niektoré apomikty, ako sú

apomiktické druhy rodu Erigeron, Taraxacum a Hieracium, tvoria endosperm autonómne. Pri

prevažnej väčšine apomiktov (napr. z rodu Paspalum, Pennisetum, Tripsacum a Hypericum)

je vývin endospermu naďalej závislý na oplodnení centrálneho jadra zárodočného mieška,

pseudogamii (Nogler 1984a, Grimanelli a kol. 2001a). Pri týchto sa museli vytvoriť

mechanizmy brániace oplodneniu vajcovej bunky, a súčasne umožňujúce pseudogamiu. Tieto

môžu byť následkom tvorby kompletnej bunkovej steny vajcovej bunky pred oplodnením

(Grossniklaus 2001). Autonómny vývin endospermu je jav pozorovaný predovšetkým pri

diplospórických apomiktoch (Koltunow 1993).

29

Hlavným faktorom ovplyvňujúcim vývin endospermu je vplyv dávky medzi relatívnym

príspevkom materského (m) a otcovského (p) genómu vo vyvíjajúcom sa endosperme. Pri

sexuálne sa rozmnožujúcich rastlinách je tento pomer 2m:1p. Pri kukurici a pravdepodobne

väčšine rastlín je tento pomer kritický pre normálny vývin endospermu a jeho odchýlky majú

negatívny vplyv na viabilitu semena (Birchler 1993). Naproti tomu, oba spomenuté typy

apomiktov dávajú vznik semenám so širokou škálou podielov materského a otcovského

genómu bez narušenia viability. Pri niektorých apomiktoch nemusí byť táto požiadavka

splnená alebo pri iných je dosiahnutá modifikáciou gametogenézy a oplodnenia (Nogler

1984a, Grimanelli a kol. 2001b, Sherwood 2001). Napr. apomikty typu Panicum majú

pozmenenú tvorbu zárodočného mieška, ktorý obsahuje iba jedno neredukované centrálne

jadro, oplodnením ktorého ostáva zachovaný pomer genómov 2m:1p (Nogler 1984a). Pri

iných, napr. apospórickom Paspalum notatum a Paspalum simplex, pomer materského a

otcovského genómu neovplyvňuje viabilitu, hoci pre sexuálne sa rozmnožujúcich zástupcov je

zachovanie tohto pomeru nevyhnutné (Quarin 1999, Cáceres a kol. 2001). Rovnako

diplospórické druhy rodu Tripsacum nie sú citlivé na zmenený pomer rodičovských genómov

v endosperme (Grimanelli a kol. 1997).

O genetickej podmienenosti a dedičnosti kontroly vývinu endospermu u apomiktov

existuje len niekoľko zmienok. Pri pseudogamicky apospórickom Paspalum simplex sú

všetky tri elementy apomixie lokalizované na jednej relatívne rozsiahlej väzbovej skupine

segregujúcej ako jedna genetická jednotka (Cáceres a kol. 2001). Aj autonómna apospória

apospórických zástupcov rodu Hieracium je riadená jedným dominantným lokusom (Bicknell

a kol. 2000). Naproti tomu, jednotlivé elementy apomixie nie sú vo väzbe a sú iniciované

nezávisle pri autonómne diplospórickom Taraxacum officinale (van Dijk a kol. 1999, van

Baarlen a kol. 2002). Rovnako aj pri fie a fis mutantoch Arabidopsis thaliana autonómna

tvorba endospermu nie je viazaná na partenogenézu a neriadi súčasne partenogenetický vývin

embrya (Ohad a kol. 1996, Chaudhury a kol. 1997).

3.4.2 Genetická kontrola sporofytickej apomixie

Na rozdiel od gametofytickej apomixie, o genetike adventívnej embryónie sa vie

podstatne menej. Na základe skorších segregačných analýz u Citrus sp. sa predpokladalo, že

polyembryónia je monogénny znak a dominantný voči monoembryónii. V súčasnosti, na

základe segragácie 69 molekulových markerov, Garcia a kol. (1999) predpokladajú, že

30

genetická kontrola adventívnej embryónie je oveľa komplexnejšia a zahŕňa prinajmenšom

šesť lokusov, t.j. javí sa ako kvantitatívny znak (Spillane a kol. 2001).

3.5 Regulácia apomiktických procesov.

Apomiktický vývin možno považovať za skrátenie, skrat alebo dereguláciu kľúčových

fáz pohlavného vývinového programu (Koltunov 1993, Vielle-Calzada a kol. 1996,

Grossniklaus a kol. 1998a). Takáto deregulácia môže byť spôsobená "heterotopickým" alebo

"heterochronickým" postupom normálneho, pohlavného vývinového programu. Heterotopický

vývin nastáva v zmysle neodpovedajúceho, chybného načasovania vývinových procesov,

napr. iniciácie megagametogenézy pred dokončením megasporogenézy alebo iniciácie

embryogenézy pred oplodnením. Heterochronický vývin zasa zodpovedá iniciácii niektorých

vývinových procesov na neodpovedajúcom, nesprávnom mieste, pravdepodobne v dôsledku

deregulácie presného stanovenia vývinového programu niektorých buniek, napr. iniciácia

tvorby embryocytov, resp. apospórických iniciál zo somatických buniek vajíčka pri

adventívnej embryónii, resp. apospórii (Grossniklaus 2001, Spillane a kol. 2001).

Zdá sa, že regulácia vývinových udalostí je konzervovaná pri pohlavnom a

apomiktickom rozmnožovaní. Preto je pravdepodobné, že regulačné gény, ktoré sú

nevyhnutné pri pohlavnom rozmnožovaní sú nesprávne regulované v čase a priestore, čo

vedie ku vývinovým zmenám pozorovaným u apomiktov. Predčasná iniciácia

megasporogenézy a aktivácia vajcovej bunky môže byť spôsobená chybnou expresiou

regulačných génov, ktoré vykonávajú rovnaké funkcie počas pohlavného rozmnožovania.

Preto gény (gén) kontrolujúce apomixiu nemusia nevyhnutne kódovať zmenené génové

produkty (produkt), ale môžu byť skôr deregulované alebo pod rozdielnou priestorovou a

časovou kontrolou (Mogie 1992, Peacock 1992, Koltunov 1993, Grossniklaus a kol. 1998a,

Grossniklaus 2001).

3.5.1 Apomixia a polyploidia

Existuje zjavná asociácia medzi gametofytickou apomixiou a polyploidiou. S výnimkou

málo prípadov (polyhaploidov) sú apomikticky sa rozmnožujúci zástupcovia polyploidní,

zatiaľ čo pohlavné rozmnožovanie rovnakého druhu je spojené s nižšou hladinou ploidie

(Grimanelli a kol. 2001a). Je všeobecne akceptované, že existuje mechanizmus brániaci

expresií gametofytickej apomixie na diploidnej úrovni. Boli navrhnuté 3 hypotézy

31

vysvetľujúce neprítomnosť apomixie na diploidnej úrovni: model regulácie apomixie génovou

dávkou, gametofytický letálny model a genómový asynchrónny model.

� Prvá hypotéza predpokladá že alely kontrolujúce apomixiu môžu byť prenášané do

diploidných rastlín, ale expresia tohto znaku je obmedzená iba na polyploidy. Penetrancia

apomixie závisí od vplyvu génovej dávky. Mogie (1992), ktorý predpokladá monogénnu

dedičnosť apomixie Taraxacum officinale, navrhuje, že vzťah dominancie medzi divokou

alelou (a) a mutovanou alelou (A) je daný relatívnym počtom ich kópií v genóme. K apomixii

dochádza vtedy, keď je mutovaná alela prítomná vo väčšom počte kópií ako divoká. Mogie

predpokladá, že tento lokus a hrá dôležitú úlohu pri mitóze a meióze, a preto alela A nemôže

byť exprimovaná alebo je eliminovaná pri prenose v haploidnom alebo homozygótnom stave.

Najnovšie sa však uvažuje o komlexnejšom viaclokusovom modeli dedičnosti apomixie pri

tomto druhu (van Dijk a kol. 1999, van Baarlen a kol. 2002).

V zhode s touto hypotézou Quarin a kol. (2001) pozorovali, že polyploidizácia

Paspalum sp. účinkom kolchicínu môže viesť k expresii apomixie u takto vzniknutých

tetraploidných rastlín. To predpokladá existenciu genetického faktoru (faktorov) apomixie aj

na diploidnej úrovni, ale jeho (ich) expresia je obmedzená. Keďže k expresii dochádza až po

polyploidizácii, v regulácii expresie apomixie je potom pravdepodobne zahrnutý vplyv dávky.

Na druhej strane samotná polyploidizácia diploidných druhov nie je dostatočný dôvod pre

spustenie expresie apomixie. Polyploidizáciou Tripsacum sp. rovnakým spôsobom Leblanc a

kol. (1995a) získali len tetraploidné sexuálne sa rozmnožujúce rastliny.

