Materials & Methods٧٭ٕ٨ا ٟئازيٶ داٷ٭٨ا 3

الفصل الثالث المواد وطرائق العمل

40

Materials & Methodsانىاد وطزائق انعم .3

ثؼثس ثذ١ز ملاي ثور ثقر ج حـ ضقو٠و خ ثلاجدز أؽ يث ثي

نضذثس ضف ثا ثؽغ450ىه دضجدؼز 2012ث ج٠ز ص ػج 2011أىث دوث٠زد١

. جثء ثؼج ثنضذثس ثضجدؼز ؼ١جهثس ثنجؽ١ز ثنجز

Materialsانىاد -1.3

Instrumentsالأجهشح -1.1.3

: ف ثوثز ثلأؽر ثؼ١ز ث٢ص١زثضنوش

انجهبس

Instruments

انشزكخ

Company

يشأال

Suppliers

Incubator LabTech Korea فجز

Shaking water bath Gemmyco Taiwan ثفج جة

ؽج صن١ ؼقن

غج١

Hot plate with

magnetic stirrer

Jlassco

India

ELISA ؽج ث١ث BioTek ELx800

bioelisa reader U.S.A.

ثذن ثوث Vacuum rotary

evaporator Heidolph Germany

Digital camera Sony-16.1MP Japanوج١ث ل١ز

Sensitive balance Sartorius Germany ١ث فج

Microtom GmbH .Co. Germany ثثؿ ثوث

Spectrophotometer Spectronic-20 Germanyط١جف ة

Light microscope Olympus Japan ؾ ة

Hot plate – slide Electrothermal Englandؾفف لا٠وثس

.pH- meter Beckman U.S.Aم١ج ثلأ ث١وؽ١

Autoclave LabTech Korea (ؽج صؼم١)ور

Centrifuge Gallenkamp England ذير

Automatic ؽج ؼجؼ ثلأؾز ث٢

tissue processor

Tiyoda Japan

ص٠غ ثغ ؽج Wax dispenser Tiyoda Japan

Oven Tvmaks Norwayف


41

انجبهشح وانعذدصجغبدالأوطبط انغذائخ وال-2.1.3

Cultures Media, Stains and Kits

: ثؼوه ثؾجر ثضج١ز ذغجسف١ج ثلأج ثغيثة١ز ثيثضنوثثوثز ثقج١ز

انبدح

Material

انشزكخ

Company

انذونخ

Country

٠Feinberg medium (Trichomonas Agar ػ

base (TAB) ) Hi media India

Kupferberg medium٠ ػ Hi media India

٠Diamonds’ medium Remel U.S.A ػ

Gimsa stain Sigma U.S.Aذغز وث

Haematoxylin stain Sigma U.S.Aذغز ١صو١

Eosin stain Sigma U.S.A ذغز ثلأ١٠

LHLHKit-ELISA Monobind Inc. U.S.Aثؼور ثؾجر م١ج

FSHFSHKit-ELISA Monobind Inc. U.S.Aثؼور ثؾجر م١ج

ثق ثنثؼور ثؾجر م١ج

Testosterone Kit - ELISA Monobind Inc. U.S.A

Prolactinثؼور ثؾجر م١ج

ProlactinKit–ELISA Monobind Inc. U.S.A

PSAثضو ثذضجص ثػ ثؼور ثؾجر م١ج

Kit–ELISA Monobind Inc. U.S.A

ثؼور ثؾجر م١ج فؼج١ز أ٠ ثففجص١ ثقج

Acid Phosphatase Kit Human Germany

Chemicals and Solutionsائخ وانحبنم يانىاد انكى-3.1.3

: ف١ج ٠أص لجةز دأجء ثثه ثى١جة١ز ثقج١ ثضنوز ف ثوثز ثقج١ز

ثجهر

Material

ثوز

Company

ثوز

Country

Sodium phosphate monobasic BDH England ففجس أفجه٠ز ثه٠

Sodium phosphate dibasic BDH England ففجس عجة١ز ثه٠

١Sodium hydroxide Fluka Germanyوو١و ثه٠

Sodium chloride Fluka Germanyو٠و ثه٠

Thymole BDH Englandعج٠ي


42

Glycerolو١١ي BDH England

Formalin BDH Englandفج١

٠D.P.X.Distrene Plasticizer Xylene Fluka Germany صغط١ز

Methanol Fluka Germanyوقي غ١

Ethanol Fluka Germanyوقي ثع١

Potassium alum BDH Englandخ ثذصج١

Red mercuric oxide Fluka Germanyأو١و ثةذك ثلاف

Glacial acetic acid BDH Englandفج ثن١ه ثغؾ

Dimethyl Sluphoxide BDH Englandعجة غ فو١و

Xylene BDH Englandث١٠

Paraffin wax BDH Englandغ ثذجثف١

Streptomycin sulfate فجس ثضدضج١٠ IndiaMART India

Penicillin IndiaMART Indiaثذ١

B Amphotericin B IndiaMART Indiaثفص١٠

Nystatine IndiaMART Indiaضجص١

Conc. sulphuric acid BDH Englandفج ثىذ٠ض١ه ثو

Acetic anhydride BDH Englandثو٠وثن١ه

.Ferric chloride Sigma U.S.Aى٠و ثقو٠و٠ه

.Mercuric chloride Sigma U.S.Aو٠و ثةذك

.Lead acetate Sigma U.S.Aملاس ثج

Gelatin Fluka Germanyثؾلاص١

.١Ammonium hydroxide Sigma U.S.Aوو١و ثلا١

٠Potassium iodide Fluka Germanyه٠و ثذصج١

Bismuth nitrate Fluka Germanyضثس ثذط

٠Iodine Fluka Germanyه

Picric acid BDH Englandفج ثذى٠ه

Tannin acid BDH England(ثؼف١ه )فج ثضج١ه

Methodsطزائق انعم-2.3


43

Preparation of Culture Mediaرحضز الأوطبط انشرعخ-1.2.3

ثلأج ثػ١ز ث٢ص١زفخ صؼ١جس ثوز ثؼز ثوز ػ ثؼذثس، سف

ور 121، ص صؼم١ج دجوردوؽز فثر pHدؼو ىه ذ٠ ثلأ ث١وؽ١

إؼ/ دجو15 ؽ هل١مز، دغ٠ 152

37 ففظش ف هؽز فثر o

جػز 24 ور

4)ج ػو صعج، ع ففظش ف ثغلاؽز o

. ثلاضؼجيق١ (

Diamonds’ medium modifiedوطظ داىذ انحىر -1.2.31.

: ف ث٠ ثى ثثه ثضج١ز

انكخ انــــــــــــــــــــــــــبدح

Casein Peptone 24gmدذض ثذ

Yeast extract 12 gmملاز ثن١ر

Maltose 6gmجض

L - ١وو٠وثض١Cystein L_ hydrochloride 1.2gm

L –Ascorbic acid 0.24gmفج ثلاىد١ه

Agar 0.5 gmثوج

Demineralized Distilled water 900 ml مج١ز ثؼجه جء مط

س ىجس ث٠ ثيو أػلا ف ثجء ثمط ثنج ثؼجه ػؼش

Hot فض صيح ثىجس ػ ٠ك ثضنوث ؽج صن١ ؼقن غج١ شؽ١وث ل

plate with magnetic stirrer ػوي ثلا ث١وؽ١ ،(pH) دؼوج ص (6.5)ث،

ه ث٠ إ ف ظف ؼمز أ١ف ثقج ثؼم غ١ 56ºثضؼم١ ع د

Streptomycinفجس ثضدضج١٠)ثجهثس ثق٠١ز % 12دذز ثفؼجي

sulfate1.5 ضثفص١٠ ح/غ Amphotericin B 2.0ض / غ

ع , غ ثؾثع١ ثفط٠جس (ض/ فور ه١ز ١ penicillin1000000ثذ١١

5ع ث٠ دثلغ 3

30 ؼز MeCantry vials ف لج ؽجؽ١ز ؼـــــمز3

.

رحضز يصم انحصبPreparation of horse serum


44

ؼمز دلاض١ى١ز أجد١خؼش ف قجص قخ ػ١جس ثو ث٠و ثهثؽ

هل١مز دؼوج غ ث ف لج / هر 3000ثذير ؽج دجضنوثدؼوج ص ف ث

ف فج جة ور ف جػز Inactivation ١ض ثثز فؼج١ضؽجؽ١ز قىزثغك

56دوؽزفثر o

ػم يث ثؼ ٠ك ثض١ـ دثطز قجصغجة١ز

[Membrane filter-Milipore filter 0.22 µg ] .

