Biološki fakultetUniverzitet u Beogradu

Studijski program:

Biologija mikroorganizama

Vrsta i nivo studija:

Specijalističke akademske studije

Naziv predmeta:

PRIMENJENA MIKROBIOLOGIJA

SEMINARSKI RAD

Tema:

MEHANIZMI REZISTENCIJE NA ANTIBIOTIKE

Kandidat:Marija Filipović

Mentor:Dr Branka Vuković-Gačić, vanredni profesor

Beograd, oktobara 2011.

1

MEHANIZMI REZISTENCIJE NA ANTIBIOTIKE

Uvod

Antimikrobni lekovi se koriste za lečenje infektivnih bolesti još od XVII veka. Međutim hemoterapija sa razumevanjem principa selektivne toksičnosti, specifične hemijske veze između mikrobnog patogena i leka i uloga kombinovane terapije počinje tek u XX veku. S obzirom da je istorija antibiotika relativno kratka i da se sa njihovom upotrebom počelo tek pre šesdesetak godina uspeh je da danas imamo antibiotike kojima se praktično mogu lečiti sve bakterijske infekcije. Nažalost problem sa kojim se suočavamo je brži ili sporiji razvoj rezistencije bakterija na iste, tako da je pojava rezistentnih patogena važno područje istraživanja u mikrobiologiji, molekularnoj i evolucionoj biologiji kao i u medicinskoj praksi. Dva su glavna pristupa problemu brzog širenja rezistencije. Jedan je povezan sa sticanjem, razvojem i širenjem samih gena, a drugi se odnosi na specifične biohemijske mehanizme odgovorne za antibiotičku otpornost.

Antimikrobni lekovi mogu biti supstancije označene kao analozi faktorima rasta- hemijske supsatncije koje se dobijaju sintetičkim putem i antibiotici- supstancije koje pored toga što se proizvode sintetičkim putem nastaju kao produkti metabolizma mikroorganizama u prirodi.

Analozi faktorima rasta su sintetičke supstancije koje su slične po strukturi autentičnim faktorima rasta mikroorganizama. Faktori rasta su biomolekuli koji su esencijalni za sintezu jedinjenja koja ulaze u sam sastav mikroorganizama, najčešće su to gradivni elementi nukleinskih kiselina i proteina. Među onima koji su najčešće u upotrebi su: sulfonamidi, kinolini i fluorokinolini (Brock, 2009).

Sulfonamid je analog p-aminobenzoevoj kiselini. Folna kiselina je neophodna za sintezu nukleinskih kiselina kod prokariota i eukariota, sa jednom razlikom što prokarioti poseduju metabolizam za sintezu folne kiseline. Prokarioti sintetišu sopstvenu folnu kiselinu iz paraaminobenzoeve kiseline PABA i ostalih metabolata uz pomoć enzima dihidropteorat sintetaze, dihidrofolat sintetaze i dihidrofolat reduktaze. Sulfonamid deluje kao strukturni analog paraaminobenzoeve kiseline ometajući metabolizam sinteze (Brock, 2009).

Kinolini i fluorokinolilini interaguju sa enzimima koji učestvuju u pakovanju DNK u ćeliju. Ovi antimikrobni lekovi deluju na nivou replikacije. Oni interaguju sa DNK girazom ili sa topoizomerazom IV. Ova dva enzima su tetrameri koji se sastoje od dva para subjedinica. Antibiotici vezuju ove enzime i tako ih inaktiviraju kompetirajući za isto mesto sa ATP-om na enzimu ili se neki vezuju za A subjedinicu kojom se enzim vezuje za DNK(Brock,, 2009).

Kinolini interaguju sa DNK girazom, koja se sastoji od dve subjedinice: subjedinice A kodirane genima GirA i subjedinice B. Ciljno mesto kinolina je subjedinica A, koja ima ulogu u sprečavanju formiranja supernavoja DNK priliokom replikacije. Fluorokinolimi interaguju sa topoizomerazom IV, enzimom odgovornim za formiranje supernavoja (Brock, 2009).

Antibiotici u užem smislu nastaju kao produkt metabolizma mikroorganizama (bakterija i gljiva) i u niskim koncentracijama služe da inhibiraju ili spreče rast drugih mikroorganizama. Od velikog broja antibiotika koji su pronađeni u prirodi samo 1% njih je ispitano. Antibiotici u širem smislu reči su sintetički proizvodi koji se u potpunosti ili delimično proizvode hemijskim putem. Postoje različite podele antibiotika:

1) Prema spektru delovanja antibiotici se dele na one sa užim i one sa širim spektrom delovanja.

2) Prema učinku dele se na baktericidne i bakteriostatike. Baktericidni su antibiotici koji ciljno

2

deluju na mikroorganizme uništavajući ćeliju (praktično služe da ubiju ćeliju) antibiotici sa bakteriostatskim dejstom sprečavaju rast bakterijskih ćelija. Baktericidni antibiotici narušavaju integritet ćelije, najčešće inhibiraju sintezu ćelijskog zida i njihovim delovanjem se smanjuje broj ćelija mikroorganizama. Bakteriostatici inhibiraju sintezu proteina, česta meta su im ribozomi, i na taj način sprečavaju rast i razmnožavanje mikroorganizama (Brock, 2009).