Vplyv génovej dávky má však nepochybne vplyv na génovú expresiu. Viaceré súčasné

štúdie s niektorými modelovými organizmami (kvasinky, kukurica, Arabidopsis thaliana)

potvrdili, že ploidia priamo ovplyvňuje génovú expresiu. Porovnanie cDNA profilov

diploidných a odpovedajúcich tetraploidných rastlín Arabidopsis thaliana ukázalo, že 20 zo

700 skúmaných génov je na tetraploidnej úrovní zoslabovaných, čo významne vplýva na

niektoré fenotypové črty, morfológiu, čas kvitnutia, fertilitu (Comai a kol. 2000). Génová

dávka (ploidia) ovplyvňuje aj expresiu niektorých dôležitých génov, vrátane génov

regulujúcich bunkový cyklus skúmaných izogénnych kmeňov kvasiniek rozličnej ploidie

(Galitski a kol. 1999). Výsledky s kukuricou ukazujú, že už aj čiastočná duplikácia génomu

môže ovplyvňovať génovú expresiu. Táto môže prostredníctvom trans-efektu ovplyvňovať aj

gény, ktoré nie sú súčasťou duplikovaného úseku (Guo a kol. 1996).

� Druhá hypotéza objasňujúca neprítomnosť apomixie na diploidnej úrovni je

založená na tom, že apomixia nemôže byť prenášaná do diploidov (Nogler 1982, 1984a).

32

Nogler vo svojich pokusoch s apomiktickými hybridmi Ranunculus sp. nepozoroval prenos

faktoru pre apomixiu do diploidov prostredníctvom haploidných gamiet, pravdepodobne v

dôsledku letálneho efektu tejto alely (alebo letálneho efektu viazaného s touto alelou), ktorý

sa prejaví v haploidnom stave. Diploidné rastliny potom nemôžu niesť gén (gény) pre

apomixiu. Apomiktické diploidné rastliny môžu vznikať iba ako dihaploidy z apomiktických

tetraploidov (Nogler 1982). Takto predpokladá vznik dihaploidov napr. Bicknell (1997) pri

Hieracium aurantiacum. Normálne tento polyploidný apomiktický druh nie je v diploidnej

forme. Tento apomiktický diploid vzniká pravdepodobne partenogenetickým vývinom

redukovanej vajcovej bunky. Tento gametofyticky letálny model apomixie podporujú aj

výsledky s ďalšími apomiktickými druhmi (Grimanelli a kol. 1998b, Ozias-Akins a kol. 1998,

Tas a van Dijk 1999, Noyes a Riesenberg 2000). Pozorovania s Hieracium sp. naznačujú

možnosť prenášania apomixie diploidnými aj haploidnými gamétami, ale absencia

diploidného apomiktického potomstva je tu skôr spôsobená selekciou proti prežívaniu

diploidných zygót ako voči eliminácii haploidných gamiet nesúcich faktor apomixie (Bicknell

a kol. 2000).

� Carman vo svojej génomovej asynchrónnej teórii predpokladá, že apomixia vzniká

polyploidizáciou (allopolyploidizáciou) v dôsledku medzidruhovej hybridizácie geneticky

odlišných genómov, ktoré sa líšia reprodukčným správaním (Carman 1997). V takýchto

allopolyploidných hybridných taxónoch môže dochádzať ku asynchrónnej alebo časovo

nezosúladenej expresii regulačných génov kontrolujúcich dva rozličné reprodukčné programy

súčasne. To môže viesť k predčasnej aktivácii alebo ukončeniu niektorých vývinových

procesov a následne k apomixii.

V minulosti sa predpokladal allopolyploidný pôvod apomiktov a apomixia mala

predstavovať mechanizmus na záchranu pred sterilitou v dôsledku medzidruhového kríženia.

V súčasnosti však bol pri viacerých apomiktických druhoch potvrdený autopolypolidný

pôvod, resp. aspoň v úseku kontrolujúcom apomixiu (Savidan 1982, Pupilli a kol. 1997,

Grimanelli a kol. 1998a, Quarin a kol. 1998).

3.5.2 Genómový imprinting

Apomixia je relatívne frekventovaná u kvitnúcich rastlín. Naopak, u cicavcov neexistuje

takýto, apomixii podobný fenomén partenogenetického vývinu embrya bez oplodnenia, kvôli

genómovému imprintingu. Genómový imprinting môže ovplyvňovať celý genóm, isté

33

chromozómy, alebo len niektoré individuálne gény (Tilghman 1999, Reik a Walter 2001).

Genómový imprinting predstavuje selektívnu expresiu génov v potomstve v závislosti na

pôvode z materského alebo otcovského genómu, t.j. pri takto regulovaných génoch sa

exprimujú len alely pôvodom z materského alebo otcovského genómu. Pri cicavcoch, takto

regulované gény esenciálne pre vývin embrya sa navzájom dopĺňajú, čím je zabezpečená

absolútna nevyhnutnosť prítomnosti oboch genómov v zygote a vyvíjajúcom sa embryu.

Genómový imprinting je tu sprostredkovaný epigeneticky metyláciou DNA (Li a kol. 1993).

Relatívne častý výskyt apomixie však naznačuje, že u rastlín je vývin embrya a semena

riadený odlišne. Konkrétne v prípade apomiktických rastlín prítomnosť samčieho genómu nie

je absolútne nevyhnutná pre vývin embrya. Súčasné štúdie naznačujú, že expresia génov z

otcovského genómu je počas skorého vývinu semena utlmovaná a materský genóm hrá

vedúcu úlohu v riadení skorej embryogenézy (Grimanelli a kol. 2001a). Vielle-Calzada a kol.

(2000) nepozorovali v skorých štádiách embryogenézy pri Arabidopsis thaliana expresiu

žiadneho z 20 mapovaných génov pôvodom z otcovskej časti genómu. Expresia týchto génov

je teda pod kontrolou materskej časti genómu, čo je vlastne genómový imprinting. To

naznačuje, že pri apomiktoch základné procesy skorého vývinu nie sú zmenené oproti

pohlavne sa rozmnožujúcim druhom, t.j. v oboch prípadoch je zahrnutý len samičí genóm.

Preto rozdiel medzi apomiktickým a sexuálnym vývinom semena nie je v procese samotnom

ale v regulácii aktivácie tohto procesu.

Na základe pokusov so sexuálne sa rozmnožujúcou Arabidopsis thaliana sa

predpokladá, že rovnako gény riadiace vývoj endospermu sú ovplyvňované genómovým

imprintingom. Je zjavné, že gény pochádzajúce zo samčieho genómu podporujú vývoj

endospermu, zatiaľ čo gény pochádzajúce zo samičieho genómu vývin endospermu inhibujú

(Haig a Westoby 1991). Vinkenoog a Scott (2001) predpokladajú, že gény podporujúce vývin

endospermu nevyhnutné pre jeho tvorbu sú pri sexuálne sa rozmnožujúcich druhoch aj

pseudogamických apomiktoch exprimované z otcovského genómu. Potom ale pri

autonómnych apomiktoch musí dochádzať ku expresií týchto génov z materského genómu.

To znamená, že v tomto prípade nie je prítomný materský imprint.

Štúdiom mutantov Arabidopsis tahliana vykazujúcich jednotlivé komponenty apomixie

boli identifikované tri druhy mutácií – fis1/mae (Fertilization Independend Seed 1/MEDEA),

fis2 a fis3/fie (Fertilization Independend Endosperm) umožňujúce čiastočný autonómny vývin

endospermu bez oplodnenia (Ohad a kol. 1996, 1999, Chaudhury a kol. 1997, Grossniklaus a

kol. 1998b). To naznačuje, že funkčné alely týchto génov majú úlohu pri inhibícii tvorby

34

endospermu pred oplodnením. Všetky tri mutácie majú materský gametofytický letálny efekt

a semená odvodené z rastlín, ktorých gametofyt nesie takúto mutovanú alelu abortujú bez

ohľadu na to, či otcovská alela je mutovaná alebo divoká, t.j. expresia týchto génov podlieha

genómovému imprintingu. Génové produkty MAE a FIE génov vykazujú homológiu s

polycomb génmi (PcG, Grossniklaus a kol. 1998b, Ohad a kol. 1999), koré regulujú génovú

expresiu moduláciou vyššej štruktúry chromatínu (Pirotta 1999). U živočíchov PcG komplexy

regulujú homeotické gény a kontrolujú bunkovú proliferáciu.

Najlepšie preskúmaný je imprintig génu MAE. MAE kóduje PcG proteín kontrolujúci

bunkovú proliferáciu embrya aj endospermu, je maternitne exprimovaný v embryu aj

endosperme v skorých štádiách vývinu semena. Maternitný gametofitický efekt

sprostredkovaný genómovým imprintingom si vyžaduje funkčnosť DDM1 (Decrease in DNA

Methylation 1), faktoru, ktorý pravdepodobne účinkuje pri remodelovaní štruktúry

chromatínu. Genómový imprinting v tomto prípade je sprostredkovaný štruktúrou chromatínu

v závislosti na metylácii (Vielle-Calzada a kol. 1999). Neskôr počas vývoja semena sa

materský genómový imprinting udržuje iba v endosperme, ale nie vo vznikajúcom embryu a

neskôr v rastline (Kinoshita a kol. 1999).

3.6 Molekulárne markery pri štúdiu apomixie

Pri štúdiu apomixie a jej dedičnosti je potrebné ľahké a presné hodnotenie spôsobu

rozmnožovania spôsobom, ktorý sa vyhýba pracným a časovo náročným histologickým

metódam (Koltunow a kol. 1995). Na identifikáciu hybridného a materského potomstva môžu

byť využité štandardné neviazané monogénne dedené genetické markery. Využitie týchto

markerov je však limitované. V posledných rokoch sa využívajú molekulárne markery na

identifikáciu aberantných potomkov, ktorých genetické fingerprinty sa líšia od materských

rastlín.