Feinberg medium [TrichomonasAgar base(TAB)] وطظ -1.2.31.

: ٠ضى ث٠ ثثه ثضج١ز

انكخ انــــــبدح

Liver digest 25gmوذو

Glucose 5gmوو

Sodium chloride 6.5gmو٠و ثه٠

Agar 1gmأوج

Distilled water 920mlجء مط

، 6.0ص ثىثدز ثثهثجدمز ثيو ف ثجء ثمط ، ػوي ثلا ث١وؽ١ ث

ه ث٠ إ ػم ث٠دؼوج ف ظف ؼمز أ١ف ثقج ثؼم º56 ع د

Streptomycinفجس ثضدضج١٠) ثجهثس ثق٠١ز horse serumغ١ ثفؼجي

sulfate2.5 ض ثذ١١ / غpenicillin500000 ضجص١ض / فور ه١زNystatine

5ع ع ث٠ دثلغ , غ ثؾثع١ ثفط٠جس (ض/غ0.13

ف لج ؽجؽ١ز

30ؼز ( MeCantry vials)ؼـــــمز 3

.

Kupferberg mediumانىطظ انشرع -1.1.2.3


45

:٠ضى ث٠ ثثه ثضج١ز

انكخ انــــــبدح

Tryptose 20gmصث٠ذض

Maltose 1.2gmجض

L_ ج٠ض ١ ١ووث٠وL-cyttocine hydrochloride 1.5gm

Agar 1.5gmأوج

Methylene blue 0.003gmثغ١ ثلاق

Yeast extract 0.1gmملاز ثن١ر

Distilled water 950mlجء مط

ث٠ ثيو أػلا ف ثجء ثمط ص ؽ ىجسإىثدز ف ث٠ ػ ٠ك

ثىجس ػ ٠ك ثضنوث ؽج صن١ ؼقن غج١ ، سحىأؽ١وث صن١ فض

ه ث٠ إ 6.0ػوي ثلا ث١وؽ١ ث ف ظف 56º، دؼوج ص ثضؼم١ ع د

فجس )ثجهثس ثق٠١ز % 8رـدخؼمز أ١ف ثقج ثؼم غ١ ثفؼجي

, ض / غ Streptomycin sulfate1.5ثضدضج١٠

(ض/ فور ه١ز 1000000ض ثذ١١ / غChloramphenicol0.1ف١١ىيـــو

5ع ع ث٠ دثلغ, غ ثؾثع١ ثفط٠جس 3

ف لج ؽجؽ١ز ؼـــــمز ؼز

303

.

General Informationنعهىيبد انعبيخ ا-2.2.3

ص أمي ثذ١ججس ذجر و ٠ دج ف ىه ؾػز ثضقى أ ث١طر

Control ثض دأثف ثىجه ثطذ ثضن ثضجر ثلاضذ١ج ػ ٠ك ب

طمز ثى ثلالضجه٠ز ثقجز ثلاؽضجػ١ز ثؼ ثض ثضؼ١ ثقجز صضجلا

ػوه أفثه ثلأر ػوه ثلأفجي ثظ١فز ثلاث ثثفمز ثؼلاػ ثضجي لذ ثثؽؼز

في أ ػو (ج ثةقضج) وجلإفثثس Signs ثؼلاجس Symptomsثلأػث

. ثلإهثBurning أ فلز Itchingفي فىز


46

Collection of specimensجع انعبد -3.2.3

:Specimens of Urineعبد الادرار - أ

ثؽؼ١ نضذثس ضف جثء ثؼج ؽؼش ػ١جس ثلاهث ثلانج ثي

ف لج دلاض١ى١ز ؼمز صضنو ر ثفور ثنضذثس ثضجدؼز ؼ١جهثس ثنجؽ١ز ثنجز

. ٠رف١ظ ص صن دوث٠ز ثلاهث ثمي ثثف ثلاك

:Specimens of Bloodعبد انذو - ة

5 ؽؼش ػ١جس ه ثلأنج ىه دقخ 3

ثو ث٠و ع غ ثو ف

5هل١مز ور /هر3000 ١ضؾـــ٠ دوؽز فثر ثغفز ع ذي دػز أجد١خ دلاض١ى١ز صن

ق١ 20º- دوؽز فثر ؾوثهلجةك ف ث ، م ث إ أجد١خ دلاض١ى١ز ففع

, LH , FSH , Testosteroneض ثجس ثؾ١ز ، ف١ظ ثضنو م١ج ثضؼج

Prolactinل١ج ض PSA TACP PAP.

General Urine Examinationانفحص انعبو نلأدرار-4.2.3

Direct smear of urine sedimentنزاطت الادرارحانجبشزيظحخال-1.4.2.3

, ص ثؽثء ثفق ثذج ثخ ثلاهث ضأوو ؽه ثطف١ ف ثمجر ثذ١ز ثضج١ز

ثؼ١جس ف أجد١خ أمضذجدلاض١ى١ز ؼمز ذش دؾج ثطه ثو دػز ىه دغ

ثثـ أميس لطر ثثخ ؼش ػ ىخ هلجةك ، 5هل١مز ور / هر3000

ع ثم ثىذ ٠10xقز ؽجؽ١ز فقش دثطز ثؾ ثة صقش ثم ثغ

40x لو ص صن١ ثطف١ ػ ٠ك فوض ثؽثؽز ىه ىف ػ ثطف١Jerky

movementفوز ثث ثغجء ثضػ (WHO , 1991;Bafghiet al ., 2009) .

صق١ Examination with stain (Gimsa)(كشا )انفحص ثبنصجغخ -2.4.2.3

Preparation of Giemsa stainذغز وث


47

:- ثضنوش ثمجه٠ ثلاص١ز ضق١ ثذغز

ثى١ز ثجهر س

Giemsa stain g0.75قق ذغز وث 1

Glycerol 25 mlو١ي 2

Methanol -absolute 75 mlطكوقي غ١ 3

:- ص صق١ ثذغز دجط٠مز ثلاص١ز

١ي ق دثطز ي غ قق ثذغز ف ثج ثؽجؽ ع ث١ف ثه

قش ؽش ؽ١وث ع وقي ثغ١ثولز فض ثذقش ػ ى ػؾ١ز ع ث١ف ثي

ف فجز ( جػز 24 )ؼش ف لج ؼضز فش ورث٠ؼ دثطز ق ص١ـ

. ع ففظش ف هؽز فثر ثغفز ف ىج ؼض ق١ ثلاضؼجي . 37ºدوؽز

:Stainingsteps انصجغ خطىاد

: (Fernandoet al ., 2011) ثػضجهثا فخ ثنطثس ثضج١ز

قز هل١مز دغ لطر ثخ ثلاهث ػ ٠قز ؽجؽ١ز فش دجضنوث فس-1

. ٠قز ؽجؽ١ز أم صوش ضؾف

. هلجةك ث أ صؾف 10 ور %95وقي ثلاع١عذضش ثقز دغ لطثس ثي-2

1 دأمي (PBS)مففش ثذغز دجقي ثظ ثـ -33

19 ثذغز 3

(PBS) ثـ

غس ث٠قز ثؽجؽ١ز ف١ Staining jarؼش ف ثػجء ثن ذغ

. صوش ور جػز

. (دط١تز ثؾ٠ج)غش ث٠قز دجء فف١ز -4

ع ثؼوز 40x ع 10xع صوش ضؾف دؼوج فقش صقش ػوز ثؾ ثة دمر -5

. ضق ػ ثطف١ ث٠ض١ز

لذ Examination in liquid Cultureانفحص ثبنشرع انظبئم-3.4.2.3

٠Diamonds’ medium هث٠و ثق ثلأج ثػ١ز ثغلاط سثلاضذجس ف

modified ٠ Feinberg medium [Trichomonas Agar base(TAB)] ث٠

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Fernando%2BSD%5bauth%5d


48

37 دوؽز فثر Kupferbery mediumثػ o

ف ثقجز ور جػز غ

ج٠ى ض 250دئجفزص ع ثؼ١جس ىه . صؼو٠ هؽز ثقثر ثجذز ثطف١

37ثخ ػ١جس ثلاهث ع فش ثلاج ثػ١ز دوؽز فثر o

ص ف ثقجز

جػز ىه دقخ لطر لؼ ثلاذدز 96 , 72 , 48 , 24لافظز ثطف١ دؼو

, Clark & Diamond)فقش دجط٠مز ثذجر ث غ ثذغز micropipetteدثطز

2002) .

