QUÍMICA FISIOLÓGICA Y PATOLOGÍA INTEGRADA I

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR DEL CÁNCER

METÁSTASIS

2015

Vicente A. Torres, PhDLaboratorio de Biología Celular y Molecular

Instituto de Investigación en Ciencias OdontológicasFacultad de Odontología – Universidad de Chile

Centro FONDAP-ACCDIS

PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR DEL CÁNCER

Generalidades y Conceptos

Características del Cáncer (“hallmarks”)Proliferación, Diferenciación y Muerte CelularAngiogénesis

Invasión de Tejidos y MetástasisMarcadores Emergentes

Oncogenes y Supresores de Tumores

Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer

La Cascada de MetástasisSEGUNDA PARTE

Muertes en Chile: años 1970, 1990, 2004

órgano/tejido vs rankingmujeres hombres

1o

3o

2o

6º

10º

7º

11º

Prevalencia de Distintos Tipos de Cáncer en Chile

biliar

El Cáncer de Colon como Modelo de Estudio

pólipos y adenomas adenocarcinomatejido normal

PÉRDIDA DE LA HOMEOSTASIS CELULAR TUMORIGÉNESIS

¿Qué sucede a nivel celular y molecular durante el cáncer?

HOMEOSTASIS CELULAREn un determinado tejido, las células deben co-existir de maneraorganizada e interdependiente. En relación a ésto, se destacan una seriede características que deben ser finamente reguladas:

⇒PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR

⇒INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO

⇒RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES(MITÓGENOS Y FACTORES INHIBITORIAS DEL CRECIMIENTO)⇒

“TRANSFORMACIÓN CELULAR”

Proliferación

muerte celular

Proliferación sostenidaEvasión de la muerte celular

Ejemplo en el cáncer de colon tejido normal

cáncer colorectal

Normal

muerte

celular

Proliferación

cáncer

muerte celular

Proliferación

normal

Se han definido una serie de eventos característicos o marcadores (hallmarks) asociados al cáncer

Douglas Hanahan & Robert WeinbergCell 2000: 100: 57-70

Douglas Hanahan & Robert WeinbergCell 2011: 144: 646-674

INMORTALIDAD REPLICATIVA

PÉRDIDA DE LA RESPUESTA A SEÑALES DE DIFERENCIACIÓN E INHIBIDORAS DEL CRECIMIENTO

RESISTENCIA A LA MUERTE CELULAR

INDUCCIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS

INVASIÓN DE TEJIDOS Y METÁSTASIS

Hallmarks del Cáncer

El orden y la temporalidad de cada uno de estos

marcadores es propio de cada neoplasia en particular

SEÑALIZACIÓN PROLIFERATIVA SOSTENIDA

La capacidad de proliferación en una célula somática es limitada. Estaproliferación ocurre hasta alcanzar el “Límite de Hayflick” (Exp Cell Res1965; 37: 614). Este límite restringe hasta 40-50 divisiones, luego del cual se llega a un estado de “senescencia” y muerte celular

PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR

Inmortalización celular

Senescencia

Poblaciones clonales con crecimiento continuo

(alteraciones teloméricas y cromosomales, aneuploidía)

Dependencia de anclaje a sustrato: La proliferación celular está directamenteasociada a la interacción célula-matriz extracelular, mediada por integrinas

Inhibición por contacto: En cultivos celulares, el contacto entre células del “mismo tipo” inhibe su movimiento

INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO

Pérdida de la “inhibición por contacto”:Las células pueden crecer por sobre la capacidad

permitida en una monocapa

Pérdida de la dependencia de anclaje a sustratoLas células pueden crecer en suspensión

Transformación Celular:Proliferación Celular

Viabilidad Celular

Interacción Célula-Célula

Respuesta a Señales Extracelulares

¿Cuál célula será más transformada?