RAPD markery v kombinácií s analýzou ploidie pomocou prietokovej cytometrie boli

využité pri determinácii nematerských rastlín Poa pratensis (Huff a Bara 1993, Barcaccia a

kol. 1997). V prípade rovnakého rastlinného druhu využili Mazzucato a kol. (1995) variabilitu

detekovanú RAPD markermi a polymorfizmus izoenzýmov na sledovanie miery apomixie. V

prípade Rubus sp. bola využitá hybridizácia minisatelitnými sondami (Antonius a Nybom

1995) a RFLP spolu s RAPD markermi použili Ortiz a kol. (1997) pri Paspalum notatum.

Prietokovú cytometriu v kombinácii s variabilitou izoenzýmov, resp. mikrosatelitných

35

markerov využili pri sledovaní potomstva rôznych krížení Taraxacum officinale Tas a van

Dijk (1999) resp. van Dijk a kol. (1999).

Okrem vplyvu na formovanie zárodočného miešku, partenogenézu a zachovanie

materského genotypu nemajú gény (gén) apomixie žiaden známy vplyv na vlastnosti rastlín,

ani nebol identifikovaný žiaden transkript alebo iný priamy produkt týchto génov. Neexistuje

žiaden konvenčný morfologický, agronomický alebo fyziologický znak špecificky asociovaný

s apomixiou (Sherwood 2001). Molekulárne markery sú obzvlášť vhodné pre štúdium

vlastností exprimovaných neskoro vo vývine rastliny, ako je apomixia. Využitím

molekulárnych markerov viazaných na apomixiu môže byť rapídne predpovedané

reprodukčné správanie už v štádiu klíčenca s presnosťou závislou na úzkosti väzby markera a

mapovaného génu. Navyše, na rozdiel od cytoembryologických testov je analýza

molekulových markerov nedeštruktívna (Grimanelli a kol. 2001b). Identifikácia

molekulárnych markerov viazaných na apomixiu rovnako zvyšuje možnosť realizácie

komparatívnych štúdií štruktúry genómov a môže poskytovať nástroj pre izoláciu génov

(génu) riadiacich tento znak pozičným klonovaním v prípade, že sa ukáže dostatočne úzko

väzba markera na cieľový lokus (Pessino a kol. 1999).

Molekulárne markery (RFLP, RAPD, SSR, STS, AFLP) viazané na apomixiu,

apomeiózu alebo partenogenézu boli identifikované pre viaceré apospórické druhy:

Pennisetum sp. (Ozias-Akins a kol. 1993, 1998), Cenchrus sp. (Gustine a kol. 1997, Roche a

kol. 1999), Brachiaria sp. (Pessino a kol. 1997, 1998), Poa sp. (Barcaccia a kol. 1998),

Paspalum sp. (Pupilli a kol. 2001, Labombarda a kol. 2002) a diplospórické Erigeron annuus

(Noyes a Riesenberg 2000), Tripsacum dactyloides (Leblanc a kol. 1995b, Kindiger a kol.

1996, Grimanelli a kol. 1998a, 1998b).

36

4. GENETICKÉ MARKERY

Genetické markery sú rýchlo a jednoznačne detekovateľné vlastnosti, ktoré slúžia ako

orientačné body pri analýze genómu. Takéto markery predstavujú polymorfizmy

charakterizujúce geneticky odlišné genotypy. Genetické markery sú v podstate dvoch typov:

morfologické a molekulárne.

Ľubovoľná metóda identifikácie a diferenciácie rastlinných genotypov a markery s ňou

spojené by mali spĺňať základné a všeobecne platné parametre:

– vykazovať vysoký stupeň polymorfizmu

– distribúcia polymorfických markerov po celom genóme

– jednoznačnosť a presnosť

– reprodukovateľnosť

– podľa možnosti kodominantnosť markerov

– rýchlosť a manuálna nenáročnosť

– nízka cena a jednoduchá a široká dostupnosť

4.1 Morfologické markery

Prítomnosť a dedičnosť týchto markerov môže byť hodnotená vizuálne, t.j. bez potreby

špecializovaných biochemických alebo molekulárnych techník. Ako takéto markery sú

najvhodnejšie jednoznačne a jasne determinovateľné morfologické znaky, ktoré sú

kontrolované jedným lokusom a ich expresia je reprodukovateľná pri rozličných vonkajších

podmienkach. Množstvo takýchto znakov je však limitované. Nevýhodou je tiež, že tieto

markery sú dominantné, t.j. na základe ich prítomnosti nie je možné rozlíšiť dominantne

homozygotných od heterozygotných jedincov (Kumar 1999).

4.2 Molekulárne markery

V dôsledku nesmierneho rozvoja v oblasti molekulárnej genetiky bolo vyvinutých

množstvo rozličných metód pre analýzu genetickej variability. Molekulárne markery nimi

tvorené sa líšia v mnohých dôležitých črtách, ako je ich bohatosť v genóme, množstvo

možných nimi detekovateľných polymorfizmov, špecificita na konkrétny lokus,

37

reprodukovateľnosť a technická a finančná náročnosť. Preto nemožno povedať, že niektorý z

markerov je kvalitnejší ako ostatné a voľba najvhodnejšieho závisí od špecifického cieľa a

konkrétnej situácie laboratória. Najdôležitejšie vlastnosti najčastejšie používaných markerov

sú zhrnuté v Tab. 3.

Medzi najčastejšie používané molekulárne markery patria markery založené na

biochemických vlastnostiach organizmu (polymorfizme proteínov) a DNA markery založené

na polymorfizme nukleových kyselín.

4.2.1 Markery založené na polymorfizme proteínov

Proteíny spĺňajú kritériá pre genetické markery, pretože sa vyznačujú vysokým stupňom

geneticky fixovaného polymorfizmu, sú kodominantné a relatívne nezávislé na vonkajších

podmienkach prostredia. V princípe všetky bielkoviny vykazujúce genetický polymorfizmus

môžu byť využité ako diferenciačné markery. Tieto markery vychádzajú najčastejšie z

polymorfizmu zásobných proteínov alebo izoenzýmov, čo sú rozličné varianty (alely) toho

istého enzýmu (Vodenicharová 1989). Proteínové markery odhaľujú polymorfizmy v

kódujúcich sekvenciách, pretože vznikajú ako dôsledok expresie rôznych alel kódovaných

týmito génmi. Podobne ako morfologické markery, aj množstvo týchto znakov je obmedzené.

Môžu byť ovplyvnené podmienkami vonkajšieho prostredia a podliehajú postranslačným

modifikáciám. V súčasnosti sa markery založené na polymorfizme proteínov využívajú

hlavne ako doplnková metóda k metódam založeným na DNA markeroch.

4.2.2 Markery založené na polymorfizme DNA

DNA markery predstavujú vlastne konkrétne polymorfizmy v sekvenciách DNA. Zatiaľ

čo proteínové markery predstavujú variabilitu v exprimovaných kódujúcich sekvenciách,

markery založené na polymorfizme DNA odhaľujú variabilitu vo všetkých oblastiach

genómu, vrátane nekódujúcich sekvencií. Hlavnými výhodami týchto markerov je, že sú

nezávislé od vonkajších podmienok prostredia a v každej živej bunke je prítomná rovnaká

molekula DNA (ak neberieme do úvahy mutácie a epigenetickú variabilitu), čo umožňuje

analýzu v každom ontogentickom štádiu rastliny. Veľkosť rastlinného genómu a možnosti

kombinácie nukleotidov v DNA poskytuje prakticky neobmedzené množstvo variability

DNA, t.j. DNA-markerov. V závislosti na princípe metódy detekcie takýchto polymorfizmov

DNA, rozdeľujeme tieto markery na: markery založené na hybridizácii nukleových kyselín a

38

markery založené na amplifikácií DNA polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Medzi

oboma skupinami existujú viaceré metódy kombinujúce obe techniky.

4.2.2.1 Markery a metódy založené na hybridizácii nukleových kyselín

Tieto metódy sú založené na hľadaní polymorfizmu v sekvenciách DNA pomocou

DNA-DNA hybridizácie. Vzorka DNA sa štiepi restrikčnými endonukleázami (RE) na

množstvo fragmentov (Depicker a kol. 1994). Tie sa potom elektroforeticky rozdelia podľa

veľkosti v polyakrylamidovom (PAGE) alebo agarózovom géli, denaturujú a prenesú

kapilárnym alebo elektrickým prenosom (Southern blotting) na nitrocelulózovú alebo

nylonovú membránu, kde sa fixujú (obr. 5). Pomocou označenej sondy sa potom vizualizujú

komplementárne fragmenty.

Obr. 5 Kapilárny prenos DNA na nitrocelulózovú membránu (Southern blotting)

4.2.2.1.1 RFLP

Polymorfizmus v dĺžke reštrikčných fragmentov medzi vzorkami je výsledkom zmien

v cieľových sekvenciách pre RE, ktoré vznikajú v dôsledku bodových mutácií, resp.

metylačných alebo štruktúrnych zmien DNA (delécie, inzercie alebo translokácie častí

chromozómov). Prejaví sa zmenou v množstve, resp. veľkosti detekovaných reštrikčných

fragmentov. Prítomnosť fragmentu predstavuje v tomto prípade kodominantný znak (marker).

Najväčšou nevýhodou je namáhavosť a potreba veľkého množstva DNA pri analýze. Pri

39

štandardnej detekcií polymorfizmu dĺžky restrikčných fragmentov (Restriction Fragment

Length Polymorphism) – RFLP, sa môžu využiť ako sondy konkrétne segmenty génov,

náhodné genómové klony alebo klony cDNA.

