Manual de practicas instrumentales y analiticas

Manual de prácticasde química analítica II

José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado

Alberto Reyes Dorantes • Frida Malpica Sánchez

Casa abierta al tiempoUNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]

Ramón Verde Calvo es egresadode la Facultad de Química de laUNAM, en donde obtuvo su títulode químico farmacéutico biólogo,tecnólogo en alimentos. Poste-riormente realizó sus estudios demaestría en la Facultad de Cienciasde la UNAM. Actualmente trabaja

en la UAM-Iztapalapa en el grupo de Enología y Ali-mentos Fermentados, en donde lleva a cabo investiga-ciones sobre el cambio en el color del vino tinto du-rante el añejamiento.

María de Lourdes Escamilla Hur-tado realizó sus estudios de licen-ciatura en la Facultad de Químicade la UNAM, obteniendo el títulode química farmacéutica bióloga,orientación en Tecnología de Ali-mentos. Posteriormente obtuvo sugrado de maestría en la Universi-

dad de Hiroshima, Japón, en el área de Tecnología deFermentaciones. Posteriormente se ha desarrolladoprofesionalmente como profesora-investigadora en laUniversidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapa-lapa, desde 1982, dirigiendo proyectos sobre fermen-taciones lácticas en alimentos indígenas tradicionales,producción de aromas por fermentación y enología, delos cuales surgieron diversas publicaciones nacionalese internacionales. También ha ejercido la docencia, tantoen la UAM-Iztapalapa como en la Facultad de Químicade la UNAM, formando recursos humanos en los cam-pos de microbiología y biotecnología alimentaria.


Casa abierta al tiempo





Manual de prácticas dequímica analítica II



UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

Dr. José Luis Gázquez MateosRector General

Lic. Edmundo Jacobo MolinaSecretario General

UNIDAD IZTAPALAPADr. Luis Mier y Terán CasanuevaRector

Dr. Eduardo Carrillo HoyoSecretario

Dr. José Luis Arredondo FigueroaDirector de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Dr. Gerardo SaucedoJefe del Departamento de Biotecnología

Ma. del Rosario Hoyos AleaJefa de la Sección de Producción Editorial




Manual de prácticas dequímica analítica II

José Ramón Verde Calvo

Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado

Alberto Reyes Dorantes

Frida Malpica Sánchez

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Cuidado de la edición y corrección de estilo:Ma. Guadalupe Olvera Arellano

Primera impresión: 1999

© UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANAUNIDAD IZTAPALAPAAv. Michoacán y La PurísimaIztapalapa, 09340, México, D.F.

ISBN: 970-654-363-5Impreso y hecho en México / Printed in México



índice

Presentación 9

Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 11

Práctica 1. Análisis cualitativo de cromatografía

de gases (dos columnas) 33

Práctica 2. Factor de respuesta en cromatografía de gases 37

Bibliografía 40

Capítulo 2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DEALTA RESOLUCIÓN 43Práctica 3. Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído(método del patrón interno) 63

Práctica 4. Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas(método del patrón externo) 69

Bibliografía 74

Capítulo 3. ESPECTROFOTOMETRÍ A 75

I. VISIBLE ULTRAVIOLETA 77

Práctica 5. Desarrollo de un método espectrofotométrico 85

Práctica 6. Determinación por espectrofotometría de laconcentración de cobalto y níquel en una mezcla 91



II. TURBIDIMETRÍA 95

Práctica 7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97

Bibliografía 101

Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 103

Práctica 8. Determinación potenciométnca de constantes

de ionización 113

Práctica 9, Titulación potenciométnca del ferrocianuro con ceno 117

Bibliografía 125



Presentación

El presente manual tiene como meta apoyar de la manera más amplia el cursoteórico-práctico de Química Analítica II, materia que se imparte en el sextotrimestre de las carreras de ingeniería en alimentos e ingeniería bioquímica in-dustrial. El material está elaborado pensando en el sistema trimestral de laUniversidad Autónoma Metropolitana, hecho que no restringe que cual-quier curso de química analítica impartido en otra escuela pueda utilizar estematerial.

En el manual se abordan temas como: cromatografía de gases y de líquidosde alta resolución, espectrofotometría y potenciometría. Cada capítulo estáestructurado con una introducción (los fundamentos teóricos necesarios paracomprender los temas incluidos en la parte práctica), y presenta la descripciónde los aparatos a utilizar, así como la forma correcta de operarlos.

El texto se compone de nueve prácticas, estructuradas con objetivos, intro-ducción, material y reactivos, normas y reglas de seguridad, técnicas, tratamientode datos experimentales, cuestionario y bibliografía. Esta última se presenta alfinal de cada capítulo e incluye textos de autores reconocidos, así como revistascon artículos actualizados de apoyo a los experimentos.

Para la obtención de mejores resultados, se recomienda relacionar am-pliamente los conceptos teóricos con las actividades experimentales.

Los autores





Capítulo 1

CROMATOGRAFÍA DE GASES





Introducción

Este capítulo tiene como objetivo mostrar al alumno los fundamentos prácticosde la cromatografía de gases: cómo funciona un cromatógrafo con detector deconductividad térmica y cómo se obtiene e interpreta el cromatograma, in-cluyendo una explicación sobre los cálculos para cuantificar muestras a partirde compuestos puros.

La cromatografía de gases es la técnica más utilizada entre los métodosinstrumentales de separación, ya que identifica de manera sencilla y rápida elnúmero de componentes de una mezcla. El único requisito para su imple-mentación es que las sustancias a separar sean estables a la temperatura ne-cesaria para mantenerlas en estado gaseoso (Ewing, 1979).

Clasificación de la cromatografía

Por sus características analíticas la cromatografía puede ser:

a) Cromatografía cualitativa, que consiste solamente en la separaciónde los componentes de una mezcla.

b) Cromatografía cuantitativa o analítica, que permite identificar ycuantificar cada uno de los componentes de la mezcla.

De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía degases se divide en dos:

a) Cromatografía gas sólido (CGS), también conocida como croma-tografía de adsorción, en donde la fase estacionaria cuenta con unmaterial sólido como el sílice granular, la alúmina o el carbón. El solutose adsorbe en la superficie de las partículas sólidas. Las separaciones sellevan a cabo sobre adsorbentes, debido a que se crea un equilibrioentre el adsorbente y las moléculas de la fase móvil. Si las moléculas deun componente están estrechamente ligadas al adsorbente, la sustancia



Manual de prácticas de química analítica II

no correrá por la columna ya que es retenida fuertemente por ésta. Si lasmoléculas tienen una baja atracción por el adsorbente, tenderán a moversecon rapidez junto con la fase móvil (figura 1.1).

Soluto absorbido en lasuperficie de la faseestacionaria

Figura 1.1 Cromatografía de adsorción.

La tabla siguiente muestra algunos ejemplos de columnas capilares comer-ciales, utilizadas en cromatografía gas sólido, mencionando su aplicacióny la temperatura máxima de trabajo.

Tabla 1.1 Columnas capilares comerciales.

Columna

H P S o M

Poraplot Q

Poraplot U

TemperaturaMáxima

200 °C

250 °C

190°C

Aplicación

Hidrocarburos, gas natural

Alcoholes volátiles enagua,gases

Compuestos volátiles polares,aldehidos

HP Hewlett PackardColumnas capilares, soporte; A12O3

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Cromatografía de gases

b) Cromatografía gas líquido (CGL) o cromatografía de reparto, endonde la fase estacionaria es una capa delgada de un líquido no volátil,colocada sobre un soporte sólido (figura 1.2).

La fase estacionaria forma una película delgada en la superficie de unsoporte sólido. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario yuna fase móvil gaseosa. La cromatografía de reparto o de particiónpresenta grandes ventajas, comparada con la cromatografía de adsorción:es mucho más reproducible y, gracias a que el coeficiente de particiónse hace constante en un margen más amplio de concentraciones, permiteque las bandas sean más definidas y mucho más simétricas.

Soluto disuelto en la faselíquida que recubre lasuperficie del soportesólido

Figura 1.2 Cromatografía de reparto.

El soporte sólido ideal no debe tener efecto en el procesocromatográfico, sólo debe servir como matriz mecánica para la faselíquida. El soporte más común es la tierra de diatomeas, también conocidacomo kieselguhr, material muy poroso que contiene muchos gruposoxidrilo libres en su superficie.

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Componentes importantes de un cromatógrafo de gases

Uno de los puntos más importantes a considerar en la cromatografía de gases,es el grado de separación que puede lograrse entre diferentes componentes enuna columna dada. Son varios los factores que pueden influir en la separacióndeseada: dimensiones de la columna, temperatura, velocidad de flujo del gasacarreador, volumen de la muestra y caída de presión en la columna.

Existen dos diferentes tipos de columnas: las empacadas y las capilares.En las primeras el soporte se encuentra empacado en tubos de acero inoxidableo vidrio, que comúnmente tienen un diámetro de 3 a 6 mm y de uno a cincometros de longitud. Las columnas con mayor diámetro son utilizadas en trabajosde preparación para obtener una mayor cantidad de compuestos separados.En las columnas capilares la longitud es mucho mayor, pudiendo llegar hasta100 metros con un diámetro de 0.1 a 0.3 mm. Estas últimas se caracterizan portener un mayor número de platos teóricos, lo que implica mejor resolución,menor tiempo de análisis y una mayor sensibilidad, aunque la cantidad demuestra por correr debe ser menor (Harris, 1992).

Se pueden emplear muy diversos soportes sólidos y fases líquidas esta-cionarias. La elección depende básicamente de la naturaleza de los compuestosque se desean separar (tabla 1.2). La literatura informa acerca de gran cantidadde soportes sólidos que han resultado satisfactorios, y de un número aun mayorde líquidos para la fase estacionaria. El líquido estacionario debe producir unreparto diferencial de los diversos componentes de la mezcla de ensayo, yposeer suficiente poder de disolución sobre los componentes en estado vapor.Por supuesto, el líquido estacionario no ha de ser volátil a las temperaturas detrabajo, pues de otra manera se evaporaría abandonando la columna. Si setiene interés por profundizar en este tema, se pueden consultar los trabajos deBens (1961), donde describe algunas propiedades y características de lossoportes ordinarios. Rohrschneider (1971) reportó una clasificación de las faseslíquidas en función de su polaridad, y propuso una escala de 0 a 100 en la queel escualeno es tomado como cero y el oxidipropionitrilo como cien.

La temperatura necesaria para efectuar la separación de una mezcla estádeterminada por dos factores: el grado de separación que se considere suficientey el tiempo razonable para el análisis. En general, cuanto más baja es la tem-peratura mayor es la separación de los componentes, y mayor también el tiempo

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de retención de estos últimos en la columna. Rowan (1961), al igual que Desty(1965) y muchos otros autores (Meloan, 1973), analizan el efecto de latemperatura en la cromatografía de gases.

La velocidad de flujo del gas portador varía con cada análisis y puede cambiarpara diferentes tipos de compuestos por analizar. Tal velocidad influye en lacuantificación de la altura equivalente de un plato teórico (AEPT). Para lascolumnas empacadas de 0.63 cm de diámetro, se recomiendan flujos de 40 a100 ml/min, que deberán regularse con una precisión mayor de 1 ml/min.

Los gases portadores que se utilizan con más frecuencia son: nitrógeno,helio, argón y dióxido de carbono. Su elección se basa, al menos en parte, enel factor económico, pero un criterio más importante es el tipo de detectorempleado. Para un detector de conductividad térmica, los gases adecuadosson: nitrógeno, hidrógeno, argón y helio. El hidrógeno presenta altos valores deconductividad térmica, factor muy importante en la detección de compuestos,pero debido a su explosividad no es recomendable para la docencia. El heliotambién tiene un alto valor de conductividad térmica, pero es un recurso norenovable y de costo elevado. En cambio, el nitrógeno se utiliza ampliamentepor ser barato e inocuo, a pesar de no tener un valor alto de conductividadtérmica.

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Tabla 1.2 Fases estacionarias líquidas de uso común encromatografía de gases.

NombreComercial

Escualeno

Apienzon L

SE-30

OV-1

UCW-982

DC-200

OV-101

SP-2100

SE-52 0 SE-54

Dexsii 300

OV-17

OV-25

OV-210

Carbowax20M

Carbowax20MTPA

Carbowax1500

SilariOC

Descripción

Escualeno

Apienzon L

100% goma de silicona

100% goma de silicona

goma del 99% metil, 1% vinil

100% de metil silicona líquida



fenilo al 5%

Metil carbonato de silicona

Metil fenil silicona al 50%

Metil fenil silicona al 75%

3,3,3-trifluoropropilo al 50%

polietilen glicol

polietilen glicol modificadocon ácido tereftálico

polietilen glicol

Cianopropil silicona al 100%

Polaridad*

I

I

I

I

II

II

II

II

II

II

II

III

III

IV

IV

IV

IV

TemperaturaIíquido/°C

20/100

50/300

50/300

50/300

0/300

0/250

0/350

0/350

50/300

50/450

0/375

0/350

0/275

60/225

60/250

40/200

0/250

* I a IV de menor a mayor polaridad.

