Manual Virología

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE VIROLOGA

Q.F.B

1

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

REA ESPECFICA DE: MICROBIOLOGA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGA CDIGO: FAR 315L FECHA DE ELABORACIN: MARZO 2002 NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO TIPO DE ASIGNATURA: DISCIPLINARIA PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIN:

M. C. Nidia Gary Pazos Salazar M. C. Maria Susana Prez Fernndez M. C. Oscar Prez Torz M. C. Alejandro Ruz Tagle M. C. Carlos Tllez Osorio M. C. Claudy Lorena Villagran Padilla

HORAS DE TEORA: 3 HORAS PRCTICA: 2 CRDITOS: 8


Q.F.B

2

INDICE

NMERO DE LA PRCTICA

TTULO DE LA PRCTICA PGINA

PRCTICA No. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGA.

3

PRCTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIN (HA) E INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES.

7

PRCTICA No. 3

PRUEBA DE HEMAGLUTINACIN (HA) PARA EL DIAGNSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.

12

PRACTICA NO 4 PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN (IHA) PARA EL DIAGNSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.

16

PRCTICA No. 5 HUEVO FRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLGICO PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIN DE VIRUS.

20

PRCTICA No. 6 ENSAYO DE LAS VAS DE INOCULACIN EN HUEVO FRTIL DE POLLO.

24

PRCTICA No. 7 REPLICACIN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR EN HUEVO FRTIL DE POLLO.

28

PRCTICA No. 8 TITULACIN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FRTIL DE POLLO.

28

PRCTICA No. 9 CULTIVOS DE CLULAS EUCARITICAS PARA LA REPLICACIN DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIN, PROLIFERACIN Y MANTENIMIENTO.

32

PRACTICA No 10 SEMINARIO: OBTENCIN DE UN CULTIVO PRIMARIO DE FIBROBLASTOS DE EMBRIN DE POLLO.

PRCTICA No. 11 PROLIFERACIN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2

37

PRCTICA No. 12 REPLICACIN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIN DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPTICOS.

40

PRCTICA No. 13 REPLICACIN DE BACTERIFAGOS LTICOS EN ESCHERICHIA COLI.

43

PRCTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA) EN EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES.

47

PRACTICA No 15 ENSAYOS INMUNOENZIMTICOS PARA EL DIAGNSTICO DE CITOMEGALOVIRUS, RUBOLA, HEPATITIS B Y HIV.

52

PRACTICA No 16 EVALUACIN FINAL


Q.F.B

3

PRACTICA NO. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

VIROLOGA

INTRODUCCIN

El conocimiento de las propiedades fisicoqumicas y de la infecto-

contagiosidad de los viriones, permite definir las normas que en materia de

seguridad, son necesarias para no correr ningn riesgo de adquirir an en forma

accidental, una infeccin por este tipo de partculas.

Con base en lo anterior, se enlistan a continuacin los reglamentos y normas

que habrn de seguirse en el Laboratorio de Virologa, con la finalidad de asegurar

la integridad fsica de los alumnos, as como para mantener una organizacin

adecuada para el desarrollo de las prcticas correspondientes.

La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se permitir el acceso al laboratorio.

Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Colocar todo los artculos personales en la zona lateral o en los cajones de

las mesa de trabajo.

Al iniciar y finalizar las prcticas, lavarse las manos con agua y jabn desinfectante.

Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, as como introducir algn objeto en la boca.

La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de utilizarla. Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo. Comunicarse con sus compaeros solo en la medida indispensable. Antes de iniciar la prctica, leer y recordar la metodologa a seguir de acuerdo

con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para

aclararlas.


Q.F.B

4

Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material, derramamiento de suspensiones virales, etc.).

Todo el material que se va a incubar o desechar, deber colocarse en el sitio indicado por el profesor.

Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de desecho no contaminado deber depositarse en los contenedores

correspondientes.

En forma previa a su lavado, siempre se deber desinfectar el material que se le proporcione en el laboratorio.

Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo, seccin, equipo, nombre del alumno, as como fecha de entrada y salida.

En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma

Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para

la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y

disposicin final de los Residuos Peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en

establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud.

En la NOM referida, se establecen adems definiciones de inters para los

laboratorios y reas de microbiologa, tales como:

Desinfeccin: Destruccin de microorganismos patgenos en todos los ambientes,

materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecnicos,

fsicos o qumicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de

transmisin de enfermedades.

Residuo peligroso biolgico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros

microorganismos con capacidad de causar infeccin o que contiene o puede

contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a

seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de

atencin mdica.

En adicin, se consideran residuos peligrosos biolgico-infecciosos los

siguientes:


Q.F.B

5

La sangre Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin,

as como los generados en la produccin de biolgicos

Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e

histolgico

Los residuos anatmicos derivados de la atencin a pacientes de los laboratorios

Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploracin y toma de muestras

Los objetos punzo cortantes usados o sin usar Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clnicas

durante el diagnstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas,

pipetas Pasteur, agujas hipodrmicas, de acupuntura y para tatuaje, bistures,

cajas de Petri, cristalera entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo

y similares.

Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, debern

ser tratados por mtodos fsicos o qumicos, los cuales:

Debern garantizar la eliminacin de microorganismos patgenos Debern volver irreconocibles a los residuos peligrosos biolgico-infecciosos Debern ser cremados, si se trata de residuos patolgicos.

El cumplimiento de las consideraciones sealadas con anterioridad, garantiza

la seguridad que deber observarse tanto para alcanzar los objetivos de las

prcticas, como para su desarrollo en condiciones aspticas.

Finalmente y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en

esta primera sesin de laboratorio se har nfasis en que a travs de las diferentes

prcticas, se utilizarn nicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas

para uso veterinario, con la finalidad de evitar el ms mnimo riesgo de infeccin

hacia los estudiantes.


Q.F.B

6

CUESTIONARIO 1. Con ayuda de un esquema especifique, cul sera el manejo que se la dara a

materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de

tejidos, desde que han sido utilizados para el anlisis de virus hasta su destino final.


Q.F.B

7

PRACTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIN (HA) E INHIBICIN DE LA

HEMAGLUTINACIN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES

Desde el descubrimiento de los virus, se identifico que de acuerdo a sus caractersticas moleculares, estos agentes requieren del empelo de modelos vivos

para su anlisis; esta condicin hace particularmente difcil implementar el uso de

sistemas adecuados como son el uso de animales de laboratorio o los modelos de

Clulas en Cultivo. De esta manera se hizo necesaria la bsqueda de alternativas

para el anlisis de virus que omitieran la necesidad de modelos vivos.

PRUEBA DE HEMAGLUTINACIN (HA). Inicialmente, la HA se aplic para el anlisis del virus Influenza, sin embargo

como explicaremos ms adelante, se puede aplicar para realizar ensayos sobre

cualquier virus con protenas estructurales con propiedades hemaglutinantes. El

nombre de Hemaglutinacin se debe al hallazgo de que los virus Influenza podan

aglutinar eritrocitos, posteriormente se determin que el origen de esta propiedad se

deba a la existencia de una glicoprotena presente en la envoltura viral a la cual se

le denomin como hemaglutinina.

Actualmente se sabe que una gran cantidad de virus poseen protenas

externas con estas caractersticas por lo que el mtodo tiene una amplia

aplicabilidad en el anlisis de diferentes entidades virales.

Tambin se descubri que la hemaglutinina tiene el papel de funcionar

precisamente como el ligando viral encargado de reconocer al receptor en las

clulas blanco. De manera general, el receptor corresponde a las molculas de

cido silico presente sobre la superficie de diversos tipos celulares, aun que

dependiendo del virus esta molcula puede estar enlazada en diferentes tipos de

enlaces qumicos.

A este respecto cabe resaltar que la funcin de la hemaglutinina no es

entonces aglutinar eritrocitos, ms bien es participar en el primer paso de la

replicacin viral que es la adsorcin, pero sus propiedades sirven para desarrollar la

prueba de HA que se utiliza como un ensayo in vitro.


Q.F.B

8

Para empezar a conocer la prueba de HA, se hace necesario describir las

ventajas y desventajas que ofrece.

Ventajas: Prueba sencilla de desarrollar. No requiere de una infraestructura complicada. Es econmica. Ideal cuando se manejan muestras con alta carga viral. Se aplica en los ensayos para la determinacin de la naturaleza qumica

de los receptores celulares.

Desventajas: Se emplea slo como diagnstico presuntivo. Existen agentes no virales que pueden causar HA. Es poco sensible. Genera falsos negativos.

El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la existencia

de virus con protenas con capacidad hemaglutinante que reconocen receptores

celulares. De esta manera los virus se unirn a los eritrocitos de la especie que sea

siempre que contenga en su superficie molculas de cido silico. La prueba se

representa en el siguiente esquema: | HEMAGLUTINACIN Para la realizacin de esta prueba se requiere tomar una muestra que

contenga virus, como ejemplo tenemos: stocks virales provenientes de lotes

vacunales o de cosechas obtenidas de clulas en cultivo; muestras de origen clnico

tomadas de acuerdo a la zona anatmica que afecta el virus, tal es el caso del virus

influenza donde la muestra a tomar corresponde a un lavado farngeo.

