Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA

1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta –1977)

2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger i wsp. 1977)

Obydwie metody sprowadzają się do uzyskania puli(zbioru) cząsteczek DNA zakończonych określonymnukleotydem A, C, G lub T, różniących się długością o 1 nt

3. Metody sekwencjonowania „odmienne od tradycyjnych” (tj. klasycznej metody Sangera)

•Metody określane jako NGS – next generation sequencing: (ich odmienność wynika głównie z faktu, że nie używa się w nich ddNTP) – np. pirosekwencjonowanie

1. Metoda chemicznej degradacji DNA – w metodzie cząsteczki DNAzakończone określonym nukleotydem otrzymuje się przez działanieodczynnikami specyficznie tnącymi nić DNA w miejscuokreślonego nukleotydu

Wyjściowym materiałem jest dsDNA,które przed rozpoczęciem degradacjiznakuje się na końcu 5’. Uzyskujemypulę cząsteczek z wyznakowaną zawsze tąsamą nicią.

Dodaje się ograniczoną ilość siarczanudimetylu, tak że w poszczególnychcząsteczkach metylowana jest losowotylko jedna G – DNA jest ciąglenienaruszone.

Dodaje się piperydyny – usunięciezmetylowanego pierścienia G i przecinassDNA przed miejscem pozbawionymzasady azotowej.

Uzyskuje się pulę cząsteczek,wyznakownych na końcu 5’ aróżniących się długością na końcu 3’

Rodzaj zasad

azotowych

Odczynnik do

modyfikacji zasady

Odczynnik do

usunięcia

zmodyfikowanej

zasady

Odczynnik do

przecięcia nici

DNA

G Siarczan dimetylu Piperydyna Piperydyna

A+G Kwas Kwas Piperydyna

C+T Hydrazyna Piperydyna Piperydyna

C Hydrazyna + alkalia Piperydyna Piperydyna

A>C Alkalia Piperydyna Piperydyna

Metoda chemicznej degradacji DNA

Istnieje trudność w uzyskiwaniu chemicznej reakcji specyficznie degradującej w pozycji A i T. Dlatego przeprowadza się zwykle cztery równoczesne reakcje dla;

G, A+G, C i C+T.

Nie ma to wpływu na wierność odczytywanej sekwencji.

Metoda chemicznej degradacji DNA•Produkty degradacji poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości•Ponieważ są one wyznakowane radioaktywnie przeprowadza się autoradiografię w celu ich wizualizacji

• Autoradiogram analizujemy (czytamy) od dołu

• Wysokorozdzielczy żel umożliwia rozdział fragmentów różniących się długością o 1 nt

2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA – metoda Sangera (metoda dideoksy)

• zbioru cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T uzyskuje się na drodze syntezy DNA in vitro

• Materiałem wyjściowym (w oryginalnej metodzie) było jednoniciowe - ssDNA –fragment DNA do sekwencjonowania trzeba było sklonować do wektora, który umożliwia otrzymanie matrycowego ssDNA (np. wektora fagowego M13 lub fagemidu)

• Opiera się na wykorzystaniu ddNTP (3’dideoksynukleotydów, pozbawionych grupy hydroksylowej na końcu 3’), które polimeraza DNA może wbudowywać w syntetyzowaną nić DNA tak jak „normalne nt”

• Wbudowanie ddNTP sprawia, że łańcuch DNA nie może być dalej wydłużany, czyli ddNTP działa jak terminator syntezy DNA

• Jak w każdej reakcji syntezy DNA w próbówce potrzebne są poza matrycą: starter, polimeraza DNA, dNTP, kationy dwuwartościowe.

Jak długi fragment (czyli ile nukleotydów) można było „przeczytać” w pojedynczej reakcji?

•Na standardowym 6% żelu poliakrylamidowym można odczytać kolejność kilkuset nukleotydów (ok. 650 nt)

Dodatkowe zabiegi zwiększające wydajność odczytu

•Na żelu 8% możliwe jest odczytanie sekwencji leżących bliżej startera (zakres 50-400 pz)

•Na żelu 4% możliwe jest odczytanie sekwencji leżących dalej od startera (500-1500 pz)

Modyfikacje metody Sangera w kierunku automatyzacji procesu sekwencjonowania DNA

wybór optymalnej polimerazy DNA

zamiana 33P na 35S do znakowania dNTP (ostrzejsze prążki, lepsze odczyty sekwencji – wczesne lata 80-te)

wprowadzenie do znakowania dNTP barwników fluorescencyjnych

zastosowanie ddNTP znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi

automatyczny sekwenator DNA LI-COR (koniec lat 80-tych)

Polimeraza do sekwencjonowania musi spełniać trzy warunki:

