7. Manual de Virología

1

MANUAL DE LABORATORIO DE VIROLOGIA

AUTORES:

M. en C. JUAN CARLOS BENTEZ SERRANO.

M. en C. GLORIA LEN TELLO.

D. en C. ANA MARTA DE LOS NGELES LOBO SNCHEZ.

M. en C. LAURA MARTNEZ PREZ.

M. en C. NIDIA GARY PAZOS SALAZAR.

M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA.

2013

BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

LICENCIATURA: QUIMICO FARMACOBILOGO

2

NDICE

NMERO DE LA

PRCTICA

TTULO DE LA PRCTICA PGINA

Prctica 1

Seminario: Pruebas de hemaglutinacin (HA) e

inhibicin de la hemglutinacin (IHA).

Fundamentos y aplicaciones.

4

Prctica 2

Pruebas de hemaglutinacin (HA) para el

diagnstico preliminar del virus de la enfermedad

de Newcastle.

9

Prctica 3

Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (IHA)

para el diagnstico definitivo del virus de la

enfermedad del Newcastle.

12

Prctica 4

Seminario: Modelos biolgicos para el cultivo e

identificacin de virus. Huevo frtil de pollo,

animales de laboratorio y cultivos celulares.

15

Prctica 5 Ensayos de las vas de inoculacin en huevo frtil

de pollo.

21

Prctica 6 Replicacin del virus de la enfermedad de

Newcastle en huevo frtil de pollo.

25

Prctica 7

Titulacin (DI50) del virus de la enfermedad de

Newcastle en huevo frtil de pollo.

28

Prctica 8

Preparacin de un medio mnimo para el cultivo y

propagacin de clulas.

31

Prctica 9

Taller demostrativo de proliferacin de cultivos

celulares mediante subcultivo o pase 1:2.

35

Prctica 10 Seminario: Pruebas para el diagnstico clnico de

virus (ELISA, Inmunofluorescencia y Western

blot). Fundamentos, aplicaciones y limitaciones.

38

3

Prctica 12 Replicacin de bacterifagos lticos en 50

Escherichia coli.

Prctica 13 Seminario de pruebas moleculares para el anlisis. 54

PCR y sus variantes; retrotranscripcin, mltiple,

anidada, tiempo real, RFLP, Souther blot,

Northern blot.

Prctica 14 Taller demostrativo para el diagnstico molecular 60

de virus: PCR, electroforesis, restriccin enzimtica.

Bibliografa 72

Prctica 11

Ensayos inmunoenzimticos para el diagnstico de

virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

antgeno de superficie del virus de la hepatitis B

(Ag HBs).

45

4

Practica No. 1

Seminario: pruebas de hemaglutinacin (HA) e inhibicin de la

hemaglutinacin (IHA) fundamentos y aplicaciones

Introduccin

Desde el descubrimiento de los virus se estableci que, de acuerdo con sus propiedades

moleculares, estos agentes infecciosos requieren del empleo de sistemas biolgicos para su

reproduccin; esta condicin hace particularmente difcil emplear sistemas adecuados tales como

los animales de laboratorio o cultivos celulares. De esta manera se tuvieron que buscar

alternativas para el estudio de virus en el laboratorio que eliminasen la necesidad de emplear

clulas vivas.

Prueba de Hemaglutinacin (HA)

Inicialmente, la HA se aplic para el anlisis del virus Influenza, sin embargo, se puede

aplicar para otros viriones que posean protenas estructurales con capacidad hemaglutinante. El

nombre de hemaglutinacin se debe al hallazgo de que los virus Influenza podan aglutinar

eritrocitos; posteriormente se determin que el origen de esta propiedad se deba a la existencia

de una glicoprotena presente en la envoltura viral a la cual se le denomin hemaglutinina. Esta

protena acta como el ligando viral que reconoce a su receptor en clulas blanco. En trminos

generales, este receptor corresponde a molculas de cido silico presentes sobre la superficie de

diversos tipos celulares, organizadas en diferentes enlaces qumicos con otros carbohidratos.

La funcin de la hemaglutinina viral no es simplemente aglutinar eritrocitos, sino mediar

la adsorcin en la replicacin viral, pero sus propiedades son empleadas para desarrollar pruebas

de seleccin tal como la hemaglutinacin. Esta prueba de presenta algunas ventajas, pero

tambin limitaciones que se enlistan a continuacin:

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO


5

Fig. 1 Ilustracin del virus Influenza

Ventajas:

Desarrollo sencillo.

No requiere de una infraestructura elaborada.

Econmica.

Ideal cuando se emplean muestras con alta concentracin de viriones.

Aplicacin en ensayos que orientan sobre la naturaleza qumica de receptores celulares.

Limitaciones:

Empleada slo como diagnstico presuntivo.

Especificidad limitada por agentes no virales que pueden hemaglutinar

Poca sensibilidad.

Riesgo de obtencin de resultados falsos negativos.

El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la presencia de viriones con

protenas hemaglutinantes que reconocen receptores celulares. De esta manera, los virus se

unirn a los eritrocitos de diferentes especies siempre que posean en su superficie molculas de

cido silico (fig.2).

6

Fig. 2. Representacin de la reaccin de HA

Esta prueba requiere contar con muestras que contengan un nmero elevado de viriones,

tales como suspensiones virales provenientes de lotes vacunales, cosechas virales obtenidas de

clulas en cultivo, o bien, muestras clnicas tomadas durante la fase aguda de la enfermedad.

Para procesar las muestras se preparan diluciones seriadas al doble, desde una dilucin

1:10 hasta 1:1280 empleando como diluyente solucin reguladora de fosfatos. Posteriormente a

cada dilucin se le adiciona la misma cantidad de una suspensin de eritrocitos preparada al 1%,

incluyendo un control de reaccin que solo contendr solucin reguladora de fosfatos y

eritrocitos.

El soporte para llevar a cabo este ensayo son microplacas de 96 pozos con fondo en U, de

tal manera que los eritrocitos aglutinados forman una red o malla en el fondo del pozo,

mientras que los no aglutinados sedimentan por gravedad formando un botn homogneo (fig.

3).

Fig. 3. Sedimentos en la prueba de HA

7

Una prueba de HA positiva sugiere la presencia de un virus con capacidad hemaglutinante

en la muestra, sin embargo la identificacin final del virus debe establecerse con un ensayo

complementario.

Prueba de Inhibicin de la Hemaglutinacin (IHA)

Para realizar un diagnstico viral definitivo debe llevarse a cabo una prueba que

demuestre un tipo de respuesta especfica del husped hacia un virus en particular, tal como la

produccin de anticuerpos que se pone de manifiesto en pruebas del tipo de la Inhibicin de la

Hemaglutinacin (IHA).

Este ensayo se basa inicialmente en la unin de anticuerpos especficos con la

hemaglutinina viral, tal que se impida en una reaccin posterior, la formacin de puentes entre los

ligandos virales y los receptores presentes sobre la superficie de los eritrocitos que daran lugar a

una reaccin de hemaglutinacin.

La prueba de IHA, puede representarse esquemticamente de la siguiente manera:

Primera etapa: Reconocimiento Ag viral Ac

Viriones con

protenas

hemaglutinantes

Anticuerpos anti-HA Neutralizacin

de protenas

hemaglutinantes

8

No se lleva a cabo

la interaccin

virus-eritrocito

Segunda etapa: Reaccin de complejos Ag-Ac con eritrocitos

La presencia de anticuerpos que puedan reconocer aislamientos virales, permite realizar

un diagnstico especfico, tomando como base un principio fundamental en inmunologa el cual

establece que la presencia de anticuerpos en un hospedero, es la consecuencia de una exposicin

previa al antgeno que origin su produccin.

En esta prueba se realizan diluciones seriadas al doble de un suero que contenga

anticuerpos contra un virus hemaglutinante, iniciando con una dilucin 1:2 y hasta alcanzar

1:256. A cada dilucin del suero se le agregan 4 unidades hemaglutinantes (concentracin que se

conoce a travs de un ensayo preliminar de hemaglutinacin) de un virus determinado, incubando

durante 10 minutos para permitir el reconocimiento Ag-Ac. Finalmente se adiciona una

suspensin de eritrocitos al 1%. Al igual que en la prueba de hemaglutinacin, se incluye un

control de reaccin que solo contendr solucin reguladora de fosfatos y eritrocitos. Si el ensayo

se realiza en microplacas de 96 pozos con fondo en U, los resultados esperados sern los

siguientes:

Fig.4. Sedimentos correspondientes a las pruebas de IHA+ e IHA

9

Practica No. 2

Pruebas de hemaglutinacin (HA) para el diagnstico preliminar del virus de

la enfermedad de Newcastle

Introduccin

Muchos virones animales posen en su envoltura protenas codificadas por el genoma viral

capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar puentes entre los glbulos

para constituir una red. Este fenmeno conocido como Hemaglutinacin fue primeramente

descrito para el anlisis del virus Influenza. En este caso la protena hemaglutinante

(Hemaglutinina) en la superficie del virin es una glicoprotena que en adicin de la

Neuraminidasa se proyecta en la envoltura viral. El virin se unir a cualquier eritrocito de la

especie que sea siempre que lleve los receptores complementarios que en este caso son molculas

de Acido N-Acetil-Neuramnico.