أدايخ انطفه -5.3

دؼو ثضأوو ؽه ثطف١ ف ث٠ م ثضعضش ػ١ز أهثز ثطف١

ثقجفظز ػ١ ضؾجح ثلافمز ملاي أمي و١ز ث٠ ثضذش ثنج دجطف١

ج٠ى ض لؼ ثلاذدز مج ث ث٠ ثػ ثؾو٠و ف ث٠ 250دموث

37ثؾو٠و دوؽز فثر o

صقش لو ص ثهثز ثطف١ ثغج٠ز دجضث , ف ثقجز

ا ىه غ فوط ثضط دجذىض٠ج ثفط٠جس . ظف صؼم١ ث٠ج

The used plantsانجبربد انظزخذيخ-6.3

وف ثذ١Adiantumcapillus

ثىضجLinumusitatissimum

ثذد١Portulacaoleracea

Collection and storageof plants حفظ انجبربدوجع-1.6.3

ص ؽغ ثذجصجس ثنضجر ي ثوثز ثجو نضفز ف١ظ ؽؼش ثثق ١مج ذجس

وف ثذ١ ثجك ثثػ١ز ثضجدؼز مجء جثءأج دي ثذد١دي ثىضج فؾؼش

ثجف ي ثضأوووج ص , قلاس ثؼطجر قلاس ثضؾ١ثس ثثػ١ز ف لجء جثء

لو ص صظ١ف ثجىػ ثذجص١ز ج ػك دج , ؽجؼز صى٠ش / ثذجصجس ف و١ز ثثػز

ثلاجك ثثةخ قمش ؽ١وث ففظش ف غفجس ل١ز ف ظف مج١ز ثدز

. ق١ ثذوء دضق١ ثضنجس ثذجص١ز

extracts Preparation of: رحضز انظزخهصبد-2.6.3


49

Aqueous extractsخيبئانظزخهصبد ال-1.2.6.3

: (Rioseet al., 1987) ثنطثس ثضج١ز دجلاػضجه ػ ٠مز ثضنوش

ذجص ثىضج لأثق ١مج وف ثذ١ دي) غ ثقق ثذجص50ص -1

200ص مؼف ، (ثد١3

دذز [ثؼم ذمج دثطز ثور ] ثجء ثمط

(1:4) .

ضقط١ ؽوث Magnetic stirrer ع غ ثضن ػ ؽج ثقن ثغج١- 2

.(30-25)ثنلا٠ج ثذجص١ز ور جػز دوؽز فثر

. جػز 24 ور 4مع دوؽز فثر ثيدؼوج صن ثضن -3

ا دجضنوث ػور ذمجس ثج ىه ضن ثلأ١جف ا أ١ج ف ث١ ثضج ـ ص١قج

. ثذجص١ز ثضذم١ز

ثثـ إ ثذي ثو دمر -4 ,Channoum). هلجةك 10هل١مز ور / هر3000ػ

1990) .

.Bukhner funnelضنوث ف لغ دمثـ ثضن ر ثغج١ز ح-5

جػز ع 24 ور 37ؽفف ثثـ دجضنوث ؽج ثف ثىدجة دوؽز فثر -6

ق١ (-20)ؼش ثجهر ف ػذثس ؼز ؼضز ىثس غطجء قى دوؽز فثر

.[ وس ثنطثس ثػلا ػور ثس ؾغ ثى١ز ثطدز ]ثلاضؼجي

Alcoholicextractsانظزخهصبد انكحىنخ -2.2.6.3

:(Harborne ,1984)أضنوش ثنطثس ثضج١ز دجلاػضجه ػ ٠مز

250 ع صش ثىثدض ف ثقق ثذجص دؼو ثطق غ 25 -13

ثىقي ثلاع١

.( 1: 10)دذز % 70دضو١

غ ثضق٠ه ثض Magnetic stirrerغ ثن٠١ دؼو ىه ػ ثقن ثغج١-2

.دوؽز فثر ثغفز ( جػز 24 )ور

ا دجضنوث ػور ذمجس ثج ىه ضن ثلأ١جف -3 ا أ١ج ف ث١ ثضج ـ ص١قج

.ثذجص١ز ثضذم١ز

.Buchner funnel لغ دندثطزـ ثقي -4

دوؽز فثر Vacuum Rotary evaporator دجضنوث ثذن ثوث ثثـع دن-5

وس ثنطثس ثػلا ػور ثس ؾغ . غ ثضن ثي٠خ 37ºلاص٠و ػ


50

ف ػذثس ؼز ؼضز ىثس غطجء قى ضن ثؾجفغ ثثى١ز ثطدز ،

. ق١ ثلاضؼجي (-20)ثو دوؽز فثر

Etheric extractsح لاثزيانظزخهصبد ا-3.2.6.3

وف ثذ١ دي ثىضج يضق١ ثضن ثلا٠غSoxhletثضنو ؽج ثلاضنلا -1

ف ؽج Thumble ثذجس هثم ثغذققغ 50دي ثذد١ ىه دغ

500أ١فش ثSoxhlet١ثـ 3

غ ثضن١ Petroleum ether ثذض١ ثلا٠غ

Panda,et)ثي٠خ ثةمج ػو٠ ثجػجس ث ث ثذـ 10 ور 60ػو هؽز

al,2009) .

م ثضن ثنج ث ؽج ثذن ثوث غ ثضن ثي٠خ دوؽز لاص٠و ػ -2

37 .

غ ثضن ثؾجف ف وس ثنطثس ثػلا ػور ثس ؾغ ثى١ز ثطدز ، -3

. ق١ ثلاضؼجي (-20)ػذثس ؼز ؼضز ىثس غطجء قى ثو دوؽز فثر

رأثز رزاكش يخزهفخ ي انظزخهصبد عهى ى طفه انشعزاد انهجهخ-3.6.3

صـ صق١ مـــز صثو١ ىــلا ـــ ثضن ثـــجة، ثىقـــ ثلا٠غـــــ

ىـه [أثق ١مج وف ثذ١ــ،دي ثىضج دي ثذد١ــ]ذجصجس ل١ــــو ثوثـــــز

/ غ(0.05 ,0.15,0.10, 0.20 ,0.25) دئجفز 3

و ضن ث ثلاججػ١ز

ف لج ؽجؽ١ز [TAB Kupferberg،هث٠و ثق]ثغلاط ثضنوز ف ثوثز

(0.05 ,0.15,0.10, 0.20 ,0.25)ؼمز فج٠ز ػ ث٠ ثػ ضؼط ثضو١ ثجة

/ غ3

10×1) ف و ل١ز دثلغ علاط ىثس ، ع مقش و ل١ز دـ5

/م١ز (3

ث٠

ثس ثذ١ز ف ثط ملاي ثط ثغج٠ض ف١ظ ص أفضجح أػوثه ف١ ثؼ

ع Haemocytometerثغجص١ ث دجضنوث ٠قز صؼوثه ملا٠ج ثو

Improved Neubauer,دثلغ ويه مقش لج ؽجؽ١ز غ١ ؼجز دجضن ثذجص

ع فش ي ثمج دوؽز negative control ػوس ػ١ز ١طر جذز علاط ىثس

, 72، 48، 24)ف ثف ث ثنضفز ثػوثه ثطف١ أ٠ج ص صقو٠و (4) ور (37)فثر

,Benjamin and German) ثضو١ ثغذ٠ ثطف١ضأوو ثجػز (96

1993).