4.2.2.1.2 DNA-fingerprinting

Princípom zhodná, použitou sondou rozdielna je modifikácia klasickej RFLP, DNA-

fingerprinting . Táto metóda využíva ako sondy sekvencie odvodené od sekvencie

vysokovariabilných tandemových repetívnych jednotiek, VNTR (Variable Number Tandem

Repeat), nazývaných aj mini- a mikrosatelity. Takéto repetície sú rozptýlené v genóme

eukaryotov vo variabilnom množstve opakovaní a umožňujú detekovať vysoký stupeň

polymorfizmu. V tomto prípade sa polymorfizmus medzi vzorkami prejaví v dôsledku

rozličného počtu opakovaní repetitívnych jednotiek (Weising a kol. 1998).

4.2.2.1.3 DGGE

Inou alternatívou ku RFLP je denaturačná gradientová gélová elektroforéza, DGGE

(Denaturating Gradient Gel Electrophopresis). Pri DGGE sú štiepené fragmenty DNA

rozdelené v polyakrylamidovom géli, ktorý obsahuje chemický denaturačný gradient

zvyšujúcej sa koncentrácie. Táto modifikácia umožňuje identifikovať polymorfizmy medzi

dvoma rovnako veľkými fragmentami DNA líšiacimi sa aj v jednom bázovom páre (Lerman a

kol. 1986).

4.2.2.2 Markery a metódy založené na PCR

Polymerázová reťazová reakcia, PCR (Polymerase Chain Reaction) je metóda, pri

ktorej sa in vitro enzýmovo, pomocou termostabilnej DNA-polymerázy, na templáte vzorky

amplifikuje úsek DNA vymedzený párom oligonukleotidových primerov. Mnohonásobným

opakovaním troch krokov reakcie (denaturácia templátu, hybridizácia primerov a enzymatické

predlžovanie) dochádza k exponenciálnemu množeniu produktu reakcie (Saiki a kol. 1988).

Ako primery možno použiť oligonukleotidy špecificky komplementárne ku istej, konkrétnej

sekvencii DNA alebo náhodné, nešpecifické oligonukleotidové primery. Techniky založené

na amplifikácii náhodných úsekov DNA sa nazývajú aj spoločným názvom MAAP (Multiple

Arbitrary Amplicon Profiling, Caetano-Anolés 1994). Základné MAAP techniky sú RAPD,

AP-PCR a DAF.

40

4.2.2.2.1 RAPD

Amplifikácia DNA pomocou náhodných oligonukleotidových primerov, RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA) využíva len jeden oligonukleotidový primer

ľubovoľnej sekvencie, dlhý zvyčajne 10 nukleotidov. V miestach, kde sa takéto primery viažu

na templát v rozsahu amplifikovateľnom DNA-polymerázou, dochádza k amplifikácii

náhodných úsekov DNA. V dôsledku bodových mutácií alebo štruktúralnych zmien DNA

v mieste hybridizácie primeru alebo v amplifikovanom úseku, dochádza k vytvoreniu nových,

resp. strate existujúcich väzbových miest pre primery, čo má za následok zmenu počtu alebo

dĺžky amplifikovaných fragmentov v geneticky odlišných vzorkách. Výsledkom RAPD

analýzy je potom po elektroforetickom rozdelení fragmentov a ich zafarbení v roztoku

etídiumbromidu vytvorenie amplifikačného obrazu špecifického pre daný genotyp. Takto je

možné aj bez poznania špecifickej nukleotidovej sekvencie detekovať polymorfizmus DNA,

ktorý spočíva v rôznom počte a dĺžke PCR produktov syntetizovaných u rôznych druhov

alebo u rôznych jedincov toho istého druhu. Prítomnosť určitého fragmentu predstavuje

dominantný marker, jeho neprítomnosť recesívny. Touto metódou nie je možné v danom

amplifikovanom lokuse rozlíšiť homo- od heterozygotov. RAPD je metóda, pri ktorej sa

tvoria "genetické odtlačky" (fingerprints) u druhov, u ktorých nie je známa nukleotidová

sekvencia úsekov DNA (Williams a kol. 1990). Hlavnou nevýhodou tejto techniky je niekdy

jej nízka reprodukovateľnosť.

4.2.2.2.2 AP-PCR

V rovnakom období ako bola objavená RAPD, Welsh a McClelland (1990) popísali

metódu založenú na rovnakom princípe AP-PCR (Arbitrary Primered PCR). AP-PCR

využíva úplne ľubovoľné primery dĺžkou porovnateľné ako pri normálnej PCR (cca 20

nukleotidov). Prvé dva cykly prebiehajú pri zníženej prísnosti hybridizácie primerov (znížená

teplota na 40°C) dlhšiu dobu (5 min.) a vyššej koncentrácií MgCl2. Nasledujúce kroky už

prebiehajú pri špecifickejších podmienkach (60°C). Na vyhodnocovanie sa používajú

polyakrylamidové gély a autorádiografia.

4.2.2.2.3 DAF

Ďalšou z metód MAAP je DNA amplifikačný fingerprinting, DAF (DNA Amplification

Fingerprinting, Caetano-Anollés a kol. 1991). DAF využíva primery len 5-8 nukleotidov dlhé

a 10 až 100 krát vyššiu koncentráciu primeru. Produkty amplifikácie sa separujú v

41

polyakrylamidových géloch a vizualizujú farbením striebrom, čím sa zvýši dvoj až

trojnásobne množstvo detekovaných monomorfných a polymorfných fragmentov.

4.2.2.2.4 RAMPO

Modifikáciu RAPD analýzy predstavuje náhodná aplifikácia mikrosatelitných

polymorfizmov, RAMPO (Random Amplified M icrosatelite Polymorphism), kombinácia

RAPD analýzy a hybridizácie DNA s mikrosatelitnou sondou (Richardson a kol. 1995).

Polymorfizmus je detekovaný hybridiáciou produktu RAPD amplifikácie rozdeleného v

polyakryalmidom géli s rádioaktívne značenou sondou odvodenou od sekvencie

mikrosatelitov.

4.2.2.2.5 SSR a ISSR

Na detekciu variability v počte opakovaní repetitívnych jednotiek mini- a

mikrosatelitov, nazývaných aj SSR (Simple Sequence Repeats) alebo STR (Short Tandem

Repeats) možo použiť aj PCR.. Použitím špecifických primerov odvodených od sekvencií

susediacich s nimi možno detekovať vysoký stupeň polymorfizmu založený podobne ako

DNA-fingerprinting na rozličnom počte opakovaní repetetívnych jednotiek.

Primery tvorené sekvenciou mikrosatelitov sa využívajú na amplifikáciu vnútorných

sekvencií satelitov, ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Na zvýšenie ich špecificity sa

používa ešte ukotvenie na 3' konci (Zietkiewicz a kol. 1994).

4.2.2.2.6 CAPS

Polymorfizmus štiepených amplifikovaných sekvencií, CAPS (Cleaved Amplified

Polymorphic Sequence) je založený na štiepení produktov PCR pomocou RE. Genotypy

diferencované CAPS markermi sú porovnávané, v závislosti od toho, či majú alebo nemajú

restrikčné miesta pre restrikčné endonukleázy, teda porovnávané na úrovni restrikčného

dĺžkového polymorfizmu rovnakých alel (Konieczny a Ausubel 1993).

4.2.2.2.7 STS

Sekvenčne označené miesta, STS (Sequence Tagged Sites) sú markery vychádzajúce z

RFLP sond, ktoré umožňujú detekovať špecifickú, žiadanú vlastnosť. Primery pre PCR sú

tvorené komplementárne k okrajovým sekvenciám takejto sondy. To umožňuje detekovať

42

pôvodne náročné a zdĺhavo identifikovateľné RFLP markery jednoducho a rýchlo pomocou

PCR (Kumar 1999).

4.2.2.2.8 EST

Markery založené na známych exprimovaných sekvenciách, EST (Expressed Sequence

Tag) predstavujú sekvencie čiastočne sekvenovaných cDNA klonov (Adams a kol. 1991).

Tieto sekvencie sú veľmi vhodné pre štúdium génovej expresie.

4.2.2.2.9 SCAR

Obdobou STS sú sekvenčne charakterizované amplifikované markery, SCAR

(Sequence Characterized Amplified Regions). Primery pre ich amplifikáciu sú založené na

koncových sekvenciách niektorých RAPD produktov (Michelmore a kol. 1991). Výhodou je

potom vyššia reprodukovateľnosť ako pri pôvodných RAPD markeroch. SCAR markery majú

väčšinou dominantnú povahu, ale štiepením RE môžu byť transformované na kodominantné.

4.2.2.2.10 AFLP

Táto metóda detekuje restrikčné fragmenty genómovej DNA pomocou selektívnej

amplifikácie. Prvým krokom je štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami a ligácia

dvojvláknových oligonukleotidových adaptérov, na ktorých sú miesta pre hybridizáciu

primerov. Nasleduje selektívna amplifikácia restrikčných fragmentov a detekcia DGGE.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) odhaľuje vysoký polymorfizmus medzi

genotypmi a nie je spojená s problémami reprodukovateľnosti a niekedy komplikovanej

optimalizácie reakčných podmienok PCR (Vos a kol. 1995).