El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro de la familia Paramyxoviridae; es

un patgeno primario de aves en quienes produce infecciones respiratorias y digestivas con

trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a parlisis y muerte; en el humano puede

ocasionalmente producir conjuntivitis autolimitada.

Se requieren aproximadamente 107

viriones de Newcastle para causar aglutinacin, por lo

que la Hemaglutinacin no es un indicador sensible de la presencia de pequeas cantidades de

viriones pero por su simplicidad constituye un ensayo conveniente si se dispone de grandes

cantidades de viriones.

Objetivos

1. El alumno dominar el manejo de la tcnica de la reaccin de Hemaglutinacin (HA).

2. El estudiante determinar la concentracin de viriones presentes en una suspensin, la

cual expresar en Unidades Hemaglutinantes (UHA).





10

Material

Solucin reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2

Microplacas de poliestrireno con fondo en U.

Micropipetas de volmen variable de 20- 200 L.

Puntillas para micropipeta.

Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota)

Suspensin de glbulos rojos de pollo al 1% en solucin reguladora de fosfatos con pH =

7.2.

Pipetas de vidrio de 1 y 5 mL.

Solucin de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.

Algodn alcohol al 70%.

Recipiente para recolectar desechos.

Metodologa

1. Empleando solucin reguladora de fosfatos con pH = 7.2, realizar una serie de diluciones

seriadas al doble de la vacuna viral, desde 1:10 hasta 1:1280 (Esquema No. 1); es muy

importante incluir un pozo control que no contendr virus.

a. En un frasco con tapn de rosca preparar una dilucin 1:10 de la vacuna viral. Agregar al

pozo A1 de la microplaca 200 L de la dilucin anterior.

b. Agregar 100 L de solucin reguladora de fosfatos con pH = 7.2 de los pozos A2 hasta el

A9.

c. Transferir 100 L de la dilucin 1:10 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave.

d. Nuevamente transferir 100 l de sta dilucin (1:20) al pozo A3 mezclando en forma

homogenea como en el paso c; de esta manera se obtendr ahora una dilucin 1:40.

e. Repetir este procedimiento hasta el pozo A8 que corresponder a una dilucin 1:1280.

f. Desechar 100 L de la suspensin viral del pozo A8, tranfirindolos al pozo A12 y

teniendo cuidado en no agregar dilucin viral al pozo A9 que sirve como control de la

reaccin.

11

Esquema No. 1

2. Agregar a todos los pozos 100 L de una suspensin al 1% de glbulos rojos de pollo.

3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo e incubar a temperatura ambiente hasta que

los eritrocitos del pozo A9 hayan sedimentado.

4. Identificar la ltima dilucin en que se presente una reaccin positiva de hemaglutinacin,

la cual corresponder a 1 unidad hemaglutinante (1 UHA), es decir, la concentracin

mnima de viriones que es capaz de aglutinar una suspensin de referencia de eritrocitos

de pollo al 1% en solucin reguladora de fosfatos con pH = 7.2.

5. Reconocer la dilucin del virus vacunal que contenga 4 UHA.

Cuestionario

1. Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA.

2. Anote dos razones por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba

de HA.

3. De qu otra especie animal se pueden emplear eritrocitos para la prueba de HA?

4. Porque la prueba de HA no se considera confirmatoria?

5. Cul sera la muestra clnica para diagnosticar infeccin por virus del Newcastle

aplicando la prueba de HA.?

12

Practica No. 3

Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (IHA) para el diagnstico

definitivo del virus de la enfermedad del Newcastle

Introduccin

La prueba de Hemaglutinacin es un diagnstico preliminar de enfermedad por virus Newcastle,

de manera que si resulta positiva, no permite concluir que este virus sea el agente causal del

cuadro clnico en el ave con enferma.

Con base en lo anterior, para realizar un diagnstico definitivo se debe demostrar una

respuesta especfica del husped hacia este virus, determinando la presencia de anticuerpos por

medio de la reaccin de Inhibicin de la Hemaglutinacin (IHA).

Esta prueba se basa en la unin de un anticuerpo especfico hacia la hemaglutinina del

virin que impida la formacin de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este hecho

permite identificar completamente a virus hemaglutinantes y se conoce tambin como

neutralizacin vrica.

Objetivos

1. El estudiante desarrollar la tcnica de Inhibicin de la Hemaglutinacin para determinar

el ttulo de un suero problema.

2. El alumno ser capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar esta prueba de

identificacin viral.

Material

Solucin reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2.

Microplaca de poliestireno de 96 pozos con fondo en U.

Micropipetas de volmen variable de 20- 200 L.

Puntillas para micropipeta.

Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota).





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Suspensin de glbulos rojos de pollo al 1%.

Suero problema.

Pipetas de vidrio de 1 y 5 mL.

Solucin de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.

Algodn y alcohol al 70%.

Recipiente para recolectar desechos.

Metodologa

Con base en los resultados de la prctica anterior, preparar en un frasco con tapn de

rosca una dilucin del virus de la enfermedad de Newcastle que contenga 4 UHA, empleando

solucin reguladora de fosfatos; considerar un volumen suficiente para realizar la prueba de IHA.

De esta manera, si el resultado de la prctica de HA hubiese sido:

Dilucin 1:40 de la vacuna viral = 1 UHA, Por lo tanto:

Dilucin 1:10 de la vacuna viral = 4 UHA

Volmen suficiente para realizar la prueba de IHA = 2 ml. Entonces:

Vacuna viral concentrada 200 l

+

SRF 1800 l

_________

Volmen final 2000 ml de una dilucin viral con 4 UHA

1. Hacer diluciones seriadas al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo

al esquema No. 2; incluir un pozo control que no contendr antisuero ni suspensin viral:

a) Agregar 100 L de una dilucin 1:2 del suero problema al pozo A1.

b) Adicionar 50 L de SRF de los pozos A2 al A8; en el pozo A9 colocar 100 l de la

misma solucin.

c) Transferir 50 L del pozo A1 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave para obtener

una dilucin del suero problema de 1:4.

d) Nuevamente transferir 50 l ahora del pozo A2 al A3 (para obtener una dilucin 1:8),

homogenizar y repetir el procedimiento hasta el pozo A8 que corresponder a una

dilucin 1:256.

e) Desechar 50 L del pozo A8 colocndolos en el pozo A12, teniendo cuidado en no

agregar ninguna dilucin del suero al pozo A9 ya que sirve como control de la reaccin.

14

Esquema No. 2

2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del virus vacunal en un

volumen de 50 L.

3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo para que haya reaccin antgeno-anticuerpo e

incubar a temperatura ambiente durante 10 min.

4. Agregar 100 L de la suspensin de glbulos rojos al 1% a todos los pozos, desde A1

hasta A9; nuevamente rotar la microplaca e incubar a temperatura ambiente hasta que los

glbulos rojos del pozo A9 que sirven como control hayan sedimentado.

5. Determinar el ttulo del suero problema identificando la ltima dilucin en que se observe

inhibicin de la hemaglutinacin.

Cuestionario

1. Cul es la interpretacin que debe darse a un resultado negativo en la prueba de IHA?

2. Qu interpretacin diagnstica debe sealarse para un resultado positivo en la prueba de

IHA?

3. Combinando los resultados de las pruebas de HA e IHA, cul es la interpretacin

diagnstica en los siguientes casos: a) HA: positiva, IHA: negativa; b) HA: negativa,

IHA: positiva; c) HA: positiva, IHA: positiva

15

Practica No. 4

Seminario: modelos biolgicos para el cultivo e identificacin de virus. Huevo

frtil de pollo, animales de laboratorio y cultivos celulares.

Introduccin

Gran parte de nuestro conocimiento sobre la herencia, el desarrollo, la fisiologa y los

procesos celulares y moleculares subyacentes se derivan de los estudios de un modelo u

organismos de referencia; a pesar de la gran diversidad de formas de vida y su alto grado de

complejidad, algunas caractersticas compartidas entre los seres vivos ha permitido la bsqueda

de respuestas ante las interrogantes planteadas por los investigadores.

Se cree que Gregor Mendel fue el primero que eligi cuidadosamente un organismo para

responder experimentalmente preguntas universales relacionadas con la herencia. Mendel fue

muy cuidadoso con las caractersticas filogenticas y la susceptibilidad a la investigacin

experimental que deba tener un organismo modelo para evitar obtener resultados dudosos; estas

caractersticas siguen siendo actualmente la base para la seleccin de un modelo biolgico.

Los modelos biolgicos representan slo una nfima fraccin de la biodiversidad que

existe en el planeta por lo que podra ser una muestra sesgada de los seres vivos, por lo que se

asume que el conocimiento de estos organismos permite extrapolar la informacin obtenida al

resto de organismos considerando un origen comn de las especies. Sin embargo, queda la

interrogante de si el corto ciclo vital de la mayora de los modelos biolgicos y la facilidad de

manipulacin, son representativos de todos los seres vivos o si sus caracteres excepcionales

permiten hacer generalizaciones del mundo vivo (figura 1).





