Manual Virología

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA

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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

ÁREA ESPECÍFICA DE: MICROBIOLOGÍA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGÍA CÓDIGO: FAR 315L FECHA DE ELABORACIÓN: MARZO 2002 NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO TIPO DE ASIGNATURA: DISCIPLINARIA PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN:

M. C. Nidia Gary Pazos Salazar M. C. Maria Susana Pérez Fernández M. C. Oscar Pérez Toríz M. C. Alejandro Ruíz Tagle M. C. Carlos Téllez Osorio M. C. Claudy Lorena Villagran Padilla

HORAS DE TEORÍA: 3 HORAS PRÁCTICA: 2 CRÉDITOS: 8


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INDICE

NÚMERO DE LA PRÁCTICA

TÍTULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA

PRÁCTICA No. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA.

3

PRÁCTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES.

7

PRÁCTICA No. 3

PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.

12

PRACTICA NO 4 PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.

16

PRÁCTICA No. 5 HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS.

20

PRÁCTICA No. 6 ENSAYO DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.

24

PRÁCTICA No. 7 REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.

28

PRÁCTICA No. 8 TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO.

28

PRÁCTICA No. 9 CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO.

32

PRACTICA No 10 SEMINARIO: OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PRIMARIO DE FIBROBLASTOS DE EMBRIÓN DE POLLO.

PRÁCTICA No. 11 PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2

37

PRÁCTICA No. 12 REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS.

40

PRÁCTICA No. 13 REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN ESCHERICHIA COLI.

43

PRÁCTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES.

47

PRACTICA No 15 ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA, HEPATITIS B Y HIV.

52

PRACTICA No 16 EVALUACIÓN FINAL


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PRACTICA NO. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

VIROLOGÍA

INTRODUCCIÓN

El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infecto-

contagiosidad de los viriones, permite definir las normas que en materia de

seguridad, son necesarias para no correr ningún riesgo de adquirir aún en forma

accidental, una infección por este tipo de partículas.

Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas

que habrán de seguirse en el Laboratorio de Virología, con la finalidad de asegurar

la integridad física de los alumnos, así como para mantener una organización

adecuada para el desarrollo de las prácticas correspondientes.

La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se

permitirá el acceso al laboratorio.

Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada.

Colocar todo los artículos personales en la zona lateral o en los cajones de

las mesa de trabajo.

Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón

desinfectante.

Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así

como introducir algún objeto en la boca.

La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada.

Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla.

Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo.

Comunicarse con sus compañeros solo en la medida indispensable.

Antes de iniciar la práctica, leer y recordar la metodología a seguir de acuerdo

con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para

aclararlas.


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Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material,

derramamiento de suspensiones virales, etc.).

Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el sitio

indicado por el profesor.

Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de

desecho no contaminado deberá depositarse en los contenedores

correspondientes.

En forma previa a su lavado, siempre se deberá desinfectar el material que se

le proporcione en el laboratorio.

Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo,

sección, equipo, nombre del alumno, así como fecha de entrada y salida.

En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma

Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para

la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y

disposición final de los Residuos Peligrosos biológico-infecciosos que se generan en

establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud.

En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los

laboratorios y áreas de microbiología, tales como:

Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes,

materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecánicos,

físicos o químicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de

transmisión de enfermedades.

Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros

microorganismos con capacidad de causar infección o que contiene o puede

contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a

seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de

atención médica.

En adición, se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los

siguientes:


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La sangre

Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos

Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación,

así como los generados en la producción de biológicos

Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos

Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e

histológico

Los residuos anatómicos derivados de la atención a pacientes de los

laboratorios

Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploración y toma

de muestras

Los objetos punzo cortantes usados o sin usar

Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clínicas

durante el diagnóstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas,

pipetas Pasteur, agujas hipodérmicas, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes,

cajas de Petri, cristalería entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo

y similares.

Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán

ser tratados por métodos físicos o químicos, los cuales:

Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos

Deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos

Deberán ser cremados, si se trata de residuos patológicos.

El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza

la seguridad que deberá observarse tanto para alcanzar los objetivos de las

prácticas, como para su desarrollo en condiciones asépticas.

Finalmente y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en

esta primera sesión de laboratorio se hará énfasis en que a través de las diferentes

prácticas, se utilizarán únicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas

para uso veterinario, con la finalidad de evitar el más mínimo riesgo de infección

hacia los estudiantes.


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CUESTIONARIO 1. Con ayuda de un esquema especifique, cuál sería el manejo que se la daría a

materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de

tejidos, desde que han sido utilizados para el análisis de virus hasta su destino final.


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PRACTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA

HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES

Desde el descubrimiento de los virus, se identifico que de acuerdo a sus

características moleculares, estos agentes requieren del empelo de modelos vivos

para su análisis; esta condición hace particularmente difícil implementar el uso de

sistemas adecuados como son el uso de animales de laboratorio o los modelos de

Células en Cultivo. De esta manera se hizo necesaria la búsqueda de alternativas

para el análisis de virus que omitieran la necesidad de modelos vivos.

PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA). Inicialmente, la HA se aplicó para el análisis del virus Influenza, sin embargo

como explicaremos más adelante, se puede aplicar para realizar ensayos sobre

cualquier virus con proteínas estructurales con propiedades hemaglutinantes. El

nombre de Hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían

aglutinar eritrocitos, posteriormente se determinó que el origen de esta propiedad se

debía a la existencia de una glicoproteína presente en la envoltura viral a la cual se

le denominó como hemaglutinina.

Actualmente se sabe que una gran cantidad de virus poseen proteínas

externas con estas características por lo que el método tiene una amplia

aplicabilidad en el análisis de diferentes entidades virales.

También se descubrió que la hemaglutinina tiene el papel de funcionar

precisamente como el ligando viral encargado de reconocer al receptor en las

células blanco. De manera general, el receptor corresponde a las moléculas de

ácido siálico presente sobre la superficie de diversos tipos celulares, aun que

dependiendo del virus esta molécula puede estar enlazada en diferentes tipos de

enlaces químicos.

A este respecto cabe resaltar que la función de la hemaglutinina no es

entonces aglutinar eritrocitos, más bien es participar en el primer paso de la

replicación viral que es la adsorción, pero sus propiedades sirven para desarrollar la

prueba de HA que se utiliza como un ensayo in vitro.


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Para empezar a conocer la prueba de HA, se hace necesario describir las

ventajas y desventajas que ofrece.

Ventajas: Prueba sencilla de desarrollar.

No requiere de una infraestructura complicada.

Es económica.

Ideal cuando se manejan muestras con alta carga viral.

Se aplica en los ensayos para la determinación de la naturaleza química

de los receptores celulares.

Desventajas: Se emplea sólo como diagnóstico presuntivo.

Existen agentes no virales que pueden causar HA.

Es poco sensible.

Genera falsos negativos.

El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la existencia

de virus con proteínas con capacidad hemaglutinante que reconocen receptores

celulares. De esta manera los virus se unirán a los eritrocitos de la especie que sea

siempre que contenga en su superficie moléculas de ácido siálico. La prueba se

representa en el siguiente esquema: | HEMAGLUTINACIÓN Para la realización de esta prueba se requiere tomar una muestra que

contenga virus, como ejemplo tenemos: stocks virales provenientes de lotes

vacunales o de cosechas obtenidas de células en cultivo; muestras de origen clínico

tomadas de acuerdo a la zona anatómica que afecta el virus, tal es el caso del virus

influenza donde la muestra a tomar corresponde a un lavado faríngeo.

ERITROCITO

Virus con proteínas Hemaglutinantes

ERITROCITO


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Para procesar la muestra se preparan diluciones seriadas al doble

empezando desde la dilución 1:10 hasta la dilución 1:1280 empleando como

diluyente una solución amortiguadora de fosfatos. Posteriormente a cada dilución se

le adiciona la misma cantidad de una suspensión de eritrocitos preparada al 1%.

Todo esto se realiza en tubos de fondo en U o en microplacas de fondo en U. Los

eritrocitos aglutinados sedimentarán en el fondo del pozo formando una red,

mientras los no aglutinados sedimentan por gravedad. De acuerdo a la forma del

pozo se forma una dona o un anillo en el centro. Los sedimentos se aprecian de la

siguiente manera:

PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

Una prueba de HA positiva implica la sospecha de un virus presente en la

muestra, sin embargo la determinación exacta del virus involucrado en una patología

es aún incierta. Por esta razón como siguiente paso se debe aplicar una prueba que

permita la plena identificación del tipo de virus, a este respecto se cuenta con una

prueba serológica.

PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que

demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta

está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se

conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).

Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la

hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el

receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce

como neutralización vírica.

La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera:


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Primera fase: Reconocimiento Ag-Ac.

Segunda fase: Interacción con eritrocitos: demostración de la IHA.

La existencia de anticuerpos que puedan reconocer a cepas virales

específicas permite diagnosticar plenamente que un virus en particular es el

responsable de alguna patología. Esto basándose en un principio fundamental de

inmunología: La presencia de anticuerpos en un hospedero es la consecuencia de

la exposición previa al antígeno que induce entonces su producción.

Para esta prueba la muestra es el suero del hospedero sobre el que se

realizan diluciones seriadas también con factor dos como en HA pero iniciando de la

dilución 1:2 hasta alcanzar la de 1:256.

Cada dilución del suero se incuba con 4 Unidades Hemaglutinantes de un

virus conocido, durante 10min. para permitir el reconocimiento.

ERITROCITO

NO EXISTE RECONOCIMIENTO

Virus con proteínas

hemaglutinantes

Anti-HA

Neutralización viral


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Transcurrido este tiempo, se adiciona una suspensión de eritrocitos al 1 %. Al igual

que para HA la prueba se efectúa en microplacas o tubos con fondo en U. De esta

manera los patrones de sedimentación para los resultados positivos y negativos se

observan de la siguiente manera:



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PRACTICA No. 3

PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL NEWCASTLE

INTRODUCCIÓN.

Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el

genoma viral capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar

puentes entre los glóbulos para constituir una red. Este fenómeno conocido como

Hemaglutinación fue primeramente descrito para el análisis del virus Influenza. En

este caso la proteína hemaglutinante (hemaglutinina) en la superficie del virión es

una glicoproteína que en adición de la Neuraminidasa se proyecta en la envoltura

viral. El virión se unirá a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que lleve

los receptores complementarios que en este caso son moléculas de Acido N-

AcetilNeuramínico.

El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los

Paramyxovirus; es un patógeno primario de aves en quienes produce infecciones

respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a

parálisis y muerte; en el humano puede ocasionalmente producir conjuntivitis

autolimitada.

Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar

aglutinación, por lo que la Hemaglutinación no es un indicador sensible de la

presencia de pequeñas cantidaes de viriones pero por su simplicidad constituye un

ensayo conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones.

OBJETIVOS:

1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de

Hemaglutinación (HA).

2. El alumno determinará la concentración de viriones presentes en una

suspensión, la cual expresará en Unidades Hemaglutinantes (UHA).


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MATERIAL Solución reguladora de fosfatos SRF.

Microplacas de poliestrireno con fondo en U.

Espejo.

Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.

Puntillas para micopipeta.

Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET)

Suspensión de glóbulos rojos al 1%.

Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.

Solución de Hipoclorito de Sodio.

Alcohol y algodón.

Tina para recolectar desechos.

METODOLOGÍA 1. Realizar con SRF una serie de diluciones del virus a partir de una suspensión

concentrada (vacuna viral), con factor de dilución 2, desde 1:10 hasta 1:1280, de

acuerdo al esquema de la figura 1; incluir un tubo control que no contendrá virus.

El proceso se describe a continuación:

a Agregar al pozo No. 1 de la microplaca 180 µl de SRF y del 2 al 9

agregar 100 µl.

b Colocar en el pozo 1 20 µl de la suspensión viral (vacuna) y mezclar

por aspersión y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la

dilución 1:10.

c Transferir 100 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente

de la misma manera que para el paso b.

d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que

corresponderá a la dilución 1:1280.

e Desechar del pozo 8 100 µl en el recipiente para recolección de

desechos.

f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución viral al pozo No. 9

que sirve como control.

2. Agregar a todos los pozos 100 µl de una suspensión de glóbulos rojos de pollo al

1%.


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3. Agitar la microplaca y dejar reposar a temperatura ambiente el sistema hasta que

los eritrocitos del pozo 9 hayan sedimentado.

PATRONES DE SEDIMENTACIÓN 1. Los glóbulos rojo normales se asientan en el fondo del pozo formando un botón,

mientras que los glóbulos rojos aglutinados forman una malla homogénea.


2. Determinar el título de la muestra, identificando la última dilución en que se

presenta una reacción de HA evidente, que corresponderá entonces a 1 UHA por

volumen.

3. Identificar la dilución que contiene 4 UHA.

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. No 1. Realización de las diluciones virales

Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 a)SRF (µl) 180 100 100 100 100 100 100 100 100 Dilución 1.10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 Control

2) Eritrocitos al 1% (µl)

100 100 100 100 100 100 100 100 100

VACUNA CONTRA

NEWCASTLE

b) 20 µl

e) Desechar 100 µl

c y d) Transferir seriadamente 100 µl de cada dilución al siguiente pozo


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CUESTIONARIO 1.- Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA. 2.- Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba de HA. 3.- Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA.


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PRACTICA No. 4

PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD

DEL NEWCASTLE INTRODUCCIÓN

La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no

específico de infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva

no nos permite asegurar que este virus sea el agente causal.

Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que

demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta

está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se

conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).

Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la

hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el

receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce

como neutralización vírica.

OBJETIVOS

1. El alumno desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para

determinar el título de un suero problema.

2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar la

prueba de IHA.

MATERIAL

Solución reguladora de fosfatos SRF.

Microplaca de poliestireno con fondo en U.

Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl.

Puntillas para micopipeta.

Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET),

preparada en una suspensión con 4 UHA.

Suspensión de glóbulos rojos al 1%.

Suero problema.

Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml.

Solución de Hipoclorito de Sodio.


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Alcohol y algodón.

Tina para recolectar desechos.

METODOLOGÍA Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un tubo una

dilución del virus del Newcastle que contenga 4 UHA en un volumen suficiente para

realizar la prueba de IHA.

Ejemplo:

a Resultado de la práctica de HA:

Dilución 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA

b Volúmen suficiente para realizar IHA= 2ml Entonces.....

Vacuna viral concentrada 100 µl + SSI 1900 µl _________ Volúmen final 2000 µl de dilución con 4 UHA

1. Hacer diluciones al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo

al esquema de la figura 2; incluir un pozo control que no contendrá antisuero ni

virus. El proceso se describe a continuación:

a Agregar 75 µl de SSI a los pozos del 1 al 9 de la microplaca.

b Colocar en el pozo 1 75 µl del suero problema y mezclar por aspersión

y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:2.

c Transferir 75 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente

de la misma manera que para el paso b.

d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que

corresponderá a la dilución 1:256.

e Desechar del pozo 8 75 µl en el recipiente para recolección de

desechos.

f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución del suero al pozo

No. 9 que sirve como control.


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2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antígeno viral

en un volumen de 75 µl.

3. Agitar la microplaca para que reaccionen los sutratos y dejar en reposo durante 10

min.

4. Agregar 75 µl de la suspensión de glóbulos rojos a todos y cada uno de los pozos,

agitar y colocar la microplaca a temperatura ambiente hasta que los glóbulos rojos

del pozo que no contiene antisuero y sirve como control haya sedimentado.

5. Determinar el título del antisuero identificando la última dilución que presenta IHA.

PATRONES DE SEDIMENTACIÓN: PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

Fig. No. 2 Diluciones seriadas del suero problema Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones

Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 a)SSI (µl) 75 75 75 75 75 75 75 75 75 Dilución 1.2 1:4 1:8 1.16 1:32 1:64 1:128 1.256 Control 2) 4 UHA 75 75 75 75 75 75 75 75 -----

3) INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 10 MIN 4) Eritrocitos

al 1% (µl) 75 75 75 75 75 75 75 75 75

SUERO

PROBLEMA

b) 75 µl

e) Desechar 75 µl

c y d) Transferir seriadamente 75 µl de cada dilución al siguiente pozo


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CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado negativa en la prueba de IHA?

2. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado positivo en la prueba

de IHA?

3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, ¿Cómo explica un resultado negativo

en la prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y ¿Cuál es el

diagnóstico final que daría después de analizar ambas pruebas?


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PRACTICA No. 5

HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS. (1ª. Parte)

INTRODUCCIÓN .

Los embriones se han utilizado como el huésped natural para el crecimiento

de los virus, propagación y caracterización de los virus aviares y para la producción

de vacunas virales.

El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células

necesarias para el cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias

condiciones:

1.- Vía de inoculación

2.- Edad del embrión

3.- Periodo de tiempo de incubación

4.- Volumen y dilución del inóculo utilizado

5.- Temperatura de incubación

6.- El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos

Manejos preliminares.

