METODA EFECTUARII SECTIUNILOR FINERealizarea unui preparat
microscopic permanent prin metoda efectuarii sectiunilor fine
necesita o tehnica care se desfasoara in mai multe etape. Astfel,
recoltarea const n obinerea de material biologic de la organisme
vii sau de la organisme moarte, persoane decedate sau animale de
experien sacrificate. Recoltarea materialului biologic din
organismele vii se poate efectua prin: biopsie, punctie bioptica,
aspiratie endoscopica, punctia cavitatilor, raclarea mucoaselor,
prelevarea intraoperatorie, recoltarea de material biologic de la
cadavrele umane si prin recoltarea de la animelele de experienta.
Aceasta procedura se face pe o placa de pluta sau de P.V.C. foarte
curata; se folosesc pense fine, fara dinti. La fasonarea pieselor
se folosesc lame de ras noi, degresate. Daca tesutul are o
consistenta moale (sistem nervos central, testicol) se prefera
fixarea unor fragmente mai mari timp de 1-2 ore, perioada in care
structurile superficiale se intaresc si permit obtinerea lor.
Fixarea are drept scop esential conservarea constituientilor
celulari intr-o stare cat mai apropiata de starea vie si de
pregatirea lor in vederea manevrelor ulterioare. Aceasta etapa
poate fi realizata prin agenti fizici sau chimici. In fixarea prin
agenti fizici se incadreaza metodele ce folosesc caldura, desicarea
la temperaturi scazute(congelare-desicare sau criodesicare),
desicarea la temperatura laboratorului, metodele ce presupun
racirea preparatului biologic urmata de actiunea unui fixator
lichid(congelare-substitutie), racirea nereprezentand un procedeu
de fixare. Dintre toti fixatorii fizici trecuti in evidenta numai
caldura asigura o fixare in adevaratul sens al cuvantului, adico o
denaturare a proteinelor tisulare incat in majoritatea cazurilor se
impune interventia agentilor chimici susceptibili a asigura aceasta
denaturare. In functie de tipul de actiune asupra ovalalbuminei se
poate face o clasificare a agentilor chimici fixatori in coagulanti
(metanol, etanol, acetona, acid nitric, acid clorhidric, trioxidul
de croom etc) si necoagulanti (acid acetic, tetraoxid de osmiu,
formaldehida). De asemenea exista si amestecuri fixatoare definite
ca amestecuri de doi sau mai multi fixatori simpli la care se pot
adauga substante destinate realizarii unui anumit pH al solutiei.
Acestea se pot sistematiza in patru grupe: amestecuri cromo-osmice,
amestecuri cromice fara OsO4 si acid acetic, amestecuri pe baza de
metale grele in afara de crom si OsO4 si amestecuri cromo-acetice.
Alti fixatori mai sunt amestecul de formol-calciu, fixatorii Clarke
si Carnoy si fixatorii Bouin, Susa, Heidenhein. La alegerea
fixatorului se tine cont de natura tesutului sau organului,
detaliile de structura care trebuie evidentiate si coloratia pe
care vrem sa o facem. Urmatoarea etapa este includerea in parafina
si are mai multe subetape. Deshidratarea se realizeaza trecand
tesuturile fixe prin alcooluri de concentratie crescatoare. Pentru
tesuturile fragile se recomanda o deshidratare lenta incepand cu
alcool 50. In clarificare piesa este trecuta prin bai succesive de
solvent organic: toluen, xilen, benzen, cloroform. Impregnarea cu
parafina se face in parafina mentinuta in stare lichida prin
plasarea ei intr-un termostat la 56 la care se adauga o mica
cantitate de ceara de albine. Durata impregnarii variaza in functie
de volumul piesei, fiind in medie de 6 ore. In includerea
propriu-zisa piesa se aseaza in parafina noua, neutilizata care se
toarna intr-o forma. Racirea acestei parafine duce la solidificarea
ei si obtinerea unui bloc gata de a fi sectionat. Parafina este
mediul de includere cel mai frecvent utilizat, dar exista si alte
medii si tehnici de includere: in paraplast, in celoidina, dubla
includere in celoidina si parafina, in dietilen sau polietilen
glicol sau in gelatina. A patra etapa este sectionarea si se
realizeaza cu ajutorul microtoamelor, existand doua tipuri.
Microtoame cu miscare verticala(pentru sectionarea blocurilor de
parafina) si microtoame
cu miscare orizontala(mai ales pentru blocurile de celoidina).
Pentru blocurile de parafina aceasta operatiune este simpla: se
incalzeste port-obiectul metalic, apoi se aplica blocul de
parafina, se introduc apoi in apa rece, mentinand in contact cele
doua piese pana cand blocul adera solid la port-obiect. Etalarea si
lipirea sectiunilor reprezinta ultima etapa a metodei efectuarii
sectiunilor fine. Metodele de etalare si lipire variaza in functie
de procesul de includere ce a fost folosit. Pentru sectiunile la
parafina, paraplan sau Ester Wax (etalarea la bain-marie si
etalarea pe lama) panglicile de parafina obtinute prin procesul
sectionarii la microtom sunt plisate si trebuiesc etalate pe un
mediu lichid, slab incalzit pentru ca pliurile sa dispara. Pentru
sectiunile in celoidina pot fi utilizate trei modalitati:
transportul sectiunilor culese in etanol 70%, in diferiti reactivi
sau coloranti, se poate de asemenea lipi sectiunea pe o lama de
sticla cu ajutorul unei solutii de celoidina sau cand colorantii
folositi se fixeaza pe celoidina sectiunile trebuiesc lipite cu
ajutorul unei solutii de gelatina. Sectiunile in celoidina-parafina
sunt in general etalate si lipite ca si sectiunile de parafina, iar
sectiunile in polietilen-glicol vor fi etalate folosind o solutie
de gelatina sau albumina, dar la rece. Utilizarea mediului Reid si
Sarantakos indeparteaza acest inconvenient.