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Fig. 5 rbol de la vida, mostrando una seleccin de varios organismos. Los organismos

utilizados con mayor frecuencia en la investigacin como modelos biolgicos se indican en color

rojo (Ciccarelli et al., 2006; Letunic et al., 2007)

Criterios de seleccin

En la actualidad los criterios utilizados para seleccionar un modelo biolgico para

experimentacin es su posicin filogentica, ya que cualquier organismo seleccionado para un

estudio es un modelo si es tomado como representante de algunas caractersticas de un grupo

mayor (gnero, familia, orden o phylum) o de un taxn inaccesible y la disponibilidad

experimental, pues estos organismos son seleccionados de acuerdo a caractersticas muy

especficas de la investigacin que se realiza, siendo importante controlar su pureza y evitar su

contaminacin bitica, por lo que se requiere que su produccin sea estandarizada, que tengan

caractersticas genticas y sanitarias definidas, que sean criados o cultivados en ambientes

17

controlados, que respeten los requerimientos de la especie y que se cumplan los principios ticos

para su bienestar.

Ejemplos de algunas especies utilizadas como modelos biolgicos en virologa

Drosophila

Fue adoptada como animal de experimentacin gentica por Thomas Morgan a principios

del siglo XX. Tambin llamada mosca del vinagre o mosca de la fruta, es una especie de dptero

braqucero de la familia Drosophilidae. Recibe su nombre debido a

que se alimenta de frutas en proceso de fermentacin. Es una especie

utilizada frecuentemente en experimentacin gentica, dado que

posee un reducido nmero de cromosomas (4 pares), breve ciclo de

vida (15-21 das) y aproximadamente el 61% de los genes de

enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el genoma de las

moscas de la fruta y el 50% de las secuencias protenicas de la mosca tiene anlogos en los

mamferos. Para propsitos de investigacin, fcilmente pueden reemplazar a los humanos.

Actualmente se utiliza como modelo para estudiar numerosos procesos biolgicos incluyendo la

respuesta inmunolgica a ms de 20 virus de RNA diferentes como el VIH, virus del dengue,

Fiebre amarilla, etc.

Neurospora

Es un gnero de hongos Ascomyceto. La especie ms conocida de este gnero es

Neurospora crassa. The National Institute of Health lo reconoci

como uno de los 12 organismos eucariotes modelo para la

investigacin en Gentica y Biologa Molecular, debido a que es fcil

de cultivar y tiene un ciclo de vida haploide que simplifica el anlisis

gentico ya que los rasgos recesivos se mostrarn en la descendencia;

el anlisis de la recombinacin gentica es facilitado por el arreglo ordenado de los productos de

la meiosis. Este hongo es utilizado para expresar los genes de herpes virus thymidine-kinase,

permitiendo el estudio de drogas anticancergenas y antivirales.

Bacteria

Entre los organismos modelo ms utilizados se encuentra la bacteria Escherichia coli, una

bacteria Gramnegativa, anaerobia facultativa y no esporulada, con un genoma de

aproximadamente 4'6 kb. Algunas cepas de esta bacteria son enormemente verstiles en

18

laboratorio, tolerando muy bien la manipulacin gentica e incluso

perdiendo su capacidad patognica. Se ha observado que gran parte de

sus estructuras y funciones son extrapolables en cierta medida a un

gran nmero de microorganismos, incluida la clula eucariota.

Tambin se utiliza como almacn de material gentico, fbrica de

virus, vector de plsmidos, etc.

Bacteriofagos

Los fagos o virus que infectan bacterias, se establecieron como modelos biolgicos por la

iniciativa de Max Delbrck. Los fagos cumplen un papel de gran

importancia en la Biologa Molecular al ser utilizados como vectores

de clonacin para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener como

resultado bibliotecas genmicas. Los fagos ms utilizados con este fin

son el Fago y el Fago T4. Algunos estudios realizados en los

bacterifagos son: Protenas involucradas en la sntesis de ADN, ARN y protenas Regulacin

gnica; Cncer y control de la proliferacin celular, Transporte de protenas y organelos dentro de

las clulas; Infeccin e inmunidad; Posible va de acceso para terapia gnica. En la actualidad

estn siendo utilizados como modelos biolgicos para inducir la respuesta inmunolgica.

Caenorhabditis elegans

Es un nemtodo con una longitud aproximada de 1 mm, estructura bilateral simtrica y

ciertos precursores de rganos superiores, a saber, boca (estoma),

faringe, intestino y gnadas principalmente. Es un nemtodo

transparente por lo que permite diferenciar visualmente todas sus

estructuras, es hermafrodita, facilitando la transmisin de mutaciones.

Su genoma de 97 Mb est estructurado en 5 pares de cromosomas ms

dos cromosomas X en hermafroditas y un slo X en machos (un

0'05% del total de una descendencia). Si juntamos las caractersticas anteriores con su ciclo vital

de dos o tres semanas en laboratorio y la implicacin de larvas en el desarrollo se consigue un

organismo modelo con nuevas perspectivas en investigacin. El estudio de este organismo aporta

gran cantidad de informacin sobre diferenciacin celular y apoptosis, especialmente til en la

rama conocida como biologa del desarrollo. Los investigadores de la Universidad de California

en Riverside (UCR), han desarrollado de C. elegans como modelo para estudiar la reproduccin

19

de virus altamente peligrosos como el virus del Ebola, VIH, Hepatitis C, Fiebre del Nilo, etc.;

permitiendo trazar un mapa de la delicada interaccin entre virus y anfitrin; demostrado que la

copia del virus en el gusano provoca una respuesta antiviral conocida como ARN silenciador o

ARN interferencia (ARNi) que destruye el ARN viral.

Ratn

El ratn comn (Mus musculus), es una especie de roedor miomorfo de la familia

Muridae. Es la especie ms frecuente de ratn. Se cree que es la segunda especie de mamferos

con mayor nmero de individuos, despus del Homo sapiens. Habita

siempre cerca a los humanos, con los que mantiene una relacin de

comensalismo. Es tambin el mamfero ms utilizado en experimentos

de laboratorio y existen multitud de variantes transgnicas que simulan

enfermedades genticas humanas. Los principales estudios realizados en

el ratn comn son: desarrollo de tejidos corporales, funcin del sistema inmune de los

mamferos, formacin y funcin del cerebro y del sistema nervioso, modelos de cnceres y de

otras enfermedades humanas, regulacin gnica y herencia, enfermedades infecciosas virales y la

respuesta inmunolgica.

Huevo Frtil de Ave

El huevo frtil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible

para el cultivo, titulacin e identificacin de virus. En

comparacin con los animales de laboratorio empleados para

otros ensayos virales, el modelo de huevo frtil ofrece

diversas ventajas tales como: desarrollo en condiciones de

esterilidad; no poseen funciones inmunolgicas desarrolladas;

bajo costo; manipulacin relativamente sencilla; no requieren

de una infraestructura compleja. El huevo frtil empleado

para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves libres de patgenos especficos (ALPES), para

evitar la presencia de virus que comnmente afectan a las aves, en especial Adenovirus,

Coronavirus, Bronquitis Infecciosa Aviar, etc., o bien, bacterias de los gneros Salmonella,

Pseudomonas, Pasteurella, etc. Para el cultivo y titulacin de virus, es indispensable determinar

la viabilidad del embrin, as como tener destreza en el dominio de las tcnicas de inoculacin,

20

todo ello debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas clulas o

tejidos.

Cultivos Celulares

En 1949 John Enders, Thomas Weller y Frederick Robbins describieron las condiciones

bajo las cuales Poliovirus poda cultivarse en clulas eucariticas de origen no neuronal, lo que

les permiti ganar aos ms tarde el premio Nobel en Fisiologa y

Medicina. A partir de entonces, los cultivos de clulas reemplazaron a

los animales de laboratorio como modelo de reproduccin de virus y en

nuestros das son utilizados en muchos campos del rea biomdica.

Este modelo biolgico est conformado por conjuntos de clulas con

caractersticas definidas que se mantienen en condiciones de laboratorio sobre soportes inertes (in

vitro), pero mantienen capacidad de proliferar a travs de divisiones mitticas requiriendo de

medios de cultivo con una composicin compleja que les provea de los nutrientes necesarios para

su preservacin y desarrollo. Las clulas se obtienen inicialmente de tejidos sanos o tumorales y

se disocian mediante diferentes mtodos hasta obtener fragmentos ms pequeos que pueden ser

disgregados con enzimas proteolticas para formar suspensiones celulares.

Cuestionario

1. Cules son las limitantes del uso de huevo frtil para la propagacin de virus?

2. Mencione las ventajas y desventajas del empleo de animales de laboratorio para el anlisis

de virus.

3. Qu virus se propagan nicamente en animales de laboratorio?

4. Cite las desventajas del modelo de cultivos celulares.

5. Mencione ejemplos de bacterias, diferentes de Escherichia coli, en las que se pueden

propagar bacterifagos y cite ejemplos de stos.

21

Practica No. 5

Ensayos de las vas de inoculacin en huevo frtil de pollo

Introduccin

El huevo frtil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para el

cultivo, titulacin e identificacin de virus. En comparacin con los animales de laboratorio

empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo frtil ofrece diversas ventajas tales como:

Son estriles.

No tienen funciones inmunolgicas desarrolladas.

No son costosos.

Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza tcnica en

comparacin con otros sistemas biolgicos, tales como el mantenimiento y

reproduccin de cultivos celulares.