La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de

parvadas infectadas con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos.

Después de 4 a 5 días de incubación cuando el embrión puede ser observado

fácilmente, estos son ovoscopeados para determinar cuales son fértiles. La

incubación es alrededor de 37° C y una humedad de 60 a 70% (un alto exceso de

humedad permite un subdesarrollo de la cámara de aire, por lo tanto una baja de

humedad permitirá que halla un desarrollo menor). Los embriones deben estar en

movimiento varias veces al día, ya sea automáticamente o manualmente, el periodo

de incubación antes de la inoculación depende sobre todo de la vía de inoculación.

Ovoscopeo. El ovoscopeo consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente

de luz intensa en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrión, las

membranas asociadas y las cavidades del embrión se observan fácilmente.


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1.- En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el

movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrión. Notar

las diferencias con los embriones de diferentes edades.

2.-Con un lápiz, marcar la posición del embrión y la cámara de aire (esta área es

mantenida arriba en el ovoscopio).

3.- Comparar los embriones fértiles y los embriones muertos de varias edades,

descartar los embriones infértiles y muertos.

Estructura del huevo embrionado. Justo bajo el cascarón se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a

través de la superficie interna del embrión y forma la cámara de aire en el extremo

ancho del huevo. Esta membrana en conjunto con el cascarón ayudan al intercambio

de gases en el huevo. Esta distribución de gases se facilita por la membrana

corioalantoidea altamente vascularizada que sirve como órgano respiratorio del

embrión. Esta membrana se forma de manera adyacente a la membrana del

cascarón y forma una cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5

a 10 ml de fluido alantoideo. El embrión se encuentra envuelto por la membrana

amniótica formando el saco amniótico que contiene entre 1 y 2 ml de fluido

amniótico. El embrión se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de

nutrientes y se encuentra localizado aproximadamente al centro del huevo.

Técnicas y/o vías de inoculación. Las cuatro vías más comunes para la inoculación del huevo embrionado fértil son:

La vía de saco alantoideo

La vía de saco vitelino

La vía de membrana corioalantoidea (MCA)

La vía de saco amniótico.

En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es

sospechoso, es conveniente utilizar muchas vías como sean posibles. Si una

elección ha sido hecha, la vía MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran

numero de virus y porque es menos probable para afectarse por contaminación

bacteriana.

Saco vitelino.


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La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y propagación

del virus de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta vía, son

generalmente incubados de 10 a 13 días postinoculación.

Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al término del periodo

de incubación es parálisis de patas. Si los embriones se dejan nacer, a partir del

tercer día de nacidos se pueden observar pollos que se sientan en las patas, no se

mueven bien y algunos caen hacia los lados. Aparece un ligero pero rápido temblor

del cuello y de la cabeza, que especialmente se nota cuando los pollitos afectados

se mantienen en la mano.

Cavidad alantoidea. La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el

aislamiento y propagación de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los

embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días

postinoculación.

Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los

Myxovirus es que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y

cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero tanto los Paramyxovirus como

los Myxovirus normalmente se evalua a través de fluido alantoideo de los embriones

y no tanto por las lesiones. En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una

prueba de hemoaglutinación con glóbulos rojos de ave al 5 % para determinar la

presencia de hemoaglutininas en dicho fluido, que no es otra cosa más que la

formación de grumos de color rojo rodeados por espacios transparentes fácilmente

visible.

Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus

son enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depósitos de uratos

en riñones.

Membrana corioalantoidea (MCA).

La inoculación de embriones en MCA es utilizada para el aislamiento y pases

de Poxvirus y virus Herpes. Los embriones inoculados por esta vía son incubados

durante 7 días postinoculación.

Las lesiones que presentan los embriones por los virus Herpes y Poxvirus es

principalmente en la membrana. Presencia de áreas focales (pústulas) engrosadas

con necrosis o un engrosamiento generalizado de la membrana.


Q.F.B

23

Saco amniótico. La inoculación de embriones en saco amniótico es utilizada para el

aislamiento inicial de los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta vía, son

generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación.

Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias

generalizadas en todo el embrión y pueden llegar a causar la muerte, siempre y

cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero también se evalúa por la

presencia de hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrión.

Intravenosa

La inoculación por esta vía no tiene aplicación amplia para el estudio de

infecciones experimentales en embriones de pollo. El procedimiento es

generalmente empleado para estudios hematológicos. Embriones de 10 a 15 días de

edad son los mas adecuados para esta vía. La cantidad de inóculo puede variar de

0.2 a 0.5 ml.

Intracerebral. La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y el

inóculo es de 0.1.a 0.2 ml. Esta vía puede ser empleada en estudios de alteraciones

patológicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados

por esta vía.


Q.F.B

24

PRACTICA NO. 6 ENSAYOS DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE

POLLO INTRODUCCIÓN El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema

sensible para el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los

animales de laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil

ofrece diversas ventajas tales como:

Son estériles.

No tienen funciones inmunológicas desarrolladas.

No son costosos.

Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica

en comparación con otros sistemas biológicos, tales como el

mantenimiento y reproducción de Cultivos Celulares.

El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves

sanas ALPES, aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés,

para de esta manera eliminar la presencia de virus que comúnmente afectan a las

aves como Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.

Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar

la viabilidad del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de

inoculación debido a la especificidad que presentan algunos viriones por

determinadas células o tejidos. En la figura 3 se presenta en esquema de las

diferentes zonas que conforman a un huevo fértil.

Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto

del huevo fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema

biológico empleado.


Q.F.B

25

Fig.3 Vías de inoculación en huevo fértil de ave. OBJETIVOS: 1. El alumno determinara al ovoscopio la viabilidad del embrión.

2. El alumno dominará las técnicas comúnmente utilizadas para la inoculación de

huevos fértiles de ave.

3. El alumno diferenciara las estructuras embrionarias observando la organización

de los tejidos fuera de su cutícula.

MATERIAL: Huevos fértiles de ave de 10 días de inoculación (+/- 1 día), calidad ALPES.

Ovoscopio y pinzas de disección

Recipiente para recibir desechos

Charola porta embriones

Perforadores, bulbos y lápiz.

Jeringas de insulina

Agujas de 20 x 38 mm.

Colorantes

Guantes

1

2

3 4

5

1 Cavidad Alantoidea 2 Saco de Aire 3 Saco Amniótico 4 Saco Vitelino 5 Membrana Corioalantoidea


Q.F.B

26

DESARROLLO: I.- CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN Trasluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio.

Un embrión no viable puede reconocerse a través de:

Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna

de la cutícula.

Falta de irrigación.

Falta de movimiento.

Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general

contaminación bacteriana.

II.- TÉCNICAS DE INOCULACIÓN A Cavidad alantoidea

a Trasluminar el huevo fértil con ayuda del ovoscopio.

b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del limite de la cámara de aire

del lado contrario al embrión y en una zona escasamente irrigada.

c Perforar la marca señalada.

d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ángulo

de 45 grados con respecto al huevo fértil de ave.

B Saco vitelino

a Localizar la parte más alta del embrión sobre la cámara de aire y marcar con

un punto o cruz.

b Marcar otro punto o guía que indicara la localización del embrión.

c Perforar la marca señalada

d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinación opuesta a la

localización del embrión

C Membrana corioalantoidea

a Localizar la parte más alta de la cámara de aire y marcar un punto o cruz (*).

b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localización del embrión en

un área con la menor irrigación posible.

c Perforar ambas marcas.

d Succionar con un bulbo de goma a través del punto marcado en la primera

posición (*), creando así una cámara de aire falsa en la parte media del

embrión.


Q.F.B

27

e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar

que se desarrollo la cámara de aire falsa.

En estos ensayos, se emplearan colorantes para las diferentes inoculaciones

con el objetivo de facilitar la visualización del sitio donde se pretendió depositar un

volumen determinado de colorante. Una vez realizada la técnica, se abrirán los

huevos fértiles de ave para analizar si la vía elegida fue efectivamente inoculada,

vertiendo el contenido del embrión sobre cajas de Petri.

CUESTIONARIO 1. De acuerdo con lo observado después de abrir los embriones de pollo y

según la vía de inoculación empleada; esquematice para cada vía, cuales

zonas deben quedar teñidas y cuales no, si la inoculación se realizó

correctamente.