3) Prema mehanizmu delovanja mogu biti:

a) oni koji imaju baktericidno dejstvo i inhibiraju sintezu ćelijskog zida ili ometaju funkciju ćelijske membrane (penicilini, cefalosporini, karbapenemi, monobaktemi, glikopeptidi, vankomicin, bacitracin…linezolid, polimiksini, kloramfenikol…)

b) oni koji deluju na nivou transkripcije, na DNK zavisnu RNK polimerazu (rimfapicin)c) oni koji imaju bakteriostatsko dejstvo i deluju na nivou translacije, ometaju sintezu

proteina 50s subjedinice (makrolidi, azalidi, linkozamidi, klindamicin, amfenikoli, hloramfenikol, florfenikol…) ili ometaju sintezu proteina 30s subjedinice (tetraciklin, aminoglikozidi…)

4) Prema hemijskoj strukturi antibiotici se dele na:

a) antibiotike oligopeptidne građe i jednostavnih aminokiselina (penicilin, cefalosporini, karbapenemi, monobaktami…)

b) aminoglikozidni antibiotici (gentomicin, neomicin, streptomicin, kanamicin…)c) polipeptidni antibiotici (bacitracin, polimiksini…)d) polienski (nistatin)e) makrolidni (azalidi, linkozamidi, eritromicin, klaritromicin, azitromicin…)f) tetraciklinski antibiotici (tetraciklin)g) nitrofenilpropilaminski (kloramfenikol)

3

Mehanizmi delovanja antibiotika

Antibiotici koji sprečavaju sintezu ćelijskog zida

Ćelijski zid bakterija je izgrađen od peptidoglikana. To je složeni molekul (polimer) koga sačinjavaju lanci od naizmenično raspoređenih molekula N-acetilglukozaminske i N-acetilmuraminske kiseline koje su međusobno povezne β(1,4)-glikozidnom vezom. Za N-acetilmuraminsku kiselinu vezan je tetrapeptid. Bočni, tetrapetidni lanci, imaju kod svih vrsta bakterija neke zajedničke osobine. Većina vrsta na poziciji 1 ima L-alanin, na pozicija 2 D-glutamat a na poziciji 4 D-alanin. Najveća varijabilnost prisutna je na poziciji 3: većina gram-negativnih bakterija na poziciji 3 ima diaminopimelinsku kiselinu (za koju se vezuje lipoproteinska komponenta ćelijskog zida). Kod gram-pozitivnih bakterija na poziciji 3 nalazi se L-lizin ili diaminopimelinska kiselina ili neka druga amino kiselina L serije. Između paralelno postavljenih polisaharidnih lanaca, dolazi do unakrsnog vezivanja tetrapeptida peptidnom vezom čime nastaje veliki trodimenzionalni molekul. Unakrsno vezivanje čini ćelijski zid čvrstom i rigidnom strukturom, sposobnom da se suprotsavi delovanju osmotskog pritiska. Kod mnogih Gram negativnih bakterija peptidna veza se formira direktno između ε-amino grupe diaminopimelinske kiseline (DAP) jednog lanca i α-karboksilne grupe terminalnog D-alanina drugog lanca, dok gram-pozitivne bakterije ostvaruju ove veze posredno pomoću umetnutih peptida. Na primer, D-alanin i L-lizin mogu biti povezani preko pentaglicina (Staphylococcus aureus). U građenju peptidne veze učestvuju enzimi transpeptidaze i oni mogu biti ciljno mesto za beta-laktamske antibiotike (Brock, 2009).

Beta-laktamski antibiotici deluju inhibirajući formiranje ćelijskog zida bakterije, inhibicijom stvaranja peptidoglikanskih veza koje spajaju molekule polimera primarno kod gram-pozitivnih bakterija, sprečavajući unakrsno vezivanje tetrapeptida peptidnom vezom. Ovo ima baktericidan učinak. Aktivnost laktamskih antibiotika zavisi od afiniteta samog antibiotika za PVP (penicilin vezujući proteini), to su proteini koji su uključeni u sam proces formiranja ćelijskog zida. Ti proteini su zapravo enzimi transpeptidaza i karboksipeptidaza. Antibiotik-PVP kompleks stimuliše sintezu autolizina koji dodatno lizira postojeći ćelijski zid (Brock, 2009).

Slika 1. Rezistencija na betalaktamske antibiotike (Petrović-Jeremić, 2011)

4

Prvi beta laktamski antibiotik je penicilin, izolovan iz gljivice roda Penicillium. Iako je penicilin otkriven još 30-tih godina dvadesetog veka, njegova šira upotreba krenula je krajem drugog svetskog rata. Već 1950 godine polovina stafilokoknih izolata razvilo je rezistenciju na penicilin. Kao odgovor 1960 u upotrebu je ušao meticilin, da bi već 70-tih godina MRSA (meticilin rezistentna Staphylococcus aureus) postao rastući problem. Meticilin je jedan od derivata penicilina, specifičnost meticilina je u njegovoj otpornosti na dejstvo enzima penicilinaze koje luče neki sojevi bakterija, a koji se vezuje i razara beta laktamski prsten inaktivirajući ceo antibiotski molekul. Prisustvo orto-dimetoksifenilne grupe vezane sa penicilinsko jezgro meticilina onemogućava dejstvo enzima na beta-laktamski prsten, jer je ovaj enzim posebno osetljiv na promene u prostornoj konformaciji svog supstrata. Utoliko meticilin može da deluje na standardan način, bez obzira na prisustvo penicilinaze. Iako je njegova klinička upotreba u velikoj meri obustavljena (zahvaljujući razvitku drugih antibiotika) meticilin danas ima ulogu u laboratorijskim testiranjima mikrobioloških kultura, gde služi kao referentna supstanca prilikom određivanja antibiotske senzitivnosti datog soja. Nekad je upotrebljivan u lečenju infekcija prouzrokovanih gram-pozitivnim bakterijama koje luče penicinilazu.

Poslednjih godina sa svih strana sveta stižu podaci o širenju MRSA sojeva (Meticilin rezistentni Staphylococcus aureus), kako u bolničkoj tako i u vanbolničkoj sredini. Na osnovu podataka Centra za kontrolu bolesti u poslednjih deset godina se broj MRSA infekcija udvostručio i da je broj umrlih od ovih infekcija u SAD veći od broja umrlih od AIDS-a.Između bolničkih i vanbolničkih sojeva MRSA osim sličnosti ima i mnogo razlika, epidemioloških, kliničkih, po učestalosti javljanja i po faktorima virulencije. Vanbolničkih izolata ima jos uvek daleko manje nego bolničkih mada se predviđa da će se ta razlika sve više smanjivati. Vanbolnički izolati CA-MRSA, (community acquired MRSA) su virulentniji, brže se šire i mogu izazvati teže infekcije od bolničkih (hospital acquired MRSA). Sve veća rezistencija na meticilin znači i rezistenciju na sve beta-laktamske antibiotike koji se nalaze u kliničkoj primeni (Petrović- Jeremić, 2011).