ERITROCITO

Virus con protenas Hemaglutinantes

ERITROCITO


Q.F.B

9

Para procesar la muestra se preparan diluciones seriadas al doble

empezando desde la dilucin 1:10 hasta la dilucin 1:1280 empleando como

diluyente una solucin amortiguadora de fosfatos. Posteriormente a cada dilucin se

le adiciona la misma cantidad de una suspensin de eritrocitos preparada al 1%.

Todo esto se realiza en tubos de fondo en U o en microplacas de fondo en U. Los

eritrocitos aglutinados sedimentarn en el fondo del pozo formando una red,

mientras los no aglutinados sedimentan por gravedad. De acuerdo a la forma del

pozo se forma una dona o un anillo en el centro. Los sedimentos se aprecian de la

siguiente manera:

PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

Una prueba de HA positiva implica la sospecha de un virus presente en la

muestra, sin embargo la determinacin exacta del virus involucrado en una patologa

es an incierta. Por esta razn como siguiente paso se debe aplicar una prueba que

permita la plena identificacin del tipo de virus, a este respecto se cuenta con una

prueba serolgica.

PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN (IHA) Para realizar un diagnstico definitivo se debe realizar una prueba que

demuestre una respuesta especfica del husped hacia este virus, dicha respuesta

est representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se

conoce como Inhibicin de la Hemaglutinacin (IHA).

Esta prueba se basa en la unin de un anticuerpo especfico hacia la

hemaglutinina del virin que impida la formacin de puentes entre el ligando viral y el

receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce

como neutralizacin vrica.

La prueba de IHA, puede representarse esquemticamente de la siguiente manera:


Q.F.B

10

Primera fase: Reconocimiento Ag-Ac.

Segunda fase: Interaccin con eritrocitos: demostracin de la IHA.

La existencia de anticuerpos que puedan reconocer a cepas virales

especficas permite diagnosticar plenamente que un virus en particular es el

responsable de alguna patologa. Esto basndose en un principio fundamental de

inmunologa: La presencia de anticuerpos en un hospedero es la consecuencia de

la exposicin previa al antgeno que induce entonces su produccin.

Para esta prueba la muestra es el suero del hospedero sobre el que se

realizan diluciones seriadas tambin con factor dos como en HA pero iniciando de la

dilucin 1:2 hasta alcanzar la de 1:256.

Cada dilucin del suero se incuba con 4 Unidades Hemaglutinantes de un

virus conocido, durante 10min. para permitir el reconocimiento.

ERITROCITO

NO EXISTE RECONOCIMIENTO

Virus con protenas

hemaglutinantes

Anti-HA

Neutralizacin viral


Q.F.B

11

Transcurrido este tiempo, se adiciona una suspensin de eritrocitos al 1 %. Al igual

que para HA la prueba se efecta en microplacas o tubos con fondo en U. De esta

manera los patrones de sedimentacin para los resultados positivos y negativos se

observan de la siguiente manera:



Q.F.B

12

PRACTICA No. 3

PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (HA) PARA EL DIAGNSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL NEWCASTLE

INTRODUCCIN.

Muchos virones animales posen en su envoltura protenas codificadas por el

genoma viral capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar

puentes entre los glbulos para constituir una red. Este fenmeno conocido como

Hemaglutinacin fue primeramente descrito para el anlisis del virus Influenza. En

este caso la protena hemaglutinante (hemaglutinina) en la superficie del virin es

una glicoprotena que en adicin de la Neuraminidasa se proyecta en la envoltura

viral. El virin se unir a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que lleve

los receptores complementarios que en este caso son molculas de Acido N-

AcetilNeuramnico.

El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los

Paramyxovirus; es un patgeno primario de aves en quienes produce infecciones

respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a

parlisis y muerte; en el humano puede ocasionalmente producir conjuntivitis

autolimitada.

Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar

aglutinacin, por lo que la Hemaglutinacin no es un indicador sensible de la

presencia de pequeas cantidaes de viriones pero por su simplicidad constituye un

ensayo conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones.

OBJETIVOS:

1. El alumno dominar el manejo de la tcnica de la reaccin de

Hemaglutinacin (HA).

2. El alumno determinar la concentracin de viriones presentes en una

suspensin, la cual expresar en Unidades Hemaglutinantes (UHA).


Q.F.B

13

MATERIAL Solucin reguladora de fosfatos SRF. Microplacas de poliestrireno con fondo en U. Espejo. Micropipetas de volmen variable de 20- 200 l. Puntillas para micopipeta. Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET) Suspensin de glbulos rojos al 1%. Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml. Solucin de Hipoclorito de Sodio. Alcohol y algodn. Tina para recolectar desechos.

METODOLOGA 1. Realizar con SRF una serie de diluciones del virus a partir de una suspensin

concentrada (vacuna viral), con factor de dilucin 2, desde 1:10 hasta 1:1280, de

acuerdo al esquema de la figura 1; incluir un tubo control que no contendr virus.

El proceso se describe a continuacin:

a Agregar al pozo No. 1 de la microplaca 180 l de SRF y del 2 al 9 agregar 100 l.

b Colocar en el pozo 1 20 l de la suspensin viral (vacuna) y mezclar por aspersin y dispersin de dos a tres veces obteniendo as la

dilucin 1:10.

c Transferir 100 l de sta dilucin al pozo 2 y mezclar homogneamente de la misma manera que para el paso b.

d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que

corresponder a la dilucin 1:1280.

e Desechar del pozo 8 100 l en el recipiente para recoleccin de desechos.

f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilucin viral al pozo No. 9

que sirve como control.

2. Agregar a todos los pozos 100 l de una suspensin de glbulos rojos de pollo al 1%.


Q.F.B

14

3. Agitar la microplaca y dejar reposar a temperatura ambiente el sistema hasta que

los eritrocitos del pozo 9 hayan sedimentado.

PATRONES DE SEDIMENTACIN 1. Los glbulos rojo normales se asientan en el fondo del pozo formando un botn,

mientras que los glbulos rojos aglutinados forman una malla homognea.


2. Determinar el ttulo de la muestra, identificando la ltima dilucin en que se

presenta una reaccin de HA evidente, que corresponder entonces a 1 UHA por

volumen.

3. Identificar la dilucin que contiene 4 UHA.

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. No 1. Realizacin de las diluciones virales

Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 a)SRF (l) 180 100 100 100 100 100 100 100 100 Dilucin 1.10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 Control

2) Eritrocitos al 1% (l)

100 100 100 100 100 100 100 100 100

VACUNA CONTRA

NEWCASTLE

b) 20 l

e) Desechar 100 l

c y d) Transferir seriadamente 100 l de cada dilucin al siguiente pozo


Q.F.B

15

CUESTIONARIO 1.- Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA. 2.- Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba de HA. 3.- Porqu es importante determinar la dilucin que contiene 4 UHA.


Q.F.B

16

PRACTICA No. 4

PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN (IHA) PARA EL DIAGNSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD

DEL NEWCASTLE INTRODUCCIN

La prueba de Hemaglutinacin es un diagnstico presuntivo ms no

especfico de infeccin por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva

no nos permite asegurar que este virus sea el agente causal.

Para realizar un diagnstico definitivo se debe realizar una prueba que

demuestre una respuesta especfica del husped hacia este virus, dicha respuesta

est representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se

conoce como Inhibicin de la Hemaglutinacin (IHA).

Esta prueba se basa en la unin de un anticuerpo especfico hacia la

hemaglutinina del virin que impida la formacin de puentes entre el ligando viral y el

receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce

como neutralizacin vrica.

OBJETIVOS

1. El alumno desarrollar la tcnica de Inhibicin de la Hemaglutinacin para

determinar el ttulo de un suero problema.

2. El alumno ser capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar la

prueba de IHA.

MATERIAL

Solucin reguladora de fosfatos SRF. Microplaca de poliestireno con fondo en U. Micropipetas de volmen variable de 20- 200 l. Puntillas para micopipeta. Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET),

preparada en una suspensin con 4 UHA.

Suspensin de glbulos rojos al 1%. Suero problema. Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml. Solucin de Hipoclorito de Sodio.


Q.F.B

17

Alcohol y algodn. Tina para recolectar desechos.

METODOLOGA Con base en los resultados de la prctica anterior, preparar en un tubo una

dilucin del virus del Newcastle que contenga 4 UHA en un volumen suficiente para

realizar la prueba de IHA.

Ejemplo:

a Resultado de la prctica de HA:

Dilucin 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA

b Volmen suficiente para realizar IHA= 2ml Entonces.....