Q.F.B

28

PRACTICAS NO. 7 y No.8 REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR

EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO (1ª Parte) TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL

DE POLLO (2ª Parte). INTRODUCCIÓN Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros

mamíferos daños severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable

es que esta interacción induzca una protección inmunológica al individuo como

consecuencia del reconocimiento de antígenos específicos tanto en forma natural

como artificial. En el caso de medidas profilácticas, con el empleo de vacunas se

procura inducir una Inmunidad Adquirida Activa Artificial.

Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de

la vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede

efectuar en sistemas biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden

responder a la infección viral dando lesiones características del virión inoculado que

afecte directamente al embrión y le produce signos tales como músculos distróficos,

enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y líquidos extraembrionarios donde

se pueden observar hemorragias, formación de placas o pústulas así como

determinar la presencia de hemaglutininas virales.

Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos

fértiles de ave cuando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al

50% (DLEP50) o en el caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al

50% (DIEP50) empleando la reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados.

OBJETIVOS

1. El alumno dominara las técnicas para propagar y titular una cepa vacunal de

virus.

2. El alumno determinará la DLEP50 para la vacuna del Virus de la Bronquitis

Aviar (VBA), calculando sus concentración por unidad de volumen.

MATERIAL


Q.F.B

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Huevo fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES.

Vacuna de VBA. INTERVET

Solucion salina de Dulbecco

Lápiz, pegamento blanco y perforadores

Hisopos estériles, tintura de yodo.

Estufa a 37°C.

Ovoscopio.

Jeringas de insulina.

Mechero.

Recipiente para desechos.

DESARROLLO: 1. Realizar con solucion salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna

viral desde 10-1 hasta 10-6 a partir de una suspensión concentrada.

2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para

cavidad alantoidea

3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con tintura de

yodo antes y después de perforar

4. Inocular 0.1 ml de las cuatro ultimas diluciones en cada uno de 5 embriones

de 9 a 11 días de incubación (20 embriones en total), vía cavidad alantoidea.

5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento

blanco

6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculadas

7. Incubar a 37°C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los

embriones al ovoscopio, señalando en el primer dia los embriones que

resulten muertos por traumatismo

8. Al termino de la incubación,trasluminar los embriones al ovoscopio y realizar

un recuento de embriones vivos y muertos.

9. Anotar los resultados obtenidos y realizar los cálculos para determinar la

DLEP50 / 0.1 ml empleando el metodo de Reed & Muench, con base en el

siguiente ejemplo


Q.F.B

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RESULTADOS DEL RECUENTO DE EMBRIONES VIVOS Y MUERTOS DILUCION EMBRIONES

INOCULADOS

MUERTOS VIVOS

10-3 5 4 1

10-4 5 3 2

10-5 5 2 3

10-6 5 1 4

CALCULOS

1) ACUMULADOS

MUERTOS

2) ACUMULADOS

VIVOS

3) RADIO DE

MORTALIDAD

4) PORCENTAJE

10 1 10 / 11 90.9

6 3 6 / 9 66.6

3 6 3 / 9 33.3

1 10 1 / 11 9.09

Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos

para cada columna:

1) Realizar la suma acumulada de embriones muertos desde la dilución mas alta

hasta la mas baja.

2) Realizar la suma acumulada de embriones vivos desde la dilución mas baja a

la mas alta.

3) Calcular el cociente dado por los acumulados muertos sobre la suma de

acumulados muertos mas acumulados vivos de cada dilución.

CALCULAR EL VALOR DE INTERPOLACIÓN (V.I.)

% Positividad > 50% - 50% 66.6 – 50.0 16.6

V.I. = = = % Positividad > 50% - % Positividad < 50% 66.6 – 33.3 33.3

V.I. = 0.49

Multiplicar el logaritmo negativo del radio de dilución por el valor de interpretación

para así calcular el valor de interpolación corregido.

Para este caso:

log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49 = V.I.C.


Q.F.B

31

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad

En el ejemplo: 10-4 y 10-5

Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor

al 50% de efecto.

En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50

El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50.

Finalmente:

Titulo = 104.49

CUESTIONARIO 1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote

vacunal antes de salir al mercado.

2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra

viral.


Q.F.B

32

PRACTICA No.9 CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN

DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO

En 1949 John Enders, Thomas Séller y Frederick Robbins descubrieron que

el poliovirus podía cultivarse en células de origen no neuronal, lo que les valió el

premio Nobel en Fisiología y Medicina en 1954. Desde entonces, Los cultivos

celulares reemplazaron a los animales de laboratorio convirtiéndose en el principal

método para la propagación de virus y son utilizados en prácticamente todos los

campos de la bio-medicina.

Un Cultivo Celular (CC), es entonces un modelo biológico conformado por un

grupo de células con características específicas que se mantienen adecuadamente

bajo condiciones in vitro. En este sentido deberemos entender que las células

deben ser obtenidas a partir de un tejido vivo y para su mantenimiento y propagación

in vitro, requieren de medios de cultivo especiales que provean de los nutrientes que

cubran sus necesidades de crecimiento, tal y como se encontraban en sus

condiciones originales.

Para la preparación de un CC se puede considerar el siguiente orden.

1) El tejido se obtiene del modelo original, que puede ser en un caso, cualquier

tejido sano de algún animal, por ejemplo, células epiteliales de intestino,

embriones de rata, etc. En otro caso los CC provienen de tejido anormal que

se puede obtener directamente de tumores cancerosos o bien de tejidos que

inicialmente son normales y que por exposición a algún mutágeno se

transforman en el laboratorio.

2) Las células que se obtienen inicialmente de los tejidos se disocian en una

suspensión celular mediante métodos mecánicos, como maceración. De esta

manera, se tienen trozos de tejido, más pequeños que el original, pero sin

células individuales. Para disgregar a las células, el procedimiento continúa

con una….

3) Digestión con enzimas proteolíticas.

4) Centrifugación


Q.F.B

33

5) Las células se suspenden en un medio de cultivo y se colocan en recipientes

o placas de plástico, conforme las células se dividen van cubriendo la

superficie. Las células de fibroblastos o epiteliales se adsorben al plástico y

van formando una monocapa, mientras que células como las sanguíneas o

los linfocitos, sedimentan pero no se adhieren.

6) El medio adecuado para las células consiste de una solución isotónica de

sales, glucosa, vitaminas, coenzimas y aminoácidos mantenidos en buffers a

un pH entre 7.2 y 7.4 Y se complementan con antibióticos para inhibir el

crecimiento microbiano. Frecuentemente se adicionan diferentes tipos de

suero para proveer a las células de una fuente rica de factores de crecimiento

Existen principalmente tres tipos de cultivos celulares:

Cultivos celulares primarios

Cepas celulares diploides

Líneas celulares continuas

Dado que el desarrollo de una línea celular es un proceso costoso, la gran mayoría

de líneas celulares de amplia utilización, son depositadas en y distribuidas desde

centros de reposición. Existen unos pocos de estos centros en el mundo, el principal

en EEUU es el American Type Culture Collection (ATCC). Algunos ejemplos de líneas celulares que se distribuyen con origen y calidad certificados ATCC son: Vero

E-6, Vero C-76, BHK-21, MDCK, MDBK, HEp-2 entre otras.

Además del análisis viral, los Cultivos Celulares pueden emplearse en

diferentes áreas y aplicaciones como: Actividad y flujo intracelular, movimientos del

RNA, de proteínas etc. Ecología celular, Interacciones celulares, Inmunología,

Ingeniería de proteínas, Estudios de diferenciación y desarrollo celular, Aplicaciones

diagnósticas. Medicina, Farmacología,etc.


Q.F.B

34


Q.F.B

35

RECONOCIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CELULAS INFECCION VIRAL

CAMBIO MORFOLÓGICO

EFECTO CITOPATICO (ECP) Sin cambio aparente:

Hemadsoción Hemaglutinación. Interferencia

TIPOS DE EFECTO CITOPATICO

Monocapa confluente de células

Formación de sincitios

Redondeamiento

Vacuolización

Lisis

Cuerpos de inclusión

Alargamiento


Q.F.B

36

HEMADSORCIÓN

INTERFERENCIA

Monocapa confluente de células

Eritrocitos con el receptor adecuado

Virus con HA

Línea celular

Línea celular, previamente infectada con Rubéola

Línea celular

Sin efecto aparente

Redondeamiento

Interferencia

Muestra presuntiva de Rubéola

Infección con Rinovirus

Infección con Rinovirus

A

B

C


Q.F.B

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PRACTICA No.11 PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE

SUBCULTIVO O PASE 1:2

INTRODUCCIÓN El diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales requiere

frecuentemente del aislamiento de virus en cultivos celulares. Para tal efecto,

monocapas celulares son inoculadas con un espécimen clínico adecuado y entonces

son observadas para detectar cambios citológicos inducidos por la reproducción de

virus.