51

نهزكجبد انفعبنخ ف انظزخهصبد انبئخ، (الاطزذلانخ)انكىاشفبنززطجخ-4.6.3

:- ثذر انكزب و انجزثوانكحىنخ و الاثزخ نكم ي كزفض انجز،

:انكشف ع انظززولارىانززثبد:اولالا

ذجصجس ف ثضنجس ثجة١ز ثىق١ز ثلا٠غ٠زثض١لاصثضد١جسص ثىف ػ ؽه

:Gibbs,1974)) ثضج١ز دجضنوث ثىثفل١و ثوثز

لطثس فج ثىذ٠ض١ه ثو 5ص ثجفز :Salkowski’s Testوف جىفى-1

Conc. Sulphuric acid 1 دذ٠ء ػ ؽوث ثذدز ثمضذج صقض ػ3

ثضن

.، صى ث ثلاف ٠وي ػ ؽه ثض١ي

ص ثجفز دغ لطثس -:Liebermann-Burchard testدو-وف ١ذج-2

1 ث acetic anhydrideثو٠وثن١ه3

1 ثضن،ن ث ثغ١ج ع ث١ف

3

صى ث ثلام ثق ٠وي ػ . فج ثىذ٠ض١ه ثو ػ ؽوث ثلاذدز

.Triterpinesؽه ثض١ي ثلاؽث ػ ؽه ثضد١ ثغلاع١ز

1ص ثجفز -:Trim-Hillوف -33

1 ثىجف ث 3

ثضن ثق ف

صى ث ثلاق ٠وي ػ ؽه . هلجةك ف فج جة10ثذ٠ز ثمضذج ف ث٠ؼ ور

.Monoterpenoids ثلام ػ ؽه ثضد١ ثلافجه Diterpenoidsثضد١ ثغجة

Test for Fixed Oils and Fatsانكشف ع انشىد انثبثزخ وانذهى :الا ثب

ىف ػ ؽه ث٠س ثغجدضز ثو ف١ظ ٠ؤه Spot testص ثلاضؼجز دىف ثذمؼز

صى دمؼز ٠ض١ز فجىر ء ػ لز ثض١ـ ػو ثجفز لطثس ثضن ث١ج ث

.Ashutosh,2007))ثلاضولاي ث ؽه ث٠س ثغجدضز ثو

لا Test for Glycosidesانكشف ع انكلاكىطذاد:ثبنثب

1ص ثىثدز -:KellarKiliani testو١ش-وف و١-3

5 ثضن ف 3

فج

لطر 2 ،ده ثقي دجضؼجي فج عؾ ع ث١ف Glacial acetic acidثن١ه ثغؾ

2 قي نفف ى٠و ثقو٠و٠ه،ىخ ث٠ؼ ف ثذدز ثمضذج فج٠ز ػ 3


52

فج ثىذ٠ض١ه ثو،صى ثف جة ث ثذ ٠وي ػ ؽه

.((Kokateet al.,2009ثىلا٠ى١و

لا :انكشف ع انصبثىبد:-راثعب

:(2008, محمد ) ص ثضنوث ثىفجس ثضج١ز ىف ػ ثجد١جس

10ص ثجفز -:Foam testوف ثغر -13

ثضن ف ثذدز ثمضذج ػ دور

.، صى غر و٠ور ٠وي ػ ؽه ثجد١جسVortexدجضنوث ؽج

1ص ػ -:mercuric chlorideوف و٠و ثةذك -23

% 1 ثضن غ

.، صى ثخ ثد١ ٠وي ػ ؽه ثجد١جسHgCl2قي و٠و ثةذك

:وانزببد انكشف ع انفىلاد:الا خبيض

Test for phenolic compounds and tannins

ص ثىف ػ ؽه ثوذجس ثف١١زثضج١جس ف ثضنجس ثقر دجضنوث

:Treare and Evans,1985))ثىفجس ثضج١ز

1ص ػ -:Ferric chloride testوف و٠و ثقو٠و٠ه-13

0.5 ثضن غ 3

صى ثم ق ٠وي ػ ؽه ثوذجس ثف١١ز ث .قي و٠و ثقو٠و٠ه% 1

.ف ف١ ث صى ثخ د ٠وي ػ ضجةؼ وجىدز. ثضج١جس

1ص ػ -:Lead acetate testوف ملاس ثج -23

ثضن غ دغ

صى ثخ ثد١ لا ٠وي ػ ؽه ثوذجس .ملاس ثج% 1لطثس

.ثف١١ز

ص ػ و١جس ضج٠ز ثضن قي -:Gelatin testوف ثؾلاص١-3

100غ ثؾلاص١ ف 1ف دجىثدز]ثؾلاص١3

قي و٠و ثه٠ % 10

.صى ثخ ثد١ ٠وي ػ ؽه ثضج١جس.[

Peach and) )طريقة ت بعات Test for Flavonoidsانكشف ع انفلافىبد:الا طبدص

Tracey , 1956; Sofowara,1993ثقر ضنجسف ثثفلافجسعنكشف الي ف

: فخ ثىثف ثضج١ز


53

لطثس فج ث١وو٠ه ث 5-3ص ثجفز -:Shinoda’s testوف هر-1

13

Magnesium ثضن ػ ؽ١وث ع ث١فش لطؼز غ١ر ٠٠ ثغ١

ribbon. صى ثف ٠وي ػ ؽه ثفلافجس.

1ص ػ -:Ferric chloride testوف و٠و ثقو٠و٠ه-23

-4 ثضن غ

53

blackishصى ث ثلاف ثه.قي و٠و ثقو٠و٠ه ثضؼجهي ثلا ث١وؽ١

red ٠وي ػ ؽه ثفلافجس.

ص ثجفز دغ لطثس ثقي ثجة -:Lead acetate testوف ملاس ثج-3

1ثمجػو نلاس ثج ث 3

صى ثخ ثف جة ث ثذ دىغر . ثضن

.٠وي ػ ؽه ثفلافجس

ص ػ و١جس ضج٠ز ثضن قي -:Alkaline reagent testثىف ثمجػو -4

ىذش ػ لز ص١ـ ع Ammonium hydroxideنفف ١وو١و ثلا١

Fluorescenceصى . U.V. lightفقش صقش و ة لاؼز فق ثذفؾ١ز

color٠ؼو ؤث ؽه ثفلافجس .

لا :انكشف ع انكىيبر:-طبثعب

ف١ظ ص غ Na OHص ثىف ػ ثىج٠ دجضنوث وف قي ١وو١و ثه٠

10 3

ثضن ثنفف دججء ثمط ف ثذدز ثمضذج غط ثلاذح دلز ص١ـ

غر ذمج دقي ١وو١و ثه٠ ثنفف ثغ، صى ثف ء

Yellow fluorescence ػ لز ثض١ـ ػو فقج صقش و ة لاؼز فق

.Rizk,1982))ثذفؾ١زج٠وي ػ ؽه ثىج٠

Test for alkaloids:انقهىذاد عانكشف-الا ثبي

ص ثؽثء ثىف ػ ثم٠وثس دجضنوث ثىفجس ثضج١ز فــخ

:(Harborne, 1985 ; Kokateet al., 2009):٠مـــز

:Mayer’’s testوف ج٠-1

: [أ ح ]ص صق١ ق١ -

60 ف mercuric chloride غ و٠و ثةذم١ه1.4ص ثىثدز -أ3

. ثجء ثمط


54

10ف potassium iodide غ ٠ه٠و ثذصج١ 5ص ثىثدز -ح3

. ثجء ثمط

ثو ثقؾ ث فو ثؼلاز ف ل١ز فؾ١ز ؼز [ح أ ]ص ػ ولا ثق١

1003

.