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La muestra líquida se introduce en el cromatógrafo inyectándola con unajeringa a través de un septo de goma, la temperatura vaporiza la muestra y elgas acarreador lo lleva a lo largo de la columna. Las columnas analíticas requierende 0.1 a 10 jal de muestra líquida, mientras que las columnas para trabajopreparativo llegan a utilizar de 20 a 1000 jil. Las muestras gaseosas requierende jeringas con cierre hermético o válvulas de muestreo de gases. Para el trabajoanalítico se utilizan volúmenes de 0.5 a 10 mi de gas, y para el análisis preparativolos volúmenes pueden aumentar hasta un litro (Harris, 1992).

Detector de conductividad térmica. La capacidad de enfriamiento de ungas está basada en la facilidad que tiene para transferir el calor que absorbe,cualidad representada por su valor de conductividad térmica. Entre más grandesea el valor, la capacidad para transmitir el calor será mejor. Por lo tanto, si sesuministra una cantidad constante de energía eléctrica al filamento del detector,su temperatura estará en función de la conductividad térmica del gas acarreador.Con un gas puro, la temperatura del filamento es constante, pero al presentarsecambios en la composición del gas, la temperatura varía y se modifica laresistencia eléctrica. Por lo tanto, los filamentos deben ser resistentes a loscambios de temperatura y a la corrosión química. Para su fabricación se empleageneralmente platino, tungsteno y níquel.

Los factores que afectan la sensibilidad de los filamentos son: su geometría,la corriente que pasa a través de los mismos, su resistencia y el valor de la con-ductividad térmica del gas. La tabla 1.3 muestra la conductividad térmica delos gases y de algunos compuestos utilizados en cromatografía.

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Tabla 1.3 Conductividad térmica.

sustancia

Nitrógeno

Helio

Argón

co2

Hidrógeno

Oxígeno

CO

Metano

Propano

n-Butano

Étanol

Acetona

Cloroformo

ct*

5.81

34.80

3.98

13.52

41.60

5.89

5.63

7.21

3.58

3.22

3.50

2.37

1.58

* unidades de la conductividad térmica cal cnrr2 seg^2/°C crrr1

Cálculos en cromatografía

Con los datos de un cromatograma es posible realizar una serie de cálculossencillos para conocer parámetros como la eficiencia de la columna, además,si aplicamos técnicas de estándares se puede conocer también la concentraciónde muestras problema. A continuación se desarrollan los cálculos más comunesy útiles en cromatografía.

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Número de platos teóricos en una columna (n)

Un plato teórico es el lugar donde se lleva a cabo el equilibrio de distribuciónde la muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria. A mayor número deplatos teóricos, la separación en la columna es mejor.

w= 16

n - número de platos teóricost = tiempo que transcurre desde la inyección hasta el centro del pico delcomponenteAw=ancho del pico del componentetj y Aw se expresan en las mismas unidades (tiempo, volumen, distancia, etc.)

Altura equivalente de un plato teórico (AEPT)

Un plato teórico puede considerarse la longitud de columna necesaria paraestablecer un equilibrio de distribución entre la fase estacionaria del soluto y lafase móvil.

AEPT = ^

AEPT = altura equivalente de un plato teóricoL = longitud de la columnan = número de platos teóricos

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Cálculo del área de un pico con forma de triángulo

Las curvas o picos en un cromatograma generalmente presentan una formagaussiana. Un método sencillo para calcular el área bajo la curva es transformarlaen un triángulo, extrapolando la tangente en los puntos de inflexión hacia lalínea de referencia, como lo indica la figura 1.3.

Respuestadel.detector

t = 0inyección

tr o vr

Punto de inflexión(parte más jinclinada de la /curva) /

tiempo o volumen

Figura 1.3 Cromatograma ideal

Fórmula para calcular el área de un triángulo:

A b*hA

A = áreah = alturab = longitud de la base

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Cálculo de la resolución

Mide la separación entre componentes. La figura 1.4 indica la manera de medirlos parámetros:

ECUACIÓN DE RESOLUCIÓN

Figura 1.4 Resolución entre dos picos cromatográficos.

V -VV 2 V \

R 1/2 (Wx + W2)

Vx = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 1V2 = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 2FPj y fP2 = ancho de los picos 1 y 2

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Análisis cuantitativo

Existen diversos métodos para el cálculo de concentraciones en un sistemacromatográfico. Los hay sencillos, pero poco confiables, pues no utilizan ningunasustancia de referencia, y los hay más elaborados con un mayor grado deconfiabilidad. Estos métodos son:

1. Normalización2. Calibración absoluta3. Estándar interno4. Estándar externo

Normalización o porcentaje por áreas

Con base en el cromatograma de una mezcla separada, es posible determinarla concentración de cada uno de sus componentes por el área bajo la curva.Primero hay que medir las áreas individuales de cada pico, sumarlas y, conbase en el total, sacar el porcentaje de cada componente. Este porcentaje esproporcional a la concentración del componente en la mezcla, siempre y cuandola conductividad térmica de los componentes sea la misma, o muy parecida, yque la respuesta del detector de conductividad térmica también sea igual paratodos los componentes. Como esto no es posible en la mayoría de los casos,se requiere utilizar otros métodos más exactos.

Calibración absoluta

Consiste en inyectar en la columna una cantidad conocida de sustancia purapara medir el área del pico resultante. Enseguida, bajo las mismas condicionesde corrimiento cromatográfico, se mide el área del pico que resulte de la sustanciaen la mezcla desconocida.

Finalmente, estableciendo una proporción, se puede encontrar la con-centración de la sustancia desconocida.

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Estándar interno

Este método se puede utilizar de dos formas, para calcular un factor de respuestao elaborando una curva estándar para encontrar la concentración de una muestraproblema. El estándar o patrón interno es aquella sustancia que se inyectajunto con la o las muestras problema en un cromatógrafo. Las condiciones queesta sustancia debe cumplir son (León, 1982):

• No debe formar parte de la muestra que se desea analizar.• Tener similitud con los componentes del problema.• Proporcionar por sí sola y junto con la muestra problema, picos bien resueltos

y de buena forma.• Eluir en un tiempo cercano al de los componentes del problema.• No debe reaccionar con los componentes de la muestra.

a) Factor de respuesta El método se basa en calcular el factor de respuestapara cada sustancia analizada, ya que los detectores no responden de lamisma manera a todos los solutos. La técnica no es muy complicada yconsiste en medir el área bajo los picos de cada compuesto, en relacióncon el área de los picos de un patrón interno. El factor de respuesta estádefinido por la relación:

[P] \Ap

[S] = concentración del soluto (cualquier unidad de masa/volumen)[P] = concentración del patrón (cualquier unidad de masa/volumen)As = Área del solutoAp = Área del patrón

Este factor de respuesta se puede utilizar tanto con el método denormalización como con el del patrón interno.

b) Estándar interno con elaboración de curva estándar. En este casotambién se requiere de la adición de un compuesto de concentraciónconocida. Se utilizan mezclas conocidas del patrón (P) y del soluto oanalito (S) para construir una curva patrón, como en la figura 1.5. Si una

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cantidad conocida de patrón se agrega a una muestra problema, la curvade calibración puede utilizarse para hallar la concentración del soluto.Cuando se use un estándar interno es recomendable que la curva decalibración se elabore cuando menos con tres puntos. Las unidades deconcentración pueden ser moles/litro, g/1, mg/1, porcentuales, etc.

hs

~hp

[S] = concentración del soluto hs = altura del soluto[P] = concentración del patrón hp = altura del patrón

Figura 1.5 Curva para estándares internos.

Estándar externo

Esta técnica es menos complicada que el estándar interno, pero requiere demayor cuidado durante las separaciones cromatográficas. Las curvas decalibración con patrones puros son elaboradas con base en varias concen-traciones. Es importante cuidar que los volúmenes de inyección sean los mismosque para los compuestos de interés. Se construye una gráfica de área o altura,en función de la concentración, la cual puede estar en cualquier unidad demasa/volumen, ya sea molaridad, % p/v, o también puede utilizarse el % p/p.La concentración del compuesto desconocido se interpola en el gráfico, conbase en el dato de área o altura del pico correspondiente (figura 1.6).

Áreaoaltura

Concentración

Figura 1.6 Curva para estándares externos.

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Operación del cromatógrafoGow-Mac modelo 69-350

Descripción

Todos los controles de operación del modelo 69-350 están localizados en laparte frontal del aparato (figura 1.7).

11

Figura 1.7 Cromatógrafo de gases Gow-Mac.

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1. Puerto de inyección para la columna "A"2. Control de ajuste del flujo de la columna "A"3. Control de temperatura del puerto de inyección4. Control de temperatura del detector5. Control de temperatura de la columna6. Sistema analógico de medición7. Selector de medición8. Control de encendido del cromatógrafo9. Control de cambio de polaridad10. Control de encendido del detector11. Control de ajuste del cero12. Control de atenuación13. Control de la corriente del detector14. Control de ajuste de flujo de la columna "B"15. Puerto de inyección para la columna "B"16. Tapa del horno del cromatógrafo

Uso del cromatógrafo

1. Verifique que todos los controles estén apagados y siga las instrucciones,en función de los parámetros a utilizar en cada una de las prácticas decromatografía de gases.

2. Abra la llave del tanque que contiene el gas acarreador y verifique que lapresión se encuentre entre 500 y 2 300 lb/in2, en caso de ser menor a500 lb/in2, repórtelo al profesor.

3. La presión de entrada del gas al cromatógrafo debe ser de 30 lb/in2.Mida la velocidad del flujo de salida de las columnas utilizando unflujómetro de burbuja que tenga una disolución de jabón al 3 %.

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Flujo del gas delcromatógrafo

u

Marcas decalibración

_ Disoluciónjabonosa

PERA

Burbuja

Figura 1.8 Medidor de flujo.

La metodología es la siguiente: conecte la manguera del flujómetro a lasalida de la columna donde se quiere ajustar el flujo. Presione ligeramenteel bulbo lleno de disolución jabonosa, para formar las burbujas que seránarrastradas por el gas. Mida el tiempo en segundos, desde la marcacero hasta la diez del aparato y calcule el flujo utilizando la siguienteecuación:

Flujo =600tseg

Con base en el resultado y utilizando el control correspondiente (columna"A" o "B") ajuste el flujo requerido.

4. Ajuste los controles de temperatura y de inyección (tanto de la columnacomo del detector). Fije la corriente de este último.

5. Verifique que el registrador tenga papel y tinta para un buen funciona-miento, enciéndalo y seleccione la velocidad de corrimiento.

Para su buen funcionamiento el cromatógrafo requiere aproximada-mente de 2 horas para que se estabilice la línea base. Durante este tiempose puede preparar la muestra, limpiar la jeringa y ajustar el cero.

6. Ajuste del cero: el atenuador del cromatógrafo debe marcar infinito(número 12 de la figura 1.7). Con el control de cero del graficador,coloque la plumilla donde desee la línea base. Ponga el control de la

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atenuación del cromatógrafo en la posición 1. Coloque el atenuador enla posición 256 y el cero con el control del cromatógrafo.

7. Inyección de la muestra. Se debe tener cuidado al introducir la j eringa,si ésta es de una capacidad de 5 o 10 |il, tanto el émbolo como la agujason muy delgadas y se doblan fácilmente. Debe colocarse la jeringa enposición perpendicular con respecto al cromatógrafo e introducirla en elpuerto de inyección de la columna. Efectuar la inyección con fuerza,para asegurar que la muestra entre en la columna.

Con el fin de evitar contaminaciones, se debe enjuagar la jeringacuando menos cinco veces con el disolvente adecuado. Debe limpiarseinmediatamente después de usarla, para prevenir que la muestra se sequey queden residuos en la jeringa o el émbolo.

8. Si los picos de la muestra se salen de escala, incremente la atenuación ycorra nuevamente su sistema.

9. Una vez terminado el trabajo cromatografía) disminuyalas temperaturasde la columna, inyector y detector, y apague la corriente de este último.Cuide que el flujo del gas continúe hasta que la temperatura de la columnadescienda hasta 50 °C o menos. Cierre él paso del gas acarreador ylimpie lajeringa.