El término efecto citopático (ECP) es aplicado para indicar los cambios

celulares que inducidos por virus, son observables al microscopio óptico. Estos

cambios incluyen el redondeamiento o lisis de células, la formación de células

gigantes multinucleadas (sincitios) y la producción de inclusiones en el núcleo y

citoplasma de células infectadas.

La obtención de cultivos de células eucarióticas en el laboratorio de Virología,

es una de las mayores contribuciones históricas para toda el área de las ciencias

naturales, en especial para la Biología Celular y Molecular. La labor de los

investigadores que sentaron estas bases, ha sido reconocida con el otorgamiento de

varios premios Nobel en Fisiología y Medicina.

Con base en lo anterior, resulta conveniente conocer el procedimiento de

reproducción de cultivos celulares a través de un subcultivo o pase en relación 1:2,

ya que de esta manera, se pueden obtener monocapas de células en cultivo para la

reproducción de virus en condiciones de laboratorio.

OBJETIVO Realizar un subcultivo in vitro de células eucarióticas para promover su

proliferación por división mitótica y obtener monoestratos celulares.

MATERIAL Y EQUIPO Gabinete de bioseguridad

Incubadora con fuente de CO2

Microscopio con circuito cerrado de televisión

Medidor de pH

Pipeteador automático

Bomba de vacío


Q.F.B

38

Equipo de esteriliación por filtración

Etanol al 70%

Cultivo celular MRC-5

Frascos para cultivo celular de 25 cm2

Medio para cultivo de células Mínimo Esencial (MEM)

Suero fetal de ternera

Solución de tripsina en regulador de pH de Dulbecco

Agua desmineralizada

DESARROLLO 1. Desinfectar el área de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con

etanol al 70%.

2. Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso y encender

la luz ultravioleta por espacio de 30 minutos, evitando observar en forma

directa la fuente de radiación.

3. Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminación convencional del gabinete

de bioseguridad.

4. Disolver en condiciones asépticas, el medio mínimo esencial en agua

desmineralizada y ajustar el pH a 7.0

5. Esterilizar el medio de cultivo por filtración con vacío a través de una

membrana con diámetro de poro de 0.22 micrometros.

6. Decantar el medio del frasco de cultivo original que contiene células MRC-

5.

7. Agregar 2.0 ml de solución de tripsina y dejar interaccionar con las células

durante 30 segundos; retirar el exceso de la solución de tripsina.

8. Incubar a 37° C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las

células se hayan redondeado (disgregación celular).

9. Añadir al frasco de cultivo con las células disgregadas, 14 ml de medio para

cultivo celular adicionado de 5% de suero fetal de ternera y homogenizar por

pipeteo hasta formar una suspensión celular homogénea.

10. Dispensar 7 ml de la suspensión celular obtenida a cada uno de dos frascos

estériles para cultivo celular.

11. Incubar a 37° C en la incubadora con una concentración de 5% de CO2,

durante 24 a 48 horas.


Q.F.B

39

12. Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una

confluencia del 100% (monoestrato celular).

13. Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo

contenga 0.5 % de suero fetal de ternera, hasta el momento de emplear el

cultivo de células MRC-5 para la reproducción de virus.

CUESTIONARIO 1. ¿Que significa confluencia?

2. ¿Que función tiene el Suero de ternera adicionado al medio de cultivo para

células?

3. ¿Explique el efecto que produce la adición de tripsina a la monocapa celular?


Q.F.B

40

SESIÓN No. 12 REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN

DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS

INTRODUCCION. Entre los modelos disponibles para el estudio de virus, encontramos a los

animales de laboratorio, el embrión de pollo y los cultivos celulares. Estos últimos

ofrecen ventajas como la reproducibilidad de los resultados, la diversidad de virus

que pueden ser analizados y sobre todo la posibilidad de conocer los diferentes

eventos que ocurren dentro de ese compartimiento esencial para la supervivencia

del virus, la célula. Debido a estas propiedades las células en cultivo representan el

estándar de oro para la validación de pruebas efectuadas tanto en investigación

como a nivel industrial para la producción y control de calidad de vacunas.

Su mayor limitante recae en el alto costo de la infraestructura requerida para

su implementación, situación que vuelve inaccesible su aplicación en el diagnóstico

clínico de rutina.

La técnica consiste en inocular una muestra de prueba sobre células en

monocapa, que posteriormente se incuban bajo condiciones adecuadas efectuando

un observación diaria de los cambios presentados. Los cambios que son

perceptibles como modificaciones morfológicas en la célula, inducidos y

característicos de cada virus analizado se conocen como Efecto Citopático ECP.

Existen diferentes tipos de ECP como: redondeamiento, alargamiento, formación de

Sincicios, vacuolización, cuerpos de inclusión, lisis, etc. En algunos casos el ECP

presentado es tan característico que se relaciona con un solo tipo de virus, en otros,

la diversidad de virus que inducen a un mismo ECP merece la aplicación de otras

técnicas. Sin embargo el modelo de Cultivos Celulares se requiere para el primo

aislamiento de los virus a partir de un espécimen dado.

OBJETIVOS 1.- El alumno valorará la importancia de los cultivos celulares para el aislamiento de

virus.

2.- El alumno será capaz de determinar la presencia de virus en una muestra

reconociendo el ECP inducido en células en monocapa.


Q.F.B

41

MATERIAL Y REACTIVOS 2 Botellas de 25 cm2 con células en monocapa con un 80% de confluencia.

Inóculo viral (Vacuna viral, muestra clínica, stock viral)

Microscopio invertido.

Campana de Flujo Laminar.

Estufa de incubación con 5% de CO2

Micro pipetas con volumen variable de 20-200 µl y de 100-1000 µl.

Puntillas amarillas y azules estérilizadas.

Solución Salina de Fosfatos (SSF) estéril.

Pipetas Pasteur esterilizadas.

Pipetas de 5 y 10 ml esterilizadas

Plancha de agitación.

Medio Mínimo Esencial (MME) esterilizado por filtración.

Suero fetal de ternera esterilizado por filtración.

DESARROLLO 1. Revisar en el microscopio invertido la integridad de la monocapa celular de

las dos botellas.

2. Asignar una de las botellas como control y la otra como botella de prueba.

3. Decantar el medio de cultivo de ambas botellas.

4. Adicionar 7 ml de SSF a cada una de las botellas y lavar las células,

aspirando y dispensando por pipeteo la SSF sobre las monocapas. Desechar

la solución y repetir el procedimiento dos veces más.

5. Adicionar 500 µl de MME a la botella control y 500 µl del inóculo viral a la

botella de prueba.

6. Colocar ambas botellas en la plancha de agitación y mantener a temperatura

ambiente por una hora.

7. Adicionar a cada botella 5 ml de MME complementado con 0.5% de suero de

ternera e incubar a 37° C dentro de una estufa de CO2 en posición horizontal.

8. Observar diariamente, la botella control debe mantener la integridad de la

monocapa mientras en la botella de prueba se presentan cambios

morfológicos.


Q.F.B

42

9. Registrar los cambios especificando el tiempo en que se presentaron los

primeros cambios morfológicos y a cual de los ECP conocidos corresponde.

CUESTIONARIO 1. Cite tres ejemplos de ECP, los virus que los producen y el tipo de cultivo

celular en que se presentan.

2. Además del ECP, de que otra manera se puede mostrar la infección de un

virus empleando como modelo las células en cultivo.


Q.F.B

43

PRACTICA No. 13 REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN

ESCHERICHIA COLI.

Introducción Las bacterias son huéspedes de un grupo particular de virus denominados

bacteriófagos o simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para

estudios sobre la infección a nivel celular, la relación huésped parásito, la

multiplicación viral y estudios de ingeniería genética. Por otro lado, también son muy

útiles en la tipificación de cepas bacterianas.

En los bacteriófagos lisogénicos, también denominados temperados, el genoma del

fago se replica sincrónicamente con el genóforo bacteriano, pasando a la progenie

cada vez que la bacteria se divide por fisión binaria. En este estado lisógenico, los

fagos integrados al genóforo bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su

separación. Estos genes permiten a la bacteria lisógenica expresar nuevas

actividades y producir diferentes proteínas.

El genoma del fago lisógenico puede modificar la estructura del polisacárido

bacteriano y su antigenicidad, así como codificar la producción de toxinas

bacterianas que causan enfermedades tales como la difteria, la escarlatina, el

botulismo y el síndrome urémico hemolítico.