1. Wysoka procesywność – zdolność syntezy odpowiednio długiego odcinka DNA i oddysocjowanie dopiero po włączeniu ddNTP

2. Brak aktywności egzonukleazy 5’-3’ (lub nieznaczna taka aktywność) zdolność zastępowania istniejącego łańcucha DNA – zjawisko niekorzystne w sekwencjonowaniu, ponieważ usuwanie nukleotydów z końca 5’ nowosyntetyzowanego łańcucha skraca go uniemożliwiając odczytanie prawidłowej sekwencji z wzoru prążków po autoradiografii

3. Brak aktywności egzonukleazy 3’-5’ (lub nieznaczna taka aktywność) aktywności korektorskej – polimeraza pozbawiona tej aktywności nie usuwa wbudowanych ddNTP kończących łańcuch po ich włączeniu

Pierwszym enzymem używanym w reakcji sekwencjonowania był fragment Klonowa –pol DNA I E. coli, pozbawiona aktywność exo 5’-3’ – WADA: ma niską procesywność

Sekwenaza: zmodyfikowana polimeraza faga T7 (1987) – wysoka procesywność, brak aktywności egzonukleolitycznej, dodatkowy atut to duża szybkość przeprowadzonej reakcji.

Modyfikacje metody Sangera w kierunku automatyzacji procesu sekwencjonowania DNA

wybór optymalnej polimerazy DNA

zamiana 33P na 35S do znakowania dNTP (ostrzejsze prążki, lepsze odczyty sekwencji – wczesne lata 80-te)

wprowadzenie do znakowania dNTP barwników fluorescencyjnych

zastosowanie ddNTP znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi+ reakcja PCR do syntezy cząsteczek DNA

automatyczny sekwenator DNA LI-COR (koniec lat 80-tych)

Sekwencjonowanie automatyczne (cykliczne )

• Zasada reakcji pozostaje bez zmian – opiera się na syntezie DNA z użyciem ddNTP

• Zmiana dotyczy sposobu przeprowadzenia syntezy DNA: wykorzystuje się reakcję PCR i termostabilną polimerazę Taq (a właściwie jej zmodyfikowaną wersję, w której Phe z centrum aktywnego zastąpiono Tyr, co znacznie zmniejszyło dyskryminację ddNTP przez polimerazę

• Otrzymaną pulę cząsteczek zakończonych określonym nukleotydem analizuje się albo przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym albo elektroforezę kapilarną

Zalety w stosunku do metody oryginalnej metody Sangera:

• Możliwość stosowania dsDNA jako matrycy, np. plazmidowego, genomowego DNA – łatwość przygotowania matrycy (nie trzeba klonować odcinka DNA przed sekwencjonowaniem do jakiegokolwiek wektora)

• Dzięki zastosowaniu reakcji PCR sekwencjononowania wystarcza bardzo mała ilość matrycowego DNA

•Reakcja cyklicznego sekwencjonowania przebiega podobnie do reakcji PCR, ale wykorzystuje się w niej tylko jeden starter –syntetyzowana jest tylko jedna nić analizowanej cząsteczki matrycowego dsDNA - asymetryczny PCR (często jest on dodatkowo dwustopniowy dla podniesienia wierności amplifikacji)

•Każdy z ddNTPwyznakowany jest innym fluoroforem, co umożliwia prowadzenie reakcji w jednej próbówce

•1 matryca = 1 reakcja

• Cztery różne kolory fluoroforów, którymi wyznakowane są ddNTP, oznacza układ:

1 matryca=1 reakcja a to daje możliwość analizy większej ilości próbek na jednym żelu

Do sekwencjonowania genomów potrzebna jest wysoka przepustowość użytych technik

Problem: czy można odczytać sekwencje odcinka DNA długości kilkuset kpzw jednej reakcji enzymatycznej?

1. Sekwencjonowanie klonów biblioteki genomowej z dużymi wstawkami poprzez podklonowanie fragmentów do „zwykłych” wektorów np. plazmidowych np. pUC18/19 (zawierają one miejsca komplementarne dla uniwersalnych starterów, które mogą być użyte do syntezy DNA in vitro na matrycy zrekombinowanego plazmidu

2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking)

Długi fragment genomowego DNA

2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking)

3. Metody określane jako NGS – next generation sequencing:

Co je wyróżnia?

•nie używa się w nich ddNTP

•ogromna przepustowość (ang. highthroughput)

•w większości oparte na syntezie cząsteczek DNA

Pirosekwencjonowanie – sekwencjonowanie przez syntezę DNA

Nie używa się ddNTP, w czasie reakcji rejestruje się kolejność wbudowywania nukleotydów w trakcie syntezy nowej nici

•Wbudowanie nukleotydu rejestruje się jako błysk chemiluminescencji indukowany przez pirofosforan, który uwalnia się z dNTP.