43

Tab. 3 Prehľad niektorých vlastností najčastejšie používaných molekulárnych markerov (http://www.cgn.wageningen-ur.nl/pgr/research/molgen/)

Bohatosť úroveň polymorfizmu

špecifickosť lokusu

kodominancia alel

reproduko-vateľnosť

pracovná náročnosť

technická náročnosť

pracovné náklady

vývojové náklady

kvalita potrebnej

DNA

možnosť automatizácie

Izoenzýmy nízka nízka áno áno vysoká nízka nízka nízka nízka - nie

RFLP vysoká stredná áno áno vysoká vysoká vysoká vysoká stredná-vysoká vysoká nie

DNA fingerprinting

stredná vysoká nie/áno nie/áno vysoká vysoká vysoká vysoká stredná-vysoká vysoká nie

RAPD vysoká stredná nie nie nízka nízka nízka nízka nízka nízka áno

Mikrosatelity SSR

vysoká vysoká áno áno vysoká nízka nízka-stredná

nízka-stredná vysoká nízka áno

ISSR stredná-vysoká stredná nie nie stredná-vysoká nízka nízka-

stredná nízka-stredná nízka nízka áno

CAPS nízka nízka-stredná áno áno vysoká nízka-stredná nízka-stredná

nízka-stredná vysoká nízka áno

SCAR nízka stredná áno áno/nie vysoká nízka nízka nízka vysoká nízka áno

AFLP vysoká stredná nie nie/áno vysoká stredná stredná stredná nízka stredná áno

44

5. ZÁVER

Liečivá rastlina Hypericum perforatum je významným zdrojom mnohých sekundárnych

metabolitov s bohatým spektrom farmakologických účinkov využiteľných v klinickej praxi.

Ich najvýznamnejšie, a v súčasnosti najviac využívané sú antidepresívne účinky.

Predpokladá sa, že hlavné aktívne zložky zodpovedné za tieto účinky sú acyfloroglucinol

hyperforín, niektoré flavonoidy a naftodiantróny, hypericín a pseudohypericín. Z

kvalitatívneho hľadiska je prítomnosť týchto látok v rastline stabilná. Ich množstvo v rastline

je však variabilné. Variabilita množstva týchto obsahových látok je do značnej miery

ovplyvnená genotypom, čo bolo potvrdené aj v pokusoch na našom pracovisku, a preto

dostupnosť geneticky kvalitnejšieho materiálu je nevyhnutná pre šľachtenie a úspešnú poľnú

produkciu s vysokými výnosmi.

Možnosťou pre získavanie týchto sekundárnych metabolitov by mohli byť bunkové

kultúry. Produkcia sekundárnych metabolitov takýmto spôsobom je však obmedzenná,

pretože v nediferencovaných kultúrach sa tieto látky tvoria len v obmedzenom množstve a ich

syntéza je spojená s istou mierou bunkovej diferenciácie.

Pre šľachtenie a pestovanie rastlín s vysokým obsahom sekundárnych metabolitov je

dôležitý aj spôsob rozmnožovania. Pre Hypericum perforatum je typický spôsob

rozmnožovania apospórická apomixia, kde viac ako 90 % potomstva vzniká z apospórických

iniciál. Kombinácia pohlavného a apomiktického spôsobu rozmnožovania u tejto rastliny

(fakultatívna apomixia) umožňuje veľkú diverzitu spôsobov vzniku semena. Bolo

identifikovaných až 11 možných spôsobov, ktorými môže vznikať semeno.

Hoci sa v poslednej dobe venuje štúdiu tejto vlastnosti, ktorá poskytuje možnosť

zachovávania genetickej informácie materskej rastliny a jej množenie pomocou semien, veľká

pozornosť, molekulárna podstata ako aj gény podmieňujúce takýto spôsob rozmnožovania nie

sú známe. Pri objasňovaní genetického pozadia apomixie, ako aj skúmaní roznmožovania

Hypericum perforatum hrajú dôležitú úlohu aj molekulárne markery. V súčasnosti existuje

veľké množstvo metód, ktoré možno použiť na tieto ciele.

45

6. TÉZY DOKTORANDSKEJ DIZERTA ČNEJ PRÁCE

Hlavnými cieľmi môjho štúdia v rámci dizeratačnj práce sú:

1. Študovať korelácie v obsahu niektorých sekundárnych metabolitov v potomstve

vybraných rastlín Hypericum perforatum,

2. Analyzovať variabilitu DNA v somaklonálnych rodinách Hypericum perforatum,

3. Využiť molekulárne markery pri štúdiu reprodukčnej diverzity Hypericum

perforatum.

46

7. L ITERATÚRA

Adams M.D., Kelley J.M., Gocayne J.D., Dubnick M., Polymeropoulos M.H., Xiao H., Merril C.R., Wu A., Olde B., Moreno R.F., Kerlavage A.R., McCombie W.R., Venter J.C., 1991. Complementary-DNA sequencing - expressed sequence tags and human genome project. Science 252 (5013), 1651-1656

Albertini E., Porceddu A., Ferranti F., Reale L., Barcaccia G., Romano B., Falcinelli M., 2001. Apospory and parthenogenesis may be uncoupled in Poa pratensis: a cytological investigation. Sex Plant Reprod 14 (4), 213-217

Antonius K., Nybom H., 1995. Discrimination between sexual recombination and apomixis/automixis in a Rubus plant breeding programme. Hereditas 123 (3), 205-213

Arnholdt-Schmitt B., 2000. RAPD analysis: a method to investigate aspects of the reproductive biology of Hypericum perforatum L. Theor Appl Genet 100 (6), 906-911

Asker S.E., Jerling L., 1992. Apomixis in Plants. CRC Press, Boca Raton

Barcaccia G., Mazzucato A., Albertini E., Zethof J., Gerats A., Pezzotti M., Falcinelli M., 1998. Inheritance of parthenogenesis in Poa pratensis L.: auxin test and AFLP linkage analyses support monogenic control. Theor Appl Genet 97 (1-2), 74-82

Barcaccia G., Mazzucato A., Belardinelli A., Pezzotti M., Lucretti S., Falcinelli M., 1997. Inheritance of parental genomes in progenies of Poa pratensis L. from sexual and apomictic genotypes as assessed by RAPD markers and flow cytometry. Theor Appl Genet 95 (4), 516-524

Barone G.W., Gurley B.J., Ketel B.L., Lightfoot M.L., Abul-Ezz S.R., 2000. Drug interaction between St. John's wort and cyclosporine. Ann Pharmacother 34 (9), 1013-1016

Bashaw E.C., Hanna W.W., 1990. Apomictic reproduction. In: Chapman G.P. (ed.) Reproductive versatility in the Grasses, 110-130, Cambridge University Press, London, England

Bicknell R., Borst N.K., Koltunow A.M., 2000. Monogenic inheritance of apomixis in two Hieracium species with distinct developmental mechanisms. Heredity 84 (2), 228–237

Bicknell R.A., 1997. Isolation of a diploid, apomictic plant of Hieracium arantiacum. Sex Plant Reprod 10 (3), 168-172

Biffignandi P.M., Bilia A.R., 2000. The growing knowledge of St. John's wort (Hypericum perforatum L) drug interactions and their clinical significance. Curr Ther Res Clin E 61 (7), 389-394

Birchler J.A., 1993. Dosage analysis in maize endosperm development. Annu Rev Genet 24, 181-204

Bombardelli E., Marazzoni P., 1995. Hypericum perforatum. Fitoterapia 66 (1), 43-68

Bonilla J.R., Quarin C.L., 1997. Diplosporous and aposporous apomixis in a pentaploid race of Paspalum minus. Plant Sci 127 (1), 97-104

Briskin D.P., Gawienowski M.C., 2001. Differential effects of light and nitrogen on production of hypericins and leaf glands in Hypericum perforatum. Plant Physiol Bioch 39 (12), 1075-1081

Briskin D.P., Leroy A., Gawienowski M., 2000. Influence of nitrogen on the production of hypericins by St. John's wort. Plant Physiol Bioch 38 (5), 413-420

Brutovská R., Čellárová E., Doležel J., 1998. Cytogenetic variability of in vitro regenerated Hypericum perforatum L. plants and their seed progenies. Plant Sci 133 (2), 221-229

Brutovská R., Čellárová E., Schubert I., 2000a. Cytogenetic characterization of three Hypericum species by in situ hybridization. Theor Appl Genet 101 (1-2), 46-50

Brutovská R., Kušniriková P., Bogyiová E., Čellárová E., 2000b. Karyotype analysis of Hypericum perforatum L. Biol Plantarum 43 (1), 133-136

47

Büter B., Orlacchio C., Soldati A., Berger K., 1998. Significance of genetic and enviromental aspects in the field cultivation of Hypericum perforatum. Planta Med 64 (5), 431-437

Butterweck V., Jürgenliemk G., Nahrstedt A., Winterhoff H., 2000. Flavonoids from Hypericum perforatum show antidepressant activity in the forced swimming test. Planta Med 66 (1), 3-6

Butterweck V., Petereit F., Winterhoff H., Nahrstedt A., 1998. Solubilized hypericin and pseudohypericin from Hypericum perforatum exert antidepressant activity in the forced swimming test. Planta Med 64 (4), 291-294

Butterweck V., Wall A., Lieflander-Wulf U., Winterhoff H., Nahrstedt A., 1997. Effects of the total extract and fractions of Hypericum perforatum in animal assays for antidepressant activity. Pharmacopsychiatry 30 (Suppl. 1), 117-124

Cáceres M.E., Matzk F., Busti A., Pupilli F., Arcioni S., 2001. Apomixis and sexuality in Paspalum simplex: characterization of the mode of reproduction in segregating progenies by different methods. Sex Plant Reprod 14 (4), 201-206