Antibiotici koji ometaju funkciju ćelijske membrane

Antibiotici koji ometaju funkciju ćelijske membrane su polimiksini, to su polikatjonske površinski aktivne supstancije, koje se ponašaju kao deterdženti, narušavaju strukturu membrane tako što narušavaju strukturu fosfolipida. Gram-negativne bakterije su osetljivije na polimiksine zbog veće količine fosfolipida.

Daptomycin je jedan od novijih antibiotika koji se prvenstveno koristi za lečenje infekcija gram-pozitivnim bakterijama, ima takođe uticaj ne ćelijsku membranu tako što se vezuje za istu i izaziva brzu promenu polarizacije, posledica depolarizacije je gubljenje sposobnosti ćelije za sintezu esencijalnih makromolekula kao što su nukleinske kiseline i proteini što automatski uzrokuje smrt ćelije (Brock, 2009).

.

Antibiotici koji sprečavaju sintezu proteina

U ovu grupu antibiotika spadaju oni koji utiču na 50S i 30S subjedinicu ribozoma i oni imaju bakteriostatsko dejstvo. Na 30S subjedinicu utiču aminoglikozidi i tetraciklin. Aminoglikozidi su hidrofilni polikatjonski ugljeni hidrati koji sadrže amino grupu. U prirodi su najčešće produkt aktinomiceta. Oni se vezuju za specifično mesto i sprečavaju vezivanje aminoacil tRNK za A mesto na ribozomu i samim tim blokiraju inicijaciju sinteze proteina. Prvi otkriveni aminofglikozid je streptomicin kod Streptomyces griceus, zatim, neomicin kod Streptomyces fradiae, kanamicin kod Streptomyces kanamyceticus i gentamicin kod Micronospora purpurea i Micronospora echinospora. Streptomicin blokira prelazak sa inicijacije na elongaciju translacije, interagujući sa faktorima elongacije. Antibiotici koji takođe blokiraju sintezu proteina vezujući se za 50S subjedinicu su makrolidi i linkozamidi. Tako eritromicin blokira translokaciju interagujući sa

5

riboziomalnim proteinima koji učestvuju u translokaciji, a hloramfenikol blokira rad enzima peptidil transferaze 23S rRNK i onemogućava formiranje peptidne veze između aminokiselina tj. formiranje kompletnog proteina (Sakar, 2010).

Slika 2. Tetraciklini-Ometanje sinteze proteina (Sakar, 2010)

Antibiotici koji deluju na nivou transkripcije

Mnogi antibiotici sprečavaju transkripciju inhibirajući sintezu RNK. Rimfapicin inhibira sintezu RNK vezujući se za beta subjedinicu RNK polimeraze i na taj način sprečava rad ovog enziama. Aktinomicin takođe sprečava sintezu RNK tako što se vezuje za bazni par guanin-citozin na molekulu DNK (Brock, 2009).

6

Mehanizmi razvijanja rezistencije

Rezistencija na antibiotike se može biti „urođena“ ili stečena. Urođena se odnosi na otpornost roda ili vrste koja se temelji na nedostatku ciljnih mesta ili nedostupnosti ciljnih mesta na mikroorganizmu.

Stečena otpornost se temelji na mutaciji hromozomskih gena ili, još važnije, prisutnosti mobilnih genskih elemenata koji nose informaciju za rezistenciju. Antimikrobna rezistencija je posledica ekspresije specifičnih gena. Kada je u pitanju mutacija na hromozomu nastaju promene u strukturi bakterijske ćelije, a ako je rezistencija posredovana plazmidima onda bakterijska ćelija dobija informaciju o sintezi enzima koji razgrađuju ili na neki način blokiraju dati antibiotik.

Treba napomenuti da se geni rezistencije smešteni na plazmidima jednostavno i brzo šire horizontalno, dok se geni smešteni na hromozomu po pravilu šire vertikalno.

Širenje gena odgovornih za rezistenciju na antibiotike

Vertikalni transfer genaRezistencija uzrokovana hromozomskim genima uvek se prenosi vertikalnim transferom, što znači da se rezistencija prenosi na ćerke ćelije tokom deobe ćelija.

Horizontalni transfer genaŠiroko rasprostranjena rezistencija posledica je horizontalnog transfera gena putem mobilnih genetičkih elemenata dole opisanih. Ovi se elementi mogu razmenjivati između bakterija istih i različitih bakterijskih vrsta i rodova i mogu se čak preneti i na domaćina koji je filogenetski jako udaljen od prirodnog domaćina. Mehanizmi prenošenja ovih gena su konjugacija, transdukcija, transpozicija i transformacija (Knežević-Vukčević i sar, 2009).

Elementi koji posreduju rezistenciju

Postoje četiri najvažnija tipa genetičkih elemenata koji učestvuju u prenošenju informacije o rezistenciji na antibiotike: plazmidi, transpozoni, integroni i genske kasete.

Plazmidi su nehromozomski genetički elementi, najčešće dvostruki heliksi DNK koji se nalaze u gotovo svim bakterijskim rodovima. Veličine su od 2 do više od 100 kbp, i imaju sposobnost da se sami reprodukuju, ne integrišu se u hromozom i nose različite genetičke funkcije. U jednoj ćeliji se najčešće nalaze više vrsta plazmida.