Por otra parte, los bacteriófagos líticos o virulentos se replican dentro de la bacteria

huésped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos líticos más

extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con

la letra T y diferentes números (bacteriófagos de la serie T). Los fagos virulentos al

destruir a las bacterias producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en

cultivos sobre placas de agar.


Q.F.B

44

Objetivo El alumno aprenderá a desarrollar bacteriófagos en el laboratorio y conocerá su

importancia en la Microbiología.

Material y equipo

• Incubadora bacteriológica

• Pipeteador automático

• Pipetas Pasteur

• Pipetas serológicas de 1 y 5 ml

• Tubos de ensaye de 13 x 100

• Gradillas

• Asa bacteriológica

• Cajas Petri

• Suspensión de bacteriófago T2

• Cultivo en caldo de Escherichia coli

• Etanol al 70%

• Solución salina fisiológica

• Agar cerebro corazón

• Caldo cerebro corazón

Desarrollo

1. Prueba cualitativa:

a) Siembre una placa de agar cerebro corazón, depositando en la superficie 0.2 ml

de una suspensión de Escherichia coli, que será el huésped específico del fago.

b) Enseguida distribuya el inóculo homogéneamente con un asa bacteriológica.

c) A continuación, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en

cada uno deje caer una gota de suspensión del fago T2, utilizando una pipeta

Pasteur.

d) Incube a 37º C por 24 hrs.

e) Observe las áreas circulares sin crecimiento de la bacteria, equivalentes a zonas

de bacterias lisadas por replicación del fago.


Q.F.B

45

II. Prueba cuantitativa por dilución en placa:

a) Haga diluciones de una suspensión del fago de la siguiente manera: En un tubo

estéril coloque 0.5 ml de la suspensión del fago, más 4.5 ml de caldo cerebro

corazón.

b) Transfiera 0.5 ml a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solución salina fisiológica (S.

S. F.) y continúe haciendo diluciones con S. S. F. hasta obtener una dilución de

1:1000 000.

c) De cada dilución del fago, transfiera 0.1 ml a tubos que contengan 0.1 ml de

Escherichia coli. Mezcle e incube a 37º C por 20 min.

d) Al cabo de este tiempo adicione a cada tubo 4 ml de agar cerebro corazón

“blando” (0.5%), mezcle y vacíe en cajas de Petri estériles con agar cerebro corazón.

e) Deje solidificar e incube a 37º C durante 24 hrs. Determine las placas líticas o

calvas y cuéntelas.

f) Para calcular el número de partículas virales / ml, cuente el número de placas

líticas en las cajas de cultivo que presenten pocas calvas y emplee la siguiente

fórmula:

UFP / ml = PV x FD

Donde:

PV = número de placas virales

FD = Factor de dilución

UFP / ml = unidades formadoras de placas por ml de suspensión original del fago.

Cuestionario

1. Anote Usted un ejemplo de bacteriófago temperado

2. En que mecanismo de recombinación genética entre bacterias se involucra la

participación de bacteriófagos

3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes

estructurales de los bacteriófagos de la serie T


Q.F.B

46

4. Investigue Usted el porque ciertas cepas de Escherichia coli son capaces de

producir colitis hemorrágica


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PRACTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO

SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES

El diagnóstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que

se enfrenta la medicina actual ya que para estos agentes, una cosa es lo que

idealmente deseamos tener y otra la realidad con la que contamos. Durante las

últimas décadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas para

evidenciar las etiologías de tipo viral, hace posible que estas entidades se puedan

descubrir y estudiar no sólo a nivel de laboratorios especializados, sino también en

los de diagnóstico de rutina.

¿Qué es lo ideal? Identificar plenamente el agente viral.

Resultados en corto tiempo.

Una sola prueba.

¿Cuál es la realidad?

No se hace diagnóstico directo del agente viral (descarte).

Se requiere la complementación entre la clínica y el laboratorio.

Recurrir al análisis por pruebas pares.

Diagnosticar si una infección es de etiología viral es muy importante porque

determina un cambio en la conducta clínica y en el manejo terapéutico del paciente, además de que ayuda a realizar un seguimiento clínico de la entidad.

Llevada con ética, esta actitud impacta social y económicamente, puesto que la

administración oportuna del tratamiento correcto reduce aspectos como el tiempo de

hospitalización y directamente el gasto a familiares.


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PRUEBAS SEROLÓGICAS

Al igual que la mayoría de los microorganismos, los virus se pueden

descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas directas son las que

evidencian al virus o algunos de los antígenos virales que se pueden encontrar

presentes en los tejidos o fluidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se

utilizan con más frecuencia y básicamente demuestran un contacto del huésped con

el agente viral mediante la determinación de anticuerpos específicos contra el virus.

En el laboratorio clínico se cuenta con las pruebas serológicas que tanto de

forma directa e indirecta son la principal herramienta que se aplica en el diagnóstico

viral. En estos ensayos se aprovechan las características fisicoquímicas de los

anticuerpos, así como su especificidad. Los principales aspectos a considerar son:

Se pueden detectan antígenos virales.

Se pueden valorar anticuerpos con especificidad antiviral en el paciente.

Requiere del análisis de sueros pares. En muestras tomadas con periodos de

separación de 10-14 días, un incremento de 4 veces o más en el título de la

segunda muestra con respecto a la primera, es considerado significativo para

una infección viral en curso.

Puede diferenciar entre infecciones primarias y crónicas. La presencia de Ig

M específica es más rápido y detectable a pocos días del inicio de la

enfermedad

Las pruebas serológicas con mayor aplicación en el diagnóstico clínico viral son:

INMUNOFLUORESCENCIA

a) Directa (Antígenos virales)

b) Indirecta (Anticuerpos de respuesta)

ENSAYOS ENZIMÁTICOS

a) Directo (Antígenos)

b) Indirecto (Anticuerpos de respuesta)

WESTERN-BLOT


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ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS: ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay)

ELISA Directo

Ensayos de captura del antígeno (sandwich). Son inmunoensayos en fase

sólida donde se fijan los anticuerpos específicos para el virus en la superficie de una

matriz, tubo o microplaca y luego se pone en presencia del suero o muestra que

contiene el antígeno que se quiere demostrar; una vez que ocurre la reacción

antígeno-anticuerpo, se hace un lavado y se agrega un anticuerpo marcado (Fig

1A).

En la técnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima que puede ser la

fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano (PR) y para revelar la reacción se

coloca el sustrato específico para la enzima que es modificado por ésta y produce

un compuesto coloreado. En el caso de la FA el sustrato es el paranitrofenilfosfato y

para la PR es el peróxido de hidrógeno en una solución de ortofenilendiamina

(OPD) que hace visible la reacción. Para la cuantificación se mide la absorbancia en

una longitud de onda determinada en un espectrofotómetro. La absorbancia será

directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra.

Estas técnicas se utilizan ampliamente en el diagnóstico de hepatitis A y B,

rotavirus, el agente Norwalk, parainfluenza, influenza A y B. Para la hepatitis B la

demostración de antígeno de superficie diagnóstica la infección activa así como el

estado de portador; el diagnóstico de rotavirus con este método ayuda a obtener un

resultado rápido en niños menores de dos años con cuadros diarreicos, donde este

virus es el principal causante de dichos cuadros; por otro lado para VIH la

demostración del antígeno p 24 es útil en el diagnóstico de la infección en niños y en

pacientes que se encuentran en ventana inmunológica y además es de gran utilidad

en el pronóstico y la progresión de la infección así como en el control de la terapia

antirretroviral.

ELISA Indirecto

Estas técnicas serológicas se emplean para determinar la existencia de

anticuerpos contra determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposición al


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agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que genera la

producción de anticuerpos específicos.

La prueba ELISA indirecta tiene un principio semejante al de ELISA directa, en

este caso, un antígeno específico está unido a una fase sólida que puede ser un

tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se añade el suero del paciente que posee

los anticuerpos y después se adiciona el conjugado constituido por un anti-

anticuerpo IgG o IgM unido a una enzima; posteriormente se adiciona el sustrato

específico para la enzima, que lo va a modificar y produce un compuesto coloreado,

cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero del

paciente (Fig. 1B).