1 2

ONCOGENES

1. Son genes cuya sobre-expresión o mutación con “ganacia de función”favorecen la tumorigénesis

2. Descubiertos a raíz de virus con acción transformante

PROTEÍNAS ONCOGENES

SUPRESORES DE TUMORES

SUPRESORES DE TUMORES

1. Son genes cuya “pérdida o disminución de su función” favorece la tumorigénesis

2. Inicialmente se describieron en el contexto de mutaciones, ya seande la línea germinal (hereditarias) o de origen somático. Ejemplos, pRb, p53, APC, BRCA1

ALTERACIONES EN LA

PROLIFERACIÓN Y CRECIMIENTO

CELULAR

Dependencia de factores de crecimiento: La proliferación depende de la disponibilidad de factores de crecimiento específicos para el tejido. En cultivos celulares, la privación de estos factores (por ejemplo, suerosuplementario) lleva a muerte celular. Otro factor importante es la producción autocrina de estos factores

Pérdida completa o parcial de la dependencia de factores de crecimiento

Factores de suplemento en cultivo (suero)Crecimiento a menor densidad inicial

In vitro

RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES(MITÓGENOS)

RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA

5. Catalizan la transfosforilación en residuos de tirosina (autofosforilación)

4. La unión de ligando lleva a la dimerización del receptor

1. Son proteínas integrales de membrana

2. Poseen actividad tirosina kinasaintrínseca

3. Sus ligandos son usualmente MITÓGENOS

EGF, PDGF, FGF, VEGF, insulina

SEÑALIZACIÓN POR FACTORES DE CRECIMIENTO RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA

SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR POR RECEPTORES DE TIROSINA KINASA

La cascada de proteínas MAP kinasa (MAPK, Proteína KinasaActivada por Mitógeno)

La cascada de señalización MAPK se inicia por Ras-GTP

Las MAPK son kinasas que fosforilan en residuos de Ser o Thr

Estas enzimas se activan en respuesta a estímulos extracelulares, como MITÓGENOS, shock térmico y citoquinas

Ras

MAPK

MAPKK

MAPKKK

Proliferación y Diferenciación Celular

Apoptosis

Expresión génicaMitosis

Mecanismos moleculares por los cuales las células

tumorales sobre-activan las vías de señalización de

mitógenos (RTKs)

1.Sobre-producción de ligando (mitógeno)

2.Mutaciones activadoras del receptor (RTK)

3. Mutaciones en la cascada río abajo: Ras

VIABILIDAD Y MUERTE CELULAR

Mecanismos de Control de la Viabilidad y Muerte Celular

MEMBRANA PLASMÁTICA

Señales de sobrevivencia

Receptor de factor de crecimiento

Receptor de la MEC (integrinas)

Receptor de muerte celular

Proliferación

muerte celular

MUERTE CELULAR PROGRAMADA

www.invesmed.com

Principal forma caracterizada: apoptosis

Otras formas: autofagia, necrosis programada

DESARROLLO Y PROCESOS FISIOLÓGICOS

En el modelo de adenocarcinoma de colon

APOPTOSIS: DOS VÍAS PRINCIPALES CON UN MISMO FIN

ANGIOGÉNESIS, INVASIÓN DE TEJIDOS

Y METÁSTASIS

ANGIOGÉNESIS

El ”sprouting” de vasos sanguíneos ocurre a razón de varios milímetros por día (dependiendo del estímulo)

“Crecimiento de nuevos vasos a partir de vasos sanguíneos pre-existentes”

Angiogénesis de “sprouting”(brotante)

Factores de regulación importantes:

Factores de crecimiento: FGF, VEGF, PDGF

Receptores: VEGFR

Receptores de adhesión célula-célula: VE-cadherina

Enzimas: eNOS, COX2

VEGFR (Tirosina kinasa receptora)

El receptor VEGF (VEGFR) es una proteína tirosina kinasa receptora, del tipoPDGFR

PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR DEL CÁNCER

Generalidades y Conceptos

Características del Cáncer (“hallmarks”)Proliferación, Diferenciación y Muerte CelularAngiogénesis