Vacuna viral concentrada 100 l + SSI 1900 l _________ Volmen final 2000 l de dilucin con 4 UHA

1. Hacer diluciones al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo

al esquema de la figura 2; incluir un pozo control que no contendr antisuero ni

virus. El proceso se describe a continuacin:

a Agregar 75 l de SSI a los pozos del 1 al 9 de la microplaca. b Colocar en el pozo 1 75 l del suero problema y mezclar por aspersin

y dispersin de dos a tres veces obteniendo as la dilucin 1:2.

c Transferir 75 l de sta dilucin al pozo 2 y mezclar homogneamente de la misma manera que para el paso b.

d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que

corresponder a la dilucin 1:256.

e Desechar del pozo 8 75 l en el recipiente para recoleccin de desechos.

f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilucin del suero al pozo

No. 9 que sirve como control.


Q.F.B

18

2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antgeno viral

en un volumen de 75 l. 3. Agitar la microplaca para que reaccionen los sutratos y dejar en reposo durante 10

min.

4. Agregar 75 l de la suspensin de glbulos rojos a todos y cada uno de los pozos, agitar y colocar la microplaca a temperatura ambiente hasta que los glbulos rojos

del pozo que no contiene antisuero y sirve como control haya sedimentado.

5. Determinar el ttulo del antisuero identificando la ltima dilucin que presenta IHA.

PATRONES DE SEDIMENTACIN: PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

Fig. No. 2 Diluciones seriadas del suero problema Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 a)SSI (l) 75 75 75 75 75 75 75 75 75 Dilucin 1.2 1:4 1:8 1.16 1:32 1:64 1:128 1.256 Control 2) 4 UHA 75 75 75 75 75 75 75 75 -----

3) INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 10 MIN 4) Eritrocitos

al 1% (l) 75 75 75 75 75 75 75 75 75

SUERO

PROBLEMA

b) 75 l

e) Desechar 75 l

c y d) Transferir seriadamente 75 l de cada dilucin al siguiente pozo


Q.F.B

19

CUESTIONARIO

1. Cul es la interpretacin diagnstica de un resultado negativa en la prueba de IHA?

2. Cul es la interpretacin diagnstica de un resultado positivo en la prueba

de IHA?

3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, Cmo explica un resultado negativo

en la prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y Cul es el

diagnstico final que dara despus de analizar ambas pruebas?


Q.F.B

20

PRACTICA No. 5

HUEVO FRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLGICO PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIN DE VIRUS. (1. Parte)

INTRODUCCIN .

Los embriones se han utilizado como el husped natural para el crecimiento

de los virus, propagacin y caracterizacin de los virus aviares y para la produccin

de vacunas virales.

El embrin y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de clulas

necesarias para el cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias

condiciones:

1.- Va de inoculacin

2.- Edad del embrin

3.- Periodo de tiempo de incubacin

4.- Volumen y dilucin del inculo utilizado

5.- Temperatura de incubacin

6.- El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos

Manejos preliminares. La utilizacin de huevo frtil en el laboratorio, no debe ser obtenida de

parvadas infectadas con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos.

Despus de 4 a 5 das de incubacin cuando el embrin puede ser observado

fcilmente, estos son ovoscopeados para determinar cuales son frtiles. La

incubacin es alrededor de 37 C y una humedad de 60 a 70% (un alto exceso de

humedad permite un subdesarrollo de la cmara de aire, por lo tanto una baja de

humedad permitir que halla un desarrollo menor). Los embriones deben estar en

movimiento varias veces al da, ya sea automticamente o manualmente, el periodo

de incubacin antes de la inoculacin depende sobre todo de la va de inoculacin.

Ovoscopeo. El ovoscopeo consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente

de luz intensa en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrin, las membranas asociadas y las cavidades del embrin se observan fcilmente.


Q.F.B

21

1.- En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el

movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrin. Notar

las diferencias con los embriones de diferentes edades.

2.-Con un lpiz, marcar la posicin del embrin y la cmara de aire (esta rea es

mantenida arriba en el ovoscopio).

3.- Comparar los embriones frtiles y los embriones muertos de varias edades,

descartar los embriones infrtiles y muertos.

Estructura del huevo embrionado. Justo bajo el cascarn se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a travs de la superficie interna del embrin y forma la cmara de aire en el extremo

ancho del huevo. Esta membrana en conjunto con el cascarn ayudan al intercambio

de gases en el huevo. Esta distribucin de gases se facilita por la membrana

corioalantoidea altamente vascularizada que sirve como rgano respiratorio del

embrin. Esta membrana se forma de manera adyacente a la membrana del

cascarn y forma una cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5

a 10 ml de fluido alantoideo. El embrin se encuentra envuelto por la membrana

amnitica formando el saco amnitico que contiene entre 1 y 2 ml de fluido

amnitico. El embrin se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de

nutrientes y se encuentra localizado aproximadamente al centro del huevo.

Tcnicas y/o vas de inoculacin. Las cuatro vas ms comunes para la inoculacin del huevo embrionado frtil son:

La va de saco alantoideo

La va de saco vitelino

La va de membrana corioalantoidea (MCA)

La va de saco amnitico.

En situaciones de diagnstico donde hay un agente no especifico que es

sospechoso, es conveniente utilizar muchas vas como sean posibles. Si una

eleccin ha sido hecha, la va MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran

numero de virus y porque es menos probable para afectarse por contaminacin

bacteriana.

Saco vitelino.


Q.F.B

22

La inoculacin en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y propagacin del virus de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta va, son

generalmente incubados de 10 a 13 das postinoculacin.

Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al trmino del periodo

de incubacin es parlisis de patas. Si los embriones se dejan nacer, a partir del

tercer da de nacidos se pueden observar pollos que se sientan en las patas, no se

mueven bien y algunos caen hacia los lados. Aparece un ligero pero rpido temblor

del cuello y de la cabeza, que especialmente se nota cuando los pollitos afectados

se mantienen en la mano.

Cavidad alantoidea. La inoculacin de embriones en saco alantoideo es utilizada para el

aislamiento y propagacin de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los

embriones inoculados por esta va, son generalmente incubados de 4 a 7 das

postinoculacin.

Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los

Myxovirus es que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y

cuando se trate de cepas altamente patgenas, pero tanto los Paramyxovirus como

los Myxovirus normalmente se evalua a travs de fluido alantoideo de los embriones

y no tanto por las lesiones. En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una

prueba de hemoaglutinacin con glbulos rojos de ave al 5 % para determinar la

presencia de hemoaglutininas en dicho fluido, que no es otra cosa ms que la

formacin de grumos de color rojo rodeados por espacios transparentes fcilmente

visible.

Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus

son enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depsitos de uratos

en riones.

Membrana corioalantoidea (MCA). La inoculacin de embriones en MCA es utilizada para el aislamiento y pases

de Poxvirus y virus Herpes. Los embriones inoculados por esta va son incubados

durante 7 das postinoculacin.

Las lesiones que presentan los embriones por los virus Herpes y Poxvirus es

principalmente en la membrana. Presencia de reas focales (pstulas) engrosadas

con necrosis o un engrosamiento generalizado de la membrana.


Q.F.B

23

Saco amnitico. La inoculacin de embriones en saco amnitico es utilizada para el

aislamiento inicial de los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta va, son

generalmente incubados de 4 a 7 das postinoculacin.

Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias

generalizadas en todo el embrin y pueden llegar a causar la muerte, siempre y

cuando se trate de cepas altamente patgenas, pero tambin se evala por la

presencia de hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrin.

Intravenosa

La inoculacin por esta va no tiene aplicacin amplia para el estudio de

infecciones experimentales en embriones de pollo. El procedimiento es

generalmente empleado para estudios hematolgicos. Embriones de 10 a 15 das de

edad son los mas adecuados para esta va. La cantidad de inculo puede variar de

0.2 a 0.5 ml.

Intracerebral. La inoculacin puede ser realizada con embriones de 8 a 14 das de edad y el

inculo es de 0.1.a 0.2 ml. Esta va puede ser empleada en estudios de alteraciones

patolgicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados

por esta va.


Q.F.B

24

PRACTICA NO. 6 ENSAYOS DE LAS VAS DE INOCULACIN EN HUEVO FRTIL DE

POLLO INTRODUCCIN El huevo frtil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para el cultivo, titulacin e identificacin de virus. En comparacin con los

animales de laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo frtil

ofrece diversas ventajas tales como:

Son estriles. No tienen funciones inmunolgicas desarrolladas. No son costosos. Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza tcnica

en comparacin con otros sistemas biolgicos, tales como el

mantenimiento y reproduccin de Cultivos Celulares.

El huevo frtil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves

sanas ALPES, aves libres de patgenos especficos o SPF por sus siglas en ingls,

para de esta manera eliminar la presencia de virus que comnmente afectan a las

aves como Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.

Para la propagacin, cultivo y titulacin de virus, es indispensable determinar

la viabilidad del embrin, as como dominar las tcnicas para las diferentes vas de

inoculacin debido a la especificidad que presentan algunos viriones por

determinadas clulas o tejidos. En la figura 3 se presenta en esquema de las

diferentes zonas que conforman a un huevo frtil.

Una vez realizado el ensayo de la inoculacin, deber observarse el conjunto

del huevo frtil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema

biolgico empleado.


Q.F.B

25

Fig.3 Vas de inoculacin en huevo frtil de ave. OBJETIVOS: 1. El alumno determinara al ovoscopio la viabilidad del embrin.