Precauciones en el manejo del detector de conductividad térmica

a) Para evitar que se queme el filamento del detector, verifique que el gasacarreador fluya a través del cromatógrafo, antes de encender eldetector.

b) Apagar la corriente del filamento, antes de abrir el sistema, para evitarque éste se oxide.

c) La velocidad de flujo del gas portador debe permanecer constante.

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Metodología para las prácticas de química analítica II

1. Los alumnos deben cubrir totalmente las nueve prácticas de este manual.2. Cada alumno debe elaborar una bitácora, en la cual, además de anotar

todas las observaciones de la práctica en cuestión, realizará las siguientesactividades:• Dibuj ar un diagrama de bloques de la práctica que se va a realizar.• Anotar las propiedades físicas, químicas y tóxicas de cada uno de los

reactivos mencionados en el protocolo de la práctica (investigadospreviamente en la biblioteca).

• Realizar los cálculos necesarios para la preparación de las disolucionesmencionadas en la práctica, tomando como base 100 mi de disolución.

Prevención de accidentes en el trabajocon sustancias químicas*

1. Al manipular sustancias corrosivas será obligatorio el uso de equipopersonal de protección.

2. La transferencia de líquidos, especialmente los corrosivos o tóxicos,debe hacerse con ayuda de pipeta y propipeta. Queda estrictamenteprohibido usar las pipetas succionando con la boca.

3. Al poner en contacto sustancias que reaccionan violentamente o alcalentar líquidos en tubos de ensayo o frascos, la cara deberá apartarsepara que no sea alcanzada por posibles proyecciones. Se deben usaranteojos protectores o careta de plástico.

4. Nunca vierta agua sobre ácido sulfúrico concentrado.5. Todas las operaciones con sustancias volátiles deberán hacerse en la

campana de extracción.6. Queda estrictamente prohibido probar cualquier sustancia química.7. Las sustancias susceptibles de generar peróxidos (THF, éter, etc.) deberán

ser verificadas periódicamente.

* Las normas de seguridad indicadas en esta parte fueron extraídas del Instructivo sobreel funcionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalacionesde los laboratorios de docencia de la UAM, aprobado por el Consejo Académico en susesión 133.

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Práctica 1

Análisis cualitativo de cromatografía de gases(dos columnas)

Introducción

Objetivo

Conocer y utilizar la cromatografía de gases es hoy en día un aspecto primor-dial, tanto en la industria como en el campo científico. La elaboración deproductos alimenticios o farmacéuticos necesita de un buen control de calidad,y muchas de las técnicas utilizadas para esto requieren de la precisión del análisiscromatográfico.

Uno de los primeros problemas en cromatografía es la selección de la faseestacionaria o tipo de columna a utilizar. Existe una gran variedad de faseslíquidas disponibles para la cromatografía de reparto gas-líquido. Para resolvereste problema es necesario considerar que un soporte polar retendrá másfuertemente un soluto polar y que, por lo tanto, las sustancias menos polaressaldrán con mayor rapidez de la columna, presentando tiempos de retenciónmás cortos.

En esta práctica se corrobora tal criterio, ya que son separados compuestosde diferente polaridad corriéndolos en una columna polar como la Carbowax20 M. Posteriormente se efectúa la misma separación, pero utilizando la columnaDC-200 no polar.

El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de gases Gow-Mac, modelo69-350, para el análisis cualitativo de mezclas y observará la diferencia deseparar una misma muestra en dos columnas de diferente polaridad.

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Manual de prácticas de química analítica Ií

Materiales y reactivos

• Cromatógrafo de gases• Medidor de fluj o de burbuj a• Cronómetro• Jeringa para cromatografía de gases de 50 mi• 5 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita• 5 vasos de precipitados de 50 mi

5 pipetas volumétricas de 1 miPropipeta

• n-pentanoTetrahidrofurano

• 2-butanona• n-propanol

En la parte teórica de este capítulo se encuentran las instrucciones de ope-ración del cromatógrafo Gow-Mac, modelo 69-350 (p. 27).

Normas de seguridad

Maneje los disolventes con cuidado en un lugar ventilado, utilicepropipetas para hacer la mezcla. Asegúrese de que no haya mecherosprendidos y coloque letreros para indicar que está trabajando condisolventes.Cuando trabaje con el cromatógrafo, asegúrese de que se encuentrepresente el profesor del laboratorio, quien le ayudará y brindará asesoríasobre el buen manejo del equipo.

Procedimiento

1. Mezcle un mililitro de cada uno de los siguientes disolventes: n-heptano,tetrahidrofurano, 2-butanona y n-propanol. Guarde la mezcla en un re-cipiente cerrado.

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Análisis cualitativo de cromatografía de gases

2. Las condiciones del cromatógrafo deben ser las siguientes:

Temperatura de la columna

Flujo del gas

Corriente del detector

130°C

80 ml/min.

200 mA (si el gas es helio)100 mA (si el gas es nitrógeno)

3. Tome en cuenta que el equipo requiere al menos de tres horas de ca-lentamiento previo, con el fin de estabilizar la temperatura de la columna,el flujo del gas acarreador y la corriente del detector, y para que todoesto se refleje en una línea base estable.

4. Verifique el flujo del gas en las dos columnas, utilice un medidor deburbuja como se indica en la figura 1.8.

5. Trabaje primero con la columna de Carbowax. Fije el atenuador en 4 yponga a funcionar el graficador a una velocidad de 2.5 cm/min.

6. Con una jeringa de 50 fil, mida 3 \ú de n-heptano y adicione otros 10 |Lilde aire. Inyéctelos en la columna y enjuague la jeringa.

7. Marque el punto de inyección en la carta, así como la informaciónrelacionada con la muestra inyectada.

8. El primer pico que debe eluir es el pico de aire, seguido por el pico deln-heptano.

9. Repita los pasos 5 y 6 con los otros tres componentes y, por último,inyecte la mezcla de los disolventes.

10. Baj o las mismas condiciones de trabaj o, repita todo el proceso utilizandola columna DC-200. Cambie la polaridad del sistema para que los picossalgan en el mismo sentido que con la columna polar.

Tratamiento de datos experimentales

• Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas lascorridas.

• Con la ayuda de los tiempos de retención de las sustancias puras,identifique los componentes de la mezcla en los cromatogramas de lasdos columnas.

35




Cuestionario

i.

2.

3.

Calcule el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada columna,utilizando los datos del n-heptano.Calcule el porcentaje de cada componente de las mezclas, utilizando elmétodo de normalización (por áreas).

¿En qué se basa la cromatografía de gases?

¿Cómo puede medirse la eficiencia de una columna?

¿Qué se entiende por cromatografía líquido-líquido y cromatografía gas-líquido?

¿Qué ventajas tiene la programación de temperatura en la cromatografíade gases? ¿Se puede hacer esta programación en un cromatógrafo degases con detector de conductividad térmica? Justifique su respuesta.

Explique cuáles son las ventajas y desventajas de las columnas capilaresy las columnas empacadas.

Con base en los siguientes datos, obtenidos con el empleo de una columnade ftalato de dodecilo, realice los ejercicios que se piden.

Compuesto

Acetona

Butanona

3-pentanona

Acetilcetona

Vr(ml)

21.5

58.0

145.0

400.0

a) Calcular el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada compuesto.b) Calcular el porcentaje de cada componente, utilizando el método de

normalización.

36



Práctica 2

Factor de respuesta en cromatografía de gases

Introducción

El uso de estándares internos es necesario en el análisis cuantitativo. Lasensibilidad de los detectores de conductividad térmica difiere de un compuestoa otro, ya que depende de la conductividad térmica del analito. A menorconductividad térmica, mayor es la respuesta para una cantidad dada decompuesto. Por lo tanto, debe medirse un factor de respuesta empírico paracada sustancia que se somete a un análisis cuantitativo. El factor de respuestaF está definido por la relación:

[P] \ApJ

Objetivo

El alumno efectuará el análisis de cromatografía de gases para conocer elfactor de respuesta con el n-heptano, empleando como estándar interno aln-pentano.


• Cromatógrafo de gases• Medidor de fluj o de burbuj a

37




CronómetroJeringa para cromatografía de gases de 50 mi2 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita2 vasos de precipitados de 50 mi2 pipetas volumétricas de 1 miPropipetan-pentanon-butano

Normas de seguridad

Procedimiento

Los compuestos a trabajar son muy volátiles y flamables, trabaje en unárea ventilada y lejos de fuentes de calor. Tome en cuenta las reglas deseguridad de la práctica 1.

1. Prepare en tubo de ensayo una disolución estándar, mezclando un mililitrode n-heptano con otro de n-pentano.

2. Ajuste las condiciones del cromatógrafo con base en los siguientes datos:

Columna

Gas acarreador

Flujo del gas

Temperatura

Atenuación

Corriente del detector

Velocidad de la carta

DC-200

Helio

60 ml/min.

90 °C

4

200 mA

2.5 cm/min.

3. Verifique que la línea base se encuentre estable.4. Inyecte 3 (il de la disolución estándar, repita por triplicado.5. Solicite al profesor la muestra problema e inyecte 3 \ú9 repita por

triplicado.

38



Factor de respuesta en cromatografía de gases


Cuestionario

Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas lascorridas.Con base en las áreas y concentraciones de la disolución patrón, calcularel factor de respuesta para el n-heptano, utilizando el n-pentano comoestándar interno.Calcular la concentración del n-heptano en la muestra problema, utilizandoel factor de respuesta y las áreas del segundo grupo de cromatogramas.

1. Explicar qué se entiende por factor de respuesta.

2. Esta técnica para el cálculo del factor ¿se puede utilizar con otrosdetectores como el de ionización de flama o el de captura de electrones?

3. ¿Cómo se seleccionan las temperaturas para el inyector, la columna y eldetector?

4. Problema: Para la cuantificación de una muestra comercial delantimicrobiano metil parabeno, se utilizó la técnica del factor de respuestausando el propil parabeno como estándar interno. Se corrieron las mues-tras en un cromatógrafo con detector de ionización de flama, columnacapilar BP5 con película de 0.5 |Lim, temperatura inicial de 160 °C y ungradiente de 15 °C/min. La temperatura final fue de 280 °C. Para elcálculo del factor se utilizaron 0.98 mmol de metil parabeno y 0.75 mmolde propil parabeno. Se obtuvieron las siguientes alturas respectivas: 180y 165 mm.

Una segunda corrida cromatográfica es utilizada para cuantificar lamuestra comercial. Se mezcla el problema con 1.2 mmol de propilparabeno. Las alturas resultantes fueron 150 mm para el metil y 160 mmpara el propil parabeno. Calcular la concentración del metil parabenoen la muestra comercial.

39




Bibliografía

Baugh, P. J. (editor). 1993. Gas Chromatography A Praetical Approach.IRL Press, Gran Bretaña.

Bens, E. 1961. "Adsorption Characteristics of Some Gas-Liquid Chromato-graphic Supports."Anal Chem., 33:178, California.

Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa,México.

Ewing, G. W. 1979. Métodos instrumentales de análisis químicos. Ed. MeGraw Hill, México.

Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1965. Advances in Chromatography.Vol. 1:199, USA.

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Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo EditorialIberoamérica, México.

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Pecsok, R. L. 1981. Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa,México.

40



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Storch de García y Asensio, J. M. 1975. Fundamentos de la cromatografíade gases. Alhambra, España.

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Capítulo 2

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDADE ALTA RESOLUCIÓN





Introducción

La cromatografía de líquidos de alta resolución en los pasados diez años haincrementado su importancia en muchas de las áreas del análisis, tanto a nivelinvestigación como a nivel industrial. Muchas de las técnicas de control de ca-lidad de fármacos, alimentos, aditivos y contaminantes ya se están efectuandoconHPLC.

Hace más de 80 años que se conoce la cromatografía de líquidos, pero sóloa partir de 1967 los avances tecnológicos permitieron desarrollar un procesocromatográfico para trabajar con altas presiones. Este proceso de ningunamanera sustituye a la cromatografía de gases, sólo es un complemento para elanálisis de componentes que no toleran una fase móvil gaseosa o temperaturasmuy elevadas. De hecho, presenta las siguientes ventajas frente a la cromatografíade gases:

• Tiene una difusión mínima en la fase móvil, debido a la rapidez del análisis.• No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente se realiza a

temperatura ambiente o ayudado por un calentador de columnas atemperaturas menores de 100 °C.

• La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un usoposterior.