Esta prueba se utiliza ampliamente; más aún, con el advenimiento y la

disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo de 1 a

2 horas. Su utilidad en virología es básicamente para determinar anticuerpos contra

antígenos específicos del virus dengue, herpesvirus, VIH, sincitial respiratorio,

Citomegalovirus, rubéola, hepatitis A, B y C principalmente, y en infecciones por

Virus Epstein-Bar se usa para demostrar marcadores serológicos tempranos de la

infección, que se pueden utilizar en el manejo de huéspedes inmunocomprometidos.

La especificidad de las pruebas de ELISA, depende de la calidad de los

sustratos adsorbidos en la fase sólida, lo cual se aprecia principalmente en los

diferentes tipos de ELISA indirecto donde de acuerdo con el antígeno que se utilice

la prueba puede ser:

a. De primera generación

Son pruebas incipientes donde se utilizan antígenos crudos sin mayores

procesos de purificación, como p.e., el virus completo inactivado, es el caso de las

primeras técnicas de ELISA para VIH. Sin embargo, estos ensayos presentaban

como resultado muchas reacciones inespecíficas.


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A) ELISA Directo B) ELISA Indirecto

Fig. 1. Diagrama esquemático de las pruebas de ELISA

b. De segunda generación

En este caso los antígenos son proteínas recombinantes, que se producen

mediante ingeniería genética en bacterias y son sometidas a procesos de

purificación lo que da más especificidad a la prueba pues se descubren anticuerpos

particulares contra las proteínas consideradas más inmunogénicas.

c. De tercera generación

Son las más utilizadas actualmente y las más específicas, donde se emplean

péptidos sintéticos (fabricados en un sintetizador en el laboratorio) con secuencias

más específicas del virus: tal es el caso de las pruebas diseñadas para determinar

sólo anticuerpos contra VIH2 y VIH1.

En otra modalidad de ELISA se usa el sistema biotina/avidina-estreptavidina,

método que se fundamenta en sistemas con distintos marcadores unidos a la

biotina y demostrados por reacciones enzimáticas, de color o quimioluminiscentes

que portan la avidina, la estreptavidina o la biotina. La biotina ligada a un

anticuerpo, nucleótidos, proteína o lecitina, se une a una molécula blanco que

puede ser anticuerpo (indirecta) o antígeno (directa), la avidina o estreptavidina se

marcan con una molécula demostrable como una enzima, una sustancia

fluorescente o un metal.

Marcaje

Anticuerpo secundario

Antígeno viral

Anticuerpo de captura

Fase sólida

Marcaje

Anti-IgG

Anticuerpo en la muestra (IgG o IgM)

Antígeno viral Fase sólida


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PRACTICA No. 15 ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE

CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA, HEPATITIS B Y HIV.

ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO INDIRECTO DE FASE SÓLIDA (EIA), PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LOS VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA

HUMANA (HIV). INTRODUCCIÓN

El virus de inmunodeficiencia humana (HIV) es un retrovirus, identificado en

1983 como el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida

(SIDA).

Aunque se trata de un síndrome, es decir, un conjunto de signos y síntomas, y

no de una sola enfermedad, por ser valido y más sencillo de aquí en adelante nos

referimos al SIDA como enfermedad. Por lo pronto no existe tratamiento ni vacuna

contra el virus, por lo que una vez que se desarrolla, casi inexorablemente, a la

muerte en un tiempo muy corto.

En nuestro país, el informe, descripción y análisis de esta singular

enfermedad, ha sido objeto de múltiples actividades académicas, clínicas, e incluso

culturales. A partir de abril de 1987, el SIDA se convirtió en una enfermedad sujeta a

vigilancia epidemiológica; la notificación de los casos tiene carácter de obligatoria e

inmediata.

Hasta ahora se conocen dos variables genéticas del virus, en función del

antígeno de superficie que los clasifica en VIH-1 y VIH-2. Para el VIH-1 la

glicoproteína externa es la gp120 y la de transmembrana es la gp41; para el VIH-2 la

gp externa es la 140 y la de transmembrana es la gp36.

Desde que se reconocieron los primeros casos de SIDA, una de las primeras

líneas de investigación ha sido lo referente a la transmisión del virus; conociéndose

hasta el momento las siguientes vías:

1. Sexual: homosexual, heterosexual.

2. Sanguínea: transfusión de sangre y/o hemoderivados.

3. Perinatal: durante el embarazo, en el parto, después del parto (leche materna).

Para el diagnostico de VIH se cuenta con:


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Métodos directos (determinan estructuras de los virus), como:

Aislamiento del virus en cultivos celulares

Detección de antígenos virales con anticuerpos monoclonales

Reacción en cadena de la polimerasa

Hibridización con sonda de DNA marcadas

Métodos indirectos (donde se valoran anticuerpos contra el virus), como:

Pruebas de Inmunoenzayo enzimatico (ELISA)

Aglutinación pasiva con partículas de látex

Inmunoelectrotransferencia (Western-Blot)

OBJETIVO: El alumno aprenderá una de las técnicas empleadas para el diagnostico de

infección por los virus del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA)

MATERIAL Y REACTIVOS: Equipo Inmuno Comb HIV 1+2 PBS-Orgenics

Micropipetas con puntillas para 25, 50 y 100 µl

Tijeras

Perforador

Reloj

Papel desechable

Sueros problema

Sueros control positivo y negativo

Solución de hipoclorito de Sodio

METODOLOGÍA o Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de

los sueros problema, control positivo y negativo

o Deposito de muestra. Compartimiento A.

Deposite por separado 50 µl de los sueros dentro de cada pozo del

compartimiento A perforando la cubierta de papel aluminio y descargando la

muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente contenido en

el compartimiento A mediante carga y descarga del a solución en varias

ocasiones. Utilice una puntilla por cada muestra y deséchela


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Desarrollo de la prueba o Reacción antígeno-anticuerpo.

Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa

apuntando hacia usted. Reinserte el peine varias veces para mover las

burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.

Al final de la incubación extraiga el peine del compartimiento y seque el

líquido sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y

perfore con las pinzas el papel que cubre los pozos del siguiente

compartimiento.

NOTA: Este último procedimiento se repetirá siempre antes de pasar de un

compartimiento a otro.

o Lavado. Compartimiento B Inserte el peine en el compartimiento B, para lograr un lavado adecuado

mueva el peine hacia atrás y adelante durante un periodo 2 min.

o Conjugado. Compartimiento C. Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces.

Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.

o Lavado. Compartimiento D. Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.

o Lavado. Compartimiento E. Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B.

o Reacción de color. Compartimiento F Inserte el peine dentro del compartimiento F; Reinserte el peine varias veces

durante 10 min. a temperatura ambiente.

o Detección de la reacción. Compartimiento E. Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E, después de 1 min. retire el

peine y séquelo al aire completamente.

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el fundamento de está prueba?

2. ¿Cuándo se dice que el paciente es seropositivo?

3. ¿Cuál es la diferencia entre un paciente seropositivo y uno con SIDA?


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4. ¿Cómo se puede prevenir el SIDA?

5. ¿Cómo se trata la enfermedad del VIH?


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ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS IgG CONTRA EL VIRUS DE LA RUBÉOLA EN EL SUERO O PLASMA HUMANO.

INTRODUCCIÓN El virus de la rubéola es miembro de la familia Togavirus. La familia está

formada por un grupo de agentes virales pequeños que contienen ácido ribonucléico

en su genoma y una envoltura lipídica, de donde deriva la palabra “toga”.

Es considerable el avance alcanzado en el conocimiento del virus de la

rubéola a partir de que se logro cultivar in vitro en 1962. Esto condujo a la posibilidad

de hacer estudios moleculares del virus, de estudiar la infección y su replicación.

El virus de la rubéola es sensible al éter y fácilmente inactibable por agentes

químicos y por radiación ultravioleta; es relativamente termolábil, perdiendo su in

efectividad si permanece durante una hora a 37ºC, mientras que es capaz de

mantener su viabilidad a temperatura de refrigeración si se encuentra en una

solución que contenga proteínas. Son partículas esféricas y de diámetro de 60 a 70

micras; posee una nucleocápside rodeada de doble membrana lipídica con espículas

con capacidad hemaglutinante, se cultiva en varios tipos de líneas celulares,

principalmente las provenientes de mono (RK-13, VERO y AGMK).

El único resrvorio del virus de la rubéola es el humano y la enfermedad se

propaga por medio de las secreciones faríngeas, la orina, líquido cefalorraquideo y

sangre de personas infectadas, tengan o no síntomas clínicos, desde varios días

antes de aparecer el exantema y hasta después de una semana, manifestándose

con una multitud de formas clínicas posibles desde la infección inaparente, hasta un

cuadro clínico clásico de exantema linfadenopatía y fiebre. Puede haber

complicaciones de tipo meningoencefalítico.