2. El alumno dominar las tcnicas comnmente utilizadas para la inoculacin de

huevos frtiles de ave.

3. El alumno diferenciara las estructuras embrionarias observando la organizacin

de los tejidos fuera de su cutcula.

MATERIAL: Huevos frtiles de ave de 10 das de inoculacin (+/- 1 da), calidad ALPES. Ovoscopio y pinzas de diseccin Recipiente para recibir desechos Charola porta embriones Perforadores, bulbos y lpiz. Jeringas de insulina Agujas de 20 x 38 mm. Colorantes Guantes

1

2

3 4

5

1 Cavidad Alantoidea 2 Saco de Aire 3 Saco Amnitico 4 Saco Vitelino 5 Membrana Corioalantoidea


Q.F.B

26

DESARROLLO: I.- CONFIRMACIN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIN Trasluminar cada embrin colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio.

Un embrin no viable puede reconocerse a travs de:

Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutcula.

Falta de irrigacin. Falta de movimiento. Cualquier coloracin de verde a negra que indica por lo general

contaminacin bacteriana.

II.- TCNICAS DE INOCULACIN A Cavidad alantoidea

a Trasluminar el huevo frtil con ayuda del ovoscopio.

b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del limite de la cmara de aire

del lado contrario al embrin y en una zona escasamente irrigada.

c Perforar la marca sealada.

d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ngulo

de 45 grados con respecto al huevo frtil de ave.

B Saco vitelino

a Localizar la parte ms alta del embrin sobre la cmara de aire y marcar con

un punto o cruz.

b Marcar otro punto o gua que indicara la localizacin del embrin.

c Perforar la marca sealada

d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinacin opuesta a la

localizacin del embrin

C Membrana corioalantoidea

a Localizar la parte ms alta de la cmara de aire y marcar un punto o cruz (*).

b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localizacin del embrin en

un rea con la menor irrigacin posible.

c Perforar ambas marcas.

d Succionar con un bulbo de goma a travs del punto marcado en la primera

posicin (*), creando as una cmara de aire falsa en la parte media del

embrin.


Q.F.B

27

e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar

que se desarrollo la cmara de aire falsa.

En estos ensayos, se emplearan colorantes para las diferentes inoculaciones

con el objetivo de facilitar la visualizacin del sitio donde se pretendi depositar un

volumen determinado de colorante. Una vez realizada la tcnica, se abrirn los

huevos frtiles de ave para analizar si la va elegida fue efectivamente inoculada,

vertiendo el contenido del embrin sobre cajas de Petri.

CUESTIONARIO 1. De acuerdo con lo observado despus de abrir los embriones de pollo y

segn la va de inoculacin empleada; esquematice para cada va, cuales

zonas deben quedar teidas y cuales no, si la inoculacin se realiz

correctamente.


Q.F.B

28

PRACTICAS NO. 7 y No.8 REPLICACIN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR

EN HUEVO FRTIL DE POLLO (1 Parte) TITULACIN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FRTIL

DE POLLO (2 Parte). INTRODUCCIN Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamferos daos severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable

es que esta interaccin induzca una proteccin inmunolgica al individuo como

consecuencia del reconocimiento de antgenos especficos tanto en forma natural

como artificial. En el caso de medidas profilcticas, con el empleo de vacunas se

procura inducir una Inmunidad Adquirida Activa Artificial.

Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de

la vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoracin se puede

efectuar en sistemas biolgicos tales como huevos frtiles de ave que pueden

responder a la infeccin viral dando lesiones caractersticas del virin inoculado que

afecte directamente al embrin y le produce signos tales como msculos distrficos,

enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y lquidos extraembrionarios donde

se pueden observar hemorragias, formacin de placas o pstulas as como

determinar la presencia de hemaglutininas virales.

Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos

frtiles de ave cuando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al

50% (DLEP50) o en el caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al

50% (DIEP50) empleando la reaccin de Hemaglutinacin de los fluidos cosechados.

OBJETIVOS 1. El alumno dominara las tcnicas para propagar y titular una cepa vacunal de

virus.

2. El alumno determinar la DLEP50 para la vacuna del Virus de la Bronquitis

Aviar (VBA), calculando sus concentracin por unidad de volumen.

MATERIAL


Q.F.B

29

Huevo frtil de ave de 10 dias de incubacin (+/- 1 dia) calidad ALPES. Vacuna de VBA. INTERVET Solucion salina de Dulbecco Lpiz, pegamento blanco y perforadores Hisopos estriles, tintura de yodo. Estufa a 37C. Ovoscopio. Jeringas de insulina. Mechero. Recipiente para desechos.

DESARROLLO: 1. Realizar con solucion salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna

viral desde 10-1 hasta 10-6 a partir de una suspensin concentrada.

2. Trasluminar el huevo frtil de ave y seguir la tcnica de inoculacin para

cavidad alantoidea

3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculacin con tintura de

yodo antes y despus de perforar

4. Inocular 0.1 ml de las cuatro ultimas diluciones en cada uno de 5 embriones

de 9 a 11 das de incubacin (20 embriones en total), va cavidad alantoidea.

5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforacin con una gota de pegamento

blanco

6. Marcar con lpiz sobre cada embrin la dilucin y vacuna inoculadas

7. Incubar a 37C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los

embriones al ovoscopio, sealando en el primer dia los embriones que

resulten muertos por traumatismo

8. Al termino de la incubacin,trasluminar los embriones al ovoscopio y realizar

un recuento de embriones vivos y muertos.

9. Anotar los resultados obtenidos y realizar los clculos para determinar la

DLEP50 / 0.1 ml empleando el metodo de Reed & Muench, con base en el

siguiente ejemplo


Q.F.B

30

RESULTADOS DEL RECUENTO DE EMBRIONES VIVOS Y MUERTOS DILUCION EMBRIONES

INOCULADOS

MUERTOS VIVOS

10-3 5 4 1

10-4 5 3 2

10-5 5 2 3

10-6 5 1 4

CALCULOS

1) ACUMULADOS

MUERTOS

2) ACUMULADOS

VIVOS

3) RADIO DE

MORTALIDAD

4) PORCENTAJE

10 1 10 / 11 90.9

6 3 6 / 9 66.6

3 6 3 / 9 33.3

1 10 1 / 11 9.09

Para una mejor explicacin, se desgloza a continuacin la realizacin de los clculos

para cada columna:

1) Realizar la suma acumulada de embriones muertos desde la dilucin mas alta

hasta la mas baja.

2) Realizar la suma acumulada de embriones vivos desde la dilucin mas baja a

la mas alta.

3) Calcular el cociente dado por los acumulados muertos sobre la suma de

acumulados muertos mas acumulados vivos de cada dilucin.

CALCULAR EL VALOR DE INTERPOLACIN (V.I.)

% Positividad > 50% - 50% 66.6 50.0 16.6

V.I. = = = % Positividad > 50% - % Positividad < 50% 66.6 33.3 33.3

V.I. = 0.49

Multiplicar el logaritmo negativo del radio de dilucin por el valor de interpretacin

para as calcular el valor de interpolacin corregido.

Para este caso:

log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49 = V.I.C.


Q.F.B

31

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad

En el ejemplo: 10-4 y 10-5

Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilucin que presente mayor

al 50% de efecto.

En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50

El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50.

Finalmente:

Titulo = 104.49

CUESTIONARIO 1. Adems de la titulacin viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote

vacunal antes de salir al mercado.

2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra

viral.


Q.F.B

32

PRACTICA No.9 CULTIVOS DE CLULAS EUCARITICAS PARA LA REPLICACIN

DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIN, PROLIFERACIN Y MANTENIMIENTO

En 1949 John Enders, Thomas Sller y Frederick Robbins descubrieron que

el poliovirus poda cultivarse en clulas de origen no neuronal, lo que les vali el

premio Nobel en Fisiologa y Medicina en 1954. Desde entonces, Los cultivos

celulares reemplazaron a los animales de laboratorio convirtindose en el principal

mtodo para la propagacin de virus y son utilizados en prcticamente todos los

campos de la bio-medicina.

Un Cultivo Celular (CC), es entonces un modelo biolgico conformado por un

grupo de clulas con caractersticas especficas que se mantienen adecuadamente

bajo condiciones in vitro. En este sentido deberemos entender que las clulas

deben ser obtenidas a partir de un tejido vivo y para su mantenimiento y propagacin

in vitro, requieren de medios de cultivo especiales que provean de los nutrientes que

cubran sus necesidades de crecimiento, tal y como se encontraban en sus

condiciones originales.

Para la preparacin de un CC se puede considerar el siguiente orden.

1) El tejido se obtiene del modelo original, que puede ser en un caso, cualquier

tejido sano de algn animal, por ejemplo, clulas epiteliales de intestino,

embriones de rata, etc. En otro caso los CC provienen de tejido anormal que

se puede obtener directamente de tumores cancerosos o bien de tejidos que

inicialmente son normales y que por exposicin a algn mutgeno se

transforman en el laboratorio.