La cromatografía de líquidos es una técnica de separación que utiliza unafase móvil líquida, es ideal para la separación de macromoléculas de interésbiológico y de compuestos iónicos, ya que no depende de la volatilidad o es-tabilidad térmica de los componentes. Se puede utilizar para separar proteínas,aminoácidos, lípidos, ácidos nucleicos. Otras aplicaciones industriales son elanálisis de pesticidas, aceites, polímeros, antioxidantes, análisis de agua,contaminantes, sabores, colorantes, etc. La cromatografía de líquidos se basaen la solubilidad de los compuestos: hay que escoger el disolvente o la mezclade disolventes apropiados para llevar a la muestra a través del sistema, tambiénhay que tomar en cuenta que los compuestos se adsorben en menor o mayor




medida en la fase estacionaria y que gracias a las altas presiones con las que semueve la fase móvil, se puede obtener una rápida separación de los componentesde una mezcla.

La cromatografía de líquidos se puede clasificar en cuatro tipos, dependiendode su uso:

Cromatografía de líquido-sólido

En este caso, la separación depende de la afinidad de la muestra hacia la fasesólida o líquida. Si la muestra es muy afín a la fase estacionaria (compuesta porpartículas sólidas pequeñas) el tiempo de retención será mayor. El solventeutilizado se conoce como eluyente y también influye de manera importante enla separación: si la muestra es más afín a la fase líquida, los tiempos de retenciónserán más cortos. La tabla 2.1 muestra una lista de disolventes según sucapacidad para eluir solutos.

La selección de la fase móvil influye directamente en la separación de lasmuestras. Los solventes pueden ser de naturaleza orgánica o acuosa. Existenmuchas características que debe tener una buena fase móvil, entre las másimportantes se encuentran: no alterar la columna ni su naturaleza, disolver lamuestra, ser de baja viscosidad y, una vez terminada la separación, debe permitirla recuperación del soluto de manera simple (Watty, 1989).

En la cromatografía líquido-sólido existen dos subdivisiones que están enfunción de su conformación: la fase normal y la fase inversa.

Para l^fase normal se requiere de una fase estacionaria polar, por lo tanto,la fase móvil debe ser no polar. Los empaques que se pueden utilizar en fasenormal son diol, sílica y amino, entre otros.

En \difase inversa se necesita un empaque no polar y una fase móvil po-lar. Los empaques más comunes para la fase reversa son: ODS (C18), octyl,dimetil, etc.

Otra variación de este tipo de cromatografía se conoce como fase ligada(bondedphase), que consiste en enlazar con el soporte de sílica compuestosque aumenten su carácter no polar (C2, C6, C8, Clg). En función del tamaño dela cadena de hidrocarburos que se haya unido, los tiempos de retención de lossolutos que eluyan en estas columnas, tenderán a aumentar, pues se retendránmás fuertemente.

46



Cromatografía líquida de alta resolución

Tabla 2.1 Lista de disolventes.

Disolvente

Ácido acético

Acetona

Acetonitrilo

Benceno

N-butanol

Tetracloruro de carbono

Cloroformo

Ciclohexano

1,2-dicloroetano

Cloruro de metileno

Dimetil sulfóxido

Dioxano

Acetato de etilo

Etanol

Dietiléter

Heptano

Hexano

Metanol

Pentano

N-propanol

Iso-propanol

Tetrahidrofurano

Tolueno

Tricloroetileno

Agua

Xileno

índice depolaridad

0.62

5.10

5.80

2.70

3.90

1.60

4.10

0.20

3.50

3.10

7.20

4.80

4.40

6.20

2.80

0.00

0.00

5.10

0.00

4.00

3.90

4.00

2.40

1.00

9.00

2.50

Longitud deonda de corte nm

230

330

190

280

215

263

245

200

225

235

268

215

260

210

220

200

200

205

200

210

210

215

285

273

200

290

Solubilidad enagua % p/p

100

100

100

0.18

7.81

0.08

0.815

0.01

0.81

1.6

100

100

8.7

100

6.89

0.0003

0.001

100

0.004

100

100

100

0.051

0.11

100

0.018

47




Cromatografía de intercambio iónico

Consiste en cambiar iones de la fase estacionaria por iones que se encuen-tran disueltos en la fase móvil. Aniones como el sulfito -SO3~ o cationes[N-(CH3*)3

+] se unen covalentemente con la fase estacionaria: los iones desoluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atraídos por fuerzaselectrostáticas (la fase móvil es un líquido, figura 2.1). Se puede efectuarcromatografía de intercambio iónico no solamente en HPLC, sino también encapa fina, en columna y en papel impregnado de resina. En este método la se-paración depende de las variables: fuerza iónica, capacidad de carga de lacolumna y del pH durante el proceso de separación. El procedimiento derivade la cromatografía de líquido-sólido, y se utiliza en la separación de aminoáci-dos, en análisis de trazas, en la separación de metales por formación decomplejos, etc.

Las resinas utilizadas en las columnas pueden estar o no polimerizadas. En elmercado existen resinas intercambiadoras catiónicas, tipo ácido fuerte o débil,e intercambiadores amónicos tipo base fuerte o débil. También hay geles deintercambio iónico, que se utilizan para separar moléculas pequeñas con pesosmoleculares menores a 500. La tabla 2.2 muestra ejemplos de columnas deintercambio iónico comerciales, mencionando el tipo de iones que puede retener,el pH de trabajo y la presión máxima a la que pueden ser utilizadas.

Aniones móvilesmantenidos cerca delos cationes unidoscovalentemente a lafase estacionaria

Figura 2.1 Cromatografía de intercambio iónico (resina de intercambioaniónico, sólo los aniones pueden ser atraídos hacia ella).

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Tabla 2.2 Columnas para HPLC de intercambio iónico.

Columna

Syn Chropac SAXFuertemente aniónica

Syn Chropac WAXDébilmente aniónica

Syn Chropac SCXFuertemente catiónica

TSKcatiónica

Soporte

Sílica

Sílica

Sílica

Resina

pH

2 a 8

2 a 8

2 a 8

2a12

Presión máx.

5 000 psi

5 000 psi

5 000 psi

200 psi

Cromatografía de exclusión molecular

Con este método las moléculas se separan por su tamaño y conformación: si elpeso molecular les permite adentrarse en la red del gel y/o si la molécula esglobular, la retención será mayor, comparada con una molécula de peso supe-rior al de la capacidad del gel o con una molécula de conformación irregular(figura 2.2). Las aplicaciones de esta técnica son amplias, ya que permite separarmuestras con pesos moleculares entre 700 y más de 150 millones, particular-mente aquellas de interés bioquímico. También es muy utilizada para laseparación de polímeros (tabla 2.3). Los soportes utilizados pueden ser de gelde sílice unido a compuestos que aumentan su carácter hidrofílico, como lascolumnas Biosep-SEC-S; o pueden ser polímeros como los de la serie Polysep-GFC-P (poliestireno, polihidroximetacrilato, estireno-divinilbenceno, etc.). Enel mercado de la cromatografía de exclusión molecular existe un gran númerode columnas que permiten seleccionar el intervalo de fraccionamiento que serequiera (Phenomenex, 1994).

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Manual de prácticas de química analítica

Moléculas grandesson excluidas

Moléculaspequeñaspenetran el gel

Figura 2.2 Cromatografía de exclusión molecular.

Tabla 2.3 Columnas comerciales para la exclusión molecular.

Columna

Styagel HR 0.5

Styagel HT 4

Styagel HMW7

Rango PM

0 a 1 000

5 000 a 600 000

500 000 a 1x108

Aplicaciones

Aditivos, fenoles, epóxidos, urea

PM intermedio

PM alto

Cromatografía de afinidad

Se basa en la interacción específica que existe entre un soluto de una mezcla yun sitio activo presente en el gel de la fase estacionaria de la columna. Lasinteracciones están relacionadas más con las características estructurales quecon la carga, tamaño, solubilidad u otras propiedades que se aprovechan enotros tipos de cromatografía. Ejemplos de aplicaciones son la relación sustratoenzima y la relación antígeno anticuerpo (Day y Underwood, 1989).

Una mayor fuente de información sobre los métodos cromatográficos sepuede encontrar en los excelentes libros: Harris, 1992; Pecsok, 1981.

50




Operación del cromatógrafo dealta resolución (HPLC)

El HPLC consta de cuatro partes: el sistema de bombas encargado de mantenerconstante el flujo de la fase móvil; el sistema de inyección que permite introducirla muestra a trabaj ar; la columna que tiene la función de separar los componentesde la muestra y el sistema de detección de los solutos eluidos, el cual mandauna señal al sistema de registro.

Sistema de bombas

Este sistema es un componente importante del cromatógrafo de líquidos, elcual requiere de una bomba de alta presión, comúnmente de un máximo de6 000 psi. La presión es necesaria para mover las partículas del soluto entre lafase estacionaria de la columna. Una bomba para cromatografía de líquidosdebe tener un flujo continuo y libre de pulsaciones.

Existen dos tipos de sistemas de elución: uno donde el disolvente no cambiade composición durante el proceso de aislamiento, conocido como elución¡socrática, y otro que requiere de un gradiente para mejorar la separación delos componentes en una mezcla (elución por gradiente).

Las bombas con pistones sincronizados son las más empleadas en los sistemasde HPLC. Un pistón siempre bombea disolvente, mientras el otro se llena. Es-te arreglo proporciona un flujo relativamente libre de pulsos o pulsaciones.

Pueden evitarse muchos problemas con las bombas si se cuidan los solventesutilizados: no deben tener un pH muy bajo ni formar precipitados con facilidad.

En columnas convencionales de 5 mm de diámetro interno y con flujos entre1 y 2 ml/min, pueden resultar presiones de 400 bar, dependiendo de la longitudde la columna, el tamaño de partícula y el disolvente.

El sistema de bombas debe de mantenerse en óptimas condiciones si sequiere tener reproducibilidad en las corridas cromatográficas.

51




Figura 2.3 Control del sistema de bombas del HPLC

Figura 2.4 Sistema de bombas del HPLC

52




Operación del sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4):

Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha (número8 de la figura 2.4). La parte frontal consta de (figura 2.3):

1. Pantalla digital para conocer la presión del sistema, la cual está dada enlibras por pulgada cuadrada (psi). El número que aparece en la pantalladebe multiplicarse por 10, a fin de obtener la presión verdadera.

2. Botones que fij an la presión mínima y máxima de trabaj o durante elproceso de separación. Se recomienda establecer la presión baja encero psi y la máxima en 3 500 psi. El valor máximo depende del tipo decolumna a utilizar y de la viscosidad del disolvente o mezcla de ellos. Sidurante el proceso de separación la presión del sistema rebasa estosvalores, el sistema de bombas se apaga automáticamente.

3. Standby. Permite que el motor se apague y el sistema eléctrico sigafuncionando.

4. Reset. Botón que reenciende las bombas y restablece el fluj o y la presióndel sistema.

5. Led. Foco rojo que indica el apagado de las bombas y que el flujo delsistema tiende a cero.

6. Control de fluj o. Consta de tres diales rotatorios individuales y permitepreseleccionar el flujo del sistema en ml/min. El flujo debe incrementarsepoco a poco (de décima de mi en décima de mi). Una lectura de 070indica un flujo de 0.70 ml/min.

7. Válvula de purga. Permite la purga hidráulica del sistema.8. Botón de encendido o apagado.

Sistema de detección de solutos eluidos

Existen diferentes tipos de detectores utilizados en la cromatografía de líquidos,los hay de fluorescencia, índice de refracción, conductividad eléctrica, de UV-visible, arreglo de diodos, etc.

El tipo UV-visible es el más ampliamente distribuido como detector enHPLC, la mayoría de los compuestos tienen cuando menos alguna absorbanciaen las regiones del UV o el visible. El fundamento cuantitativo de estas

53




Figura 2.5 Control del sistema de detección de solutos eluidos.

6

7

Figura 2.6 Detector UV-visible.

54




determinaciones se encuentra en la ley de Lamber y Beer, la cual relaciona laabsorbancia del soluto con su concentración (c, en moles/1) y la longitud delpaso del haz de luz (b): A = 8be.

Los detectores de los equipos actuales tienen una mayor flexibilidad que losespectros comunes, ya que pueden reportar valores menores de 0.001 unidadesde absorbancia.

Operación del sistema de detección

Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha. La partefrontal (figuras 2.5 y 2.6) consta de:

1. Pantalla. Permite leer hasta diezmilésimas de unidades de absorbancia.2. Botón de polaridad. Sirve para cambiar la señal de salida del sistema de

registro.3. Botón de corte (short switch). Conecta o desconecta las terminales

positiva y negativa nulificando la señal del integrador o registrador. Esteefecto es lo mismo que si se mandara una señal de cero volts al registrador,permitiendo ajustar el cero independientemente del ajuste hecho en elregistrador o integrador.