Caetano-Anollés G., 1994. MAAP: a versatile and universal tool for genome analysis. Plant Mol Biol 25 (6), 1011-1026

Caetano-Anollés G., Bassam B.J., Gresshoff P.M., 1991. DNA fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio-technol 9 (6), 553-557

Calapai G., Crupi A., Firenzuoli F., Inferrera G., Squadrito F., Parisi A., De Sarro G., Caputi A., 2001. Serotonin, norepinephrine and dopamine involvement in the antidepressant action of Hypericum perforatum. Pharmacopsychiatry 34 (2), 45-49

Campbell M.H., Delfosse E.S., 1984. The biology of australian weeds. 13. Hypericum perforatum L. J Austr I Agr Sci 50 (2), 63 – 73

Carman J.G., 1997. Asynchronous expression of duplicate genes in angiosperms may cause apomixis, bispory, tetraspory, and polyembryony. Biol. J Linn Soc 61 (1), 51-94

Ciccarelli D., Andreucci A.C., Pagni A.M., 2001. The "black nodules" of Hypericum perforatum L. subsp perforatum: Morphological, anatomical, and histochemical studies during the course of ontogenesis. Israel J Plant Sci 49 (1), 33-40

Comai L., Tyagi A.P., Winter K., Holmes-Davis R., Reynolds S.H., Stevens Y., Byers B., 2000. Phenotypic instability and rapid gene silencing in newly formed Arabidopsis allotetraploids. Plant Cell 12 (9), 1551-1568

Crane C.F., 2001. Classification of apomictic mechanisms. In: Savidan Y., Carman J.G., Dresselhaus T. (eds.) The flowering of apomixis: from mechanisms to genetic engineering, pp. 24-43, Mexico, DF: CIMMYT, IRD, European Commision DG VI (FAIR)

Curtis J.D., Lersten N.R., 1990. Internal secretory structures in Hypericum (Clusiaceae) – Hypericum perforatum L. and Hypericum balearicum L. New Phytol 114 (4), 571-580

Čellárová E., Daxnerová Z., Kimáková K., Halušková J., 1994. The variability of the hypericin content in the regenerants of Hypericum perforatum L. Acta Biotechnol 14 (3), 267-274

Čellárová E., Kimáková K., Brutovská R., 1992. Multiple shoot formation and phenotypic changes of R0 regenerants in Hypericum perforatum L. Acta Biotechnol 12 (6), 445-452

Čellárová E., Kimáková K., Daxnerová Z., Mártonfi P., 1995. Hypericum perforatum (St. John’s Wort): In vitro culture and the production of hypericin and other secondary metabolites. In: Bajaj Y.P.S., (ed.) Medicinal and aromatic plants VIII. Biotechnology in agriculture and forestry 33, pp. 261-275, Springer Verlag, Berlin Heidelberg

Depicker A., De Loose M., Van Bockstaele E., 1994. The role of biotechnology in plant breeding. Acta Horticulturae 355, 195-207

Dewick P.M., 1997. Medicinal Natural Products: A biosynthetic approach. West Sussex, England: John Wiley and Sons, Ltd.

Dias A.C.P., Seabra R.M., Andrade P.B., Ferres F., Ferreira M.F., 2001. Xantone production in calli and suspended cells of Hypericum perforatum. J Plant Physiol 158 (7), 821-827

48

Dias A.C.P., Tomás-Berberán F.A., Fernandes-Fereira M., Ferreres F., 1998. Unusual Flavonoid Produced by callus of Hypericum perforatum. Phytochemistry 48 (7), 1165-1168

Fornasiero R.B., Bianchi A., Pinetti A., 1998. Anatomical and ultrastructural observations in Hypericum perforatum L. Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plants 5 (4), 21-33

Galitski T., Saldanha A.J., Styles C.A., Lander E.S., Fink G.R., 1999. Ploidy regulation of gene expression. Science 9 (5425), 251–254

Gambarana C., Tolu P.L., Masi F., Rinaldi M., Giachetti D., Morazzoni P., De Montis M.G., 2001. A study of the antidepressant activity of Hypericum perforatum on animal models. Pharmacopsychiatry 34 (Suppl. 1), S42-S44

Garcia R., Asins M.J., Forner J., Carbonell E.A., 1999. Genetic analysis of apomixis in Citrus and Poncirus by molecular markers. Theor Appl Genet 99 (3-4), 511-518

Grimanelli D., Hernandez M., Perotti E., Savidan Y., 1997. Dosage effects in the endosperm of diplosporous apomictic Tripsacum (Poaceae). Sex Plant Reprod 10 (5), 279-282

Grimanelli D., Leblanc O., Espinosa E., Perotti E., De León D.G., Savidan Y., 1998a. Mapping diplosporous apomixis in tetraploid Tripsacum: one gene or several genes? Heredity 80 (1), 33-39

Grimanelli D., Leblanc O., Espinosa E., Perotti E., De León D.G., Savidan Y., 1998b. Non-Mendelian transmission of apomixis in maize-Tripsacum hybrids caused by a transmission ratio distortion. Heredity 80 (1), 40-47

Grimanelli D., Leblanc O., Perotti E., Grossniklaus U., 2001a. Developmental genetics of gametophytic apomixis. Trends Genet 17 (10), 597-604

Grimanelli D., Tohme J., De León D.G., 2001b. In: Savidan Y., Carman J.G., Dresselhaus T. (eds.) The flowering of apomixis: from mechanisms to genetic engineering, pp. 83-94, Mexico, DF: CIMMYT, IRD, European Commission DG VI (FAIR)

Grossniklaus U., 2001. From sexuality to apomixis: molecular and genetic approaches. In: Savidan Y., Carman J.G., Dresselhaus T. (eds.) The flowering of apomixis: from mechanisms to genetic engineering, pp. 168–211, Mexico, DF: CIMMYT, IRD, European Commission DG VI (FAIR)

Grossniklaus U., Koltunow A., Campagne M.V., 1998a. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci 3 (11), 415-416

Grossniklaus U., Nogler G.A., van Dijk P.J., 2001. How to avoid sex: The genetic control of gametophytic apomixis. Plant Cell 13 (7), 1491-1497

Grossniklaus U., Vielle-Calzada J.P., Hoeppner M.A., Gagliano W.B., 1998b. Maternal control of embryogenesis by medea, a Polycomb group gene in Arabidopsis. Science 280 (5362), 446-450

Guo M., Davis D., Birchler J.A., 1996. Dosage effects on gene expression in a maize ploidy series. Genetics 142 (4), 1349–1355

Gustine D.L., Sherwood R.T., Huff D.R., 1997. Apospory-linked molecular markers in buffelgrass. Crop Sci 37 (3), 947-951

Haig D., Westoby M., 1991. Genomic imprinting in endosperm: its effect on seed development in crosses between species, and between different ploidies of the same species, and its implications for the evolution of apomixis. Philos Tr Roy Soc B 333, 1–13

Halušková J., Čellárová E., 1997. RFLP analysis of Hypericum perforatum L. somaclones and their progenies. Euphytica 95 (2), 229-235

Hanna W.W., Bashaw E.C., 1987. Apomixis: its identification and use in plant breeding. Crop Sci 27 (6), 1136–1139

Hudson J.B., Lopezbazzocchi I., Towers G.H.N., 1991. Antiviral activities of hypericin. Antivir Res 15 (2), 101-112

49

Huff D.R., Bara J.M., 1993. Determining genetic origins of aberrant progeny from facultative apomictic Kentucky bluegrass using a combination of flow cytometry and silver stained RAPD markers. Theor Appl Genet 87 (1-2), 201-208

Chatterjee S.S., Bhattacharya S.K., Wonnemann M., Singer A., Müller W.E., 1998. Hyperforin as a possible antidepressant component of hypericum extracts. Life Sci 63 (6), 499-510

Chaudhury A.M., Ming L., Miller C., Craig S., Dennis E.S., Peacock W.J., 1997. Fertilization-independent seed development in Arabidopsis thaliana. P Natl Acad Sci USA 94 (8), 4223-4228

Jensen K.I.N., Gaul S.O., Specht E.G., Doohan D.J., 1995. Hypericin content of Nova Scotia biotypes of Hypericum perforatum L. Can J Plant Sci 75 (4), 923-926

Jürgenliemk G., Nahrstedt A., 2002. Phenolic compounds from Hypericum perforatum. Planta Med 68 (1), 88-91

Kartnig T., Göbel I., Heydel B., 1996. Production of hypericin, pseudohypericin and flavonoids in cell cultures of various Hypericum species and their chemotypes. Planta Med 62 (1), 51-53

Kasper S., 2001. Hypericum perforatum - a review of clinical studies. Pharmacopsychiatry 34 (Suppl. 1), S51-S55

Kindiger B., Sokolov V., Dewald C., 1996. A comparison of apomictic reproduction in eastern gamagrass (Tripsacum dactyloides (L.) L.) and maize-Tripsacum hybrids. Genetica 97 (1), 103-110

Kinoshita T., Yadegari R., Harada J.J., Goldberg R.B., Fischer R.L., 1999. Imprinting of the MEDEA polycomb gene in the Arabidopsis endosperm. Plant Cell 11 (10), 1945–1952

Kirakosyan A., Hayashi H., Inoue K., Charchoglyan A., Vardapetyan H., 2000a. Stimulation of the production of hypericins by mannan in Hypericum perforatum shoot cultures. Phytochemistry 53 (3), 345-348