Transpozoni su takođe dvostruki DNK heliksi, al za razliku od plazmida ne mogu se umnožavati samostalno, već se ugrađuju u hromozomalnu DNK ili plazmid. Najmanji transpozoni nose samo jedan gen za enzim transpozazu koji katalizuje njihovo premeštanje sa jednog mesta na drugo na molekulu DNK i to su insercione sekvence. Veći transpozoni nose još neke gene sem ovog i to su, najčešće oni za rezistenciju na antibiotike. Transpozoni nisu mesto specifični i mogu se ugraditi na bilo koje mesto u molekuli DNK. Neki transpozoni nose i gene koji im omogućavaju i prelazak iz jedne ćelije u drugu procesom konjugacije (Knežević-Vukčević i sar, 2009).

Genske kasete su mali pokretni elementi od 2kbp specifični za gram-negativne bakterije, sastoje se od rekombinacionog mesta i jednog gena koji je u većini slučajeva gen za rezistenciju. Oivičeni su sekvencama koje prepoznaju integraze i koje ih mesto specifičnom rekombinacjom mogu ugraditi u druge genetičke elemente. Nemaju sposobnost samorepliciranja, a za razliku od transpozona nemaju sposobnost transpozicije, to su geni ili grupe gena koji se ne eksprimiraju jer nemaju sopstveni promotor (Knežević-Vukčević i sar, 2009).

7

Integroni su genetički elementi povezani sa višestrukom antibiotskom rezistencijom kod gram-negativnih eneterobakterija. To su specifični genski elementi koji se sastoje od nepromenljivog dela koji poseduje intI region koji kodira mesto specifinu integrazu i promenljivog središnjeg regiona u koji se mogu ugraditi kasete gena odgovorne za rezistenciju. Mesto gde se ugrađuju genske kasete je označeno kao attI. Više kasete gena mogu biti poređane u tandeme, poznato ih je oko 60 i kodiraju rezistenciju na beta –laktame, aminoglikozide, trimetropin, hloramfenikol i streptomicin. Integroni su često ugrađeni u transpozone i kao takvi povećavaju pokretljivost gena i širenje rezistencije (Knežević-Vukčević i sar, 2009).

Mehanizmi rezistencije na najčešće korišćene antibiotike su:

1) smanjeno unutar-ćelijsko deponovanje antibiotika, promena propustljivosti membrane i brzo izbacivanje leka iz ćelije

2) inaktivacija antibiotika uz pomoć enzima koji hidrolizuju antibiotike, laktamaze, ili služe kao transferi za određene grupe, metilaze, acetilaze, fosforilaze...i modifikacija enzimaa) hidroliza antibiotika uz pomoć beta laktamazab) hidroliza antibiotika uz pomoć esterazac) metilacija 23S RNK (makrolidi)

3) alternativni metabolički putevi, zaobilaženje inhibirane faze metabolizma4) promena vezujućeg mesta na membrani ćelije ili ribozoma

Slika 3. Mehanizmi rezistencije na najčešće korišćene antibiotike (www.mecriticalcare.net)

8

Smanjeno unutarćelijsko deponovanje antibiotika i propustljivost membrane

Može biti posledica ili smanjenog unosa antibiotika ili njegovo pojačano izbacivanje putem transportnog sistema zavisnog od energije. Smanjeni unos antibiotika u ćeliju može biti posledica smanjenog broja, promene ili potpunog gubitka porina na ćelijskoj membrani. Spoljna membrana gram-negativnih bakterija može često biti prepreka za prolaz nekih antibiotika. Promena električnog naboja lipopolisaharidne membrane od negativnog ka neutralnom može sprečiti ulazak antibiotika sa jako pozitivnim nabojem, kao što je to slučaj sa aminoglikozidima. Drugi način je pojačano izbacivanje antibiotika tj. pojačan rad efluks pumpi.

Slika 4. Efluks pumpa – mehanizam rezistencije (www.medicalscience.com)

Jedan od vrlo čestih mehanizama rezistencije svodi se na propustljivost membrane, koja može zavisiti od prisustva porina. Mali hidrofilni molekuli β laktami, fluorokinolini prolaze kroz spoljašnju membranu, kroz hidrofilne kanale okružene proteinima porinima. Proteini koji učestvuju u formiranju pora npr. kod P. aeruginosa geni koji kodiraju proteine porine označeni su sa opr i mutacije na ovim genima skopčane su sa pojavom rezistencije. Aminoglikozidi i polimiksini se vežu za lipopolisaharidnu komponentu spoljašne membrane i menjaju njenu propustljivost, aminoglikozidi se zatim aktivnim transportom unose u ćelijiu kroz ćelijsku membranu, a polimiksini deluju na membranu menjajući njenu strukturu.

Bakterijski efluks sistemi mogu se podeliti u četiri grupe na osnovu aminokislelinskih sekvenci: MFS (major facilitator superfamily), familija ATP-vezujućih kaseta, RND familija-resistence nodulation division, SMR familija- small multidrug resistance i peta grupa je multidrug resistance and toxic compound extrusion MATE. Familije MFS, RND i MATE spadaju u protonske pumpe, a RND familija je karakteristična za gram-nagativne bakterije. Imaju tri domena, rade u saradnji sa mambranskim fuzionim proteinima koji su transmembranski linkovi i nalaze se u

9

periplazmatskom prostoru i proteinima koji se nalaze na spoljašnjoj membrani- outmembrane efflux protein. Veliki broj gena je uključen u sintezu ovih proteina koji učestvuju u aktivnom efluksu supstanci. P. aeruginoza je jedan od mikroorganizama sa razjašnjenom genetičkom osnovom rada ovih pumpi (Poole et al, 2000).