El huevo frtil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves sanas ALPES,

aves libres de patgenos especficos o SPF por sus siglas en ingls, para de esta manera eliminar

la presencia de virus que comnmente afectan a las aves como Adenovirus o Bronquitis

Infecciosa Aviar, etc.

Para la propagacin, cultivo y titulacin de virus, es indispensable determinar la

viabilidad del embrin, as como dominar las tcnicas para las diferentes vas de inoculacin

debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas clulas o tejidos. En la

figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo frtil.

Una vez realizado el ensayo de la inoculacin, deber observarse el conjunto del huevo

frtil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biolgico empleado.





22

Fig. 6. Compartimentos del huevo frtil de ave.

Objetivos:

Al finalizar la sesin, el alumno:

1. Determinar al ovoscopio la viabilidad del embrin.

2. Dominar las tcnicas comnmente utilizadas para la inoculacin de huevos frtiles de

ave.

3. Diferenciara las estructuras embrionarias observando la organizacin de los tejidos fuera

de su cutcula.

Material:

Huevos frtiles de ave de 10 das de inoculacin (+/- 1 da), calidad ALPES.

Ovoscopio y pinzas de diseccin

Recipiente para recibir desechos

Charola porta embriones

Perforadores, bulbos y lpiz.

Jeringas de insulina

Agujas de 20 x 38 mm.

Colorantes

Guantes.

1

2

3 4

5

1 Cavidad Alantoidea

2 Saco de Aire

3 Saco Amnitico

4 Saco Vitelino

5 Membrana Corioalantoidea

23

Desarrollo:

I.- Confirmacin de la viabilidad del embrin

Transluminar cada embrin colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un embrin

no viable puede reconocerse a travs de:

Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutcula.

Falta de irrigacin.

Falta de movimiento.

Cualquier coloracin de verde a negra que indica por lo general contaminacin bacteriana.

II.- Tcnicas de inoculacin

A Cavidad alantoidea

a Transluminar el huevo frtil con ayuda del ovoscopio.

b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del lmite de la cmara de aire del lado

contrario al embrin y en una zona escasamente irrigada.

c Perforar la marca sealada.

d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ngulo de 45

grados con respecto al huevo frtil de ave.

B Saco vitelino

a Localizar la parte ms alta del embrin sobre la cmara de aire y marcar con un punto o

cruz.

b Marcar otro punto o gua que indicara la localizacin del embrin.

c Perforar la marca sealada

d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinacin opuesta a la localizacin

del embrin

C Membrana corioalantoidea

a Localizar la parte ms alta de la cmara de aire y marcar un punto o cruz (*).

b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localizacin del embrin en un rea con

la menor irrigacin posible.

c Perforar ambas marcas.

d Succionar con un bulbo de goma a travs del punto marcado en la primera posicin (*),

creando as una cmara de aire falsa en la parte media del embrin.

24

e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar que se

desarroll la cmara de aire falsa.

En estos ensayos, se emplearan colorantes para las diferentes inoculaciones con el

objetivo de facilitar la visualizacin del sitio donde se pretendi depositar un volumen

determinado de colorante. Una vez realizada la tcnica, se abrirn los huevos frtiles de ave para

analizar si la va elegida fue efectivamente inoculada, vertiendo el contenido del embrin sobre

cajas de Petri.

Cuestionario

1. De acuerdo con lo observado despus de abrir los embriones de pollo y segn la va de

inoculacin empleada; esquematice para cada va, cuales zonas deben quedar teidas y

cules no, si la inoculacin se realiz correctamente.

2. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por va saco vitelino, mencionando las

lesiones que causan.

3. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por va membrana corioalantoidea

mencionando las lesiones que causan.

4. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por va cavidad alantoidea,

mencionando las lesiones que causan.

5. Qu otras aplicaciones tiene el huevo frtil adems de la propagacin de virus?

25

Prctica No. 6

Replicacin del virus de la enfermedad de newcastle en huevo frtil de pollo

Introduccin

Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamferos daos

severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interaccin induzca

una proteccin inmunolgica al individuo como consecuencia del reconocimiento de antgenos

especficos tanto en forma natural como artificial. En el caso de medidas profilcticas, con el

empleo de vacunas se procura inducir una Inmunidad Adquirida Artificial.

Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la vacuna.

Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoracin se puede efectuar en sistemas

biolgicos tales como huevos frtiles de ave que pueden responder a la infeccin viral dando

lesiones caractersticas del virin inoculado que afecte directamente al embrin y le produce

signos tales como msculos distrficos, enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y lquidos

extraembrionarios donde se pueden observar hemorragias, formacin de placas o pstulas as

como determinar la presencia de hemaglutininas virales.

Los virus vacunales o de campo pueden titularse en huevos frtiles de ave cuando

producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP50) o en el caso de virus

hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la reaccin de

Hemaglutinacin de los fluidos cosechados.





26

Objetivos

1. El alumno desarrollara la tcnica para propagar una cepa vacunal de virus. atenuados de la

enfermedad de newcastle

2. El alumno determinar la DIEP50 para la vacuna del Virus de laenfermedad de newcastle ,

calculando sus concentracin por unidad de volumen.

Material

Huevo frtil de ave de 10 dias de incubacin (+/- 1 dia) calidad ALPES.

Vacuna con viriones atenuados de la enfermedad de newcastle

Solucion reguladora de fosfatos (srf) de dulbecco con ph 7.2 o solucion salina

Suspensin de eritrocitos de pollo al 1%

Lpiz, pegamento blanco y perforadores

Hisopos estriles, tintura de yodo.

Estufa a 37C.

Ovoscopio.

Jeringas para aplicacion de insulina.

Mechero.

Recipiente para desechos.

Desarrollo:

1. Realizar con solucion salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral desde 10-1

hasta 10-8

a partir de una suspensin concentrada.

2. Trasluminar el huevo frtil de ave y seguir la tcnica de inoculacin para cavidad

alantoidea

3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculacin con tintura de yodo antes

y despus de perforar

4. Inocular 0.1 mLde las cuatro ultimas diluciones en cada uno de 5 embriones de 9 a 11

das de incubacin (20 embriones en total), va cavidad alantoidea.

5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforacin con una gota de pegamento blanco

6. Marcar con lpiz sobre cada embrin la dilucin y vacuna inoculada

27

7. Incubar a 37C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los embriones al

ovoscopio, sealando en el primer dia los embriones que resulten muertos por

traumatismo

Cuestionario

1. Que es una vacuna?

2. Qu parametros deben tomarse en cuenta para evaluar la calidad de una vacuna?

3. Para que es importante tener una vacuna de calidad?

4. Mencione al menos cinco vacunas que en la actualidad sean producidas en huevo frtil de

ave

5. Mencione vacunas elaboradas con virus atenuados de uso humano.

28

Prctica No. 7

Titulacin (DI50) del virus de la enfermedad de newcastle en huevo frtil de

pollo

Introduccin

Uno de los procedimientos importantes en virologa es medir la concentracin de un virus en

una muestra, o el ttulo viral.

Las tcnicas de titulacin viral son en muchos casos un paso previo y necesario para

desarrollar otros tipos de estudios tales como: ensayos de neutralizacin, determinacin de actividad

antiviral de un extracto dado, ensayos de identificacin viral como en el caso de virus influenza

(ensayo de inhibicin de la hemaglutinacin), etc.

La cantidad de virus presente en una muestra se calcula por diversos mtodos entre los

cuales se encuentra la dosis infectante al 50% (DI50). Para llevar a cabo este ensayo, diluciones

seriadas de virus son inoculadas en cultivos celulares, huevos embrionados o animales. Los

resultados son observados despus de dejar el tiempo apropiado para que la infeccin y replicacin

viral se lleve a cabo.

El ttulo viral es definido como aquella dilucin de virus que infecta (o mata) el 50% de la

poblacin inoculada.

En stos anlisis para determinar el ttulo viral, se utiliza el mtodo de Reed y Muench, el

cual es relativamente simple. Se basa en la suposicin de que el nmero de unidades de prueba

afectadas vara proporcionalmente al log10 de la dilucin, es decir que a diluciones menores (mayor

concentracin de virus) el porcentaje de efecto ser mayor que a diluciones mayores (menor

concentracin de virus). Adems, considera que en la zona cercana al 50% de efecto ste vara

linealmente con la dosis. Es muy importante no omitir ninguna dilucin intermedia.





29

Objetivo

1. El alumno titular la vacuna del Virus de la enfermedad de newcastle, determinando la

DLEP50 calculando sus concentracin por unidad de volumen.

Desarrollo:

1. Al termino de la incubacin, de los embriones de la prctica anterior, cosechar un poco de

fluido alantoideo de cada uno de los 20 huevos inoculados, para efectuar

hemaglutinaciones.

2. Anotar los resultados obtenidos y realizar los clculos para determinar la DIEP50 / 0.1 ml

empleando el metodo de Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo

Resultados de las pruebas de hemaglutinacion

DILUCION EMBRIONES

INOCULADOS

HA+ HA-

10-3

5 4 1

10-4

5 3 2

10-5

5 2 3

10-6

5 1 4

Calculos

1) ACUMULADOS

POSITIVOS

2) ACUMULADOS

NEGATIVOS

3) RADIO DE

POSITIVIDAD

4) PORCENTAJE

10 1 10 / 11 90.9

6 3 6 / 9 66.6

3 6 3 / 9 33.3

1 10 1 / 11 9.09

Para una mejor explicacin, se desgloza a continuacin la realizacin de los clculos para cada

columna:

Columna 1: Realizar la suma acumulada de pruebas HA+, desde la dilucin mas alta hasta la mas

baja.