4. Mark. Este botón permite producir una marca en la carta y se utilizageneralmente para indicar el momento de la inyección de la muestra.

5. Auto cero. Este botón permite definir la línea base y tiene un intervalo de± 0.7 UA (unidades de absorbancia). Cuando la lámpara parpadea indicaque la señal de salida de la línea base excede el intervalo de trabajo delauto cero.

6. Pantalla indicadora de la longitud de onda seleccionada.7. Control de selección de longitud de onda. Ajusta la longitud de onda de

trabajo entre 190 y 700 nm con incrementos de 0.2 nm.8. Intervalo de unidades de absorbancia (AUFS, Absorbance Units Full

Scale). Cuenta con doce posiciones diferentes que seleccionan lasensibilidad de las unidades de absorbancia.

9. Botón de control. Consta de seis posiciones que se pueden seleccionary observar en la pantalla:

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SE {Sample Energy). La pantalla reporta la energía UV de la celdade la muestra problema.RE (Reference Energy). Reporta la energía UV de la celda dereferencia.AU (Absorbance Units). Se observan la unidades de absorbanciapresentes en la muestra problema.Zero, cantidad en unidades de absorbancia que el aparato tomacomo cero.

• DLV(Deuterium Lamp Voltage). Reporta el voltaje de la lámparade deuterio.DLC {Deuterium Lamp Current). Reporta la corriente del filamentode la lámpara en miliamperios, una lectura de 300 es ideal y de 285a 315 es aceptable.

10. Tiempo de respuesta. Son cinco posiciones que seleccionan los diferentestiempos de respuesta:

• 0.05 sea, respuesta rápida que provoca picos angostos y muchoruido en la línea base.

• 0.10 sea, respuesta rápida con ruido ligeramente menor que laanterior.

• 0.50 sea, más rápida que la respuesta normal y con ruido ligeramentemayor de lo normal.

• 1.00 sea, respuesta normal con picos angostos y una cantidadpequeña de ruido.

• 5.00 sea, respuesta lenta para una supresión máxima del ruido.

Operación del integrador SP4400

Es un equipo que permite interpretar la señal mostrando no sólo el croma-tograma, sino también un reporte completo con los tiempos de retención, lasáreas y sus porcentajes. Si se requiere, también proporciona información sobrelas condiciones bajo las cuales se corrió el sistema y cuenta con programaspara hacer cálculos con patrones externos e internos (figura 2.7).

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Figura 2.7 Integrador

Figura 2.8 Vista parcial del teclado del integrador.

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Dentro de las ventajas que tiene utilizar un integrador, se encuentran losmétodos numéricos que permiten realizar diferentes tipos de cálculos, comolos siguientes:

a) Método numérico cero: MN = 0. Es un método de porciento de áreausado cuando los resultados de concentración no son necesarios. Estemétodo no utiliza factores de respuesta del detector y de esta manera norequiere de calibración. Una vez que el diálogo de rutina termina, seselecciona el método en el reporte, el cual incluye todos los picos delcromatograma identificados por orden de elución. Los nombres de loscomponentes no son generalmente utilizados.

b) Método numérico uno: MN = 1. Es el más utilizado en cromatografíade gases, en particular cuando todos los componentes de la muestra sonconocidos. Es muy similar al método cero, con excepción de que lasáreas (o altura) de los picos son corregidos por factores de respuesta,calculados previamente en una corrida con sustancias patrón de con-centración conocida.

c) Método numérico dos: MN = 2. Requiere la utilización de estándaresinternos para cuantificar de manera exacta los componentes de una mezcla.Es de uso común en análisis de compuestos farmacéuticos, aditivos ali-mentarios, etc. La concentración del estándar interno debe ser ligeramentemayor, pero no pasar de un factor de 10, con respecto a los componentesde interés en una mezcla.

Descripción del teclado (figura 2.8)

Backspace: borra datos previos moviendo el cursor hacia atrás.LCD status: Presenta un cuadro en pantalla donde indica el canal (C/z),archivo (FI\ número de inyecciones en ese archivo (Biri), la velocidadde la carta (Cs), atenuación (Atteri), tiempo de corrimiento (Runtime),nivel (Level) y capacidad de memoria.Inj/endA: Tecla que se debe oprimir en el momento de efectuar lainyección en la columna "A".Shift inj/endA: Detiene el desarrollo del cromatograma sin dar el reportedel mismo.

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A ítem Se usa para verificar la atenuación en cualquier momento delproceso cromato gráfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantallalos valores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis apareceel valor que se está utilizando.Chart speed: Se utiliza para verificar la velocidad de la carta en cualquiermomento del proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecenen la pantalla los valores numéricos válidos para cambiarla. Entreparéntesis aparece el valor que se está utilizando. Se recomienda usarvelocidad 2 para cromatogramas con pocos picos y 2 o 4 paracromatogramas ricos en picos.PTeval: No debe utilizarse durante la corrida. Normalmente se ob-serva su valor antes de inyectar nuevamente la muestra, ya que un valormenor a 250 indica que ya no hay residuos de soluto del análisis anteriorpasando por el detector.

Metodología para el manejo del HPLC

1. Preparación del disolvente y la muestra a analizar. Ambos deben serfiltrados en membranas de 0.4 |um, para evitar que las impurezas entreny contaminen la columna. El disolvente debe ser grado HPLC.

2. Revisar que el sistema de entrada y salida de los disolventes esténsumergidos en sus respectivos recipientes.

3. Encender el sistema de bombas (número 8 de la figura 2.4).4. Ajustar el flujo oprimiendo los botones respectivos (número 6 de la

figura 2.3) del sistema de bombas.5. Seleccione la longitud de onda con base en el sistema a separar, moviendo

el dial correspondiente (número 7 de la figura 2.6). Al igual que elcromatógrafo de gases, el HPLC requiere de un tiempo (20 a 30 minutos)para que se estabilicen las condiciones de trabajo.

6. Encender el integrador y ajustar la velocidad de la carta y la atenuación,presionando primero la tecla Chart speed del teclado del integrador yposteriormente la tecla Atten (figura 2.8). Se puede elegir entre unaserie de valores que van desde 0.5 hasta 4 096 en incrementosgeométricos para la atenuación. Si en una primera corrida los picos

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rebasan la escala del integrador, se puede aumentar la atenuación alvalor próximo, de manera que los picos reduzcan a la mitad su tamaño(siempre y cuando se utilicen las mismas condiciones de separación).

7. Verifique el valor del PT evaluation: debe ser como máximo de 250.8. Inyecte la muestra con una jeringa de 50 jal con aguja sin punta, mida

la cantidad establecida en el manual de prácticas de la muestra a correre introduzca la jeringa en la válvula de inyección. El mecanismo deinyección de la muestra (figura 2.9) es de dos posiciones: carga ydescarga. Presione el émbolo para que la muestra pase a la tubería deacceso (loop). Mueva la palanca a la posición de descarga para que lamuestra sea llevada a la columna, el líquido contenido en el loop serádesplazado hacia la columna. El movimiento debe ser rápido para evitaruna caída brusca de presión que desconecte el sistema de bombas.Posteriormente oprima la tecla inj/endA del integrador.

Terminado el tiempo de corrimiento vuelva a presionar la tecla inj/endA, el integrador le dará un reporte completo de su sistema separado.

60




Hacia lacolumna

Flujo

Alojamiento demuestras

Flujo

Jeringuilla I

Excesode inyección

CARGAR

Unión

INYECTAR

Figura 2.9 Válvula de inyección para cromatógrafo de líquidos de altaresolución.

61





Práctica 3

Cuantificación de una muestra problema deanisaldehído (método del patrón interno)

Introducción

El funcionamiento de un comatógrafo de alta resolución empieza con el sistemade bombas de alta presión, el cual impulsa el disolvente a través de todo elsistema. La muestra es inyectada por medio de una microj eringa, el volumen esde unos cuantos microlitros para que la resolución de los picos sea buena y laseparación sea más rápida. Una vez en la columna, se realiza la interacciónsoporte-soluto-disolvente, lo cual permite la separación de los componentesde la muestra. El detector está compuesto por una microcelda en forma de"Z", a través de la cual fluye la disolución; es excelente para que los compuestosno se mezclen y el flujo sea rápido. Por último, en el integrador, la absorban-cia es convertida en señal eléctrica y así es reproducida como cromatograma.

En la cromatografía de líquidos de partición existen dos grupos de trabajo,el más frecuente se conoce como cromatografía de fase inversa, en ella lafase estacionaria tiene un carácter no polar y se eluye con un disolvente polar.El segundo grupo es la cromatografía de fase normal que utiliza un soportepolar y un disolvente no polar. El sistema de elución puede ser isocrático o porgradiente y el detector más común es el uv-visible, aunque también es utilizadoel de índice de refracción.

La cuantificación de una muestra problema por medio de un estándar internose puede efectuar con la elaboración de una curva estándar, la cual debe serhecha mínimo con tres puntos. En el laboratorio se debe tener especial cuidado

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sobre las condiciones de separación, en cuanto a volumen inyectado, flujo ycomposición de la fase móvil. La curva se desarrollará en función de la relaciónde alturas o áreas de los picos del compuesto entre las del estándar (ver capítulo1: Cálculos en cromatografía). En las abscisas se coloca la relación de laconcentración del soluto entre la concentración de la sustancia patrón. Laconcentración de la muestra problema se interpola de la curva patrón.

Objetivo

El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de líquidos de alta resoluciónpara cuantificar una muestra problema de anisaldehído, utilizando el métododel patrón interno.


Cromatógrafo de líquidos de alta resoluciónColumna Spherisorb ODS C]810 mmFiltros de teflón de 0.4 mmJeringa de 50 mi, con aguja para HPLC5 frascos viales de 5 mi con tapa2 pipetas volumétricas de 1 miAnisaldehídoAcetonitriloToluenoMuestra problema con anisaldehído

Normas de seguridad

Al preparar la mezcla acetonitrilo agua y acetonitrilo tolueno debe hacerloen la campana de extracción.Revise su bitácora para recordar que el acetonitrilo es venenoso y fla-mable, que debe evitar respirar sus vapores y que puede causar irritaciónen la piel.

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Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído

Procedimiento

1. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser las si-guientes:

2.3.

4.

5.

6.

Columna Spherisorb

Dimensiones

Presión máxima

Fase móvil

Flujo

10ODS10jim

250 x 4.6 mm

3 500 psi

acetonitrilo/agua (50:50)

0.8 ml/min

Prenda y acondicione el cromatógrafo dejando que el sistema se estabilice.Prepare las siguientes mezclas de anisaldehído y tolueno:

Compuesto

Anisaldehído

Tolueno

Corrida 1

0.07 M

0.05 M

Corrida 2

0.05 M

0.05 M

Corrida 3

0.03 M

0.05 M

Filtre por membranas de 0.4 jom: a) La mezcla de acetonitrilo agua, b)cada una de las mezclas patrón y c) la muestra problema.Solicite al profesor la muestra problema que contiene 0.05 M de toluenocomo estándar interno, mida 2 |il e inyéctelos.Repita por triplicado la determinación.


Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo,elabore una curva patrón como la que se muestra en la figura 2.10.

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ALTURA SALTURA P

[SOLUTO S]

[SOLUTO P]

Figura 2.10 Curva patrón.

La concentración de la muestra problema se calcula a partir de sustituirel valor de la altura del anisaldehído (altura S) en la mezcla problema enla relación:

ALTURASALTURA P

La altura "P" es la altura del tolueno, el valor de esta relación se interpolaen la curva patrón y el valor de la gráfica es sustituido en la siguienterelación, para obtener la concentración del soluto de la muestra problema:

SOLUTO SSOLUTO P

Cuestionario

1. Mencione tres diferencias, en cuanto a su aplicación, entre la cromatografíadegasesyelHPLC.

2. Describa los cuidados experimentales que se deben tener para: a) losdisolventes a utilizar como fase móvil, b) la muestra problema a separaro cuantificar.

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Cuantifícación de una muestra problema de anisaldehído

Indique usted qué fase estacionaria, qué fase móvil y qué detector seríanlos indicados para efectuar una buena separación de las siguientes mezclas:a) de carbohidratos, b) de aminoácidos y c) de proteínas.

Para conocer el contenido de anfetamina en un preparado farmacéuticocomercial, se utiliza como estándar interno la metanfetamina y se efectúantres corridas cromato gráficas. Con base en estos datos construya unacurva patrón y calcule la concentración de una muestra problema deanfetamina que dio una altura de 123 mm.

Corrida

Fármaco

Anfetamina

Metanfetamina

1

Conc.