2) Las clulas que se obtienen inicialmente de los tejidos se disocian en una

suspensin celular mediante mtodos mecnicos, como maceracin. De esta

manera, se tienen trozos de tejido, ms pequeos que el original, pero sin

clulas individuales. Para disgregar a las clulas, el procedimiento contina

con una.

3) Digestin con enzimas proteolticas.

4) Centrifugacin


Q.F.B

33

5) Las clulas se suspenden en un medio de cultivo y se colocan en recipientes

o placas de plstico, conforme las clulas se dividen van cubriendo la

superficie. Las clulas de fibroblastos o epiteliales se adsorben al plstico y

van formando una monocapa, mientras que clulas como las sanguneas o

los linfocitos, sedimentan pero no se adhieren.

6) El medio adecuado para las clulas consiste de una solucin isotnica de

sales, glucosa, vitaminas, coenzimas y aminocidos mantenidos en buffers a

un pH entre 7.2 y 7.4 Y se complementan con antibiticos para inhibir el

crecimiento microbiano. Frecuentemente se adicionan diferentes tipos de

suero para proveer a las clulas de una fuente rica de factores de crecimiento

Existen principalmente tres tipos de cultivos celulares:

O Cultivos celulares primarios O Cepas celulares diploides O Lneas celulares continuas

Dado que el desarrollo de una lnea celular es un proceso costoso, la gran mayora

de lneas celulares de amplia utilizacin, son depositadas en y distribuidas desde

centros de reposicin. Existen unos pocos de estos centros en el mundo, el principal

en EEUU es el American Type Culture Collection (ATCC). Algunos ejemplos de lneas celulares que se distribuyen con origen y calidad certificados ATCC son: Vero

E-6, Vero C-76, BHK-21, MDCK, MDBK, HEp-2 entre otras.

Adems del anlisis viral, los Cultivos Celulares pueden emplearse en

diferentes reas y aplicaciones como: Actividad y flujo intracelular, movimientos del

RNA, de protenas etc. Ecologa celular, Interacciones celulares, Inmunologa,

Ingeniera de protenas, Estudios de diferenciacin y desarrollo celular, Aplicaciones

diagnsticas. Medicina, Farmacologa,etc.


Q.F.B

34


Q.F.B

35

RECONOCIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CELULAS INFECCION VIRAL

CAMBIO MORFOLGICO

EFECTO CITOPATICO (ECP) Sin cambio aparente:

Hemadsocin Hemaglutinacin. Interferencia

TIPOS DE EFECTO CITOPATICO

Monocapa confluente de clulas

Formacin de sincitios

Redondeamiento

Vacuolizacin

Lisis

Cuerpos de inclusin

Alargamiento


Q.F.B

36

HEMADSORCIN

INTERFERENCIA

Monocapa confluente de clulas

Eritrocitos con el receptor adecuado

Virus con HA

Lnea celular

Lnea celular, previamente infectada con Rubola

Lnea celular

Sin efecto aparente

Redondeamiento

Interferencia

Muestra presuntiva de Rubola

Infeccin con Rinovirus

Infeccin con Rinovirus

A

B

C


Q.F.B

37

PRACTICA No.11 PROLIFERACIN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE

SUBCULTIVO O PASE 1:2

INTRODUCCIN El diagnstico de laboratorio de las infecciones virales requiere

frecuentemente del aislamiento de virus en cultivos celulares. Para tal efecto,

monocapas celulares son inoculadas con un espcimen clnico adecuado y entonces

son observadas para detectar cambios citolgicos inducidos por la reproduccin de

virus.

El trmino efecto citoptico (ECP) es aplicado para indicar los cambios

celulares que inducidos por virus, son observables al microscopio ptico. Estos

cambios incluyen el redondeamiento o lisis de clulas, la formacin de clulas

gigantes multinucleadas (sincitios) y la produccin de inclusiones en el ncleo y

citoplasma de clulas infectadas.

La obtencin de cultivos de clulas eucariticas en el laboratorio de Virologa,

es una de las mayores contribuciones histricas para toda el rea de las ciencias

naturales, en especial para la Biologa Celular y Molecular. La labor de los

investigadores que sentaron estas bases, ha sido reconocida con el otorgamiento de

varios premios Nobel en Fisiologa y Medicina.

Con base en lo anterior, resulta conveniente conocer el procedimiento de

reproduccin de cultivos celulares a travs de un subcultivo o pase en relacin 1:2,

ya que de esta manera, se pueden obtener monocapas de clulas en cultivo para la

reproduccin de virus en condiciones de laboratorio.

OBJETIVO Realizar un subcultivo in vitro de clulas eucariticas para promover su

proliferacin por divisin mittica y obtener monoestratos celulares.

MATERIAL Y EQUIPO Gabinete de bioseguridad Incubadora con fuente de CO2 Microscopio con circuito cerrado de televisin Medidor de pH Pipeteador automtico Bomba de vaco


Q.F.B

38

Equipo de esteriliacin por filtracin Etanol al 70% Cultivo celular MRC-5 Frascos para cultivo celular de 25 cm2 Medio para cultivo de clulas Mnimo Esencial (MEM) Suero fetal de ternera Solucin de tripsina en regulador de pH de Dulbecco Agua desmineralizada

DESARROLLO 1. Desinfectar el rea de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con

etanol al 70%.

2. Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso y encender

la luz ultravioleta por espacio de 30 minutos, evitando observar en forma

directa la fuente de radiacin.

3. Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminacin convencional del gabinete

de bioseguridad.

4. Disolver en condiciones aspticas, el medio mnimo esencial en agua

desmineralizada y ajustar el pH a 7.0

5. Esterilizar el medio de cultivo por filtracin con vaco a travs de una

membrana con dimetro de poro de 0.22 micrometros.

6. Decantar el medio del frasco de cultivo original que contiene clulas MRC-

5.

7. Agregar 2.0 ml de solucin de tripsina y dejar interaccionar con las clulas

durante 30 segundos; retirar el exceso de la solucin de tripsina.

8. Incubar a 37 C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las

clulas se hayan redondeado (disgregacin celular).

9. Aadir al frasco de cultivo con las clulas disgregadas, 14 ml de medio para

cultivo celular adicionado de 5% de suero fetal de ternera y homogenizar por

pipeteo hasta formar una suspensin celular homognea.

10. Dispensar 7 ml de la suspensin celular obtenida a cada uno de dos frascos

estriles para cultivo celular.

11. Incubar a 37 C en la incubadora con una concentracin de 5% de CO2,

durante 24 a 48 horas.


Q.F.B

39

12. Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una

confluencia del 100% (monoestrato celular).

13. Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo

contenga 0.5 % de suero fetal de ternera, hasta el momento de emplear el

cultivo de clulas MRC-5 para la reproduccin de virus.

CUESTIONARIO 1. Que significa confluencia?

2. Que funcin tiene el Suero de ternera adicionado al medio de cultivo para

clulas?

3. Explique el efecto que produce la adicin de tripsina a la monocapa celular?


Q.F.B

40

SESIN No. 12 REPLICACIN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIN

DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPTICOS

INTRODUCCION. Entre los modelos disponibles para el estudio de virus, encontramos a los

animales de laboratorio, el embrin de pollo y los cultivos celulares. Estos ltimos

ofrecen ventajas como la reproducibilidad de los resultados, la diversidad de virus

que pueden ser analizados y sobre todo la posibilidad de conocer los diferentes

eventos que ocurren dentro de ese compartimiento esencial para la supervivencia

del virus, la clula. Debido a estas propiedades las clulas en cultivo representan el

estndar de oro para la validacin de pruebas efectuadas tanto en investigacin

como a nivel industrial para la produccin y control de calidad de vacunas.

Su mayor limitante recae en el alto costo de la infraestructura requerida para

su implementacin, situacin que vuelve inaccesible su aplicacin en el diagnstico

clnico de rutina.

La tcnica consiste en inocular una muestra de prueba sobre clulas en

monocapa, que posteriormente se incuban bajo condiciones adecuadas efectuando

un observacin diaria de los cambios presentados. Los cambios que son

perceptibles como modificaciones morfolgicas en la clula, inducidos y

caractersticos de cada virus analizado se conocen como Efecto Citoptico ECP.

Existen diferentes tipos de ECP como: redondeamiento, alargamiento, formacin de

Sincicios, vacuolizacin, cuerpos de inclusin, lisis, etc. En algunos casos el ECP

presentado es tan caracterstico que se relaciona con un solo tipo de virus, en otros,

la diversidad de virus que inducen a un mismo ECP merece la aplicacin de otras

tcnicas. Sin embargo el modelo de Cultivos Celulares se requiere para el primo

aislamiento de los virus a partir de un espcimen dado.

OBJETIVOS 1.- El alumno valorar la importancia de los cultivos celulares para el aislamiento de

virus.

2.- El alumno ser capaz de determinar la presencia de virus en una muestra

reconociendo el ECP inducido en clulas en monocapa.