1-2ص ػ -3

5 ثىجف غ 3

ثضن ،ظ ثخ ثف دجش هلاز

. ػ ؽه ثم٠و

:Dragendorff’s testوف هثىوف-2

: [أ ح ]ص صق١ ق١ -

2 غ ضثس ثذط ف 0.6ف دجىثدز-أ3

فج % 20

. ثنففHydrochloric acidث١وو٠ه

15 غ ٠ه٠و ثذصج١ ف 6ف دجىثدز-ح3

. ثجء ثمط

7 غ ثجفز [أ ح ]لذ ثؽثء ثىف ص ػ ثق١ 3

فج ث١وو٠ه

400ثو ثو ثقؾ ث 3

.دججء ثمط ف ل١ز فؾ١ز

1ػ-3

1 ثضن غ 3

صى ث ثذصمج ث ثخ ثف ٠وي ػ . ثىجف

.ؽه ثم٠و

:Wagner’s testوف و-3

20 غ ٠ه٠و ثذصج١ ف 2ف ثىجف دجىثدز-3

ثجء ثمط، دؼوج ص ثجفز

100 غ ث١ه فن ث٠ؼ ؽ١وث ع ثو ثقؾ ث 1.33

دججء ثمط ف ل١ز

.فؾ١ز

1 لطثس ثىجف ث 5-4ص ثجفز -3

ثضن، صى ثخ ثف جة ث

.ث ثذ ٠وي ػ ؽه ثم٠و

ص ثجفز دغ لطثس ثىجف ثضى قي ذغ -:Hager`s testوف جؽ -4

1 ث Picric acid فج ثذى٠ه3

ثضن، صى ثخ ثف ١٠ ث

.ؽه ثم٠و

1ص ػ -:Tannic acid testوف فج ثضج١ه-53

0.5 ثضن غ 3

.صى ث ثلاف ثذجش ٠وي ػ ؽه ثم٠و. فج ثضج١ه% 10قي

Serum examinations:انفحىصبد انصهخ-7.3


55

رقذز فعبنخ اشى انفىطفبرش انحبيض انكه وانفىطفبرش انحبيض -1.7.3

Determination of total acid phosphatase TACP and PAPانجزوطزبر

activity

:ذوأ ثط٠مز-أ

دجلاػضجه ػ ثط٠مز ث١ز ؼور ثضق١ ثؾجر TACP PAPص صمو٠ فؼج١ز ث٠

Naphthyl-1 ػ صق١ ثجهر ثلاجTACPثض صؼضو ػ ذوأ لجد١ز ث٠

phosphate فغي فخ ثؼجهز ثضج١ز-1 ث ففجس :

ACP

1- Naphthyl phosphate +H2O Phosphate + 1-Naphthol

-Chloro-2-4،دؼو صفجػ غ Azo dye ث ذغز ثلا naphthol-٠1ضقي دؼوج

methylphenyl diazonium salt-FRTRفخ ثضفجػ ثضج :

1-Naphthol + FRTR Azo dye

ج١ض ضمو٠ فؼج١ز ثلا٠ 450ص ل١ج ور ث ثضى ػو ثطي ثؽ

(Junge,1993).

:ثقج١ ثضنوز- ح

:صضأف ثؼور ثؾجر ثقج١ ثضج١ز

٠citrate bufferضى قي ثضثس ثظ :Buffer solutionثقي ثظ -1

.pH=5.2ض ى ثل ث١وؽ١ / ي100دضو١

Naphthyl phosphate -1ج٠ىي ٠145قض ػ : Substrateثجهر ثلاج -2

.FRTRج٠ىي ـ 12

٠pH=5.2 135ضى قي ثضثس ثظ :Tartrate solutionقي ثضصثس-3

.ض ثضصثس/ ي

٠ضنو Acetic acidض فج ثن١ه/ ي٠0.7ضى :Stabilizerثغذش -4

.قفع فؼج١ز ثلا٠ ػو م ثؼ١ز


56

:صق١ ثقج١-ػ

: صWorking solutionsلذ ثؽثء ثفق صق قج١ ثؼ

153ىه دأىثدز ػذر ثفور ػذثس ثجهر ثلاج ف :(RA)قي ثجهر ثلاج -أ

. قي ثضثس ثظ

ىه دئىثدز ػذر ثجهر ثلاج ف :PAP(RB)قي ثجهر ثلاج م١ج فؼج١ز ث٠ -ح

. قي ثضصثس153

:٠مز ثؼ-ه

لذ ثؽثء ثذوء °25 ػو هؽز RA RBص ثقفجظ ػ هؽز فثر عجدضز ق -

:دضمو٠ فؼج١ز ثلا٠ فك ثط٠مز ثضج١ز

RA RB انحبنم

ج٠ى١ض100 ج٠ى١ض100 ثو

RA 1.0قي 3

-

RB - 1.0قي 3

هلجةك 5هلجةك ثلاجفز، ع دؼو 5 دؼو A1ؽش ثقض٠جس ؽ١وث، لأس ثلاضج١ز

.A2ثم ضؾ١ ثلاضج١ز ثغج١ز

:ثقجدجس-ـ

: دجلاػضجه ػ ثؼجهلاس ثضج١زTACP PAPصقخ فؼج١ز -

-TACP activity (U/L) = ∆ARA* X 149

*∆ARA= A2 – A1

- PAP activity (U/L) = ∆ARB* X 149

*∆ARB= A2 – A1


57

:الأنشاثطزقخ رقذز انظزضذ انجزوطزبرىبنىعى-2.7.3

Determination oftotal Prostatic Specific Antigen (tPSA) by ELISA.

ثي صو١ ثضو ثػ ثذضجص١ف ىف ػ ثضق١ ثؾجرثضنوش ػور

. ELISAثذ٠ز دط٠مز ثمضذج ث١ث

:ثقج١ ثضنوز-أ

: ثىجس ثلاص١ز ؽجر ػور ثيثيصضأف

٠ضأف ش ػذثس و ثفور صق ػ صو١ : ثضو ثػ ذضجس-1

:صذز وجلاصPSAؼ١ ضو ثـ

F E D C B A

100ng/ml 50ng/ml 25ng/ml 10ng/ml 5ng/ml 0ng/ml

. 2-8ف هؽز فثر س ثؼذثس ثش ففع

٠13ق :PSA Enzyme solution(PSA) ـقي ثلأ٠. 23

.

-Streptavidin Coated Microplate )٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ثىر دجضدضجفج٠و٠.3

96-wells) :ىر ثوثم دذص١ ثض٠ذضجف١و٠

٠20ق : Concentrate washing solution ثو قي ثغ.43

٠7ق :Substrate –A أ –ثجهر ثلاج . 53

دجػ غ١

. 2-8ففظف هؽز فثر , Tetramethylbenzidineثذج٠و٠

٠7ق : Substrate –B ح –ثجهر ثلاج . 6 3

Hydrogenد١و١و ث١وؽ١

peroxide(H2O2) , 2-8ففظف هؽز فثر .

٠8ق:Stop solutionثقي ثلف ضفجػ . 73

HCl فج ث١وو٠ه

. 2-8ففظف هؽز فثر , لا1ػ١ج

:طزقخ انعــم-ة

لأؽثءدؼو ي ىجس ثؼور ث هؽز فثر ثغفز ثصذؼش ثنطثس ثلاص١ز

: (Stenmanet al ., 1991 ) ثلامضذج دقخ ثضؼ١جس ف ثر ثثفمز ؼور ثفق


58

. ػ طـ خ ض ٠قز ثضنجف١ف ثول١مزعذضش . 1

ج٠ى١ض ث ى ػ١ز ثه فقج ف فف ٠قز ثضنجف١ف ثول١مز 25غ . 2

ج٠ى١ض قي 25صوش ثقف ثش ثلا فجغز ، ثس ثى غ ف١ج

. (A, B,C,D,E,F) ثؼذثسثضو ثذضجصىجػ فخ ثضص١خ

ث و ثقف ثض صق ثؼ١جس (PSA)وجف ثلا٠ ج٠ى١ض 100أ١ف . 3

.ثقض٠ز قي ثضو ثػ ثذضجص

هل١مز 30ع غط١ش فش ورور, هل١مز 20-30 ؽش ثقض٠جس دقوز هثة٠ز ور . 4

.دوؽز فثر ثغفز

فغ دؼوج غطجء ث٠قز ، ثؽ٠ش ػ١ز ثغ دقخ قض٠جس ثقفؽ١ؼجلذش دؼوج . 5

ج٠ى١ض قي ثغ 100 در وجز دـ تشع , ث٠قز ػ ق ثجف

20ث١ف)ثق 3

1000 قي ثغ ثو ث 3

وس ، ( جء مط

. علاط ثس ػ١ز ثغ

ث ػذر Aث١ف قي ثجهر ثلاج )ثؼ جهر ثلاج ثق ث١ف قي . 6

/ ج٠ى١ض100 دموث 2-8 ؽش ففظش دوؽز فثر Bقي ثجهر ثلاج

غ ثػجس ػو ثػ هل١مز ف هؽز فثر ثغفز15ففر ع فش ث٠قز ور

. دؼو أجفز ثجهر ثلاج

ج٠ى١ض ثقي 50دؼو إجء ثور ث١ز ألف ثضفجػ ف ؽ١غ ثقف دئجفز . 7

. عج١ز15-20 ور ثلف ضفجػ ، فوش ث٠قز دؼو ىه ػ قض٠جس ثقف

. ص٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ػ ؽج ثمجءغ. 8

هل١مز 30 ج١ض ملاي 450لو ؼج ثلاضج ى ففر ػو ي ؽ . 9

ه٠ج ضو ثذضجس ثػثي صضجخ ملا صثو١ tPSAص فجح صو١ . 10

. ثق ثم١ج غ ثلاضج١ز

الأنشارقذز هزيى انشحى انخصىي ثطزقخ -3.7.3

Determination of testosterone-Testo by ELISA

صو١ ثق ثن٠ف ىف ػ ػور ثضق١ ثؾجرثضنوش

. ELISAثي ثذ٠ز دط٠مز ثمضذج ث١ث


59


: ثىجس ثلاص١ز ؽجرػور ثيثيصضأف

TestoTesto Calibrators : ( 1ml/vial )ثقج١ ثم١ج١ز ـ - 1

Testo Enzymesolution: ( 1ml/vial )ثضضض١قي ثلأ٠ -2

TestoTesto conjugated Buffer:7ثقي ثظ ثمض ـ -33

Testo Biotin solution: 7قي ثذج٠ص١ ثضضض١-43

.