Prirodna otpornost P. aeruginosa na antibiotike je najčešće posledica nemogućnosti postizanja dovoljne koncentracije u citoplazmi, što je posledica nedovoljnog prolaza antibiotika ili pojačanog efluksa koji posledica pojačane ekspresije mexXY-OprM gena. Poznato je da genom kodira 12 efluksnih komponenti, a ti geni su mexAB-oprM, mexXY-oprM, mexCD-oprJ, mexEF-oprN, mexJK-oprM (multidrug efflux resistence operon). Radi se o transmembranskoj komponenti koja se sastoji od tri proteina od kojih je jedan lociran ka citoplazmi i funkcioniše po principu energetski zavisne pumpe, antiporter Mex-B, MexD, MexF i MexY. Na spoljašnjoj membrani se nalazi porin OprN, OprJ i OprM i transmembranski link MexA, MexC i MexD i MexX koji povezuje ova dva. Mutacijom regulatornih gena može doći do pojačanog rada ovih pumpi i pojačanog izbacivanja antibiotika. Najefikasnija pumpa kod P. aeruginosa je MexAB, ona izbacuje aktivno β laktame, β laktamaza inhibitore, fluorokinoline, makrolide, tatracikline, kao i MexCD, MexEF izbacuje akitvno fluorokonoline i hloramfenikol. Geni označeni sa MEX-OPR čine ustvari operon i tu se nalaze geni koji kodiraju proteine koji su sastavni deo ovih pumpi, međutim ispred ove sekvence postoji regulatorna koja kontroliše ekspresija ovih gena. Uzvodno od mexAB-oprM nalazi se gen mexR, on kodira represor koji kontroliše rad ovih gena, mutacijom na ovoj sekvenci može doći do pojačane ekspresije, tzv. nalB mutacija. Isto tako takozvani nfxC mutanti, nose mutaciju na mexT lokusu uzrokuje rezistenciju na imipenem jer je skopčana sa smanjenom ekspresijom gena proteina OprN koji izgrađuju porine koji učestvuju u transportu ovog antibiotika. Homologi geni ovima kod E. coli su acr-tol i funkcionišu kao multidrug efflux sistem (Poole et al, 2000).

Otpornost bakterija na makrolide je posledica takođe jednog vida izbacivanja antibiotika. U pitanju je opet efluks pumpa kodirana od strane i mef gena opisani kod roda Streptoccocus. Tako su MefA, MefE homologi sa major facilitator superfamily MFS efluks proteinima. Dok MsrA, MsrB, CarA, SrmB, OleA, OleC, VgaB pripadaju grupi ABC transportera. Postoje tri različita efluks sistema koja su potvrđena kod gram-pozitivnih koka, i to su MsrA (macrolide and streptogramin resistance), MefA (macrolide efflux) Vga and VgaB (viginamicin factor A i B). ABC transporteri su ATP zavisne pumpe.

Inaktivacija antibiotika uz pomoć enzima

Hidroliza enzimima

Beta-laktamaze

Inaktivacija antibiotika enzimima bazira se uglavnom na hidrolizi antibiotika ili prenosa acetil, adenil ili fosforne grupe koja dovodi do konformacionih promena. Ovi enzimi uglavnom deluju na manji broj supstrata i nemaju značaja na metaboličku aktivnost ćelije. Geni koji nose informacije za ovu vrstu rezistencije nalaze se najčešće na mobilnim genetičkim elementima. Jedan od ovih načina razvijanja rezistencije na beta laktamske antibiotike je i sintetisanje enzima beta-laktamaze koja vrši hidrolizu antibiotika. Rezistencija na antibiotike se prenosi hromozomski i putem plazmida, zavisi koji gen kodira široku lepezu beta laktamaza. Ova rezistencija se jako brzo širila među gram-negativnim bakterijama. Gram-negativne bakterije zahvaljujući postojanju spoljne membrane beta-laktamazu koncentruju u periplazmatskom prostoru, gram-pozitivne ćelije daleko osetljivije na beta-laktamske antibiotike od gram-negativnih.

U početku se pojava ove rezistencije ograničavala na mali broj vrsta bakterija (E. cloacae, C. freundii, S. marcescens, P. aeruginosa). Ovi sojevi su produkovali β laktamazu C tipa,

10

hromozoski kodiranu, kasnije se ova rezistencija proširila na veliki broj bakterijskih vrsta i danas predstavlja veliki problem. Još jedan primer progresivnog razvoja ove vrste rezistencije su enetrobakterije, koje ispoljavaju plazmid kodiranu rezistenciju TEM1, TEM2 i SHV1. Međutim osamdesetih je otkrivena nova grupa β laktamskih enzima označenih kao extended spectrum beta lactamases ESBL. Ova klasa beta laktamaza je sposobna da hidrolizuje prošireni spektar cefalosporina tako što dolazi do promena u aminokiselinskoj sekvenci oko mesta vezivanja , tj, aktivnog mesta enzima. Klasifikacija enzima je zasnovana na aminokiselinskim sekvencama.

One se prema aminokiselinskim sekvencama dele na:

1) serin enzimi gde imamo A, C i D klasu enzima2) metalo enzimi gde imamo B klasu enzima čija funkcija zavisi od prisustva Zn

Klasa A enzima je kodirana plazmidom (ampA gen, tem, shv, ctx i drugi geni) posledica su ESBL sojevi (penc-ceph-inh-R)Klasa C kodirana ampC genom na hromozomu (ceph-inh-R)Klasa D je ekvivalent klasi C ali je kodiran plazmidom oxa genaKlasa B kodirama Mbl genom na hromozomu i plazmid kodirane imp i vim genima (carbamenemes-inh-R)

klasa A TEM β- laktamaza se najčešće sreće kod gram-negativnih bakterija, oko 90% ampicilinske

rezistencije kod E. coli je posledica produkta tem1 gena, kao i penicilinske rezistencije kod H. influence i K. pneumonie. Rezistencija i pojava ESBL tipova je posledica supstitucija aminokiselina najćešće na pozicijama 104, 164 i 238. Promenom konfiguracije postaje dostupna oxiamino grupa beta laktamskog supstrata. Međutim supstitucija se ne zaustavlja na tih nekoliko mesta već je mnogo šira ima oko 140 tipova Tem enzima. Ovi ESBL fenotipovi su karakteristični više za USA. Među ovim Tem enzimima ima i onih inhibitor rezistentnih. Pošto se u farmaceutskoj industriji pribegava inhibiranju ovih enzima najčešće uz pomoć klavulanske kiseline, poznati su i enzimi iz ove grupe koji su otporni na prisustvo klavulonata. Pronađeni su kod E. coli, K. pneumonie, Klebsiella oxytoca, P. miribilis, Citrobacter freundii