Q.F.B

41

MATERIAL Y REACTIVOS 2 Botellas de 25 cm2 con clulas en monocapa con un 80% de confluencia. Inculo viral (Vacuna viral, muestra clnica, stock viral) Microscopio invertido. Campana de Flujo Laminar. Estufa de incubacin con 5% de CO2 Micro pipetas con volumen variable de 20-200 l y de 100-1000 l. Puntillas amarillas y azules estrilizadas. Solucin Salina de Fosfatos (SSF) estril. Pipetas Pasteur esterilizadas. Pipetas de 5 y 10 ml esterilizadas Plancha de agitacin. Medio Mnimo Esencial (MME) esterilizado por filtracin. Suero fetal de ternera esterilizado por filtracin.

DESARROLLO 1. Revisar en el microscopio invertido la integridad de la monocapa celular de

las dos botellas.

2. Asignar una de las botellas como control y la otra como botella de prueba.

3. Decantar el medio de cultivo de ambas botellas.

4. Adicionar 7 ml de SSF a cada una de las botellas y lavar las clulas,

aspirando y dispensando por pipeteo la SSF sobre las monocapas. Desechar

la solucin y repetir el procedimiento dos veces ms.

5. Adicionar 500 l de MME a la botella control y 500 l del inculo viral a la botella de prueba.

6. Colocar ambas botellas en la plancha de agitacin y mantener a temperatura

ambiente por una hora.

7. Adicionar a cada botella 5 ml de MME complementado con 0.5% de suero de

ternera e incubar a 37 C dentro de una estufa de CO2 en posicin horizontal.

8. Observar diariamente, la botella control debe mantener la integridad de la

monocapa mientras en la botella de prueba se presentan cambios

morfolgicos.


Q.F.B

42

9. Registrar los cambios especificando el tiempo en que se presentaron los

primeros cambios morfolgicos y a cual de los ECP conocidos corresponde.

CUESTIONARIO 1. Cite tres ejemplos de ECP, los virus que los producen y el tipo de cultivo

celular en que se presentan.

2. Adems del ECP, de que otra manera se puede mostrar la infeccin de un

virus empleando como modelo las clulas en cultivo.


Q.F.B

43

PRACTICA No. 13 REPLICACIN DE BACTERIFAGOS LTICOS EN

ESCHERICHIA COLI.

Introduccin Las bacterias son huspedes de un grupo particular de virus denominados

bacterifagos o simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para

estudios sobre la infeccin a nivel celular, la relacin husped parsito, la

multiplicacin viral y estudios de ingeniera gentica. Por otro lado, tambin son muy

tiles en la tipificacin de cepas bacterianas.

En los bacterifagos lisognicos, tambin denominados temperados, el genoma del

fago se replica sincrnicamente con el genforo bacteriano, pasando a la progenie

cada vez que la bacteria se divide por fisin binaria. En este estado lisgenico, los

fagos integrados al genforo bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su

separacin. Estos genes permiten a la bacteria lisgenica expresar nuevas

actividades y producir diferentes protenas.

El genoma del fago lisgenico puede modificar la estructura del polisacrido

bacteriano y su antigenicidad, as como codificar la produccin de toxinas

bacterianas que causan enfermedades tales como la difteria, la escarlatina, el

botulismo y el sndrome urmico hemoltico.

Por otra parte, los bacterifagos lticos o virulentos se replican dentro de la bacteria

husped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos lticos ms

extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con

la letra T y diferentes nmeros (bacterifagos de la serie T). Los fagos virulentos al

destruir a las bacterias producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en

cultivos sobre placas de agar.


Q.F.B

44

Objetivo El alumno aprender a desarrollar bacterifagos en el laboratorio y conocer su

importancia en la Microbiologa.

Material y equipo

Incubadora bacteriolgica Pipeteador automtico Pipetas Pasteur Pipetas serolgicas de 1 y 5 ml Tubos de ensaye de 13 x 100 Gradillas Asa bacteriolgica Cajas Petri Suspensin de bacterifago T2 Cultivo en caldo de Escherichia coli Etanol al 70% Solucin salina fisiolgica Agar cerebro corazn Caldo cerebro corazn

Desarrollo

1. Prueba cualitativa:

a) Siembre una placa de agar cerebro corazn, depositando en la superficie 0.2 ml

de una suspensin de Escherichia coli, que ser el husped especfico del fago.

b) Enseguida distribuya el inculo homogneamente con un asa bacteriolgica.

c) A continuacin, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en

cada uno deje caer una gota de suspensin del fago T2, utilizando una pipeta

Pasteur.

d) Incube a 37 C por 24 hrs.

e) Observe las reas circulares sin crecimiento de la bacteria, equivalentes a zonas

de bacterias lisadas por replicacin del fago.


Q.F.B

45

II. Prueba cuantitativa por dilucin en placa:

a) Haga diluciones de una suspensin del fago de la siguiente manera: En un tubo

estril coloque 0.5 ml de la suspensin del fago, ms 4.5 ml de caldo cerebro

corazn.

b) Transfiera 0.5 ml a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solucin salina fisiolgica (S.

S. F.) y contine haciendo diluciones con S. S. F. hasta obtener una dilucin de

1:1000 000.

c) De cada dilucin del fago, transfiera 0.1 ml a tubos que contengan 0.1 ml de

Escherichia coli. Mezcle e incube a 37 C por 20 min.

d) Al cabo de este tiempo adicione a cada tubo 4 ml de agar cerebro corazn

blando (0.5%), mezcle y vace en cajas de Petri estriles con agar cerebro corazn.

e) Deje solidificar e incube a 37 C durante 24 hrs. Determine las placas lticas o

calvas y cuntelas.

f) Para calcular el nmero de partculas virales / ml, cuente el nmero de placas

lticas en las cajas de cultivo que presenten pocas calvas y emplee la siguiente

frmula:

UFP / ml = PV x FD

Donde:

PV = nmero de placas virales

FD = Factor de dilucin

UFP / ml = unidades formadoras de placas por ml de suspensin original del fago.

Cuestionario

1. Anote Usted un ejemplo de bacterifago temperado

2. En que mecanismo de recombinacin gentica entre bacterias se involucra la

participacin de bacterifagos

3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes

estructurales de los bacterifagos de la serie T


Q.F.B

46

4. Investigue Usted el porque ciertas cepas de Escherichia coli son capaces de

producir colitis hemorrgica


Q.F.B

47

PRACTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA) EN EL DIAGNSTICO

SEROLGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES

El diagnstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que

se enfrenta la medicina actual ya que para estos agentes, una cosa es lo que

idealmente deseamos tener y otra la realidad con la que contamos. Durante las

ltimas dcadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas para

evidenciar las etiologas de tipo viral, hace posible que estas entidades se puedan

descubrir y estudiar no slo a nivel de laboratorios especializados, sino tambin en

los de diagnstico de rutina.

Qu es lo ideal? Identificar plenamente el agente viral. Resultados en corto tiempo. Una sola prueba.

Cul es la realidad? No se hace diagnstico directo del agente viral (descarte). Se requiere la complementacin entre la clnica y el laboratorio. Recurrir al anlisis por pruebas pares.

Diagnosticar si una infeccin es de etiologa viral es muy importante porque

determina un cambio en la conducta clnica y en el manejo teraputico del paciente, adems de que ayuda a realizar un seguimiento clnico de la entidad.

Llevada con tica, esta actitud impacta social y econmicamente, puesto que la

administracin oportuna del tratamiento correcto reduce aspectos como el tiempo de

hospitalizacin y directamente el gasto a familiares.


Q.F.B

48

PRUEBAS SEROLGICAS

Al igual que la mayora de los microorganismos, los virus se pueden

descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas directas son las que

evidencian al virus o algunos de los antgenos virales que se pueden encontrar

presentes en los tejidos o fluidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se

utilizan con ms frecuencia y bsicamente demuestran un contacto del husped con

el agente viral mediante la determinacin de anticuerpos especficos contra el virus.

En el laboratorio clnico se cuenta con las pruebas serolgicas que tanto de

forma directa e indirecta son la principal herramienta que se aplica en el diagnstico

viral. En estos ensayos se aprovechan las caractersticas fisicoqumicas de los

anticuerpos, as como su especificidad. Los principales aspectos a considerar son:

Se pueden detectan antgenos virales. Se pueden valorar anticuerpos con especificidad antiviral en el paciente. Requiere del anlisis de sueros pares. En muestras tomadas con periodos de

separacin de 10-14 das, un incremento de 4 veces o ms en el ttulo de la

segunda muestra con respecto a la primera, es considerado significativo para

una infeccin viral en curso.

Puede diferenciar entre infecciones primarias y crnicas. La presencia de Ig M especfica es ms rpido y detectable a pocos das del inicio de la

enfermedad

Las pruebas serolgicas con mayor aplicacin en el diagnstico clnico viral son:

9 INMUNOFLUORESCENCIA a) Directa (Antgenos virales)

b) Indirecta (Anticuerpos de respuesta)

9 ENSAYOS ENZIMTICOS

a) Directo (Antgenos)

b) Indirecto (Anticuerpos de respuesta)

9 WESTERN-BLOT


Q.F.B

49

ENSAYOS INMUNOENZIMTICOS: ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay)

ELISA Directo

Ensayos de captura del antgeno (sandwich). Son inmunoensayos en fase

slida donde se fijan los anticuerpos especficos para el virus en la superficie de una

matriz, tubo o microplaca y luego se pone en presencia del suero o muestra que

contiene el antgeno que se quiere demostrar; una vez que ocurre la reaccin

antgeno-anticuerpo, se hace un lavado y se agrega un anticuerpo marcado (Fig

1A).