-Streptavidin Coated Microplate ).٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ثىر دجضدضجفج٠و٠-5

96-wells) ىر ثوثم دذص١ ثلاض٠ذضجف١و٠ .

Concentrate Washing solution 20 ثوقي ثغ-63

٠7ق : Substrate –A أ –ثجهر ثلاج -73

دجػ غ١

. - 28ففظف هؽز فثر , Tetramethylbenzidineثذج٠وث٠

٠7ق : Substrate –B ح –ثجهر ثلاج -83

hydrogenد١و١و ث١وؽ١

peroxide ,28ففظف هؽز فثر - .

٠8ق :Stop solutionثقي ثلف ضفجػ -93

HCl فج ث١وو٠ه

. - 28ففظف هؽز فثر, ػ١ج1ػ١ج

:٠مز ثؼ -ح

دؼو ي ىجس ثؼور ث هؽز فثر ثغفز ثصذؼش ثنطثس ثلاص١ز لاؽثء ثلامضذج

: (Tieiz , 1995) دقخ ثضؼ١جس ف ثر ثثفمز ؼور ثفق

. ػ طـ خ ض ٠قز ثضنجف١ف ثول١مز. 1

٠قز ثضنجف١ف ج٠ى١ض ث ى ػ١ز ثه فقج ف فف 10ع . 2

ثقج١ ج٠ى١ض 10 فجغز ، ثس ثى غ ف١جثش ثلاصوش ثقف ثول١مز

.( vials A ,B ,C ,D ,E ,F ,G) ثؼذثس فخ ثضص١خ Testoثم١ج١ز ـ

0.73دججفز )قي ثؼ ثضضض١ ثق ج٠ى١ض 50أ١ف . 3

Testoثقي ثظ ثمض ـ ث ػذر ثضضض١قي ثلأ٠

ث و ثقف ثض صق ثؼ١جس ثقج١ ثم١ج١ز ( - 28ففظش دوؽز فثر

.Testoـ


60

. هل١مز 20-30 ؽش ثقض٠جس دقوز هثة٠ز أفم١ز ور . 4

ؽش ثقض٠جس ,ج٠ى١ض قي ثذج٠ص١ ثضضض50١أ١ف . 5

هل١مز دوؽز فثر 60ع غط١ش فش ور, هل١مز 20-30دقوز هثة٠ز أفم١ز ور

.ثغفز

فغ دؼوج غطجء ث٠قز ، ثؽ٠ش ػ١ز ثغ دقخ قض٠جس ثقفؽ١ؼج لذش دؼوج . 6

ج٠ى١ض قي ثغ100ع تش در وجز دـ , ث٠قز ػ ق ثجف

20دججفز)ثق 3


وس ، ( جء مط

. علاط ثس ثم ػ١ز ثغ

ث ػذر Aأجفز قي ثجهر ثلاج )ثؼ جهر ثلاج ثق ث١ف قي . 7

/ ج٠ى١ض 100 دموث 2-8 ؽش ففظش دوؽز فثر Bقي ثجهر ثلاج






. هل١مز 30 ج١ض ملاي 450لو ؼج ثلاضج ى ففر ػو ي ؽ . 10

. Testoـ لوس ل١ ثلاضج قف ثقج٠ز ػ ثقج١ ثم١ج١ز. 11

.ص فجح صو١ ث ثق ثم١ج-12

:الأنشا ثطزقخ LHرقذز هزيى -4.7.3

Determination of LH hormone by ELISA.

ثي ثذ٠ز ف LHصو١ ىف ػ ثضق١ ثؾجرثضنوش ػور

. ELISAدط٠مز ثمضذج ث١ث



LHLH Calibrators : 1ثقج١ ثم١ج١ز ـ -13

LH Enzyme Reagent : 13(LH)قي ثلأ٠ -23


61

-Streptavidin Coated Microplate )٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ثىر دجضدضفج٠و٠-3

96-wells) ىر ثوثم دذص١ ثلاض٠ذضجف١و٠ .

Washing solution Concentrate: 20 ثوقي ثغ-43


ففظف , دجػ غ١ ثذج٠وث٠

. 2-8هؽز فثر

٠7ق : Substrate –B ح –ثجهر ثلاج - 63

hydrogenد١و١و ث١وؽ١

peroxide(H2O2) , 2-8ففظف هؽز فثر .

٠8ق :Stop solutionثقي ثلف ضفجػ -73

HCl1 فج ث١و١ه

. 2-8ففظف هؽز فثر , ػ١ج

:٠مز ثؼ -ح


:(Lentonet al ., 1982 )دقخ ثضؼ١جس ف ثر ثثفمز ؼور ثفق

. ػ طـ خ ض ٠قز ثضنجف١ف ثول١مزعذضش . 1

٠قز ثضنجف١ف ج٠ى١ض ث ى ػ١ز ثه فقج ف فف 50غ . 2

ثقج١ ج٠ى١ض 50 فجغز ، ثس ثى غ ف١جثش ثلاصوش ثقفثول١مز

.( vials A ,B ,C ,D ,E ,F) ثؼذثس فخ ثضص١خ LHثم١ج١ز ـ

ث و ثقف ثض صق ثؼ١جس LHوجف ثلا٠ ج٠ى١ض 100أ١ف . 3

.LHثقج١ ثم١ج١ز ـ

هل١مز 60ع غط١ش فش ور, هل١مز 20-30 ؽش ثقض٠جس دقوز هثة٠ز أفم١ز ور . 4




20دججفز)ثق 3


وس ، ( جء مط

. علاط ثس ثم ػ١ز ثغ


/ ج٠ى١ض100 دموث ( 2-8 ؽش ففظش دوؽز فثر Bقي ثجهر ثلاج


62







.ص فجح صو١ ث ثق ثم١ج. 10

:الأنشا ثطزقخ FSHرقذز هزيى -5.7.3

Determination of FSH hormone by ELISA .

ثي ثذ٠ز دط٠مز ف FSHصو١ ىف ػ ثضق١ ثؾجرثضنوش ػور

. ELISAثمضذج ث١ث



FSHFSH Calibrators : 1ثقج١ ثم١ج١ز ـ - 13

13 : (LH)قي ثلأ٠ -23

Streptavidin Coated ).٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ثىر دجضدضفج٠و٠-3

Microplate-96-wells) ىر ثوثم دذص١ ثلاض٠ذضجف١و٠ .