Columna 2: Realizar la suma acumulada de pruebas HA- desde la dilucin mas baja a la mas alta.

30

Columna 3: Para cada dilucin anotar el cociente dado por los acumulados con HA+ sobre la

suma de acumulados con HA+ y HA-.

Columna 4: Expresar el cociente anterior como porcentaje

Calcular el valor de interpolacin (VI.) con la siguiente frmula:

% Positividad 50% - 50% 66.6 50.0 16.6 V.I. = =

% Positividad 50% - % Positividad 50% 66.6 33.3 33.3

V.I. = 0.49

Multiplicar el logaritmo negativo del factor de dilucin por el valor de interpretacin para as

calcular el valor de interpolacin corregido.

Para este caso:

V.I.C.= log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de positividad

En el ejemplo: 10-6

y 10-7

Estimar la DIEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilucin que presente mayor del 50% de

positividad, en este ejemplo.

DIEP50 = 10-6 + (-0.49)

= 10-6.49

El titulo se obtiene con el inverso del valor de la DIEP50.

Finalmente el resultado sera:

Titulo = 106.49

/0.1ml , que es la concentracin de viriones presentes en 100 microlitros de

la vacuna original

Cuestionario

1. Adems de la titulacin viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote vacunal antes

de salir al mercado?

2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra viral.

3. En esta prctica que nos indica una HA+

4. Porque emplear el metodo de Reed & Muench.?

5. Qu otros mtodos se utilizan para titular una muestra viral?

31

Prctica No. 8

Preparacin de un medio mnimo para el cultivo Y propagacin de clulas

Introduccin

En el organismo, las clulas y los tejidos constantemente son alimentados con fluidos

circulantes en el cuerpo, los cuales proveen nutrientes y oxgeno adems remueven los productos

de desecho del metabolismo celular. De la misma forma cuando las clulas son cultivadas in

vitro, dependen completamente de fluidos de cultivo para sus requerimientos nutricionales. Las

primeras soluciones utilizadas para cultivos celulares consistan en suero sanguneo, coagulos de

plasma y linfa. Durante la dcada de los 30, se establecieron los requerimientos nutricionales

para el crecimiento de clulas en cultivo y de ah se desarrollaron los nuevos medios sintticos.

En 1950 Morgan formul el Medio 199, que permite el crecimiento de clulas primarias de

embrin de pollo. Este medio contiene 61 nutrientes sintticos adems de 5-10% suero bovino

fetal (SBF). En 1955, Eagle realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos

nutritivos de las clulas en cultivo e identifiva 28 sustencias esenciales para el crecimiento celular

y la necesidad de soluciones corporales complejas en el medio de cultivo como el suero,

desarrollando el Medio Basal de Eagle (MBE) que incluye glucosa como fuente de energa, 13

aminocidos como precursores de protenas, 8 vitaminas como cofactores y seis sales que

proveen cofactores metablicos que controlan el pH y regulan el balance electroltico. Eagle

desarroll posteriormente el Medio Esencial Mnimo de Eagle (MEME) el cual contiene

concentraciones mayores de aminocidos y vitaminas; este es el medio ms comn en los

laboratorios y su mayor ventaja es que permite mantener los cultivos por ms tiempo sin

necesidad frecuente de cambio de medio.





32

En 1965, Ham introduce el primer medio definido, libre de suero y capaz de mantener

indefinidamente algunas clulas de mamfero en cultivo. Basicamente, un medio de cultivo

celular debe de contener:

Iones como Na, K, Ca, Mg, Cl y P

Elementos trazas como Fe, Zn y Se

Fuentes de energa como glucosa

Aminocidos que son 13 aminocidos esenciales en los cultivos celulares

Vitaminas

Protenas, pptidos, lpidos

Antibiticos y antimicticos

Suero como soporte para el crecimiento de la mayora de las clulas

Los medios para cultivo celular se pueden clasificar como medios de mantenimiento o

crecimiento, medios de congelacin (que contienen hasta el 20% de SFB como crioprotector),

medios selectivos que favorecen el crecimiento de cierto tipo de clulas y los medios definidos

donde se conocen todos y cada uno de los componentes y sus concentraciones exactas.

Para la eleccin de un medio de cultivo se debe tener en cuenta el tipo de celula que se va

a cultivar y los requerimientos esenciales que la clula necesita para su desarrollo. Actualmente

se comercializan un gran nmero de medios de cultivo, siendo la unica diferencia la cantidad de

los componentes nutritivos en ellos ya que la composicion no varia. Algunos ejemplos de los

medios utilizados con mayor frecuencia son:

Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se

necesita siempre la suplementacin con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de

fibroblastos de ratn y clulas HeLa.

Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso ms comn, contiene ms

aminocidos y en mayor concentracin que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de

cultivos y requiere la adicin de suero (10%).

RPMI 1640. Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares

leucmicas en suspensin. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos

adecuados.

33

Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentracin

de aminocidos y vitaminas que el BME. Se usa para la seleccin de hibridomas.

Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que

incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, etc. Es muy til para el

cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambin sirve para otros tipos celulares,

pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.

McCoy 5A. Medio diseado para el crecimiento de lneas celulares diploides tanto de rata

como humanas.

Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de lneas celulares humanas, debe ser

suplementado con protenas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es til para

el cultivo de clulas amniticas.

Medio F-12 de Ham. til para el crecimiento de lneas celulares con suplementos

protenicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero.

Medio 199. Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de

cromosomopatas

Objetivos

1. Establecer los fundamentos tericos para la preparacin de medios de cultivo.

2. Preparar un medio de cultivo que permita propagar clulas.

Material y reactivos

2 frascos de vidrio de 1 L.

1 probeta de 1000 mL.

1 balanza analtica.

1 parilla con agitacin

Gabinete de seguridad biolgica

1 pH-metro

1 vaso de precipitados de 50 mL.

2 filtro con membrana con un poro de (0.22m de dimetro).

2 jeringas de 50 mL

1 sobre de Medio Esencial Mnimo de Eagle (MEM)

34

2.2 g de NaHC03

Solucin de HC1 1 N

1000 mL de agua inyectable.

Suero fetal de bovino

Penicilina G y estreptomicina

Desarrollo

a) Disolver el contenido del sobre de medio MEM de una presentacin comercial con agua

inyectable en aproximadamente el 80% del volumen final a preparar.

b) Aadir 2.2 g de NaHC03 (se observa un cambio de color de un naranja a un rojo

intenso).

c) Adicionar el antimicrobiano 100UI/ml de penicilina G y 100 g/ml de estreptomicina

d) Utilizando un pH- metro calibrado, y manteniendo el medio en agitacin, adicionar poco

a poco HC1 1 N al medio, de manera que se ajuste el pH a 7.1.

e) Aforar al volumen final con agua inyectable.

f) El medio se esteriliza por filtracin atravs de membrana con dimetro de poro de

0.22m, utilizando una jeringa de 50 mL para hacer pasar la solucion.

g) Para verificar la esterilidad del medio, se incuba un da a 37C y luego se almacena a

4C.

h) Complementar el medio con 5 % de suero fetal bovino.

i) Someter nuevamente a prueba de esterilidad y almacenar a 4C hasta su uso.

Cuestionario

1. Cul es el indicador utilizado en la formulacin y cul es su importancia?

2. Por qu es necesario esterilizar por filtracion?

3. Que funcin tiene el suero de ternera adicionado al medio de cultivo para clulas?

4. Por qu es necesario agregar NaHC03 ?

5. Qu otros antibiticos se pueden adicionar a un medio para cultivar clulas y cul es su

espectro de accin?

35

Prctica No. 9

Taller demostrativo de proliferacin de cultivos celulares mediante subcultivo

o pase 1:2

Introduccin

Los cultivos celulares son el modelo biolgico que ms se utiliza para el aislamiento y

propagacin de virus. Permite realizar ensayos de infeccin en condiciones controladas por lo

que representan el mtodo de referencia en el estudio de virus.

Estos ensayos pueden servir para la propagacin de un virus como es el caso de la

produccin de vacunas, o bien para analizar si el efecto de un virus en un determinado tipo

celular se presenta de forma reproducible, lo cual requiere adems incluir monocapas de

controles positivos y negativos. En cualquier caso es necesario contar con una cantidad

suficiente de clulas. La manera de aumentar las clulas disponibles es por la propagacin de un

cultivo inicial mediante un subcultivo o pase.

El subcultivo se realiza a partir de una monocapa confluente que se disgrega mediante la

accin enzimtica de una proteasa preparada en solucin con un agente quelante, una vez

disgregadas, las clulas se resuspenden en el medio de cultivo correspondiente hasta lograr una

suspensin homognea. El volumen de dicha suspensin se divide partes que se depositan en

recipientes adecuados para que las clulas se adhieran. Cuando la suspensin se divide en partes

iguales, se denomina como subcultivo o pase 1:2. Cada parte proliferar hasta formar

nuevamente una monocapa confluente, que puede propagarse bajo el mismo procedimiento. Los

subcultivos se realizan subsecuentemente hasta satisfacer las necesidades de trabajo.