La enfermedad es endémica en todo el mundo y aparece en epidemias

periódicas, principalmente en la infancia, aunque es más frecuente en los adultos,

común entre los estudiantes universitarios.

El período de incubación es de 14 a 21 días con un promedio de 17 días.

En los adultos la enfermedad puede presentarse en forma más severa, con

poliartralgias tan frecuentes que se consideran típicas de la enfermedad.

La infección posnatal es benigna, en contraste con la infección prenatal,

particularmente si ocurre durante las primeras 16 semanas del embarazo. Las


Q.F.B

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consecuencias de la rubéola in utero son variadas e impredecibles y pueden variar

desde la afectación severa con muerte fetal, en nacimientos vivos con

malformaciones evidentes o en productos normales sin evidencia clínica de la

infección.

El diagnostico de la rubéola puede establecerse en base a dos

procedimientos: virológico que se refiere al cultivo del virus a partir de muestras del

paciente y el serológico que se refiere a la demostración de anticuerpos que se han

adquirido como resultado de la infección, existen varios métodos tales como la

fijación del complemento, hemaglutinación, hemólisis en gel aglutinación en latex,

anticuerpos fluorescentes, métodos inmunoenzimaticos, radioinmunoanálisis y gran

variedad de pruebas especificas para detección de IgM.

La vacuna HPV 77 (Meyor-Parkman)es preparada en cultivo celular de

embrión de pato y está indicada en niños desde 1 año hasta la pubertad.

OBJETIVO El alumno aprenderá el manejo de la técnica del ensayo inmunoenzima´tico

indirecto de fase sólida (EIA), empleada para el diagnóstico de anticuerpos Ig G

contra el virus de la rubéola.

MATERIAL Y REACTIVOS Equipo Inmuno Comb II para la rubeola IgG

Micropipetas con puntilla 10, 25 y 100 ul

Perforador

Tijera.

Reloj

Papel desechable

Sueros control

Suero problema

Hipoclorito de Sodio.

METODOLOGIA Pre dilución de muestras y controles.

1. Para cada muestra y control. Colocar 100 ul de diluyente de la muestra de cada

microtubo.


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2. Añadir a cada microtubo 10ul de la muestra o del control positivo o negativo

Mezcle cargando y descargando repetidamente la solución con la pipeta.

-Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los

sueros muestra, control positivo y negativo.

-Depósito de muestra. Compartimiento A.

Deposite por separado 20 ul de los sueros problema y controles de cada pozo

de compartimiento A, perforando la cubierta de aluminio con el perforador y

descargar la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente

contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga de la solución en

varias ocasiones.

-Reacción Ag-Ac.


apuntando hacia usted. Reinserte la tarjeta varias veces para remover las burbujas

de aire. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación extraiga el peine de compartimiento y seque el líquido

sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con el

perforador el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento.

NOTA: Este último procedimiento se repetirá siempre antes de pasar de un


-Lavado. Compartimiento B.

Inserte el peine en el compartimiento B e incube por 2 minutos, para lograr un

lavado adecuado, mueva periódicamente el peine hacia atrás y adelante durante la

incubación.

-Conjugado. Compartimiento C

Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte e peine varias veces para

remover las burbujas de aire. Incube durante 20 min. a temperatura ambiente.

- Lavado. Compartimiento D.

Inserte el peine en el compartimiento D e incube por 2 min., para lograr un lavado

adecuado mueva periódicamente el peine hacia atrás y hacia delante durante la

incubación.

-Lavado. Compartimiento E.

Repetir el procedimiento como para el compartimiento D.

- Reacción de color. Compartimiento F.


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Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte el peine varias veces para

remover las burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente.

- Detección de la reacción. Compartimiento E.

Vuelva a insertar el peine al compartimiento E. Después de 1 min. retire el peine y

séquelo al aire completamente.

CUESTIONARIO. 1.- ¿Cuál es el fundamente de esta prueba?

2.- ¿Cuál es la diferencia entre rubéola congénita y neonatal?

3.- Mencione mecanismos de prevención y tratamiento para la rubéola.


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ENSAYO INMUNOENZIMATICO PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANTIGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (AgsHB).

INTRODUCCIÓN La hepatitis viral es una enfermedad generalizada que afecta principalmente al

hígado. Es causada por los siguientes agentes:

1. Virus de la Hepatitis A (agente causal de la hepatitis infecciosa)

2. Virus de la Hepatitis B (asociado a la hepatitis sérica)

3. Virus de la Hepatitis C (causa de muchos casos de hepatitis postranfucional)

4. Virus de la Hepatitis D requiere de la presencia de del VHB. Asimismo, se ha

identificado el agente causal de otra de las formadas de la antes llamada

hepatitis no A-no B

5. Virus de la Hepatitis E

Otros virus que tambien pueden ser agentes causales de la Hepatitis se

encuentran: virus Epstein Bar, rubéola, citomegalovirus, coxsakie, varicela zoster

entre otros.

El virus de la Hepatitis B pertenece al grupo hepadnavirus y su transmisión es

vía parenteral (sangre y derivados, fomites contaminados por el virus). Al virus se le

conoce como partícula DANE, presente diversos antigenos que estimulas

anticuerpos, lo cual se utiliza en el diagnostico de la enfermedad, este puede

detectarse de manera completa (virión completo) o en partes del mismo, la cubierta

proteínica se determina antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y la

partícula interna antígeno core (o central) de la hepatitis B (HBcAg). Resiste la

temperatura a 37ºC por 1 hora, 60ºC por 10 horas, 25ºC por una semana, 100ºC un

minuto y 20ºC por 5 años. El hipoclorito de sodio al 0.5 % lo inactiva en 3 minutos.

La infección tiene un periodo de incubación de 60 a 180 días; su comienzo es

insidioso, con poca o ninguna fiebre. Pudiendo presentarse a cualquier edad.

OBJETIVO 1. El alumno aprenderá el manejo de la técnica del Ensayo inmunoenzimático

indirecto de fase sólida (EIA), empleado para el diagnostico de HBsAg.

MATERIAL Y REACTIVOS Equipo Inmuno Comb II para HBsAg


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Micro pipetas con puntillas para 10, 25, y 100 ul

Estufa a 37ºC

Tijeras

Perforador

Reloj

Papel desechable

Suero problema

Suero control positivo y negativo

Solución de hipoclorito de sodio

METODOLOGÍA Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los

sueros problema, control positivo y negativo.

Deposito de muestra compartimiento A.

Deposite por separado 75 ul de los sueros problema, control positivo y

negativo dentro de cada poza del compartimiento A (cada una por separado en el

pozo A correspondiente para cada muestra), perforando la cubierta de papel

aluminio con el perforador y descargando la pipeta con la muestra en el fondo del

pozo. Mezcle vaciando y cargando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche

la punta de la pipeta.


apuntando hacia usted. Reinserte varias veces para remover las burbujas de aire,

incube por 30 minutos a 37ºC.

Al final de la incubación extraiga el peine del compartimiento y seque el

liquido sobre nadante con el papel desechable y perfore el papel que cubre los

pozos del siguiente compartimiento.

NOTA: Este ultimo procedimiento se repetira siempre antes de pasar de un


Lavado. Compartimiento B

Inserte el peine en el compartimiento B e incube por dos minutos; para lograr

un lavado adecuado mueva periódicamente el peine hacia atrás y adelante durante

la incubación.

Enlace anti-HBs. Compartimiento C.


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Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces para

remover las burbujas de aire. Incube durante 20 minutos a 37ºC.

Reacción con fosfatasa alcalina. Compartimiento D.

Inserte el peine en el compartimiento D. Reinserte el peine varias veces para

remover las burbujas de aire. Incube durante 20 minutos a 37ºC.

Lavado. Compartimiento E.

Inserte el peine en el compartimiento E y agite vigorosamente por 2 minutos,

moviendo el peine hacia atrás y adelante.

Reacción de color. Compartimiento F.

Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte varias veces igual que en

A, e incube durante 10 minutos a 37ºC.

Detección de la reacción. Compartimiento E

Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E. Después de un minuto

retire el peine y séquelo al aire completamente.

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es le fundamento de esta prueba?

2. ¿Cuál es la diferencia entre los tipos de hepatitis?

3. ¿Cuáles son las formas de transmisión de los diferentes tipos de hepatitis y

cuáles serían los mecanismos de prevención?

4. Describa otros métodos para diagnosticar hepatitis, diferente a la hepatitis B.

Documents

Manual Virología