0.6

0.6

Altura

30

38

2

Conc.

1.2

0.6

Altura

60

38

3

Conc.

1.8

0.6

Altura

98

38

Conc.= concentración en mM.

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Práctica 4

Separación y cuantificación de una muestra deantocianinas (método del patrón externo)

Introducción

La cromatografía de líquidos de alta resolución ha tenido un gran auge en losúltimos 20 años, se ha utilizado como técnica para separar, identificar y prepararsustancias en muchas áreas. Actualmente estos equipos se combinan con elbanco de memoria de una computadora, lo que ofrece una mayor facilidad enla identificación de compuestos.

Una aplicación actualizada es la separación e identificación de antocianinas,tanto en uvas como en vinos tintos. A pesar de tener el vino tantos años dehistoria, aún no se conoce qué ocurre con sus compuestos durante elañejamiento. El color es uno de los atributos más importantes del vino y esdeterminante en la evaluación sensorial. En las uvas tintas está dado por elcontenido de antocianinas y en las uvas blancas por los flavonoles. Existenen las uvas tintas 14 antocianinas, de las cuales cinco se encuentran en ma-yor proporción: malvidina, petunidina, cianidina, peonidinay delfidina (Reyesetal., 1992).

Las antocianinas son pigmentos de color rojo, azul y violeta. En condicionesacidas, el color rojo predomina; en presencia del ion bisulfito (HSO~3 )reaccionan y se decoloran, esta reacción es reversible. El color de los vinostintos se debe principalmente a las antocianinas libres (estos compuestos tiendena polimerizarse casi de manera inmediata desde que son estrujadas), y apigmentos polímeros formados durante el tiempo de afiejamiento del vino, porcondensación de antocianinas con otros compuestos flavonoides y proba-

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blemente aldehidos. El color de los vinos tintos depende del pH, el contenidode SO2? de los pigmentos poliméricos y los taninos.

El uso de equipos como el HPLC permite la separación de las antocianinasen vinos tintos y éstas aparecen como picos discretos.

Objetivo

El alumno utilizará el cromatógrafo de líquidos de alta resolución para separary cuantificar una muestra de antocianinas, utilizando el método del patrón extemo.


Cromatógrafo de líquidos de alta resoluciónColumna Spherisorb ODS Clg 10 mmFiltros de teflón de 0.4 mmPapel filtro WhatmanNo. 1Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC4 tubos de ensayo con tapa de roscaMortero con pistiloPipeta graduada de 10 miClorhidrato de malvidinamonoglucósidoÁcido fórmicoAcetonitriloMetanolHC1 (concentrado)

Normas de seguridad

Cuide que al preparar las mezclas acetonitrilo agua y acetonitrilo toluenose haga en la campana de extracción.

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Separación y cuantifícación de una muestra de antocianinas

Procedimiento

Recuerde que el acetonitrilo es venenoso, flamable y que causa irritaciónen la piel. Se debe evitar respirar sus vapores.Maneje con cuidado el ácido fórmico y evite el contacto con la piel, yaque es corrosivo.

1. Extracto a partir del hollejo de la uva: lavar y quitar el hollej o a 10 uvastintas, colocando éste en un mortero limpio. Adicionar 10 mi de metanoly presionar suavemente con el pistilo contra el hollejo para obtener unadisolución muy colorida. El extracto es prefiltrado con papel WhatmanNo. 1, antes de filtrar con membranas Millipore de 0.45 |Ltm. El extractose guarda en un tubo de ensayo limpio y con tapón de rosca. Se protegede la luz y debe utilizarse a la brevedad.

2. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser:

Columna Spherisorb 10 ODS 10 |jmDimensiones 250 x 4.6 mmPresión máxima 3 500 psiFase móvil. Se utiliza un gradiente de elución con dos disolventes:Disolvente A, ácido fórmico al 40%Disolvente B, acetonitriloGradiente inicial: 25 % solvente A6 minutos después incremente el disolvente B a 23 %.8 minutos después incremente el disolvente B a 50 %.5 minutos después incremente el disolvente B a 95 %.Flujo 0.7 ml/min

NOTA: verifique que tanto las muestras como los disolventes de la fasemóvil se filtren en membranas Millipore de 0.45 |jm.

3. Prenda y acondicione el cromatógrafo, permitiendo que se estabilice elflujo y la columna.

4. Se inyectan 2 (il del extracto colorido. Repítalo por triplicado.

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5. Para elaborar la curva patrón con el clorhidrato de malvidin 3-monoglucósido, se preparan cuatro diferentes concentraciones 25,50,100 y 150 mg/1 en metanol con 1 ml/1 de HC1 concentrado. Se inyectanen la columna por separado, los volúmenes de inyección deben ser de214,1. Ajuste la atenuación para que los picos no rebasen la escala delintegrador.


Cuestionario

Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo,elabore una curva patrón como la de la figura 1.6. Calcule el coeficientede correlación.Con la altura de los picos del extracto de uva en el cromatograma interpolelos datos en la curva patrón.Con el valor verdadero (dato proporcionado por el profesor) calcule laprecisión y exactitud y discuta sus resultados.

1. ¿Qué influencia pueden tener los siguientes cambios sobre el croma-tograma obtenido en esta práctica?

a) Utilizar una columna C-8 en lugar de una C-18.b) Disminuir el flujo de la fase móvil.c) Hacer una elución isocrática (en lugar de una por gradiente) en condi-

ciones de disminución del flujo de la fase móvil.

2. ¿Qué puede suceder si, por descuido, no se filtra el extracto de materiacolorante y se inyecta en el cromatógrafo?

72



Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas

3. ¿Se puede confiar en un cromatograma que fue obtenido durante unacorrida que presentó fuertes variaciones en la presión de las bombas?¿Qué puede ocasionar este comportamiento?

4. ¿Qué otros sistemas de detección son de uso frecuente en los croma-tógrafos de alta resolución?

5. Mencione brevemente tres aplicaciones directas de la cromatografíalíquida de alta resolución, mencionando además tipo de columna, fasemóvil que se podría utilizar y el detector adecuado.

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Bibliografía


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Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo EditorialIberoamérica, México.

León, R. 1982. Libro básico para cromatografía de líquidos. LDC/MiltonRoy, USA.

Meites, L. (editor). 1963. HandbookofChemistry. Me Graw Hill, USA.

Operator's Manual. 1993. SpeetroMonitor 3200 Variable Wavelength De-tector. Thermo Separation Products, USA.

Operator 's Manual. 1993. ConstaMetric 3200 Fluid Metering Pump. ThermoSeparation Products, USA.

Pecsok, R. L. y L. D. Shields. 1987. Métodos modernos de análisis químico.Ed. Limusa, México.

Reyes-Dorantes, A., M. L. Escamilla-Hurtado y J. R. Verde-Calvo. 1992.Enología Vol I. Elaboración de vinos de mesa. Universidad AutónomaMetropolitana Iztapalapa, México.

Watty, M. 1989. Química analítica. Ed. Alhambra Mexicana, México.

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Capítulo 3

ESPECTROFOTOMETRIA





I. VISIBLE ULTRAVIOLETA

Introducción

Los usos analíticos de la espectrofotometría en la zona del visible ultravioletason muchos y muy variados. El objeto de este capítulo es hacer mención dealgunas de estas aplicaciones, y que el alumno ponga en práctica los co-nocimientos adquiridos en la teoría sobre la ley de Lambert y Beer.

Cuando un compuesto o ion capaz de absorber luz es colocado en una cel-da en un espectrofotómetro, cierta cantidad de luz monocromática seráabsorbida por dicho compuesto y el resto saldrá de la celda para ir a incidir so-bre el fototubo que la detectará. Este comportamiento es aprovechado paraconocer la concentración de los compuestos.

La transmitancia, T, de una disolución se define como la fracción de la in-tensidad o de la fuerza de la luz incidente, Po, que se transmite verdaderamentea través de la disolución. En donde P es la intensidad de la luz que sale de lamuestra.

T = — o T = 100Po \Po)

La absorbancia, A, de una disolución es la luz que absorbe, no la que setransmite, y se define como:

A = - logT = log —

La ley de Beer (también conocida como la ley de Bouguer-Beer o de Lam-bert y Beer) establece que: a una longitud de onda dada, la absorbencia esproporcional a la concentración de la especie absorbente en una disolución,como lo indica la siguiente ecuación.

A = zbc




En donde b es el recorrido del haz de luz en la celda, c es la concentración(moles/1) y la constante de proporcionalidad es la absortividad molar, e. Suvalor numérico depende de las unidades que se usen para expresar b y c. Si bestá dada en cm y c en moles por litro, se le denomina coeficiente de extinciónmolar o absortividad molar y recibe el símbolo de e. Si la concentración se daen g/1, solamente se llama coeficiente de extinción o absortividad y su símboloes "a" (para obtener mayor información sobre esta ley se pueden leer los trabajosde Hughes, 1952,Liebhafsky, 1953,yLykos, 1992).

Desviaciones de la ley de Beer

Una gran cantidad de compuestos absorbentes siguen bastante bien la ley deBeer en soluciones diluidas, pero en algunas sustancias las absorbancias varíanen forma no lineal respecto de la concentración. Este comportamiento se conocecomo "desviación de la ley de Beer". Para trabajar estos sistemas se requiereuna curva de calibración, trazada con valores de muestras de concentraciónconocida, de este modo se puede conocer el intervalo de concentraciones enel cual la relación es lineal. Se debe tomar en cuenta que las desviaciones conrespecto a esta ley pueden tener causas diversas: por muestras muy concentradaso muy diluidas, por variación del equilibrio químico de la sustancia que absorbey por limitaciones del instrumento utilizado.

Para tener el mínimo de problemas con las desviaciones, se recomiendatrabajar en el intervalo de concentraciones de 10'2 M a 10'6 M. Si se utiliza unatécnica poco reconocida, hay que cuidar el equilibrio químico poniendo espe-cial atención en la fuerza iónica y en el pH del sistema, ya que hay muchoscompuestos cromóforos o quelatos que presentan equilibrios parciales, en estoscasos hay que agregar un exceso de ligando para desplazar el equilibrio hastala formación del complejo con mayor número de coordinación.

También existen problemas causados por los equipos, como las radiacionesreflejadas dentro del aparato que llegan al detector, los cambios de sensibilidaddel detector y las fluctuaciones en la corriente eléctrica que provocan cambiosen la intensidad de la radiación y por ende modificaciones en la lectura registrada.

Un dato muy importante es que las mediciones espectrofotométricas sóloson confiables con valores intermedios de absorbancia, aproximadamente entre0.187 y 0.824; o en % de T, entre 15 y 65; si se requiere, se puede ampliar

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Espectrofotometría

esta escala hasta 80% de 7, pero entonces se aumenta el error fotométrico(valores de absorbancia para un espectro de un solo haz, utilizando la gráficade Ringbom. Servicios Centrales de Instrumentación, 1983).

Celdas

La celda es un depósito transparente especialmente diseñado para contener ladisolución de prueba o el disolvente de referencia (blanco) durante los estudiosespectrofotométricos. Existen celdas o cubetas de diversos tamaños y formasapropiadas para los diferentes tipos de espectros comerciales (figura 3.1). Lasceldas más comunes para medir espectros en la región del visible-ultravioletaestán fabricadas con cuarzo y tienen un paso de luz de 1.0 cm. Las celdas devidrio óptico son apropiadas sólo para mediciones en la región del visible, yaque absorben la radiación ultravioleta.

Generalmente las celdas son cuadradas con dos lados esmerilados, pero lashay cilindricas en forma de tubo de ensayo para ser utilizadas en el Spectronic20. También existen las celdas de flujo que permiten la circulación continuade una disolución a través de la cubeta. Son útiles para medir la absorbancia dedisoluciones que fluyen de una columna cromatográfica. También existen lasceldas térmicas con recirculación de agua o algún líquido que fluye en una ca-misa para mantener el contenido de la celda a la temperatura deseada.

Las características de transmisión de las celdas en varias longitudes de ondason función de los materiales de fabricación. Por ejemplo, el vidrio pyrex transmiteen el intervalo de los 320 a los 2 500 nm. La figura 3.2 muestra las zonas deabsorción de los materiales más comúnmente empleados en la fabricación deceldas. Se pueden utilizar vidrios o plásticos especiales en la región del visible.

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Celda cilindrica paraflujo constante

Celda normalcon tapa

Microcelda típica contapa

Celdacuadradapara flujoconstante s

Figura 3.1 Diferentes tipos de celdas para espectrofotometria.