36

Objetivo

Realizar un subcultivo de clulas eucariticas en relacin 1:2 para promover su proliferacin y

obtener monoestratos celulares.

Material y equipo

Gabinete de bioseguridad

Incubadora con fuente de CO2

Pipeteador automtico

Etanol al 70%

Cultivo celular confluente.

Recipientes para cultivo celular

Medio de cultivo complementado con 5% de Suero fetal bovino (SFB) adecuado para el

tipo celular de trabajo.

Solucin de tripsina en regulador de pH.

Solucin reguladora de fosfatos (SRF)

Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL

Frasco de desecho

Desarrollo

a) Desinfectar el rea de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con etanol al

70%.

b) Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso previamente

limpiado con etanol al 70% y encender la luz ultravioleta por espacio de 15 minutos,

evitando observar en forma directa la fuente de radiacin.

c) Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminacin convencional del gabinete de

bioseguridad.

d) Observar la confluencia del cultivo original

e) Decantar el medio del frasco que contiene clulas.

f) Lavar suavemente las clulas con 5 ml de (SRF)

g) Agregar 1.0 ml de solucin de tripsina y dejar interaccionar con las clulas durante 1

min; retirar el exceso de la solucin de tripsina.

h) Incubar a 37 C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las clulas se

hayan redondeado (disgregacin celular).

37

i) Agregar al frasco de cultivo, 14 ml de medio complementado con SFB y homogenizar

por pipeteo hasta formar una suspensin celular homognea. Evite la formacin de

espuma.

j) Dispensar 7 ml de la suspensin celular obtenida a cada uno de dos recipientes

estriles para cultivo celular.

k) Incubar a 37 C en la incubadora con una concentracin de 5% de CO2, durante 24 a

48 horas.

l) Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una confluencia del

100% (monoestrato celular).

m) Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo

contenga 0.5 % de SFB, hasta el momento de emplear el cultivo para la reproduccin

de virus.

Cuestionario

1. Qu significa confluencia?

2. Qu funcin tiene el SFB adicionado al medio de cultivo para clulas?

3. Explique el efecto que produce la adicin de tripsina a la monocapa celular?

4. De qu materiales estn hechos los recipientes para el cultivo de celulas?

5. Mencione 5 tipos de cultivos celulares y los medios de cultivo adecuados para su

propagacin.

38

Prctica No. 10

Seminario: pruebas para el diagnstico clnico de virus (ELISA,

inmunofluorescencia y Western Blot). Fundamentos aplicaciones y

limitaciones

Introduccin

El diagnstico viral es uno de los retos importantes a los que se enfrenta la medicina

actual, ya que durante las ltimas dcadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores

herramientas hace posible que estos agentes infecciosos se puedan estudiar no slo a nivel de

laboratorios especializados, sino tambin en los de anlisis clnicos.

Idealmente se busca identificar plenamente al virus asociado con una enfermedad en corto

tiempo y a travs de una sola prueba, pero en forma prctica, en la mayora de ocasiones no se

realiza diagnstico diferencial, no hay comunicacin entre el diagnstico clnico y el de

laboratorio, as como difcilmente los pacientes aceptan realizarse estudios con muestras de suero

sanguneo pareadas, es decir, recolectadas tanto en la fase aguda de la enfermedad como en la

fase convaleciente.

Diagnosticar si una infeccin es de etiologa viral es muy importante porque determina las

acciones teraputicas del paciente y elimina los tratamientos inadecuados, adems de ayudar al

pronstico y seguimiento de la enfermedad.

Esto tiene repercusiones sociales y econmicas, puesto que la administracin oportuna de

un tratamiento correcto puede reducir el tiempo y costo de atencin hospitalaria.

En general, el contacto con virus puede ser analizado de forma directa o indirecta. Las

pruebas directas son las que evidencian al virus o alguno de sus antgenos presentes en clulas o

tejidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se utilizan con mayor frecuencia y

bsicamente demuestran un contacto del husped con el agente viral mediante la determinacin

de anticuerpos especficos hacia un virus en particular.





39

En estos ensayos se aprovechan las caractersticas fisicoqumicas de los virus o los

anticuerpos producidos hacia ellos para tener especificidad en las reacciones. Dentro de las

principales utilidades diagnsticas pueden mencionarse:

Deteccin de antgenos virales.

Determinacin de anticuerpos antivirales.

Obtencin de datos epidemiolgicos y pronstico de enfermedades efectuando anlisis de

sueros pares; en muestras tomadas con una separacin de al menos 2 semanas, un

incremento en 4 veces o ms en el ttulo de la segunda muestra con respecto a la primera,

es considerado significativo para una enfermedad viral en convalecencia o en el peor de

los escenarios activa.

Diferenciacin entre infecciones primarias, persistentes o crnicas. La presencia de IgM

especfica se puede detectar en los primeros das del inicio de la enfermedad.

Las pruebas serolgicas con mayor aplicacin en el diagnstico viral son:

1. Ensayos inmunoenzimticos (ELISA)

a) Directo (deteccin de antgenos)

b) Indirecto (deteccin de anticuerpos de respuesta inmunolgica)

2. Inmunofluorescencia

a) Directa (deteccin de antgenos virales)

b) Indirecta (deteccin de anticuerpos de respuesta)

3. Western-blot

ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay).

Se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los

conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica.

Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e

insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar

inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato

especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o

cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.

Pasos generales de un ELISA.

40

1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.

2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.

3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el

pocillo

4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido

5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima

6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo

7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

8. Adicin del substrato

9. Unin del substrato a la enzima

10. Desarrollo del color.

Tipos de ELISA

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo

los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con

anticuerpos marcados.

ELISA 'sandwich'. (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se

trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-

antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se

encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.

Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un

segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un

anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo

tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el

segundo anticuerpo.

ELISA con anticuerpo de captura (sndwich) para el diagnstico de virus:

Es una prueba en fase slida donde se fijan anticuerpos especficos (monoclonales o policlonales

obtenidos en ratn) para un virus determinado sobre una superficie inerte como las microplacas

de poliestireno; sobre estos de adiciona el suero o muestra que contiene el antgeno que se quiere

demostrar y una vez que ocurre la reaccin antgeno-anticuerpo, se hace una serie de lavados para

eliminar todo lo que no haya reaccionado. Finalmente, se agrega un segundo anticuerpo que

41

tambin reconoce al antgeno viral pero obtenido en un husped distinto (por ejemplo cabra)

conjugado a una enzima.

Pueden ser utilizadas enzimas como la fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rbano

picante (PR) y para el revelado final de la reaccin, se coloca el sustrato especfico para la

enzima, el cual es hidrolizado por sta para producir un complejo coloreado. En el caso de la FA

el sustrato es paranitrofenilfosfato y para PR es ortofenilendiamina (OPD) en solucin de

perxido de hidrgeno, los cuales permiten visualizar la reaccin.

Para cuantificar el color producido, se mide la absorbancia en un espectrofotmetro, cuya

lectura ser directamente proporcional a la concentracin de antgeno presente en la muestra.

Esta tcnica se utiliza ampliamente para el diagnstico de antgenos de la Hepatitis A, B y C,

Rotavirus, VIH, agente Norwalk, virus Parainfluenza e Influenza A y B. Para la hepatitis B la

demostracin del antgeno de superficie (HBsAg) diagnstica la infeccin activa as como el

estado de portador; el diagnstico de rotavirus con este mtodo ayuda a obtener un resultado

rpido en nios menores de dos aos con cuadros diarreicos, donde este virus es el principal

agente causal.

Por otra parte, para VIH la demostracin del antgeno p24 es til en el diagnstico de la

infeccin en nios y en pacientes que se encuentran en periodo de ventana inmunolgica; es

adems de gran utilidad en el pronstico y la progresin de la infeccin as como en el control de

la terapia antirretroviral.

ELISA Indirecto para el diagnstico de virus:

Esta tcnica serolgica determina la presencia de anticuerpos contra agentes infecciosos

como los viriones, considerando que la exposicin a ellos produce una respuesta por parte del

sistema inmune, entre otros mecanismos, a travs de la produccin de anticuerpos especficos.

La prueba de ELISA indirecto tiene un principio semejante al de ELISA directo, pero en

este caso, un antgeno viral especfico est unido a la fase slida, a la cual se aade el suero del

paciente que presumiblemente posee anticuerpos antivirales y despus se adiciona un conjugado

constituido por anti-anticuerpos IgG o IgM unidos a una enzima. Finalmente se adiciona un

sustrato especfico, que desarrollara un color cuya intensidad es proporcional a la concentracin

de anticuerpos presentes en el suero del paciente.