Invasión de Tejidos y MetástasisMarcadores Emergentes

Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer

Oncogenes y Supresores de Tumores

La Cascada de MetástasisSEGUNDA PARTE

La METÁSTASIS ocurre a través de una serie de pasos interrelacionados, en donde cada uno de ellospuede ser una etapa limitante

MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD

INTRAVASACIÓN

TRANSPORTE

EXTRAVASACIÓN

CRECIMIENTO DE TUMOR 2RIO

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816

Cada uno de estos procesos son muy ineficientes: < 0,1% células

diseminadas formarán mets

Composición del Tejido(ECM y células vecinas)

Receptores de Superficie

Señalización Intracelular

Remodelamiento de la ECM

MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD

Composición del Tejido(ECM y células vecinas)

Receptores de Superficie

Señalización Intracelular

Remodelamiento de la ECM

MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD

(Medición Experimental en Ensayo de Cierre de Herida)

Células de melanoma murino B16-F10

La migración celular esun proceso fundamental, tanto durante el desarrollo, como en el organismo adulto

MIGRACIÓN CELULAR

Durante la migración celular existen alteraciones en estas uniones

Mol Biol Cell 2010; 21: 369

MIGRACIÓN CELULAR: composición del microambiente

INTERACCIÓN CÉLULA – CÉLULA

INTERACCIÓN CÉLULA – ECM

Célula de cáncer de mama (MCF10A) sr.burnham.org

¿Qué Sucede con estas Interaccionesentre la Célula y su Entorno Durante el

Cáncer?

La célula sufre una serie de transformaciones, tantoa nivel morfológico, como bioquímico

Célula de cáncer de mama (MCF10A)

sr.burnham.org

E-cadherinaactinanúcleo

ALTERACIONES EN LA INTERACCIÓN CÉLULA-CÉLULA

Característicasde tipo epitelial

Característicasde tipo

mesenquimáticas

TRANSICIÓN EPITELIO-MESÉNQUIMA

(epithelial-mesenchymal transition, EMT)

“EMT”

BioEssays 2001; 23: 912

↓ Expresión de E-cadherina

↓ Expresión de componentesestructurales de Uniones Adherentes

Cancer Res 2006; 66 (17): 9

MORFOLOGÍA

CARACTERÍSTICAS FÍSICASUNIONES

INTERCELULARESMARCADORES MOLECULARES

ORGANIZACIÓN CITOESQUELETO

Polaridad Apical y Basolateral

Asimetría: extremolíder y posterior

Adhesión celular e inhibición por contacto

Movilidad celular e invasividad

AJ, TJ, GJ y desmosomas

Adhesiones focales / GJ transitorios

E-cadherina y citoqueratinas

N-cadherina, vimentina, metaloproteasas

Microtúbulos longitudinalesactina circunferencial

Microtúbulos astrales / Fibras de estrés

DIFERENCIAS PRINCIPALES

MECANISMOS DE DISMINUCIÓN EN LA EXPRESIÓN DE E-CADHERINA

Una célula de carcinoma pulmonar migrandosobre matriz extracelular de fibronectina

Adhesiones Focales(sitios de adhesión celular)

Citoesqueleto Celular

MIGRACIÓN CELULAR

Cancer Sci 2007; 98(10): 1512-1520

TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)

Adhesión celular

Remodelamientodel citoesqueleto

Desensamble de adhesiones

¿Cuáles son los mecanismos moleculares implicados en la migración celular?