SHV beta laktamaza deli 68% aminokiselinske strukture sa Tem1 enzimom, dakle imaju jako sličnu strukturu. Najčešća je kod K. pneumonie i preko 20% plazmid posredovane ampicilinske rezistencije je posledica prisustva Shv enzima. Posledica mutacija kao i u predhodnom slučaju je supstitucija aminokiselina, tj izmena aminokiselinske sekvence najčešće ovde na poziciji 238 i 240. Poznato je oko 60 različitih tipova enzima među kojima su najčešći Shv5 i Shv12.

CTX-M beta laktamaza je dobio naziv po velikom afinitetu prema antibiotiku cefotaximu i ceftazidinu nije mnogo sličan sa predhodna dva slaže se u 40% aminokiselina. Poznato je oko 80 tipova ovog enzima, najčešći su Ctx-M14, Ctx-M2, Ctx-M3. Pronađeni su kod E. coli i Salmonella enterica i nekih vrsta eneterobakterija.

KPC beta laktamaza takođe spada u A klasu enzima koji jako dobro hidrolizuje karbapeneme, poznati Kpc1 i Kpc2 karakteristični za Ameriku.

klasa C AmpC beta-laktamaze su najčešže izolovane iz proširenog spektra cefalosporin

rezistentnih sojeva gram-negativnih bakterija kodirana je od strane ampC gena koji se nalaze na hromozomu. Pronađeni su kod rodova Citrobacter, Enterobacter i Serratia. Mogu biti kodirani i sa plazmida.

CMY karbapenemaze otkrivene su 2006. god. izolovane iz virulentnog soja Enterobacter aerogenes, ovaj enzim je kodiran genima sa plazmida pYMG1 i mogu se premeštati u druge bakterijske rodove.

Klasa D OXA beta laktamaze koje hidrolizuju oxaciklin i po tome su dobile naziv, manje su

11

uobičajene plazmid kodirane beta laktamaze. I u ovom slučaju supstitucija aminokiselina dovodi do pojave ESBL fenotipova.

Klasa B ovde spadaju beta laktamaze-karbapenemaze koje su označene kao metaloenzimi zato što

za svoju aktivnost zahtevaju prisustvo cinka Imp tipovi beta laktamaza su plazmid posredovane, pronađene u Japanu 1990 god nekih gram negativnih enterokoka i kod rodova Pseudomonas i Acinetobacter. Imp sojevi se lagano šire u druge zemlje bliskog istoka, u Evropu su stigli 1997, a pronađni su i u Kanadi i Brazilu.

VIM (Verona integron-encoded β laktamases) pronađena je u Italiji 1996. god. kod P. aeruginosa sad ima oko deset različitih enziama, ovi sojevi su se brzo proširili po Evropi i Bliskom istoku, najpoznatiji su Vim4,Vim3, Vim2 i Vim‚1.

Esteraze

Jedna od prvootkrivenih rezistencija na na makrolide posredovana esterazom je kod E. coli. Visok nivo rezistencije kod ove bakterije na makrolide je posledica plazmid kodirane rezistencije. Geni koji su zaduženi za sintezu esteraze su označeni kao ere geni, ereA gen kodira eterazu koja je specifična za hidrolizu 14-članog prstena makrolida i pored E.coli pronađen je kod Klebsiella pneumonie i kod nekih enterobakterija. Nalazi se originalno na plazmidu pIP1100 organizovan u integron genske kasete, nosi sopstveni promotor i pripada drugoj klasi integrona, koji ima jednu insercionu sekvencu označenu IS1 uzvodno od intI2 gena koji kodiraju mesto specifičnu integrazu. Genske kasete se ugrađuju u integron uz pomoć inegraze putem mesto specifične rekombinacije, izemđu attI i attC mesta koje je povezano sa single open reading frame sekvencom koja je predstavlja genske kasete. U okviru intI sekvence pre attI regiona nalazi se promotor koji reguliše ekspresiju ovih gena. Do sada je pronađeno više od 70 antibiotskih rezistencijana ovim genima. Tako pored ereA gena kod nekih enterobacterija postoji ereB gen koji kodira još jednu makrolid specifičnu esterazu. Kod gram-nagativnih bakterija esteraze specifično hidrolizuju 14 i 15-člane makrolide dok kod gram-pozitivnih 14 i 16-člane makrolide. U odnosu na integrazu postoje dve klase integrona, one koje inkorporiraju u Tn21 familiju transpozona i druga klasa ona koja asocira sa Tn7 familijom transpozona (Biskri & Mazel, 2003).

Modifikacija enzimima

Još jedan način delovanja enzima i razvijanja rezistencije je preko enzima koji služe kao transferi određenih grupa. Često je rezistencija na aminoglikozde i posledica delovanja inaktivirajućih enzima koji se dele u tri grupe: aminoglikozid fosforiltransferaze, adeniltransferaze i acetiltransferaze (rezistencija na netilmicin, amikacin, gentamicin). Svi ovi enzimi su jako specifični u odnosu na svoj supstrat. Identifikovano je najmanje 16 acetiltransferaza koji katalizuju prenošenje acetata sa acetil koenzimaA na amino grupu aminoglikozida. Aminoglikozidne adenilaze su nukleotidne transferaze koriste ATP i vezuju se za hidroksilne izložene grupe. Fosfotransferaze takođe fosforilišu hidroksilne grupe. Najčešće se geni koji kodiraju ove enzime nalaze na plazmidima. Ovi geni se najčešće nalaze na genskim kasetama, geni koji kodiraju aminoglikozid adenil transferazu označeni su sa aadA, aadB, oni koji kodiraju aminoglikozid acetil transferazu sa aacA, aacB, za chloramfenikol acetilazu catA, catB, za dihidrofolat reduktazu drfA, drfB i sl. (Recchia & Hall,1995).U poslednje vreme sve češće opisivana rezistencija je posredovana metilazama 16 rRNA, ili 23S rRNK, u tom slučaju obično postoji rezistencija na sve aminoglikozide i makrolide. Razlika je što u slučaju metilacije 23S RNK i 16S RNK kao supstrat služi adeninski ostatak na rRNK i na taj način dolazi do maskiranja ovog mesta tako da se antibiotik ne može vezati.