Este mtodo se utiliza comnmente en laboratorios clnicos y si se automatiza puede

efectuarse en un tiempo menor a 2 horas. Su utilidad en virologa est dirigida hacia la

42

determinacin de anticuerpos contra antgenos especficos de virus Dengue, Herpesvirus, VIH,

Citomegalovirus, Rubola, Hepatitis A, B y C, as como en infecciones por Virus Epstein-Bar

para demostrar marcadores serolgicos tempranos de la enfermedad

La especificidad de las pruebas de ELISA depende en buena medida de la calidad de los

reactivos adsorbidos en la fase slida, lo cual ha permitido la generacin de diferentes ensayos a

travs del tiempo, cada vez con mejores propiedades:

a) De primera generacin

Pruebas donde inicialmente se utilizaron antgenos crudos sin mayores procesos de

purificacin, tales como el virin completo inactivado (caso de las primeras tcnicas de ELISA

para VIH), sin embargo, estos ensayos presentaban reacciones inespecficas (falsos positivos), en

particular se obtenan reacciones cruzadas con virus Herpes.

b) De segunda generacin

En este caso los antgenos son protenas recombinantes, que se producen mediante

ingeniera gentica en bacterias y son sometidas a procesos de purificacin, lo cual confiere

mayor especificidad a la prueba, pues se identifican anticuerpos particulares contra las protenas

consideradas ms inmunognicas.

c) De tercera generacin

Son las ms utilizadas actualmente, ya que presentan una alta especificidad. En ellas se

emplean pptidos sintticos (fabricados siguiendo un diseo especfico en el laboratorio) con

secuencias particulares para cada virus, como es el caso de las pruebas diseadas para determinar

anticuerpos contra VIH 1 y VIH 2.

En adicin, los mtodos ms recientes de ELISA emplean en su proceso final el sistema

de anticuerpos-biotinilados / estreptavidina-enzima, que amplifica la lectura en unidades de

densidad ptica para ganar sensibilidad en los casos en que la concentracin de anticuerpos

antivirales est muy reducida.

Inmunofluorescencia (IF)

La fluorescencia es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a

radiaciones de baja longitud de onda y alta energa (UV-Rx). Las radiaciones absorbidas

(invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una longitud de onda mayor a la

incidente.

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La absorcin de luz por parte de la molcula de fluorocromo la eleva a un estado de

excitacin en el cual contiene mayor energa. La molcula permanece en el estado de excitacin

por un perodo de tiempo muy corto. El retorno a un nivel de energa menor es acompaado por

emisin de luz (fluorescencia)

La IF es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos (como

isotiocianato de fluorescena).

La visualizacin de la cantidad de Ag-Ac formado se hace con la ayuda de un

microscopio de fluorescencia

Inmunofluorescencia Directa

Esta tcnica utiliza muestras clnicas recolectadas apropiadamente que deben ser colocadas sobre

portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especficos marcados

con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan

con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin antgeno anticuerpo se

visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde

manzana.

Esta tcnica es til para la identificacin de virus como: Herpes Simple, Virus

Respiratorio Sincitial (VRS), Rabia, Influenza A, entre otros.

Inmunofluorescencia Indirecta

Es una tcnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el

sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado

con fluorocromo (anti-anticuerpo marcado).

El proceso consta de dos etapas:

Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antgenos que constituyen el substrato

conocido especfico (clulas que contiene virus.) sobre l se coloca el suero de quien se sospecha

la presencia de anticuerpos especficos, si la reaccin es positiva se dar formacin de complejo

antgeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado.

Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionar

con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.

Western blot

El trmino blotting hace referencia a la transferencia de macromolculas biolgicas

desde un gel hasta una membrana y su posterior deteccin en la superficie de la misma. Este

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proceso es necesario ya que todas estas macromolculas estn embebidas dentro de la matriz que

forma el gel, lo que imposibilita realizar su deteccin, mientras que en la membrana, se

encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma.

El mtodo para protenas ms potente es el denominado Western blot en el que las

protenas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en

condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y posteriormente se transfieren a una membrana,

mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez

completada esta operacin la protenas de inters son reveladas por el agregado de un anticuerpo

especfico.

La especificidad de la unin antgeno-anticuerpo permite la deteccin de una nica

protena dentro de una mezcla compleja de otras protenas. En la actualidad se utiliza como

criterio de identificacin positivo de una protena especifica en una mezcla compleja y para

obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.

El primer paso de todo Western Blot es la separacin de las macromolculas mediante

geles de electroforesis; despus de la misma, las macromolculas ya separadas en funcin de su

diferente peso molecular se transfieren a una segunda matriz, generalmente una membrana de

nitrocelulosa o PVDF. Posteriormente, se bloquea la membrana para evitar la unin inespecfica a

su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la deteccin de la protena de inters.

En el siguiente paso, se une a dicha protena transferida un anticuerpo especfico marcado con

una enzima y, finalmente, se aade un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se

produce un producto detectable como, por ejemplo, un precipitado cromognico o fluorognico

en la membrana. Actulmente, los mtodos ms sensibles emplean sustratos quimioluminiscentes

que cuando se combinan con la enzima correspondiente, producen luz como producto final, que

puede detectarse mediante una pelcula o una cmara CCD. En todos los casos y sea cual sea el

sustrato que se utilice, la intensidad de la seal se correlaciona con la cantidad del antgeno en la

superficie de la membrana.

45

Prctica No. 11

Ensayos inmunoenzimticos para el diagnstico de virus de la

inmunodeficiencia humana (VIH) y antgeno de superficie del virus de la

hepatitis B (Ag HBS).

Introduccin

Virus de inmunodeficiencia humana (HIV por sus siglas en ingls)

Es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente etiolgico del Sndrome de

Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Aunque se trata de un sndrome, es decir, un conjunto de

signos y sntomas y no de una sola enfermedad, por ser valido y ms sencillo de aqu en adelante

nos referimos al SIDA como enfermedad. No existe vacuna contra el virus, por lo que una vez

que se desarrolla, casi inexorablemente lleva a la muerte en un tiempo muy corto.

En nuestro pas, el informe, descripcin y anlisis de esta singular enfermedad, ha sido

objeto de mltiples actividades acadmicas, clnicas, e incluso culturales. A partir de abril de

1987, el SIDA se convirti en una enfermedad sujeta a vigilancia epidemiolgica; la notificacin

de los casos tiene carcter de obligatoria e inmediata.

Hasta ahora se conocen dos variables genticas del virus, en funcin del antgeno de

superficie que los clasifica en VIH-1 y VIH-2. Para el VIH-1 la glicoprotena externa es la gp120

y la de transmembrana es la gp41; para el VIH-2 la gp externa es la 140 y la de transmembrana es

la gp36.

Desde que se reconocieron los primeros casos de SIDA, una de las primeras lneas de

investigacin ha sido lo referente a la transmisin del virus; conocindose hasta el momento las

siguientes vas:

1. Sexual: homosexual, heterosexual.

2. Sangunea: transfusin de sangre y/o hemoderivados.

3. Perinatal: durante el embarazo, en el parto, despus del parto (leche materna).





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Para el diagnostico de VIH se cuenta con:

Mtodos directos (determinan estructuras de los virus), como:

Aislamiento del virus en cultivos celulares

Deteccin de antgenos virales con anticuerpos monoclonales

Reaccin en cadena de la polimerasa

Hibridizacin con sonda de DNA marcadas

Mtodos indirectos (donde se valoran anticuerpos contra el virus), como:

Pruebas de Inmunoenzayo enzimatico (ELISA)

Aglutinacin pasiva con partculas de ltex

Inmunoelectrotransferencia (Western-Blot)

Hepatitis viral.

Es una enfermedad generalizada que afecta principalmente al hgado. Es causada por los

siguientes agentes:

1. Virus de la Hepatitis A (agente causal de la hepatitis infecciosa)

2. Virus de la Hepatitis B (asociado a la hepatitis srica)

3. Virus de la Hepatitis C (causa de muchos casos de hepatitis postranfucional)

4. Virus de la Hepatitis D requiere de la presencia de del VHB. Asimismo, se ha identificado el

agente causal de otra de las formadas de la antes llamada hepatitis no A-no B

5. Virus de la Hepatitis E

Otros virus que tambien pueden ser agentes causales de la hepatitis se encuentran: virus

Epstein Bar, rubola, citomegalovirus, coxsakie, varicela zoster entre otros.

El virus de la Hepatitis B pertenece al grupo hepadnavirus y su transmisin es va parenteral

(sangre y derivados, fomites contaminados por el virus). Al virus se le conoce como partcula

DANE, presente diversos antigenos que estimulas anticuerpos, lo cual se utiliza en el diagnostico

de la enfermedad, este puede detectarse de manera completa (virin completo) o en partes del

mismo, la cubierta protenica determina el antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y la

partcula interna antgeno core (o central) de la hepatitis B (HBcAg). Resiste la temperatura a

37C por 1 h, 60C por 10 h, 25C por una semana, 100C 1 min y 20C por 5 aos. El

hipoclorito de sodio al 0.5 % lo inactiva en 3 min.

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La infeccin tiene un periodo de incubacin de 60 a 180 das; su comienzo es insidioso, con

poca o ninguna fiebre. Pudiendo presentarse a cualquier edad.

Objetivo

1. El alumno aprender el manejo de la tcnica de Ensayo inmunoenzimtico de fase slida

(EIA), empleado para el diagnostico de HIV y Antgeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg).