Washing solution Concentrate: 20 ثوقي ثغ-43



. 2-8هؽز فثر

٠7ق : Substrate –B ح –ثجهر ثلاج -53

, (H2O2)د١و١و ث١وؽ١

. 2-8ففظف هؽز فثر

8 ٠ق :ثقي ثلف ضفجػ -63

, 1N ػ١ج HCl فج ث١وو٠ه

. 2-8ففظف هؽز فثر


63

:٠مز ثؼ -ح


: ( Berger et al ., 1996 )دقخ ثضؼ١جس ف ثر ثثفمز ؼور ثفق

. ػ طـ خ ض ٠قز ثضنجف١ف ثول١مز عذضش . 1

٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ج٠ى١ض ث ى ػ١ز ثه فقج ف فف 50غ . 2

ثقج١ ج٠ى١ض 50 فجغز ، ثس ثى غ ف١جثش ثلاصوش ثقف

.( vials A ,B ,C ,D ,E ,F) ثؼذثس فخ ثضص١خ FSHثم١ج١ز ـ

ث و ثقف ثض صق ثؼ١جس FSHقي ثلا٠ ج٠ى١ض 100أ١ف . 3

.FSHثقج١ ثم١ج١ز ـ



فغ دؼوج غطجء ث٠قز ، ثؽ٠ش ػ١ز ثغ دقخ قض٠جس ثقفؽ١ؼج لذش . 5

ج٠ى١ض (100)ع تش در وجز دـ , دؼوج ث٠قز ػ ق ثجف

20دججفز) ثق قي ثغ3


جء مط

. علاط ثس ثم ػ١ز ثغوس ، (


/ ج٠ى١ض 100 دموث ( 2-8 ؽش ففظش دوؽز فثر Bقي ثجهر ثلاج







.ص فجح صو١ ث ثق ثم١ج-10


64

:الأنشا ثطزقخ انجزولاكزرقذز هزيى -6.7.3

Determination of prolactin hormone by ELISA .

ثي ثذ٠ز دط٠مز ف PRLصو١ ىف ػ ؽجرثضنوش ػور فق

. ELISAثمضذج ث١ث



PRLPRL Calibrators : 1ثقج١ ثم١ج١ز ـ - 13

PRLPRLEnzyme solution : 13قي ثلأ٠ -23

Streptavidin Coated ).٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ثىر دجضدضفج٠و٠-3

Microplate-96-wells) ىر ثوثم دذص١ ثلاض٠ذضجف١و٠ .

20 : ثوقي ثغ-43

٠7ق : Substrate –A–ثجهر ثلاج -53


. 2-8هؽز فثر

٠7ق : Substrate –B–ثجهر ثلاج - 63

ففظف , (H2O2)د١و١و ث١وؽ١

. 2-8هؽز فثر

٠8ق ثقي ثلف ضفجػ -73

ففظف , 1N ػ١ج HCl فج ث١وو٠ه

. 2-8هؽز فثر

:٠مز ثؼ -ح


: (Pasiniet al ., 1985)دقخ ثضؼ١جس ف ثر ثثفمز ؼور ثفق

. ػ طـ خ ض ٠قز ثضنجف١ف ثول١مز عذضش . 1

٠قز ثضنجف١ف ثول١مز ج٠ى١ض ث ى ػ١ز ثه فقج ف فف 25غ . 2

ثقج١ ج٠ى١ض 25 فجغز ، ثس ثى غ ف١جثش ثلاصوش ثقف

.( vials A ,B ,C ,D ,E ,F) ثؼذثس فخ ثضص١خ PRLثم١ج١ز ـ

ث و ثقف ثض صق ثؼ١جس PRLقي ثلا٠ ج٠ى١ض 100أ١ف . 3

.PRLثقج١ ثم١ج١ز ـ




65



20دججفز)ثق 3


ػ١ز وس ، ( جء مط

. علاط ثس ثم ثغ


/ ج٠ى١ض 100 دموث ( 2-8 ؽش ففظش دوؽز فثر Bقي ثجهر ثلاج







.ص فجح صو١ ث ثق ثم١ج.10

: عهى انحىابد انخزجزخ دراطخ إيزاضخ طفه انشعزاد انهجهخ-8.3

: رهئخ انحىابد انخزجزخ وركبثزهب- 1.8.3

Preparation of animals and reproduction

ثفتث ثنضذ٠ز ثذ١ إ ثق١ثجس ثنضذ٠ز ثض ثضنوش لأغث ثضؾجح

ثقي ػ١ج ثوز ثض (Balb/c) لاز Musmusculus أ ٠ ص

جثء، ػ ػو ثمض١جج مج ثؼججس / ثؼجز جػز ثلأه٠ز ثضجس ثطذ١ز

- ثظجر ثلأث ، دؼو مج إ لغ ثؼ ف نضذثس ل ػ ثق١جر و١ز ثضد١ز

ا . جثء ػش ثفتث ػ ؾج١غ لأغث ثضىجع إضجػ ثفتث ثطدز ػثا ج

ش ثفتث دثلغ علاط إجط غ ىو لأغث ثضؾجح ثلافمز ١ز فضر ثذقظ ،يث ل

(13×13×30)ثفو ف ألفج ؼز دلاض١ى١ز ىثس أغط١ز ؼو١ز ذىز أدؼجهج 3

فش أ١ز ثلألفج دجر .North kent plastic cages Englandإضجػ وز

ا غ ثؼج٠ز دجظجفز ثضؼم١ . ثنخ ثنج١ز ثثه ثجر ػ ثضذوثج أذػ١ج

ثور º25ففظش ثلألفج ف ىج صفس ف١ ثظف ثلاةز هؽز فثر

جػز ظلا هس دججء ثؼ١مز ثنجز ثض صضى 12 جػز ء 12ثة١ز


66

ف١خ ؾفف % 10دص١ ف١ث ، % 10ىر ، % 25ؼ١ ، % 20فطز ، % 34)

م و أغ فج إ لف ف ضف١ , (ـ ؼج ، ف١ضج١جس% 1، دؼو ىه ص

دؼو ثفطج فش ثيو ػ ثلإجط ف ألفج . ظف أوغ لاةزا لاهر ثلإجع

ثلألفج غ ألفج ثضىجع ف١ظ جر ثنخ ثض٠و دججء ثغيثء ػشأم

ثهر ثيو مؼش ثفتث ؼج٠ز ثثلذز ث١١ز فض ثقي ػ .ثض٠

.(Terry et al.,1996)دجلأػج ثلأث ثطدز

: رصـــى انزجبرة-2.8.3

فأ ف و 5 غ دذز 25- 30 ثيودؼ ٠ ىثس 60ؼش

, . Barrio et al)ؾج١غ ثضج١زلش ثؾج١غ ثػضجهث ػ ٠مز ثفوثط ثلاجدز ث ثلف

2002) :

10 دضو١(Intrapereationial)إجدز فهر هثم ثذ٠ض )ثؾػز ثلأ - أ5

)

( قي ثـ ثفؾ 0.53فمش هثم ثذ٠ض دـ )ؾػز ث١طر ثلا - ح

10دضو١ (Subcutaneous)ثجدز فهر صقش ثؾو )ثؾػز ثغج١ز - س5

)

( قي ثـ ثفؾ 0.53دـ فمش صقش ثؾو )ؾػز ث١طر ثغج١ز - ط

10إجدز هؽز أفوعش )ثؾػز ثغجغز - ػ5

10 هثم ثذ٠ض 5

( صقش ثؾو

قي ثـ 0.253فمش هثم ثذ٠ض صقش ثؾو دـ )ؾػز ث١طر ثغجغز - ؿ

(ثفؾ

0.5فأقمز دـ 10ثفضس و ؾػز ػ 3

ػجك ث٠ ثػ ثقج ػ

0.25ثطف١ ، ثؾػز ثغجغز فمش دـ 3

. ػجك ث٠ ثػ ثقج ػ ثطف١

: قزم انحىابد ورشزحهب-3.8.3

ثلاجدز 15 ف ث١ Ether لضش ثيو ثؾج١غ ثلأدؼز ث١طر ػ ٠ك ثلأ٠غ

ؼش ثفتث دؼو لضج ػ ق ص٠ـ عذضش أثفج ثلأج١ز ثنف١ز دثطز هدجد١ ,

ؼش ثلأػجء ثضنؽز ف ذك دض ثم١خثذضجس ثن،ص ثضنثػهل١مز

. ففجس ثظ٠قض ػ قي ثي

PBSPreparation Phosphate buffer saline-صق١قي ثففجس ثظ -

ف ثجء ثمط ذ٠ ص صق١ ثقي دػ ثقض٠جس ثثهر ف ثؾوي أهج

: ىجص رثؤو ػم دؾج 7.2ثوثز ثقج١ز ػو


67

ثى١ز ثثه

غ 9و٠و ثه٠

غ 0.795 ففجس ثه٠ عجة١ز ثمجػو٠ز

غ 0.144 ففجس ثه٠ أفجه٠ز ثمجػو٠ز

990 جء مط3

Fixationانزثجذ-9.3

صغذ١ش ثلاػجء ذجر دؼو ص٠ـ ثفتث ؾج١غ ث١طر دغذش ثفج١ ص

ف ثقي , جػز24 ور Buffered Neutral Formalin Solutionثضؼجهي ثوثا

. (1998ثقجػ ، )ثضنو ف ثضغذ١ش دجلاػضجه ػ ثط٠مز ثيور ف

Buffered Neutral Formalin Solutionقي ثفج١ ثضؼجهي ثوثا-

ـــ 100 ـــ ف3

(900) (%40%-36)٠ ـــث١ دضنــ ثف3

Sodium phosphate غ ففجس ثه٠ أفجه٠ز ثمجػو٠ز 40ثجء ثمط

monobasic 6.5ه٠ز ـــثة١ز ثمجعـــ غ ففجس ثه٠ عSodium phosphate

dibasic (1998 , ثقجػ) .