12

Metilacija 23S rRNK

Makrolid-linkozamin-streptogramin MLS sojevi nose rezistenciju na ove antibiotike i ona je zasnovana na metilaciji adeninskog ostatka na 23S subjedinici rRNK. Metilaza vrši dodavanje dve metil grupe na adeninski ostatak na 23S rRNK. Ova ribozomalna RNK je ustvari ribozim, ima enzimsku aktivnost i ustvari je peptidil transferaza, tako se metilacijom zapravo štiti ovaj enzim od dejstva antibiotika čiji je on supstrat. Pronađeno je oko 30 različitih erm gena, kod gram pozitivnih i gram negativnih bakterija. Kod stafilokoka ermA, ermB, ermC i ermF, kod sterptokoka ermAM kod roda Bacillus ermD i ermG. Najčešća četiri gena za metilazu koji su identifikovani kod roda Staphilococcus: ermA, ermB, ermC i ermF, od kojih je ermC najzastupjleniji, te je tako i najbolje proučen. Prva dva su transpozon kodirana, a ermC je plazmid kodirana.

Postoji dva tipa ermC ekpresije, tzv. inducibilna i konstitutivna. Razlika između ova dva tipa ekspreije je u tome što je konstitutivna stalno prisutna, a inducibilna ekspresija zavisi od uslova u kojima se ćelija nalazi. Genetička osnova razlike ova dva tipa eksptresije leži u regulatornom regionu koji je smešten uzvodno od strukturnih ermC gena. Indukovana ermC genska ekspresija indukovana je prisustvom antibiotika, zapravo sinteza metilaze zavisi od prisustva antibiotika. Regulacija ove eksptresije se odvija po principu translacione atenuacije slično kao regulacija sinteze triptofana. Regulatorni region poseduje ORF za 19 aminokiselina i četirri invertovana ponovka, tj. dva para. Mesto vezivanja ribozoma označeno sa SD2 i stratni kodon za ermC gene je u okviru četvrtog invertovanog ponovka IR4. Tako da kada je ovo mesto slobodno, tj. kada se ne formira ukosnica između trećeg i četvrtog ponovka onda se translacija nesmetano obavlja, ukoliko se formira ukosnica i blokira ovo mesto blokira se i sinteza metilaze.

Plazmid označen pE194 originalno je izolovan iz Staphylococcus aureus, i pronađeno je da nosi inducibilnu rezistenciju na makrolide i linkozamide. Nizom eksperimenata došlo se do zaključka da mutacijom na ponovcima delecijom i duplikacijom inducibilona ekpresija se može transformisati u konstitutivnu koja ne zaviasi od prisustva antibiotika već je reglisana samo jačinom promotora (Werckethin et al, 1999).

Dakle antibiotici iz MLS grupe mogu se podeliti u dve podgrupe: induceri ermC genske ekspresije koji uključuju 14- i 15-člane makrolide i neinducere u koje spadaju 16-člani makrolidi streptogramin B i linkozamidi. Stafilokoke koje nose inducibilne ermC gene rezistentne su samo na inducere. One koje nose konstitutivnu rezistentne su na sve antibiotika iz ove grupe (Werckethin et al, 1999).

Metilacija 16S rRNK

Metil-transferaze koje pružaju otpor aminoglikozidnim antibioticima otkrivene su kod prirodnih proizvođača iz roda Streptomyces. One metiliraju guaninske i adeninske ostatke na 16S rRNK i pripadaju porodici Arm kodirane od starne arm gena (aminoglycoside resistance methyltransferase) ili metilaze iz porodice Kam za kanamicin. Pored ove dve kod E.coli pronađena je i metilaza označena NpmA koja pruža rezistenciju na široki spektar aminoglikozida. Svoje delovanje metilaze ispoljavaju tek nakon formiranja 30S subjedinice, dakle jedini supstrat koji se može uspešno metilovati je zrela 30S ribozomska subjedinica.

Promena ciljnog mesta

Promena ciljnog mesta može biti posledica rada enzima koji služe za modifikaciju mesta vezivanja kao što je već gore opisano u slučaju metilacije vezujućeg mesta za antibiotike na ribozomu, ti enzimi su različite transferaze koje maskiraju vezujuće mesto dodavanjem različitih grupa. Promena ciljnog mesta može biti i na samoj membrani u slučaju beta laktamskih antibiotika, gde dolazi do promene vezujućeg proteina.

13

MRSA sojevi imaju mecA gen koji kodira penicillin vezujući protein PVP2a, on je lociran na scc-mec, Staphylococcal Cassettte Chromosomes. Ekspresija PVP2a ima za posledicu rezistenciju bakterije na sve peniciline, cefalosporine i karbapeneme. Česti uzročnici infekcija kod dece su Streptococcus pneumoniae, ove koke razvijaju rezistenciju na penicilin tako što menjaju ciljno mesto vezivanja antibiotika. Do promene dolazi zbog izrazite sklonosti za genetsku transformaciju, strana DNK koja se ugrađuje u njihov genom potiče od viridis streptokoka koje sa njima dele stanište u sluznici gornjih disajnih puteva. Pneumokoke ne prelaze odjednom iz kategorije osetljivih u kategoriju rezistentnih, već se to dešava postepeno prelazeči fazu umerene rezistencije.