Kirakosyan A.B., Vardapetyan R.R., Charchoglyan A.G., Yamamoto H., Hayashi H., Inoue K., 2001. The effect of cork pieces on pseudohypericin production in cells of Hypericum perforatum shoots. Russ J Plant Physl+ 48 (6), 816-819

Kirakosyan A.B., Vardapetyan R.R., Charchoglycan A.G., 2000b. The content of hypericin and pseudohypericin in cell cultures of Hypericum perforatum. Russ J Plant Physl+ 47 (2), 270-273

Koltunow A.M., 1993. Apomixis: embryo sacs and embryos formed without meiosis or fertilization in ovules. Plant Cell 5 (10),1425–1437

Koltunow A.M., Bicknell R.A., CHaudhury A.M., 1995. Apomixis - molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol 108 (4), 1345-1352

Koltunow A.M., Hidaka T., Robinson S.P., 1996. Polyembryony in citrus - Accumulation of seed storage proteins in seeds and in embryos cultured in vitro. Plant Physiol 110 (2), 599-609

Konieczny A., Ausubel F.M., 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using codominant ecotype specific PCR based markers. Plant J 4 (2), 403-410

Kumar L.S., 1999. DNA markers in plant improvement: An overview. Biotechnol Adv 17 (2-3), 143-182

Labombarda P., Busti A., Caceres M.E., Pupilli F., Arcioni S., 2002. An AFLP marker tightly linked to apomixis reveals hemizygosity in a portion of the apomixis-controlling locus in Paspalum simplex. Genome 45 (3), 513-519

Leblanc O., Duenas M., Hernández M., Bello S., Garcia V., Berthaud J., Savidan Y., 1995a. Chromosome doubling in Tripsacum: The production of artificial, sexual tetraploid plants. Plant Breeding 114 (3), 226-230

Leblanc O., Grimanelli D., Gonzalez de León D., Savidan Y., 1995b. Detection of the apomictic mode of reproduction in MAIZE-TRIPSACUM hybrids using maize RFLP markers. Theor Appl Genet 90 (7-8), 1198-1203

Leblanc O., Savidan Y., 1994. Timing of megasporogenesis in Tripsacum species (Poaceae) as related to the control of apomixis and sexuality. Polish Bot Stud 8, 75-81

Leistner E., 1971. A second pathway leading to anthraquinones in higher plants. Phytochemistry 10 (12), 3015-3020

50

Lerman L.S., Silverstein K., Gringfeld E., 1986. Searching for gene defects by denaturing gradient gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 51, 285-297

Li E., Beard C., Jaenisch R., 1993. Role for DNA methylation in genomic imprinting. Nature 366 (6453), 362-365

Liu W.Z., Hu Z.H., 1999. The secretory structure of Hypericum perforatum and its relation to hypericin accumulation. Acta Bot Sin 41 (4), 369-372

Martinez E.J., Espinoza F., Quarin C.L., 1994. BIII progeny (2n+n) from apomictic Paspalum notatum obtained through early pollination. J Hered 85(4), 295-297

Mártonfi P., Brutovská R., Čellárová E., Repčák M., 1996a. Apomixis and hybridity in Hypericum perforatum. Folia Geobot Phytotx 31 (3), 389-396

Mártonfi P., Repčák M., 1994. Secondary metabolites during flower ontogenesis of Hypericum perforatum L. Zahradnictví 21 (1), 37-44

Mártonfi P., Repčák M., Ciccarelli D., Garbari F., 2001. Hypericum perforatum L. - chemotype without rutin from Italy. Biochem Syst Ecol 29 (6), 659-661

Mártonfi P., Repčák M., Mihoková L., 1996b. Hypericum maculatum CRANTZ subsp. maculatum x H. perforatum L. (Hypericaceae): Corroboration of natural hybridization by secondary metabolite analysis. Folia Geobot Phytotx 31 (2), 245-250

Matzk F., 1991. New efforts to overcome apomixis in Poa pratensis L. Euphytica 55 (1), 65-72

Matzk F., Meister A., Brutovská R., Schubert I., 2001. Reconstruction of reproductive diversity in Hypericum perforatum L. opens novel strategies to manage apomixis. Plant J 26 (3), 275-282

Matzk F., Meister A., Schubert I., 2000. An efficient screen for reproductive pathways using mature seeds of monocots and dicots. Plant J 21 (1), 97-108

Mazzucato A., Barcaccia G., Pezzotti M., Falcinelli M., 1995. Biochemical and molecular markers for investigating the mode of reproduction in the facultative apomict Poa pretensis L. Sex Plant Reprod 8 (3), 133-138

McIntyre M., 2000. review of the benefits, adverse events, drug interactions, and safety of St. John's wort (Hypericum perforatum): The implications with regard to the regulation of herbal medicines. J Altern Complem Med 6 (2), 115-124

Meruelo D., Lavie G., Lavie D., 1988. Therapeutic agents with dramatic antiretroviral activity and little toxicity at effective doses - aromatic polycyclic diones hypericin and pseudohypericin. P Natl Acad Sci USA 85 (14), 5230-5234

Michelmore R.W., Paran I., Kesseli R.V., 1991. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis - A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. P Natl Acad Sci USA 88 (21), 9828-9832

Mogie M. 1992. The evolution of asexual reproduction in plants. London, UK. Chapman and Hall

Moore L.B., Goodwin B., Jones S.A., Wisely G.B., Serabjit-Singh C.J., Willson T.M., Collins J.L., Kliewer S.A., 2000. St. John's wort induces hepatic drug metabolism through activation of the pregnane X receptor. P Natl Acad Sci USA 97 (13), 7500-7502

Müller W.E., Singer A., Wonnemann M., 2001. Hyperforín - Antidepresant Activity by a Novel Mechanism of Action. Pharmacopsychiatry 34 (Suppl. 1), S98-S102

Murín A., 1997. Karyotaxonomy of some medicinal and aromatic plants. Thaiszia - Journal of Botany 7 (1), 75-88

Nahrstedt A., Butterweck V., 1997. Biologically active and other chemical constituents of the herb of Hypericum perforatum L. Pharmacopsychiatry 30 (Suppl. 2), S129-S134

Naumova T.N., Hayward M.D., Wagenvoort M., 1999. Apomixis and sexuality in diploid and tetraploid accessions of Brachiaria decumbens. Sex Plant Reprod 12 (1), 43-52

51

Naumova T.N., Vielle-Calzada J.P., 2001. Ultrastructual Analysis of Apomictic Development. In: Savidan Y., Carman J.G., Dresselhaus T. (eds.) The flowering of apomixis: from mechanisms to genetic engineering, pp 44-63, Mexico, DF: CIMMYT, IRD, European Commission DG VI (FAIR)

Noack K.L., 1939. Über Hypericu - Kreuzungen. VI. Fortplanzungsverhältnisse und Bastarde von Hypericum perforatum L. Z. Indukt. Abstammungs-Vererbungslehre 76, 569-601

Nogler G.A., 1982. How to obtain diploid apomictic Ranunculus auricomus plants not found in wild state. Bot Helv 92 (1), 13-22

Nogler G.A., 1984a. Gametophytic apomixis. In: Johri B.M. (ed.) Embryology of Angiosperms. Springer, Berlin Heidelberg New York

Nogler G.A., 1984b. Genetics of apospory in apomictic Ranuncuclus auricomus. V. Conclusion. Bot Helv 94 (2), 411–422

Nogler G.A., 1995. Genetics of apomixis in Ranunculus auricomus VI. Epilogue. Bot Helv 105 (1), 111-115

Noyes R.D., Rieseberg L.H., 2000. Two independent loci control agamospermy (apomixis) in the triploid flowering plant Erigeron annuus. Genetics 155 (1), 379-390

Ohad N., Margossian L., Hsu Y.C., Williams C., Repetti P., Fischer R.L., 1996. A mutation that allows endosperm development without fertilization. P Natl Acad Sci USA 93 (11), 5319-5324

Ohad N., Yadegari R., Margossian L., Hannon M., Michaeli D., Harada J.J., Goldberg R.B.,

Fischer R.L., 1999. Mutations in FIE, a WD polycomb group gene, allow endosperm development without fertilization. Plant Cell 11 (3), 407-415

Ortiz J.P.A., Pessino S.C., Leblanc O., Hayward M.D., Quarin C.L., 1997. Genetic fingerprinting for determining the mode of reproduction in Paspalum notatum, a subtropical apomictic forage grass. Theor Appl Genet 95 (5-6), 850-856

Ozias-Akins P., Lubbers E.L., Hanna W.W., McNay J.W., 1993. Transmission of the apomictic mode of reproduction in Pennisetum: co-inheritance of the trait and molecular markers. Theor Appl Genet 85 (5), 632-638

Ozias-Akins P., Roche D., Hanna W.W., 1998. Tight clustering and hemizygosity of apomixis-linked molecular markers in Pennisetum squamulatum genetic control of apospory by a divergent locus that may have no allelic form in sexual genotypes. P Natl Acad Sci USA 95 (9), 5127-5132

Peacock J., 1992. Genetic engineering and mutagenesis for apomixis in rice. Apomixis Newsl 4 , 3–7

Pessino S.C., Evans C., Ortiz J.P.A., Armstead I., Do Valle C.B., Hayward M.D., 1998. A genetic map of the apospory-region in Brachiaria hybrids: identification of two markers closely associated with the trait. Hereditas 128 (2), 153-158