Material y reactivos:

Equipo Inmuno Comb HIV 1+2 PBS-Orgenics

Equipo Inmuno Comb II para AgHBs

Micropipetas con puntillas para 25, 50 y 100 L

Tijeras

Perforador

Reloj

Papel desechable

Sueros problema

Sueros control positivo y negativo

Solucin de hipoclorito de Sodio

Metodologa

o Realizar un plan de distribucin que identifique plenamente la localizacin de los sueros

problema, control positivo y negativo tanto para HIV y HBsAg

o Deposito de muestra. Compartimiento A.

Para HIV deposite por separado 50 L de los sueros problema, control positivo y negativo

dentro de cada pozo del compartimiento A perforando la cubierta de papel aluminio y

descargando la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente

contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga de la solucin con la pipeta

en varias ocasiones. Utilice una puntilla por cada muestra y deschela

Para Hepatitis B, deposite 75 L de los sueros ( problema, control positivo y negativo)

dentro de cada pozo del compartimiento A y continue el procedimiento antes mencionado.

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Desarrollo de la prueba

o Reaccin antgeno-anticuerpo.

Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa apuntando

hacia usted. Reinserte el peine varias veces para mover las burbujas de aire. Incube

durante 10 min a temperatura ambiente en el caso de HIV y para HBsAg se incubar 30

min a 37C

Al final de la incubacin extraiga el peine del compartimiento y seque el lquido

sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con las pinzas

el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento.

NOTA: Este ltimo procedimiento se repetir siempre antes de pasar de un

compartimiento a otro.

Lavado. Compartimiento B

Inserte el peine en el compartimiento B, para lograr un lavado adecuado mueva el peine

hacia atrs y adelante durante un periodo 2 min.

o Conjugado. Compartimiento C.

Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces. Para HIV Incube

durante 10 min a temperatura ambiente; para HBsAg incubar por 20 min a 37C

Para el caso de HIV se continua de la siguiente manera:

o Lavado. Compartimiento D.

Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.

o Lavado. Compartimiento E.

Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.

o Reaccin de color. Compartimiento F

Inserte el peine dentro del compartimiento F; Reinserte el peine varias veces durante 10

min. a temperatura ambiente.

o Deteccin de la reaccin. Compartimiento E.

Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E, despus de 1 min. retire el peine y

squelo al aire completamente.

Para HBsAg del compartimiento D en adelante se procede de la manera siguiente :

Reaccin con fosfatasa alcalina. Compartimiento D.

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Inserte el peine en el compartimiento D. Reinserte el peine varias veces para remover las

burbujas de aire. Incube durante 20 min a 37C.

Lavado. Compartimiento E.

Inserte el peine en el compartimiento E y agite vigorosamente por 2 min, moviendo el

peine hacia atrs y adelante.

Reaccin de color. Compartimiento F.

Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte varias veces igual que en A, e incube

durante 10 min a 37C.

Deteccin de la reaccin. Compartimiento E

Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E. Despus de un minuto retire el peine y

squelo al aire completamente.

Cuestionario

1. Cul es el fundamento de la prueba de ELISA

2. Cundo se dice que el paciente es seropositivo a VIH?

3. Cul es la diferencia entre un paciente seropositivo y uno con SIDA?

4. Cmo se puede prevenir el SIDA?

5. Cmo se trata la enfermedad del VIH?

6. Cul es la diferencia entre los tipos de hepatitis?

7. Cules son las formas de transmisin de los diferentes tipos de hepatitis y cules seran los

mecanismos de prevencin?

8. Describa otros mtodos para diagnosticar hepatitis, diferente a la hepatitis B.

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Prctica No. 12

Replicacin de bacterifagos lticos en Escherichia coli

Introduccin

Las bacterias son huspedes de un grupo particular de virus denominados bacterifagos o

simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la infeccin a

nivel celular, la relacin husped parsito, la multiplicacin viral y estudios de ingeniera

gentica. Por otro lado, tambin son muy tiles en la tipificacin de cepas bacterianas.

En los bacterifagos lisognicos, tambin denominados temperados, el genoma del fago

se replica sincrnicamente con el genforo bacteriano, pasando a la progenie cada vez que la

bacteria se divide por fisin binaria. En este estado lisgenico, los fagos integrados al genforo

bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su separacin. Estos genes permiten a la

bacteria lisgenica expresar nuevas actividades y producir diferentes protenas.

El genoma del fago lisgenico puede modificar la estructura del polisacrido bacteriano y

su antigenicidad, as como codificar para la produccin de toxinas bacterianas que causan

enfermedades tales como difteria, clera, botulismo y sndrome urmico hemoltico.

Por otra parte, los bacterifagos lticos o virulentos se replican dentro de la bacteria

husped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos lticos ms

extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con la letra T y

diferentes nmeros (bacterifagos de la serie T). Los fagos virulentos al destruir a las bacterias

producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en cultivos sobre placas de agar.

Objetivo

El alumno aprender a cultivar bacterifagos en el laboratorio y conocer su importancia en la

Microbiologa.





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Material y equipo

Incubadora bacteriolgica

Centrifuga

Tubos para centrifuga

2 filtros de nitrocelulosa de 0.45m de espesor (adaptable a jeringa)

1 jeringa de 20 a 40 mL

Hisopos estriles o varilla de vidrio.

1 asa bacteriolgica

Mecheros

2 tubo de 5mL de caldo nutritivo o soya tripticasena

Cepa aislada de Escherichia coli

2 frascos o tubos estriles de al menos 5mL

1 pipeta pasteur o 1 micropipeta.

Placas de agar nutritivo o STC (Soya Tripticasena)

1 muestra de aguas residuales o estancadas (aguas negras)

Alcohol etlico al 70%

Sanitas y/o algodn

1 maskingtape o diurex

1 marcador permanente de punto fino

Desarrollo

a. Tomar una colonia de la cepa de E. coli y sembrarla en un tubo con caldo nutritivo o soya

tripticasena e incubar a 37C por 24 h en agitacin a 200 rpm (un da antes de la

prctica).

b. En un frasco limpio colectar aproximadamente 10 mL de agua residual o estancada.

Tomar 5mL de esta agua y centrifugar a 3000 rpm durante 10 min y colectar el

sobrenadante con una jeringa estril. Adaptar el filtro de nitrocelulosa de 0.45m a la

jeringa y colectar el eludo en un tubo o frasco estril en el cual se contendr la muestra

presuntiva de fagos (cuidando de no romper el filtro con la presin que se ejerce con el

mbolo de la jeringa).

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c. En condiciones de esterilidad, tomar una alcuota del cultivo en caldo de E. coli

(aproximadamente 100L) y colocarlo en la placa con agar nutritivo. Extender la alcuota

sobre el agar mediante la tcnica de arrastre con varilla de vidrio (extensin en

superficie), o si se prefiere sustituir sta tcnica mediante el uso de hisopos estriles para

hacer un sembrado masivo hasta que se absorba el cultivo.

d. Una vez absorbida la alcuota en el agar, se hace un goteo del filtrado con una pipeta

Pasteur o una micropipeta sobre la superficie del agar y nuevamente se deja secar.

e. Voltear la placa y una vez rotulada, dejar incubar 37C durante 24 48h.

f. Leer las placas a contra luz para observar las placas de lisis (unidades formadoras de

placa, UFP).

Nota: En muchos casos es recomendable hacer una previa propagacin de los fagos,

como a continuacin se describe:

Para la propagacin de los fagos se requiere un caldo nutritivo o soya de tripticasena

previamente crecido de E. coli a 37C por 24 h en agitacin a 200 rpm.

A este caldo colocarle un volumen igual (1:1) del filtrado del agua residual descrita

anteriormente y dejarlo incubar por 24 o 48 h ms a 37C, sin agitacin.

Pasado el tiempo de incubacin centrifugar el cultivo a 3000 rpm 10 min. Y recuperar el

sobrenadante con una jeringa estril y posteriormente adaptar el filtro de nitrocelulosa de 0.45m

y colectar el eluido en un tubo o frasco estril en el cual se contendr la muestra concentrada de

fagos.

La muestra es viable aproximadamente por 3 meses si se mantiene en refrigeracin (aunque

pueden llegar a formarse cristales).

Observacin

En las placas se deben observar zonas translcidas (llamadas calvas de lisis) como se muestra en

la siguiente figura:

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Fig. 7. Placas de replicacin de bacterifagos lticos. Placa de la izquierda: ausencia de calvas.

Placa de la derecha: presencia de calvas de lisis.

Resultados e interpretacin

La presencia de calvas de lisis indica la actividad replicativa del bacterifago con la consecuente

muerte del modelo bacteriano usado. As mismo, su ausencia indica que no hay actividad de

bacterifagos lticos.

Cuestionario

1. Anote usted un ejemplo de bacterifago temperado.

2. En qu mecanismo de recombinacin gentica entre bacterias se involucra la participacin

de bacterifagos?

3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes estructurales de los

bacterifagos de la serie T.

4. Investigar por qu ciertas cepas de E. coli son capaces de producir colitis hemorrgica?

5. Escriba otros ejemplos de gneros bacterianos susceptibles a bacterifagos e indique el

nombre del bacterifago.

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Prctica No.13

Seminario de pruebas moleculares para el anlisis. PCR y sus variantes;

retrotranscripcin, mltiple, anidada, tiempo real, RFLP, Southern-Blot,

Northern-Blot.

Introduccin.

La incorpora

Documents

7. Manual de Virología