MIGRACIÓN CELULAR: MECANISMOS MOLECULARES

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA MIGRACIÓN CELULAR

ADHESIÓN CELULAR

CITOESQUELETO

FACTORES EXTRACELULARES (ECM, QUIMIOQUINAS, ETC)

PROTEÍNAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR

EXPRESIÓN GÉNICA

Modelo de estudio: migración celular sobre sustrato 2D

Según este modelo, la migración celular puede ser descrita como una serie sucesiva de etapas

EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

CONTRACCIÓN CELULAR

DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO

POLARIZACIÓN CELULAR

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

CONTRACCIÓN CELULAR

DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

POLARIZACIÓN CELULAR

Science 2003; 302: 5

MDA-MB-231golginúcleo

Polarización celular (Cdc42, Rac)

Contracción (Rho)

GTPasas de la Familia Rho

Cdc42

Rac

Rho

Polarización celular, filopodiosProtrusiones celulares, lamelipodios, polarización celularContracción celular, maduración de adhesiones focales, fibras de estrés

Dev Biol 2004: 265: 23

Tanto la regulación, como la actividad de estas GTPasas se ven alteradas en cáncer

EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

CONTRACCIÓN CELULAR

DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

POLARIZACIÓN CELULAR

Importancia del citoesqueleto en la adhesión y migración celular

Célula expandiéndose sobre fibronectina. Tinción de actina con faloidina. J Cell Sci 2013; 126(17): 3835

15‛ 45‛ 60‛

Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647

Podosomas

Invadopodios

Fibroblasto, microscopía electrónica de barrido

Molecular Biology of the Cell (Alberts, cap 16)

Queratocito, microscopía de luz

DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA

Lamelipodios y procesos de membrana

Mol Cancer Ther 2005; 4 (5): 772-778

FIBRAS DE ESTRÉS (fibras de tensión)

DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA

www.lifetechnologies.com

EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

CONTRACCIÓN CELULAR

DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

POLARIZACIÓN CELULAR

Formación y desensamble de los sitios de contacto celulares

TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)

Estos sitios de contacto se encuentran principalmente en la interfase célula-ECM

INTEGRINAS

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

2. Reclutamiento de proteínas adaptadoras

1. Unión ligando extracelular (ECM)/Activación

3. Anclaje del citoesqueleto (actina o filamentos intermedios)

4. Formación de complejos macromoleculares

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

Complejos Focales

Complejos Macromoleculares Formados por las Integrinas

CONTACTOS FOCALES

Sitio de Iniciación

ADHESIONES FOCALES

Madurez del complejo de adhesión

Filamentos de ActinaPaxilina

Adhesiones Focales

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

CONTACTOS FOCALES

Sitio de Iniciación

ADHESIÓN FOCAL

Madurez del complejo de adhesión

CONTACTOS FOCALES

Sitio de Iniciación

ADHESIÓN FOCAL

?

DESENSAMBLE DE CONTACTOS CON LA ECM

MECANISMO POCO CLARO

Proteínas de señalización:Kinasa de Adhesión Focal (FAK), Pyk2, Src, MAPK

Proteasas: Calpaínas

Componentes de la endocitosis: Dynamin, AP-2, Clathrin, Rabs

Se ha postulado que el tráfico endosomal es esencial en el desensamble de los complejos de adhesión

Traffic 2009; 10: 811–818Traffic 2009; 10: 811–818

MARCACIÓN DE ADHESIONES Y CONTACTOS FOCALES(GFP-vinculina, transfección transitoria de células de cáncer de mama MDA-MB-231)

REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR

Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647

REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR

1. Migración celular

2. Estructuras derivadas del citoesqueleto y la membrana

3. Proteasas de la matriz extracelular

MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD

INTRAVASACIÓN

TRANSPORTE

EXTRAVASACIÓN

CRECIMIENTO DE TUMOR 2RIO

EVENTOS ASOCIADOS A LA METÁSTASIS

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816 Mutation Research 2011; 1-12

VÍA LINFÁTICA

VÍA SANGUÍNEA

MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD

INTRAVASACIÓN

TRANSPORTEEXTRAVASACIÓN

CRECIMIENTO DE TUMOR 2RIO

FEBS Journal 2011; 278: 16

VEGFR

VEGFR

VEGFR

Integrinas

Integrinas

MMPs

MMPs

S Inmune

CRECIMIENTO DE TUMOR SECUNDARIO

MICROMETÁSTASISMETÁSTASIS

CLÍNICAMENTE DETECTABLE

COLONIZACIÓN

Asentamiento reciente

En estado de “dormancia”