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Espectro fotometría

200 250 300 350 400 nm

1. Spectrosil2. Sílice fundido3. Cuarzo fundido

4. Vitreosil grado IR5. Vidrio óptico especial6. Vidrio

Figura 3.2 Espectro de transmisión para materiales utilizados en lafabricación de celdas.

Resulta conveniente contar con una marca en el lado donde incida la luz, demanera que la celda pueda siempre ser orientada en la misma posición parapermitir la reproducibilidad de los resultados.

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7. Control de longitud de onda2. Control de ajuste de 0% de

transmitancia o de absorbancia

1

3. Control de cero y de encendido4. Portaceldas

Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20.

Operación del espectrofotómetro Spectronic 20

Descripción

El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de laperilla izquierda, en el sentido de las manecillas del reloj. El aparato se calienta

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7. Control de longitud de onda2. Control de ajuste de 0% de

transmitancia o de absorbancia

1

3. Control de cero y de encendido4. Portaceldas

Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20.

Operación del espectrofotómetro Spectronic 20

Descripción

El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de laperilla izquierda, en el sentido de las manecillas del reloj. El aparato se calienta

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2. Evite el uso de agentes limpiadores que sean abrasivos, corrosivos oque produzcan coloración de las superficies. Por ningún motivo las limpiecon un escobillón.

3. Enjuague las celdas cuando menos tres veces con pequeñas porcionesde la disolución de prueba antes de tomar la lectura. Evite usar solamenteagua destilada, ya que esto produce un efecto de dilución sobre la muestraa medir.

4. Cuando introduzca la celda en el compartimento de muestras, limpie eltercio inferior de la celda con papel especial para lente (nunca use ser-villetas, pañuelos o la bata), y asegúrese que las paredes no muestrenfibrillas adheridas o manchas.

5. Evite producir rayaduras en las superficies de las celdas, colóquelasdentro del portaceldas con la línea indicadora alineada con su respectivaguía

6. Mantenga cerrada la tapa del compartimento de muestras mientras realizalas mediciones, ya que esto restringe la entrada de luz parásita.

7. Al finalizar todas las mediciones, enjuague con el disolvente puro. Si lasceldas están muy sucias o si presentan depósitos difíciles de remover,use una mezcla de ácido clorhídrico 3 N y alcohol etílico absoluto 1:1.Aplique un último enjuague con etanol o metanol grado espectroscópicoy deje secar al aire.

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Práctica 5

Desarrollo de un método espectrofotométrico

Introducción

Para la cuantificación de sustancias que pueden absorber la luz que las atraviesa,las técnicas espectrofotométricas son confiables y de fácil manejo. Además,no sólo sirven para calcular la cantidad de soluto presente en una disolución,sino también se pueden utilizar para identificar sustancias de manera cualitativa.

Cuando se realiza un proyecto de investigación, se puede requerir eldesarrollo de un método espectrofotométrico para cuantificar algún soluto oquizás el producto de una reacción, que tengan la cualidad de absorber la luz.Para conseguir esto se necesita:

a) Conocer la longitud de máxima absorbancia del compuesto, que seobtiene haciendo un barrido en la región del espectro de absorción deinterés.

b) La preparación de una curva de calibración con disoluciones deconcentración conocida. Conocer la curva permite verificar si la leyde Lambert y Beer se cumple en el intervalo de trabajo.

c) Conocer si hay interferencias entre los reactivos, si las reaccionesinvolucradas son estables en las condiciones de trabajo y si hayreproducibilidad en los resultados experimentales.

Tome en cuenta que la absorción de la energía radiante en las regionesespectrales del visible y del ultravioleta, depende principalmente del número de

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Objetivo

arreglos de los electrones de las moléculas o iones absorbentes. En sustanciasinorgánicas se presenta una absorción selectiva, cuando un nivel energéticoelectrónico incompleto se halla cubierto o sobrepuesto por un nivel de energíacompleto, normalmente formado por valencias de coordinación con otrosátomos. En las moléculas orgánicas la absorción selectiva está relacionada conla localización de los electrones en la molécula. Los compuestos completamentesaturados no muestran una absorción selectiva en las regiones del visible y enlas accesibles del ultravioleta lejano. Las dobles ligaduras conjugadas producenabsorción con mayores longitudes de onda. Si la molécula es muy grande, laabsorción entrará en la región del visible y presentará color, tal como sucedecon la molécula del (3 caroteno (Ewing, 1979).

El alumno aprenderá a utilizar un espectrofotómetro (Spectronic 20) y aimplementar una metodología para la cuantificación de compuestos que absorbenla luz en la región del visible.


Espectrofotómetro Spectronic 202 celdas para el espectro3 matraces aforados 100 mi5 matraces volumétricos de 25 mi3 vasos de precipitados de 100 mi3 pipetas graduadas de 5 miVidrio de relojAgitador de vidrioBalanza analíticaEspátulaPiseta con agua destiladaNH4Fe(SO4)2*12H2OH2SO4 concentrado1,10-fenantrolinaCH3COONa

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Normas de seguridad

Procedimiento

Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención deaccidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra enel capítulo 1.Para preparar soluciones diluidas de ácido sulfúrico es recomendable:

a) Enfriar el recipiente que contenga agua en un baño de hielo.b) Agregar el ácido al agua en porciones pequeñas, dejando que éste

resbale por la pared del recipiente.c) Agitar después de cada adición de ácido regresando el recipiente al

baño de hielo.

1. Metodología para encontrar la longitud de máxima absorbancia delcomplejo hierro-fenantrolina: se obtiene haciendo un barrido en la regióndel espectro de 400 a 620 nm.

Preparación de disoluciones:

• Disolución estándar del hierro (III). Preparar 100 mi de disolución1.8 x 10-3MdeNH4Fe(SO4)2 • 12H2O en disolución de H2SO4 0.1 N.

• Disolución de 1,10-fenantrolina alO.l % (p/p) en agua. Preparar 100 ml• Acetato de sodio 2 M. Preparar 100 ml.• Coloque 5 ml de disolución estándar de Fe (III) en un matraz volumétrico

de 100 ml. Adicione 10 ml de disolución de acetato de sodio para man-tener el pH entre 3 y 5. Verifique con papel pH. Adicione 10 ml de 1,10-fenantrolina y diluya hasta la marca de aforo con agua destila-da. Deje transcurrir 10 minutos para que se desarrolle el color rojoanaranjado.

• Mida la absorbancia a intervalos de 10 nm, de 400 a 620 nm. En cadalongitud de onda ajuste la transmitancia a cero y cien porciento, use unblanco que contenga acetato de sodio y 1,10-fenantrolina.

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2. La preparación de una curva de calibración con disoluciones deconcentración conocida permite verificar si la ley de Lambert y Beer secumple en el intervalo de trabajo.

• Curva estándar. Prepare en matraces volumétricos de 25 mi una seriede disoluciones que contengan 1,2,3,4 y 5 mi de la disolución estándarde Fe (III). Agregue 10 mi de disolución de acetato de sodio, 10 mi de1,10-fenantrolina y diluya hasta la marca con agua destilada. Mídase laabsorbancia de estas disoluciones en la longitud de onda seleccionada.

3. Además se requiere conocer si hay interferencias entre los reactivos, silas reacciones involucradas son estables en las condiciones de trabajo ysi hay reproducibilidad en los resultados experimentales.

• Solicite al profesor una muestra problema de Fe (III) y mida la ab-sorbancia. Realice por triplicado la determinación.


Con los resultados del punto 1, construya una gráfica de longitud deonda en función de la absorbancia. Determine la longitud de onda demáxima absorbancia para el complejo 1,10-fenantrolina de hierro (III)que ha de emplearse. Muestre al profesor de laboratorio la longitud deonda seleccionada, antes de proceder al análisis cuantitativo.Construya una gráfica de la absorbancia en función de la concentración(moles/1). Compruebe en qué intervalo la ley de Lambert y Beer secumple.Determine la concentración de la muestra problema y exprésela en mo-laridadyenppm.Calcule el coeficiente de extinción molar del complejo colorido.Calcule la cantidad de mM por mi necesarios para dar una absorbanciade 1.0.

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Cuestionario

i.

2.

3.

Explique cuáles son las desviaciones que pueden presentarse en laaplicación de la ley de Beer.

¿Cuáles son los cuidados que se deben tener con las celdas del es-pectrofotómetro?

¿Cuáles son los factores que se deben tomar en cuenta para la deter-minación espectrofotométrica de iones inorgánicos por formación decomplejos?

Una disolución de permanganato de potasio 1.28x10"4 M tiene unatransmitancia de 0.5 a 525 nm, en una celda de 1.0 cm.

a) ¿Qué absorbancia tiene esta disolución?b) Si la concentración fuese el doble, ¿cuál sería la absorbancia y la

transmitancia?c) ¿Qué concentración correspondería a una transmitancia de 0.75 en

esta celda?

El cobalto (II) forma fácilmente un complejo de color azul cuandoreacciona con el tiocianato. El procedimiento es el siguiente: se preparauna disolución de tres partes de acetona por una de disolución acuosa al50% de NH4SCN. Esta disolución se agrega a un matraz que contieneCo (II), el complejo resultante es de color azul intenso.

Se prepararon las siguientes disoluciones y se efectuó la lectura a620 nm:

Co, ppm

3.0

6.0

9.0

12.0

A

0.10

0.21

0.32

0.42

89




Se tomaron 4.0 mi del líquido que salía de una columna de separación yse diluyeron hasta 100 mi con acetona y NH4SCN.

La absorbancia medida a 620 nm fue de 0.25. ¿Cuál fue la con-centración del cobalto, en ppm, en el matraz de 100 mi que contenía lamuestra?

6. Se tienen 20 mi de disolución con 3.0 mg de hierro (II) formando uncomplejo con la 1,10-fenantrolina. La absorbancia de la disolución esde 0.45 en una celda de 1 cm a 515 nm. Calcule el % de Ty el coeficientede extinción molar del complejo.

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Práctica 6

Determinación por espectrofotometría de laconcentración de cobalto y níquel en una mezcla

Introducción

Frecuentemente es preciso analizar mezclas de dos o más sustancias. A veceses posible hacerlo a través de determinaciones espectrofotométricas simultáneas,en lugar de efectuar las separaciones físicas o químicas necesarias para analizarlos componentes puros por separado.

Se conocen varios métodos para determinar las concentraciones de sistemascon dos o más compuestos, el más conocido requiere de establecer los picosde absorción de cada componente y que cada uno de ellos se encuentreprácticamente libre de absorciones de los otros compuestos, además, se debeconsiderar que las absorbancias de cada uno son aditivas. Existe otro métodopara sistemas en los cuales las curvas de absorción se traslapan, de maneraque requieren un barrido de las dos longitudes de onda. En este caso de debeutilizar la metodología propuesta por Blanco et al. (1989), en la cual se estableceuna correlación lineal que permite con base en la pendiente y la ordenada alorigen conocer las concentraciones de mezclas binarias.

En esta práctica se utilizará el primer método para casos en que las longi-tudes de onda de máxima absorbancia no se traslapan. En la determinación dela concentración de dos (o más) sustancias hay que tener cuidado, ya que lospequeños errores experimentales se suman rápidamente. Un error en la lecturade absorbancia en una longitud de onda puede disminuir la precisión en el re-sultado final.

91




Objetivo

El alumno aplicará sus conocimientos sobre espectrofotometría para lacuantificación de una mezcla de dos compuestos.


Espectrofotómetro Spectronic 202 celdas para el espectro2 matraces aforados 100 mi2 matraces volumétricos de 25 mi2 vasos de precipitados de 100 mi2 pipetas graduadas de 5 miVidrio de relojAgitador de vidrioBalanza analíticaEspátulaPiseta con agua destiladaCo(NO3)2 • 6 H2ONi(NO3)2 •6H2O

Normas de seguridad

Tome en cuenta el apartado "Prevención de accidentes en el trabajo con sus-tancias químicas", que se encuentra en el capítulo 1.

Procedimiento

1. Preparar las siguientes disoluciones:

a) 100 mi de Co(NO3)2 • 6 H2O 0.09 M.b) 100 mi deNi(NO3)2 • 6 H2O 0.09 M.

92



Determinación de la concentración de cobalto y níquel en una mezcla

2. Verificar que las longitudes de onda de máxima absorbancia no sesobrepongan, haciendo un barrido de ± 50 nm, de 10 en 10 nm, paracada valor. El Co(NO3)2 tiene un máximo de absorción en 510 nm y elNi(NO3 )2 lo tiene en 395 nm.