Slika 5. (www.mecriticalcare.net)

Zaobilaženje inhibirane faze metabolizma

Neke bakterijske ćelije razvijaju rezistenciju na aminoglikozide npr. tako što zaobilaze inhibiranu fazu metaboliza. To je u slučaju metabolizma folne kiseline. Bakterijska ćelija u ovom slučaju ne sintetiše folnu kiselinu već se ponaša kao eukariotska ćelija i koristi je iz spoljne sredine.

Folna kiselina ima ulogu koenzima u procesu transfera karboksilne grupe prilikom sinteze timidina i purina. Za sintezu folne kiseline neophodna je PABA, dihidrofolat sintetaza i dihidrofolat reduktaza i dihidropteorat sintetaza. Sulfonamidi su strukturni analozi PABA, oni inhibiraju rad dihidropteorat sintetaze u funkciji kompetitivnog inhibitora, sprečavajući inkorporaciju PABA i sintezu dihidropteorične kiseline. Mutacija na genima dhps, na hromozomu kod E. coli daće mutanta koji je otporan na sulfonamide. Kod mutanta se umesto fenilalanina javlja izoleucin na 28 mestu tako da se ovde javlja izmenjen enzim sa manjim afinitetom za date antibiotike. Da li je u

14

pitanju tačkasta mutacija ili duplikacija ili delecija, zavisno od soja bakterija , posledica je izmenjen enzim u manjoj ili većoj meri. Kod gram-negativnih enterobakterija češće je pojava plazmid posredovane rezistencije na sulfonamide. Plazmid posredovana rezistencija na sulfonamide uključuje pojačanu sintezu dihidrofolat reduktaze ili PABA. Geni odgovorni za ovu rezistenciju su označeni sa sulI, sulII i sulIII. Još Jedan način je i sinteza izmenjeneog enzima sa manjim afinitetom za sulfonamide. Dakle, bakterijske ćelije pored toga što imaju sposobnost da uzimaju folnu kiselinu iz spoljašnje sredine ponašajući se kao eukariotske ćelije, razvile su i alternativne puteve njene sinteze (Huovinen, 1995).

15

LITERATURA

Christiane Werchenthin, Stefan Chwarz and Henrik Westh, (1999), Structural Alteration in Translation Attenuator of Constituitively, Antimicrobial Agents and Chemoteraphy, 1681-1685, www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC89343/pdf/ac001681.pdf, pristupljeno 15.08.2010.

Darko Sakar, (2006), Makrolidi i linkozamidi i aminoglikozidi, Zavod za farmakologiju i toksikologiju, Veterinarski fakultet sveučilišta u Zagrebu

Donald D Kirsch and Margaret H. Lai, (1984), Regulation of Macrolide resistance Gene fusion in Escherichia coli, Journal of bacteriology, 381-384 www.ncbi.nlm.gov/pmc/articles/PMC/215641/.../jbacter00230-0389.pdf, pristupljeno 14.07.2010.

Gavin D. Recchia and Ruth M. Hall, (1995)Gene casette and new class of mobile element, Microbyology, 141, 3015-3027, http://mic.sgmjournals.org/content/141/12/3015.full.pdf, pristupljeno 10.07.2010.

Jelena Knežević-Vukčevič, Branka Vukovič-Gačić i Draga Simić, (2009), Osnovi biologije prokariota, Modul 2. Osnovi genetike prokariota, Univerziteta u Beogradu, Biološki fakultet

Lateef Adewoye, Ainsley Sutherland, Ramakrishnan Srikumar, and Keith Poole, (2000), The MexR Repressor of the mexAB-oprM Multidrug Efflux Operon in Pseudomonas aeruginosa: Characterization of Mutations Compromising Activity, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 2233-2241, Vol. 44, No. 9, www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC135222/pdf/1452.pdf, pristupljeno 12.07.2010.

Latefa Biskri and Didier Mazel, (2003), Erythromycin esterase gene ereA is located in a functional gene cassete in an unusual class 2 integron, Antibicrobial Agents and Chemotherapy, p.3326-3331, http://aac.asm.org/cgi/reprint/47/10/3326, pristupljeno 29.08.2010.

Ljiljana Petrović Jeremić, (2010), Učestalost meticilin rezistentnih Staphylococcus aureus MRSA sojeva, Acata Medica Medianae, vol.49 http://publishermedfak.ni.ac.rs/2010-html/1-broj/6Ljiljana%20Petrovic%20UCESTALOST%20MRSA%20SOJEVA%2033-36.pdf, pristupljeno 02.06.2010.

Mazen Kherallah, (2010), Antimicrobial Rezistance Mehanisms, www.mecriticalcare.net/downloads/IDCcourse/mechanismsofResistance.pdf, pristupljeno 25.07.2010.

Michael T. Madigan & John M. Martinko, (2006), Brosk-Biology of Microorganisms, Eleventh edition

Pentti Huovinen, Lars Sundstrom, Gote Swedberg and Ola Skold, (1995), Trimetropim and sulfonamid resistance, Antimicrobial Agents and Chemoterapy, p.279-289, http://acc.asm.org/cgi/reprint/39/2/279.pdf, pristup 29.08.2010.

S. Schwarz, Carla Lange and Christiane Werchenthin, (1998), Molecular analysis of the macrolide-linkosamide resistance gene region of novel plasmid from Staphylococcus, J. Med Microbiol. Vol47 63-70 http://jmmsgmjornals.org/content/47/1/63.full.pdf, pristupljeno 10.08.2010.

Sanda Sardelić i Branka Bedenić, (2009), Rezistencija na antibiotike u Pseudomonasa aeruginosa Infektološki glasnik 29: 4,177-183 www.hrcak.srce.hr/file/77685, pristupljeno 29.06.2010.

16