En la tcnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima que puede ser la

fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rbano (PR) y para revelar la reaccin se

coloca el sustrato especfico para la enzima que es modificado por sta y produce

un compuesto coloreado. En el caso de la FA el sustrato es el paranitrofenilfosfato y

para la PR es el perxido de hidrgeno en una solucin de ortofenilendiamina

(OPD) que hace visible la reaccin. Para la cuantificacin se mide la absorbancia en

una longitud de onda determinada en un espectrofotmetro. La absorbancia ser

directamente proporcional a la cantidad de antgeno en la muestra.

Estas tcnicas se utilizan ampliamente en el diagnstico de hepatitis A y B,

rotavirus, el agente Norwalk, parainfluenza, influenza A y B. Para la hepatitis B la

demostracin de antgeno de superficie diagnstica la infeccin activa as como el

estado de portador; el diagnstico de rotavirus con este mtodo ayuda a obtener un

resultado rpido en nios menores de dos aos con cuadros diarreicos, donde este

virus es el principal causante de dichos cuadros; por otro lado para VIH la

demostracin del antgeno p 24 es til en el diagnstico de la infeccin en nios y en

pacientes que se encuentran en ventana inmunolgica y adems es de gran utilidad

en el pronstico y la progresin de la infeccin as como en el control de la terapia

antirretroviral.

ELISA Indirecto

Estas tcnicas serolgicas se emplean para determinar la existencia de

anticuerpos contra determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposicin al


Q.F.B

50

agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que genera la

produccin de anticuerpos especficos.

La prueba ELISA indirecta tiene un principio semejante al de ELISA directa, en

este caso, un antgeno especfico est unido a una fase slida que puede ser un

tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se aade el suero del paciente que posee

los anticuerpos y despus se adiciona el conjugado constituido por un anti-

anticuerpo IgG o IgM unido a una enzima; posteriormente se adiciona el sustrato

especfico para la enzima, que lo va a modificar y produce un compuesto coloreado,

cuya intensidad es proporcional a la concentracin de anticuerpo en el suero del

paciente (Fig. 1B).

Esta prueba se utiliza ampliamente; ms an, con el advenimiento y la

disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo de 1 a

2 horas. Su utilidad en virologa es bsicamente para determinar anticuerpos contra

antgenos especficos del virus dengue, herpesvirus, VIH, sincitial respiratorio,

Citomegalovirus, rubola, hepatitis A, B y C principalmente, y en infecciones por

Virus Epstein-Bar se usa para demostrar marcadores serolgicos tempranos de la

infeccin, que se pueden utilizar en el manejo de huspedes inmunocomprometidos.

La especificidad de las pruebas de ELISA, depende de la calidad de los

sustratos adsorbidos en la fase slida, lo cual se aprecia principalmente en los

diferentes tipos de ELISA indirecto donde de acuerdo con el antgeno que se utilice

la prueba puede ser:

a. De primera generacin

Son pruebas incipientes donde se utilizan antgenos crudos sin mayores procesos de purificacin, como p.e., el virus completo inactivado, es el caso de las

primeras tcnicas de ELISA para VIH. Sin embargo, estos ensayos presentaban

como resultado muchas reacciones inespecficas.


Q.F.B

51

A) ELISA Directo B) ELISA Indirecto

Fig. 1. Diagrama esquemtico de las pruebas de ELISA

b. De segunda generacin

En este caso los antgenos son protenas recombinantes, que se producen mediante ingeniera gentica en bacterias y son sometidas a procesos de

purificacin lo que da ms especificidad a la prueba pues se descubren anticuerpos

particulares contra las protenas consideradas ms inmunognicas.

c. De tercera generacin

Son las ms utilizadas actualmente y las ms especficas, donde se emplean

pptidos sintticos (fabricados en un sintetizador en el laboratorio) con secuencias ms especficas del virus: tal es el caso de las pruebas diseadas para determinar

slo anticuerpos contra VIH2 y VIH1.

En otra modalidad de ELISA se usa el sistema biotina/avidina-estreptavidina,

mtodo que se fundamenta en sistemas con distintos marcadores unidos a la

biotina y demostrados por reacciones enzimticas, de color o quimioluminiscentes

que portan la avidina, la estreptavidina o la biotina. La biotina ligada a un

anticuerpo, nucletidos, protena o lecitina, se une a una molcula blanco que

puede ser anticuerpo (indirecta) o antgeno (directa), la avidina o estreptavidina se

marcan con una molcula demostrable como una enzima, una sustancia

fluorescente o un metal.

Marcaje

Anticuerpo secundario

Antgeno viral

Anticuerpo de captura

Fase slida

Marcaje

Anti-IgG

Anticuerpo en la muestra (IgG o IgM)

Antgeno viral Fase slida


Q.F.B

52

PRACTICA No. 15 ENSAYOS INMUNOENZIMTICOS PARA EL DIAGNSTICO DE

CITOMEGALOVIRUS, RUBOLA, HEPATITIS B Y HIV.

ENSAYO INMUNOENZIMTICO INDIRECTO DE FASE SLIDA (EIA), PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS CONTRA LOS VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA

HUMANA (HIV). INTRODUCCIN

El virus de inmunodeficiencia humana (HIV) es un retrovirus, identificado en

1983 como el agente etiolgico del Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida

(SIDA).

Aunque se trata de un sndrome, es decir, un conjunto de signos y sntomas, y

no de una sola enfermedad, por ser valido y ms sencillo de aqu en adelante nos

referimos al SIDA como enfermedad. Por lo pronto no existe tratamiento ni vacuna

contra el virus, por lo que una vez que se desarrolla, casi inexorablemente, a la

muerte en un tiempo muy corto.

En nuestro pas, el informe, descripcin y anlisis de esta singular

enfermedad, ha sido objeto de mltiples actividades acadmicas, clnicas, e incluso

culturales. A partir de abril de 1987, el SIDA se convirti en una enfermedad sujeta a

vigilancia epidemiolgica; la notificacin de los casos tiene carcter de obligatoria e

inmediata.

Hasta ahora se conocen dos variables genticas del virus, en funcin del

antgeno de superficie que los clasifica en VIH-1 y VIH-2. Para el VIH-1 la

glicoprotena externa es la gp120 y la de transmembrana es la gp41; para el VIH-2 la

gp externa es la 140 y la de transmembrana es la gp36.

Desde que se reconocieron los primeros casos de SIDA, una de las primeras

lneas de investigacin ha sido lo referente a la transmisin del virus; conocindose

hasta el momento las siguientes vas:

1. Sexual: homosexual, heterosexual.

2. Sangunea: transfusin de sangre y/o hemoderivados.

3. Perinatal: durante el embarazo, en el parto, despus del parto (leche materna).

Para el diagnostico de VIH se cuenta con:


Q.F.B

53

Mtodos directos (determinan estructuras de los virus), como:

Aislamiento del virus en cultivos celulares Deteccin de antgenos virales con anticuerpos monoclonales Reaccin en cadena de la polimerasa Hibridizacin con sonda de DNA marcadas

Mtodos indirectos (donde se valoran anticuerpos contra el virus), como:

Pruebas de Inmunoenzayo enzimatico (ELISA) Aglutinacin pasiva con partculas de ltex Inmunoelectrotransferencia (Western-Blot)

OBJETIVO: El alumno aprender una de las tcnicas empleadas para el diagnostico de

infeccin por los virus del Sndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA)

MATERIAL Y REACTIVOS: Equipo Inmuno Comb HIV 1+2 PBS-Orgenics Micropipetas con puntillas para 25, 50 y 100 l Tijeras Perforador Reloj Papel desechable Sueros problema Sueros control positivo y negativo Solucin de hipoclorito de Sodio

METODOLOGA o Realizar un plan de distribucin que identifique plenamente la localizacin de

los sueros problema, control positivo y negativo

o Deposito de muestra. Compartimiento A. Deposite por separado 50 l de los sueros dentro de cada pozo del compartimiento A perforando la cubierta de papel aluminio y descargando la

muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente contenido en

el compartimiento A mediante carga y descarga del a solucin en varias

ocasiones. Utilice una puntilla por cada muestra y deschela


Q.F.B

54

Desarrollo de la prueba o Reaccin antgeno-anticuerpo.

Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa

apuntando hacia usted. Reinserte el peine varias veces para mover las

burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.

Al final de la incubacin extraiga el peine del compartimiento y seque el

lquido sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y

perfore con las pinzas el papel que cubre los pozos del siguiente

compartimiento.