: Preparation of tissue sectionsيقبطع انظجخرجهش ال-10.3

ــس ثمجــغ ثؾ١ز ثؾـــ٠ز ثػضـــجهثا ػــــ ثط٠مز ثيور ف ثقجػ )ف

غ١ر ف١ظ , (1998، ا ؼش ف لج ص أمي لطغ غ١ر ثلأػجء ثيور آفج

ع غش ثمجغ . جػز24 ور (ثفج١ ثضؼجهي ثوثا)فس ػ ثقي ثغذش

س ثؼ١جس د. هل١مز15ثؾ١ز دجء ثقف١ز ضن ثقي ثغذش ثفجة ور ر ي

جػجس 2-4 ور (%100 % 90 % 70 % 50)صجػو٠ز صثو١ ثىقي ثلأع١

ا دغلاط ثف ثث١٠ دؼوي جػض١ ف و Xyleneف و صو١ س أ٠ج

س دغلاط ثف غ ثذثف١ ى هؽز Paraffin waxفز غ ثض٠ك ع

س ثؼ١جس. ٠خ غ ثضº 60 ور جػض١ ف و فز دوؽز º 60-56ثج

ا ف ف دجضنوث غ دجثف١ ف ثغ ثضنو ف ػ١ز ثض٠خ ػج

ف هؽز ، ث١جدج١زTiyoda وز Wax Dispenserثغ ث دػجء ص٠غ ثغ

ع ثضؼش لثخ ؼو١ز ف١ز مجز خ ، فج لجخ دلاض١ى ◦ 60فثر


68

Embedding cassettes قي ػ لثخ ثغ ثطدز ثقج٠ز ػ ثىػ ، دؼو

. صقو٠و ثلاصؾج ثطح مطغ ثجىػ ف ثمثخ أػلا

ا عذضش ػ ؽج Trimmingيدش لثخ ثغ ا هل١مج ثض صقض ػ ثمجغ صي٠ذج

ن ر دــ لطؼش غ ثقي ػ ثةـ ؾMicrotomeثؿ ثوث ــث

فش ثلأز ثمطػز دجز فجر غ١ر ػ ثةـ ؽجؽ١ز دؼو ػ . ١ضج٠ى4

، دؼوج ؼش ثثةـ (Albumin Mayer's)قز مف١فز ػ١ج آؿ ثلأذ١ ج٠

ف ثمجغ صطقج، صوش º 40-45ػو هؽز (Hot plate)ػ ٠قز جمز

. جػز ف هؽز فثر ثغفز ضؾف48ثثةـ ور

Preparation Albumin Mayer'sآؿ ثلأذ١ ج٠صق١

(50)٠ضى 3

ص١ق دجز لطؼز ج – د١ج – آؿ ثذ١ ثي ص

(50)ثس ػو٠ور ثجف إ١ 3

غ ثغج٠ي (1) (Glycerin)و٠١

(Thymole - جغ ضؼف) ق١جلاضؼجي ففع ف ثغلاؽز .

Stainingانصجغ-11.3

س ثمجغ ف ثث١٠ لإىثدز ثغ، دؼوج ف ز صثو١ صج١ز ثىقي

ج هل١مضج مش إ ثجء % 30 % 50 % 70 % 90 % 100ثلأع١ ور و

ثةك، غش دجء ـــ هق5دؼوج ذغش ثمجغ ف قي ث١جصو١ ور . ثمط

Bluing هل١مز فض ثي ج ظ ثلز ف١ج 5 ور Tap Waterثقف١ز

هلجةــك5هر ـــي ـــ ثؼـــس ف قي ث٠ــغ. % 70لاع١ لادجىقس ــغ

س دز صثو١ صجػو٠ز 5ثؾج ور ثقف١ز دؼوج غش دجء هلجةك، ع

ج هل١مز إ هل١مض١ (%100 % 90 % 70 % 50 % 30)ثىقي ثلأع١ ور و

س ف ثث١٠ ض٠مج فش د٠ جهر – Distrene-Plastizer-Xylene)دؼوج

D.P.X) (1998ثقجػ ، )ثؽ ـــثء ثػـــصذجغ٠ــغط .


69

Preparation of Harris's Hematoxilin ذغز ث١صو١ جصق١

:- (1998ثقجػ ، )ثضنوش ثمجه٠ ثلاص١ز ضق١ ثذغز

ثى١ز ثــــــجهر

غم١Hematoxylin 5.0جصو١ 3سمEthanol 50.0أع١ وقي

غمPotassium alum 100خ ثذصج١ غمRed mercuric oxide 2.5ثو١و ثةذك ثلاف 3سمGlacial acetic acid 40.0فج ثن١ه ثغؾ

3سمDistilled water 900جء مط

ر ـــف قي ثذغز دئىثدز ث١جصو١ ف ثىقي ثلاع١ ثطك ػ ج جها

أى٠خ ثخ ف ثجء ثمط ػ خ د غ ثقوز ثضر ع ص ◦ 50 – 55

قي ث١جصو١ ثىق إ قي ثخ ثجة ثوثفب مطج ؽ١وثا دجضث أ١ف

ه ثن٠١ فق خ د فض ثغ١ج ، دؼو إدؼجه ثن٠١ ثخ ص إجفز أو١و ثةذك د

ذجرا ف فج جة دجه أم١ث أ١ف فج ثن١ه ثغؾ ـ ثقي لذ

. ثلاضؼجي

Preparation of Alcoholic Eosinذغز ثلا١٠ ثىق صق١

:- (1998ثقجػ ، )ثضنوش ثمجه٠ ثلاص١ز ضق١ ثذغز

ثى١ز ثــــــجهر

غAlcoholic eosin Y 1.0 ث١٠ ث ثىق

Ethyl alcohol 993 (%70)وقي أع١

Glacial acetic acid 0.23 م١ه ثغؾثيفج

. أى٠خ ثلا١٠ ف ثىقي ثلاع١ ع أ١ف فج ثن١ه ثغؾ


70

:انفحص انجهزي نهقبطع انظجخ وانزصىز انجهزي-12.3

Microscopic study & Microscopic photography

إؽثء ثفق ثؾ مجغ ث ؽ١ز ثقر ثؼ١جس ثضنوز وثز ص

ثمضذج (Light Olympus \ Japan)دجضنوث ؾ ة دؼو صؾ١ ثلافظجس ص

-Sony-(Cyber-Shot)Model:Dsc]ثمجغ ثؾ١ز ض٠ دجضنوث وج١ث ل١ز ع

W630( 16.1 MP )Japan]ػ ثقجح ذجر ثضنوش جدؼز ز ع صد٠ (HP-

Deskjet F380-China) ػ١ز ذجػز ث ثؾ١ز ثنضجر سص ع .

Statistical analysis:انذراطبد الاحصبئخ-13.3

ض٠جس و ( ACP PAP )فؼج١ز ث٠جس ثذضجس يفش ثضجةؼ إفجة١ج

(ثذلاوضLH FSH١ثق ثن )ثضو ثذضجص ثػ ث

لش Minitabدأضنوث ثذجؼ ثلافجة (ANOVA)دضطذ١ك أمضذج صق١ ثضذج٠

Duncun'sثضطجس ثقجد١ز ضقو٠و ثفلجس دجضنوث ثمضذج هثى ضؼوه ثقوه

Multiple Range testدض أفضج١ز(P≤0.05) ( 2000, ثث).

/)????

/)????

/)????

Documents

Materials & Methods٧٭ٕ٨ا ٟئازيٶ داٷ٭٨ا 3