Pessino S.C., Ortiz J.P.A., Hayward M.D., Quarin C.L., 1999. The molecular genetics of gametophytic apomixis. Hereditas 130:1-11

Pessino S.C., Ortiz J.P.A., Leblanc O., doValle C.B., Evans C., Hayward M.D., 1997. Identification of a maize linkage group related to apomixis in Brachiaria. Theor Appl Genet 94 (3-4), 439-444

Pirotta V., 1997. PcG complexes and chromatin silencing. Curr Opin Genet Dev 7, 249–258

Poutaraud A., Di Gregorio F., Tin V.C.F., Girardin P., 2001. Effect of light on hypericins contents in freshflowering top parts and in an extract of St. John's Wort (Hypericum perforatum). Planta Med 67 (3), 254-259

Pretto F.R., Santarém R., 2000. Callus formation and plant regeneration from Hypericum perforatum leaves. Plant Cell Tiss Org 62 (2), 107-113

Pupilli F., Caceres M.E., Quarin C.L., Arcioni S., 1997. Segregation analysis of RFLP markers reveals a tetrasomic inheritance in apomictic Paspalum simplex. Genome 40 (6), 822-828

52

Pupilli F., Labombarda P., Caceres M.E., Quarin C.L., Arcioni S., 2001. The chromosome segment related to apomixis in Paspalum simplex is homoeologous to the telomeric region of the long arm of rice chromosome 12. Mol Breeding 8 (1), 53-61

Quarin C.L., 1999. Effect of pollen source and pollen ploidy on endosperm formation and seed set in pseudogamous apomictic Paspalum notatum. Sex Plant Reprod 11 (6), 331-335

Quarin C.L., Espinoza F., Martinez E.J., Pessino S.C., Bovo O.A., 2001. A rise of ploidy level induces the expression of apomixis in Paspalum notatum. Sex Plant Reprod 13 (5), 243-249

Quarin C.L., Norrmann G.A., Espinoza F., 1998. Evidence for autoploidy in apomictic Paspalum rufum. Hereditas 129 (2), 119-124

Reichling J., Weseler A., Saller R., 2001. A current review of the antimicrobial activity of Hypericum perforatum L. Pharmacopsychiatry 34 (Suppl. 1), S116-S118

Reik W., Walter J., 2001. Genomic imprinting: Parental influence on the genome. Nat Rev Genet 2 (1), 21-32

Reiser L., Fischer R.L., 1993. The ovule and the embryo sac. Plant Cell 5 (10), 1291-1301

Repčák M., Mártonfi P., 1997. The Localization of Secondary Substances in Hypericum perforatum flower. Biologia 52 (1), 91-94

Richards A.J., 1986. Plant breeding systems. Allen and Unwin, London

Richardson T., Cato S., Ramser J., Kahl G., Weising K., 1995. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers. Nucleic Acids Res 23 (18), 3798-3799

Robson N.K.B., 1981. Studies in the genus Hypericum L. (Guttiferae). 2. Characters of the genus. Bull Brit Mus Nat Hist Bot 8, 55-226

Roche D., Cong P.S., Chen Z.B., Hanna W.W., Gustine D.L., Sherwood R.T., Ozias-Akins P., 1999. An apospory-specific genomic region is conserved between Buffelgrass (Cenchrus ciliaris L.) and Pennisetum squamulatum Fresen. Plant J 19 (2), 203-208

Roche D., Hanna W.W., Ozias-Akins P., 2001. Is supernumerary chromatin involved in gametophytic apomixis of polyploid plants? Sex Plant Reprod 13 (6), 343-349

Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A., 1988. Primer - directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 (4839), 487-491

Savidan Y.H., 1982. Nature et hérédité de l’apomixie chez Panicum maximum Jacq. Travaux et Documents ORSTROM, Paris, 153, 1-159

Sherwood R.T., 2001. Genetic analysis of apomixis. In: Savidan Y., Carman J.G., Dresselhaus T. (eds.) The flowering of apomixis: from mechanisms to genetic engineering, pp. 64-82, Mexico, DF: CIMMYT, IRD, European Commision DG VI (FAIR)

Sherwood R.T., Berg C.C., Young B.A., 1994. Inheritance of apospory in buffelgrass. Crop Sci 34 (6), 1490-1494

Schempp C.M., Kirkin V., Simon-Haarhaus B., Kersten A., Kiss J., Termeer C.C., Gilb B., Kaufmann T., Borner C., Sleeman J.P., Simon J.C., 2002a. Inhibition of tumour cell growth by hyperforin, a novel anticancer drug from St. John's wort that acts by induction of apoptosis. Oncogene 21 (8), 1242-1250

Schempp C.M., Simon-Haarhaus B., Simon J.C., 2002b. Phototoxic and apoptosis-inducing capacity of pseudohypericin. Planta Med 68 (2), 171-173

Schmidt W., Abd El-Mawla A.M.A., Wolfender J.L., Hostettmann K., Beerhues L., 2000. Xanthones in cell cultures of Hypericum androsaemum. Planta Med 66 (4), 380-381

Simmen U., Higelin J., Berger-Büter K., Schaffner W., Lundstrom K., 2001. Neurochemical studies with St. John's wort in vitro. Pharmacopsychiatry 34 (Suppl. 1), S137-S142

Smith M.A.L., Kobayashi H., Gawienowski M., Briskin D.P., 2002. An in vitro approach to investigate medicinal chemical synthesis by three herbal plants. Plant Cell Tiss Org 70 (1), 105-111

53

Southwell I.A., Bourke C.A., 2001. Seasonal variation in hypericin content of Hypericum perforatum L. (St. John’s Wort). Phytochemistry 56 (5), 437-441

Southwell I.A., Campbell M.H., 1991. Hypericin content variation in Hypericum perforatum in Australia. Phytochemistry 30 (2), 475-478

Spillane C., Steimer A., Grossniklaus U., 2001. Apomixis in agriculture: the quest for clonal seeds. Sex Plant Reprod 14 (4), 179-187

Steck N., Messmer M., Schaffner W., Bueter K.B., 2001. Molecular markers as a tool to verify sexual and apomictic off-spring of intraspecific crosses in Hypericum perforatum. Planta Med 67 (4), 384-385

Tas I.C.Q., Van Dijk P.J., 1999. Crosses between sexual and apomictic dandelions (Taraxacum). I. The inheritance of apomixis. Heredity 83, 707-714

Tekeľová D., Repčák M., Zemková E., Tóth J., 2000. Quantitative changes of dianthrones, hyperforin and flavonoids content in the flower ontogenesis of Hypericum perforatum. Planta Med 66 (8), 778-780

Tilghman S.M., 1999. The sins of the fathers and mothers: Genomic imprinting in mammalian development. Cell 96 (2), 185-193

Umek A., Kreft S., Kartnig T., Heydel B., 1999. Quantitative phytochemical analysis of six Hypericum species growing in Slovenia. Planta Med 65 (4), 388-390

van Baarlen P., de Jong J.H., van Dijk P.J., 2002. Comparative cyto-embryological investigations of sexual and apomictic dandelions (Taraxacum) and their apomictic hybrids. Sex Plant Reprod 15 (1), 31-38

Van Dijk P.J., Tas I.C.Q., Falque M., Bakx-Schotman T., 1999. Crosses between sexual and apomictic dandelions (Taraxacum). II. The breakdown of apomixis. Heredity 83, 715-721

Vielle-Calzada J.P., Baskar R., Grossniklaus U., 2000. Delayed activation of the parental genome during seed development. Nature 404 (6773), 91-94

Vielle-Calzada J.P., Crane C.F., Stelly D.M., 1996. Apomixis: The asexual revolution. Science 274 (5291), 1322-1323

Vielle-Calzada J.P., Thomas J., Spillane C., Coluccio A., Hoeppner M.A., Grossniklaus U., 1999. Maintenance of genomic imprinting at the Arabidopsis medea locus requires zygotic DDM1 activity. Gene Dev 13 (22), 2971-2982

Vinkenoog R., Scott R.J., 2001. Autonomous endosperm development in flowering plants: how to overcome the imprinting problem? Sex Plant Reprod 14 (4), 189-194

Vodenicharova M., 1989. Use of proteins as molecular-genetic markers in plants. Genet Sel 22, 269-277

Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M., 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 23 (21), 4407-4414

Walker L., Sirvent T., Gibson D., Vance N., 2001. Regional differences in hypericin and pseudohypericin concentrations and five morphological traits among Hypericum perforatum plants in the northwestern United States. Can J Bot 79 (10), 1248-1255

Walker T.S., Bais H.P., Vivanco J.M., 2002. Jasmonic acid-induced hypericin production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L. (St. John's wort). Phytochemistry 60 (3), 289-293

Weising K., Winter P., Huttel B., Kahl G., 1998. Microsatellite markers for molecular breeding. J Crop Prod 1(1), 113-43

Welsh J., McClelland M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res 18 (24), 7213-7218

Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V., 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 18 (22), 6531-6535

Woelk H., 2000. Comparison of St. John’s wort and imipramine for treating depression: Randomized controlled trial. Brit Med J 321 (7260), 536-539

54

Zdunek K., Alfermann A.W., 1992. Initiation of shoot organ cultures of Hypericum perforatum and formation of hypericin derivates. Planta Med 58 (Suppl.), A621-A622

Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D., 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20 (2), 176-183

Zelený V., 1982. Hypericales. In: Futák J., Bertová L. (eds.) Flóra Slovenska III., 293-313 Veda Bratislava