NOTA: Este ltimo procedimiento se repetir siempre antes de pasar de un

compartimiento a otro.

o Lavado. Compartimiento B Inserte el peine en el compartimiento B, para lograr un lavado adecuado

mueva el peine hacia atrs y adelante durante un periodo 2 min.

o Conjugado. Compartimiento C. Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces.

Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.

o Lavado. Compartimiento D. Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.

o Lavado. Compartimiento E. Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.

o Reaccin de color. Compartimiento F Inserte el peine dentro del compartimiento F; Reinserte el peine varias veces

durante 10 min. a temperatura ambiente.

o Deteccin de la reaccin. Compartimiento E. Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E, despus de 1 min. retire el

peine y squelo al aire completamente.

CUESTIONARIO 1. Cul es el fundamento de est prueba?

2. Cundo se dice que el paciente es seropositivo?

3. Cul es la diferencia entre un paciente seropositivo y uno con SIDA?


Q.F.B

55

4. Cmo se puede prevenir el SIDA?

5. Cmo se trata la enfermedad del VIH?


Q.F.B

56

ENSAYO INMUNOENZIMTICO PARA LA DETERMINACIN CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS IgG CONTRA EL VIRUS DE LA RUBOLA EN EL SUERO O PLASMA HUMANO.

INTRODUCCIN El virus de la rubola es miembro de la familia Togavirus. La familia est

formada por un grupo de agentes virales pequeos que contienen cido ribonuclico

en su genoma y una envoltura lipdica, de donde deriva la palabra toga.

Es considerable el avance alcanzado en el conocimiento del virus de la

rubola a partir de que se logro cultivar in vitro en 1962. Esto condujo a la posibilidad

de hacer estudios moleculares del virus, de estudiar la infeccin y su replicacin.

El virus de la rubola es sensible al ter y fcilmente inactibable por agentes

qumicos y por radiacin ultravioleta; es relativamente termolbil, perdiendo su in

efectividad si permanece durante una hora a 37C, mientras que es capaz de

mantener su viabilidad a temperatura de refrigeracin si se encuentra en una

solucin que contenga protenas. Son partculas esfricas y de dimetro de 60 a 70

micras; posee una nucleocpside rodeada de doble membrana lipdica con espculas

con capacidad hemaglutinante, se cultiva en varios tipos de lneas celulares,

principalmente las provenientes de mono (RK-13, VERO y AGMK).

El nico resrvorio del virus de la rubola es el humano y la enfermedad se

propaga por medio de las secreciones farngeas, la orina, lquido cefalorraquideo y

sangre de personas infectadas, tengan o no sntomas clnicos, desde varios das

antes de aparecer el exantema y hasta despus de una semana, manifestndose

con una multitud de formas clnicas posibles desde la infeccin inaparente, hasta un

cuadro clnico clsico de exantema linfadenopata y fiebre. Puede haber

complicaciones de tipo meningoencefaltico.

La enfermedad es endmica en todo el mundo y aparece en epidemias

peridicas, principalmente en la infancia, aunque es ms frecuente en los adultos,

comn entre los estudiantes universitarios.

El perodo de incubacin es de 14 a 21 das con un promedio de 17 das.

En los adultos la enfermedad puede presentarse en forma ms severa, con

poliartralgias tan frecuentes que se consideran tpicas de la enfermedad.

La infeccin posnatal es benigna, en contraste con la infeccin prenatal,

particularmente si ocurre durante las primeras 16 semanas del embarazo. Las


Q.F.B

57

consecuencias de la rubola in utero son variadas e impredecibles y pueden variar

desde la afectacin severa con muerte fetal, en nacimientos vivos con

malformaciones evidentes o en productos normales sin evidencia clnica de la

infeccin.

El diagnostico de la rubola puede establecerse en base a dos

procedimientos: virolgico que se refiere al cultivo del virus a partir de muestras del

paciente y el serolgico que se refiere a la demostracin de anticuerpos que se han

adquirido como resultado de la infeccin, existen varios mtodos tales como la

fijacin del complemento, hemaglutinacin, hemlisis en gel aglutinacin en latex,

anticuerpos fluorescentes, mtodos inmunoenzimaticos, radioinmunoanlisis y gran

variedad de pruebas especificas para deteccin de IgM.

La vacuna HPV 77 (Meyor-Parkman)es preparada en cultivo celular de

embrin de pato y est indicada en nios desde 1 ao hasta la pubertad.

OBJETIVO El alumno aprender el manejo de la tcnica del ensayo inmunoenzimatico

indirecto de fase slida (EIA), empleada para el diagnstico de anticuerpos Ig G

contra el virus de la rubola.

MATERIAL Y REACTIVOS Equipo Inmuno Comb II para la rubeola IgG Micropipetas con puntilla 10, 25 y 100 ul Perforador Tijera. Reloj Papel desechable Sueros control Suero problema Hipoclorito de Sodio.

METODOLOGIA Pre dilucin de muestras y controles.

1. Para cada muestra y control. Colocar 100 ul de diluyente de la muestra de cada

microtubo.


Q.F.B

58

2. Aadir a cada microtubo 10ul de la muestra o del control positivo o negativo

Mezcle cargando y descargando repetidamente la solucin con la pipeta.

-Realizar un plan de distribucin que identifique plenamente la localizacin de los

sueros muestra, control positivo y negativo.

-Depsito de muestra. Compartimiento A.

Deposite por separado 20 ul de los sueros problema y controles de cada pozo

de compartimiento A, perforando la cubierta de aluminio con el perforador y

descargar la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente

contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga de la solucin en

varias ocasiones.

-Reaccin Ag-Ac.

Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa

apuntando hacia usted. Reinserte la tarjeta varias veces para remover las burbujas

de aire. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubacin extraiga el peine de compartimiento y seque el lquido

sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con el

perforador el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento.

NOTA: Este ltimo procedimiento se repetir siempre antes de pasar de un compartimiento a otro.

-Lavado. Compartimiento B.

Inserte el peine en el compartimiento B e incube por 2 minutos, para lograr un

lavado adecuado, mueva peridicamente el peine hacia atrs y adelante durante la

incubacin.

-Conjugado. Compartimiento C

Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte e peine varias veces para

remover las burbujas de aire. Incube durante 20 min. a temperatura ambiente.

- Lavado. Compartimiento D.

Inserte el peine en el compartimiento D e incube por 2 min., para lograr un lavado

adecuado mueva peridicamente el peine hacia atrs y hacia delante durante la

incubacin.

-Lavado. Compartimiento E.

Repetir el procedimiento como para el compartimiento D.

- Reaccin de color. Compartimiento F.


Q.F.B

59

Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte el peine varias veces para

remover las burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.

- Deteccin de la reaccin. Compartimiento E.

Vuelva a insertar el peine al compartimiento E. Despus de 1 min. retire el peine y

squelo al aire completamente.

CUESTIONARIO. 1.- Cul es el fundamente de esta prueba?

2.- Cul es la diferencia entre rubola congnita y neonatal?

3.- Mencione mecanismos de prevencin y tratamiento para la rubola.


Q.F.B

60

ENSAYO INMUNOENZIMATICO PARA LA DETERMINACIN DEL ANTIGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (AgsHB).

INTRODUCCIN La hepatitis viral es una enfermedad generalizada que afecta principalmente al

hgado. Es causada por los siguientes agentes:

1. Virus de la Hepatitis A (agente causal de la hepatitis infecciosa)

2. Virus de la Hepatitis B (asociado a la hepatitis srica)

3. Virus de la Hepatitis C (causa de muchos casos de hepatitis postranfucional)

4. Virus de la Hepatitis D requiere de la presencia de del VHB. Asimismo, se ha

identificado el agente causal de otra de las formadas de la antes llamada

hepatitis no A-no B

5. Virus de la Hepatitis E

Otros virus que tambien pueden ser agentes causales de la Hepatitis se

encuentran: virus Epstein Bar, rubola, citomegalovirus, coxsakie, varicela zoster

entre otros.

El virus de la Hepatitis B pertenece al grupo hepadnavirus y su transmisin es

va parenteral (sangre y derivados, fomites contaminados por el virus). Al virus se le

conoce como partcula DANE, presente diversos antigenos que estimulas

anticuerpos, lo cual se utiliza en el diagnostico de la enfermedad, este puede

detectarse de manera completa (virin completo) o en partes del mismo, la cubierta

protenica se determina antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y la

partcula interna antgeno core (o central) de la hepatitis B (HBcAg). Resiste la

temperatura a 37C por 1 hora, 60C por 10 horas, 25C por una semana, 100C un

minuto y 20C por 5 aos. El hipoclorito de sodio al 0.5 % lo inactiva en 3 minutos.

La infeccin tiene un periodo de incubacin de 60 a 180 das; su comienzo es

insidioso, con poca o ninguna fiebre. Pudiendo presentarse a cualquier edad.

OBJETIVO 1. El alumno aprender el manejo de la tcnica del Ensayo inmunoenzimtico

indirecto de fase slida (EIA), empleado para el diagnostico de HBsAg.

MATERIAL Y REACTIVOS Equi

Documents

Manual Virología