Pirosekwencjonowanie –schemat reakcji

Principle of Pyrosequencing

Pyrosequencing™ is sequencing by synthesis, a simple to use technique for

accurate and consistent analysis of DNA sequences.

Step 1

A sequencing primer is hybridized to a single stranded, PCR amplified, DNA template, and

incubated with the enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase and apyrase,

and the substrates, adenosine 5´ phosphosulfate (APS) and luciferin.

Step 2

The first of four deoxynucleotide triphosphates

(dNTP) is added to the reaction. DNA polymerase

catalyzes the incorporation of the deoxynucleotide

triphosphate into the DNA strand, if it is

complementary to the base in the template

strand. Each incorporation event is accompanied

by release of pyrophosphate (PPi) in a quantity

equimolar to the amount of incorporated

nucleotide.

Step 3

ATP sulfurylase quantitatively converts PPi to ATP

in the presence of adenosine 5´ phosphosulfate.

This ATP drives the luciferase-mediated

conversion of luciferin to oxyluciferin that

generates visible light in amounts that are

proportional to the amount of ATP. The light

produced in the luciferase-catalyzed reaction is

detected by a charge coupled device (CCD)

camera and seen as a peak in a pyrogram™. Each

light signal is proportional to the number of

nucleotides incorporated.

Step 4

Apyrase, a nucleotide degrading enzyme,

continuously degrades unincorporated dNTPs and

excess ATP. When degradation is complete,

another dNTP is added.

Step 5

Addition of dNTPs is performed one at a time. It should be noted that deoxyadenosine

alpha-thio triphosphate (dATPαS) is used as a substitute for the natural deoxyadenosine

triphosphate (dATP) since it is efficiently used by the DNA polymerase, but not

recognized by the luciferase.

As the process continues, the complementary DNA strand is built up and the nucleotide

sequence is determined from the signal peak in the pyrogram.

Czas trwania poszczególnych etapów przygotowania fragmentów do sekwencjonowania (tzw. biblioteki)

4,5 godz. 8 godz.

Czas przeprowadzenia reakcji pirosekwencjonowania – odczytu kolejności nt8 godz.

Zbieranie danych: seria wysokorozdzielczych zdjęć

Metoda odwracalnej terminacji syntezy DNA – platforma Illumina (Solexa)

do pofragmentowanegoDNA dołącza się krótkie dwuniciowe adaptery

Po denaturacji mieszaninęjednoniciowych fragmentów DNA oraz oligonukletydów komplementarnych do adapterów unieruchamia się na mikropłytce

amplifikacja fragmentów DNA w reakcji PCR typu „koci grzbiet” (bridgeamplification): unieruchomiony z jednej strony jednoniciowy fragment DNA odszukuje w najbliższym sąsiedztwie komplementarny oligonukleotyd, również związany z podłożem (koci grzbiet), a polimeraza DNA w obecności dNTPdobudowuje komplementarne sekwencje

Cykl powtarza się aż do momentu powstania w okolicydanego fragmentu odpowiedniej do sekwencjonowania liczby kopii tego fragmentu (~1000 kopii). W ten sposób otrzymuje się na mikropłytce sektory, z których każdy reprezentuje statystycznie inny powielony fragment DNA – ang. „polonies“ – polymerasegenerated colonies

Metoda odwracalnej terminacji syntezy DNA – platforma Illumina

Po amplifikacji wprowadza się starter, polimerazę DNA oraz mieszankę 4 dNTPz chemicznie zablokowaną grupą 3’OH, wyznakowanych różnymi barwnikami

Laser wzbudza świecenie fluoroforów a system rejestruje świecenie z każdego sektora specyficznego dla danego fragmentu DNA

Ilość cykli zależy od wyjściowej długości fragmentów DNA, na które zostało pofragmenowane genomowe DNA

Po uzyskaniu obrazu, przed następnym cyklem syntezy bloker grupy 3’OH oraz fluorofor są chemicznie usuwane co umożliwia przyłączenie kolejnego dNTP

NGS 5500 SOLiD™ System

Benefits:

Powerful benchtop system

Up to 15 Gb/day with 99.99% accuracy (1 genome - 30x coverage for human

genome; 12 exomes, 6 transcriptomes ~100x–150x coverage for exome; whole

transcriptome)

Simplified sequencing

Streamlined workflows and easy-to-use software

Rapid run time

Run a sample in as little as 24 hours

Flexible

Independent lanes enable multiple applications in a single run

Podstawowe zastosowania platform typu NGS:

1. Sekwencjonowanie DNA

Podstawowe zastosowania platform NGS:

2. Liczenie cząsteczek DNA