No detectable mediantetécnicas convencionales

Técnicas convencionales de detección macroscópicas

Características similaresal tumor primario

EL PROCESO DE COLONIZACIÓN INVOLUCRA DIVERSOS EVENTOS:Interacción con el nuevo estroma (ECM, células parénquima, etc)

Adquisición (o re-adquisición de hallmarks observados en tumor primario): viabilidad, proliferación

Modificaciones en el programa migratorio

APROXIMACIONES EXPERIMENTALES Y MODELOS DE ESTUDIO EN LA INVESTIGACIÓN

DEL CÁNCERAdhesión y migración celular

MODELOS DE ESTUDIO: in vitro versus in vivo

Técnicas de estudio in vitro

Proliferación, viabilidad y muerte celular

Proteínas de señalización

Ensayos de transformación celular

√

√

√

√

Técnicas de estudio in vivoTumorigenicidadModelos experimentales de metástasis

√

√

Ensayos de Transformación Celular

Tumorigenicidad(formación de tumores

primarios)

14-21 días

Análisis

Agar blando(crecimiento independiente de

anclaje)

Conteo de colonias

Modelos de Estudio in vitro

Los ensayos de proliferación y viabilidad celular son ampliamente usados en la caracterización de nuevos fármacos antineoplásicos

Formazán (A490-500nm)Sal tetrazolium

Ensayos de Viabilidad

El taxol (paclitaxel) actúa estabilizando microtúbulos. ¿Qué efecto tendrásobre el histograma de DNA?

Proliferación y Ciclo Celular

¿qué sucede si la célula es privada de factores de crecimiento (mitógenos)?

Histograma de DNA(ciclo celular)

DNA content

Cell

numbe

r

Otras Técnicas:

Incorporación de 5-bromo-2-desoxiuridina

Marcación con 3H-timidina

Microscopía de Fluorescencia

Expresión de Ciclinas

Muerte Celular / Apoptosis

DNA content

Cell

Siz

e

viableapoptosis

necrosis

Citometría de FlujoTinción de DNA vs tamaño celular

DNA laddering Microscopía de Fluorescencia

NT

APOP TOSIS

MicroscopíaElectrónica

Apoptosis

Autofagia

Otras Técnicas:Activación de caspasasProteínas señalización (WB)

Modelos de Estudio in vitro

MIGRACIÓN CELULAR

Parámetros cinéticos, comovelocidad de migración,

polarización y direccionalidad

Ensayo de cierre de heridaEXP 1

EXP 2t=0h t=12h

t=0h t=12h

¿Qué se puede decir de EXP2 en relación a EXP1?

Ensayos de Migración e Invasión Celular

Cámara Boyden Matrigel

Matriz compuesta de múltiples proteínas ECM

Depende de MMP‛s

Sustrato ECM

Migración celular (quimiotaxis – haptotaxis)

Invasión

Modelos de Estudio in vivo

ANGIOGÉNESISMembrana corioalantoide de pollo(Chick CAM assay)

Imagen membrana

corioalantoide

¿Qué agente contiene este

disco?

Disco de papel filtro

Modelos de Estudio in vivo

MODELOS EXPERIMENTALES DE METÁSTASIS

1. Metástasis Espontánea

2. Metástasis Experimental

14-21 días Análisis

Análisis

¿qué ventajas y desventajas destacan?

Modelos de Estudio in vivo

Sembrar células de tumor humano sobrela CAM de embriones

de 10 días

7-8 días

Cosechar el tumor

Extraerpulmones y médula ósea

Metástasis

Tumor primario

PCR de secuencia Alu

MODELOS EXPERIMENTALES DE METÁSTASIS

3. MicrometástasisChick CAM Assay

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816Mutation Research 2011; 1-12

Cell 2000: 100: 57-70Cell 2011: 144: 646-674

PRIMERA PARTE DE LA CLASE SEGUNDA PARTE DE LA CLASE