3. Medir la transmitancia del nitrato de cobalto y del nitrato de níquel en510y395nm.

4. Medir la absorbancia de una mezcla problema en 510 y 395 nm.


A partir de los porcientos de transmitancia calcule los valores de ab-sorbancia para cada longitud de onda. Si se hacen varias determinaciones,tome el promedio.Con estos datos calcule los coeficientes de extinción molar de los dosiones en las dos diferentes longitudes de onda.Calcule la concentración molar de cada componente. Para obtenermejores resultados efectúe los cálculos conservando tres cifras des-pués del punto decimal. Reporte los resultados en molaridad y en mg deNi/ml y mg de Co/ml.

Cuestionario

1. ¿Qué diferencia existe entre la fuente de radiación de los espectrofo-tómetros de la región ultravioleta y los de la región visible?

2. Calcule la concentración de cada uno de los colorantes en la siguientemezcla analizada por espectrofotometría.

Una disolución 0.02 M de un colorante rojo produce una absorbanciade 0.8 a 515 nm y de 0.15 a 635 nm. Una disolución 0.03 M de unsegundo colorante azul tiene una absorbancia de 0.2 a 515 nm y de 1.0a 635 nm. Una mezcla de ambos colorantes dio una absorbancia de0.55 y 0.825 a 515 y 635 nm, respectivamente.

93




Calcule la concentración de una disolución que contiene Fe (III), a partirde la siguiente técnica: A un mi de disolución con hierro se le adicionanacetona, disolución de tiocianato de amonio y agua hasta 100 mi. Ladeterminación se lleva a cabo con una celda de 2 cm. La absorbancia en480 nm fue de 0.75. El coeficiente de extinción molar fue de 14 000.

Una disolución que contiene una mezcla de AMP y GMP da unaabsorbancia de 0.621 en 260 nm y de 0.214 en 280 nm. Calcule laconcentración de AMP y GMP, si los coeficientes de absorción molar(en litros mol"1 cm"1) en estas longitudes de onda son:

AMP

GMP

260 nm

280 nm

260 nm

280 nm

0.0154

0.0025

0.0117

0.077

AMP = Adenosin mono fosfatoGMP= Glucosa mono fosfato

Las medidas fueron hechas con una celda de 1 cm de longitud depaso óptico.

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Espectrofotometría

II. TURBIDIMETRIA

El método turbidimétrico se fundamenta en el fenómeno de que la luz, al pasara través de un medio con partículas dispersas, con un índice de refraccióndiferente al del medio, disminuye su intensidad debido a la dispersión.Instrumentalmente se detecta la intensidad de la luz transmitida por el medio, osea, la luz no dispersada. La turbidimetría es muy similar a la colorimetría, encuanto que ambas se basan en la medición de la luz transmitida por un medio yemplean aparatos similares.

La intensidad de la luz que se dispersa en cualquier ángulo es función de laconcentración de las partículas dispersantes, de su tamaño y forma, de la longitudde onda y de la diferencia entre los índices de refracción de las partículas y elmedio. La dispersión total de un determinado número de partículas (suponiendoque no haya interacciones de dispersión múltiple), está dada por la suma de lasdispersiones individuales, mientras que la absorbancia del sistema esdirectamente proporcional a la concentración de partículas (Willard, 1974).

Es importante tomar en cuenta que la relación entre la intensidad de la luzdispersa y la concentración no es simple, por lo que este tipo de determinacionesdeben tener un carácter empírico. La luz no es realmente absorbida por ladisolución, sino que se dispersa en todas direcciones y no llega al detector. Laabsorción aparente o turbidancia obedece a una ecuación análoga a la ley deBeer en un intervalo limitado de concentraciones.

= kbc

"A " es la absorbancia aparente o turbidancia (Ewing, 1978, utiliza la letra Scomo símbolo de turbidancia)

Po es la potencia radiante del haz de luz incidenteP es la potencia del haz de luz emergentek es una constanteb es el recorrido del haz de luz en la celdac es la concentración de la disolución

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El valor de k se determina empíricamente con una serie de patrones (Harris,1992). Esta ecuación es válida sólo para suspensiones muy diluidas, porque amedida que la concentración aumenta, una mayor proporción de la luz dispersaencuentra su camino hacia la fotocelda de medida a través de una dispersiónmúltiple (Ewing, 1978).

La ecuación de la absorbancia aparente se puede transformar en:

UT » _ P _ - rb

"T" es la transmitancia de la disolución turbiaT es el coeficiente de turbidez y es igual a 2.303 k.

Prácticamente cualquier espectrofotómetro puede utilizarse en turbidimetría:se mide la fracción de la luz dispersada (la transmitancia), la cual es in-dependiente de la intensidad de la fuente luminosa. La turbidimetría aplicada atitulaciones no es muy precisa, debido a que la detección del punto final dependedel tamaño de las partículas. Sin embargo, la sensibilidad es muy buena, porejemplo, los sulfates pueden determinarse hasta el orden de partes por millón.

En cuanto a la selección de la longitud de onda, ésta no es crítica; sin em-bargo, si la disolución a trabajar contiene un soluto colorido, además delcomponente turbio, es preferible escoger una región de longitudes de onda demínima absorción. En cambio, si el componente turbio es el que absorbe, deberátrabajarse en la región donde se presente la longitud de onda de máximaabsorbancia.

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Práctica 7

Cuantificación turbidimétrica de sulfatos

Introducción

La aplicación de técnicas turbidimétricas es amplia, aunque en los últimos añosha sido desplazada por la aplicación de otros métodos instrumentales mássensibles. Actualmente aún existen procedimientos en el área de farmacia y ali-mentos que la siguen utilizando.

Por ejemplo, en la industria de vinos y también en la de aguardientes latransparencia y brillantez son características importantes de la calidad de estosproductos. La presencia de materiales suspendidos, aun en cantidades tanpequeñas que resultan invisibles al embotellar, producirán un sedimento visibley desagradable después de cierto tiempo. La calidad de las aguas para procesosindustriales y la transparencia del agua para la alimentación de calderas, sonotros ejemplos típicos de aplicaciones comunes.

Hay técnicas donde la turbidez en la muestra se desarrolla en condicionescontroladas. La reacción de precipitación debe efectuarse con rapidez y laspartículas formadas deben ser de baja solubilidad y de tamaño pequeño. Laadición de agentes tensoactivos o de coloides protectores es útil, ya que favoreceel tamaño de las partículas, promueve la nucleación a expensas del crecimientode los cristales y aumenta lareproducibilidad de la técnica.

Se pueden presentar problemas con la exactitud del método, pues seencuentra limitado por la falta de reproducibilidad de la forma física delprecipitado o, una vez formado, por la inestabilidad del mismo.

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Objetivo

El alumno utilizará una técnica turbidimétricapara la cuantificación de una muestraproblema de sulfates.


Espectrofotómetro Spectronic 202 celdas para el espectroMatraz aforado de 500 miMatraz aforado de 200 mi4 matraces aforados de 250 mi4 matraces Erlenmeyer de 500 mi2 vasos de precipitados de 100 mi2 pipetas graduadas de 5 miVidrio de relojAgitador de vidrioBalanza analíticaEspátulaPiseta con agua destiladaNa2SO4

NaClHC12MBaCL

Normas de seguridad

Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención deaccidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra enel capítulo 1.Para preparar soluciones diluidas de ácido clorhídrico es recomendablehacerlo en la campana de extracción.

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Cuantifícación turbidimétrica de sulfatos

Procedimiento

1. Disolución estándar de sulfatos. Prepare 500 mi de sulfato de sodioanhidro con 200 ppm.

2. Disolución de NaCl al 20 % (p/p) en HCl 2 M. Prepare 200 mi.3. Prepare 4 disoluciones de 250 mi, con las siguientes concentraciones,

para elaborar la curva patrón: 25, 50, lOOy 150ppm. Agregue 25 mide la disolución de NaCl en HCl 2 M a cada dilución, antes de llevar ala marca de aforo.

4. Trasvase cada una de las diluciones a un matraz Erlenmeyer de 5 00 miy adicione 1.0 g de BaCl2 a cada sistema. Agite muy bien y mida latransmitancia, utilizando como blanco la disolución patrón a 3 5 5 nm.

5. Solicite al profesor del laboratorio una muestra problema y mida sutransmitancia.


Trace la gráfica de transmitancia en función de la concentración (mg/1).Interpole el dato de transmitancia en la gráfica y determine la con-centración de la muestra problema.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la diferencia entre una determinación turbidimétrica y una efec-tuada por nefelometría?

2. Investigue dos aplicaciones directas de la turbidimetría dentro de algúnproceso de elaboración o de control de calidad de interés para usted.

3. Para medir la cantidad de fluoruro en una muestra de agua de una ciudad,se utilizaron dos litros de agua a la cual se le adicionaron 0.5 g de nitrato

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de calcio. Se agitó y la disolución se evaporó hasta 150 mi. Se midió latransmitancia resultando de 55 %.

La tabla muestra las concentraciones utilizadas en la curva patrón ylos datos de transmitancia obtenidos. Calcule usted la concentración delfluoruro del agua citadina.

Concentración ppm

12

25

50

110

"A"

0.04

0.10

0.30

0.52

100



Bibliografía

Bibliografía

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101




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Watty, M. B. 1989. Química analítica. Ed. Alhambra, México.

Willard, H. H. et al. 1981. Métodos instrumentales de análisis. Ed. Cecsa,México.

102



Capítulo 4

MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS





Introducción

Los métodos electroquímicos abarcan una amplia variedad de técnicas, basadasen los diferentes fenómenos que se llevan a cabo dentro de una celdaelectroquímica. Todas las mediciones eléctricas básicas, como la corriente, lasresistencias y el voltaje, se han empleado solas o en combinación para propósitosanalíticos. Los métodos electroquímicos se clasifican en:

1. Potenciometría. Utiliza de manera directa la ecuación de Nernst,midiendo el potencial de los electrodos no polarizados bajo condicionesde corriente igual a cero (sin aplicación de corriente).

2. Voltametría y polarografia. Estos métodos se usan para estudiar lacomposición de disoluciones electrolíticas diluidas utilizando curvas decorriente-voltaje. La polarografia se refiere a las aplicaciones del elec-trodo de goteo de mercurio.

3. Conductimetría. Se emplean dos electrodos inertes idénticos, y se mideel recíproco de la resistencia que es la conductancia.

4. Cronopotenciometría. En esta técnica se hace pasar una corrienteconocida a través de la disolución y se registra el potencial de loselectrodos en función del tiempo.

5. Coulombimetría. Involucra dos técnicas: a) La coulombimetría decorriente constante, que mantiene una corriente de este tipo durantetodo el período de la reacción. En este caso se debe agregar un excesode un regulador de oxidorreducción para que el potencial no aumente aun valor que permita la realización de otra reacción no deseada, b) Lasseparaciones de potencial controlado o electrogravimetría. Se puedenlograr separaciones cuantitativas por medio de una oxidación o reduc-ción electrolítica y medir la sustancia separada por coulombimetríao gravimetría: se mantiene un potencial de electrodo constante y sedetecta en forma continua el potencial del electrodo de trabajo encomparación con un electrodo de referencia.




Los métodos de cronopotenciometría, coulombimetríay las separacionesde potencial controlado no se estudian en el curso de Química analítica II,pero si existe interés acerca de estos métodos, en la bibliografía de este capítulose pueden encontrar referencias sobre el tema.

Todos los métodos electroquímicos se caracterizan por su alto grado deselectividad y precisión.

Celdas electroquímicas

Existen dos tipos de celdas: la galvánica y la electrolítica. La primera es aquellaen que una reacción de oxidorreducción espontánea genera una corrienteeléctrica (Harris, 1992). Si se suministra energía eléctrica a una celda, con unafuente de poder, entonces recibe el nombre de celda electrolítica.

Electrodos de referencia

Un electrodo de referencia tiene un potencial conocido y constante, estánconstituidos por una hemicelda interna de referencia, que puede ser de plata,cloruro de plata o de calomel (cada uno de ellos con su respectivo valor depotencial estándar); tienen un electrólito de puente salino y un pequeño canalen la punta del electrodo, a través del cual fluye muy lentamente el electrólito,permitiendo el contacto con los otros componentes de la celda.

Electrodos de calomel

Tienen un elemento no atacable, como el platino, el cual está en contacto conmercurio, cloruro mercuroso (calomel) y con una disolución neutra de clorurode potasio (de concentración conocida) que se encuentra saturada con calomel.

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Métodos electroquímicos

HgCUs) 2Hg(\) + 2CI-

Existen tres versiones de este electrodo: el electrodo de calomelsaturado (ECS), en donde la disolución de KCl es 4.2 N (figura 4.1), ylos electrodos que tienen 1.0 N o 0.1 N de la disolución de KCl. Estosúltimos se prefieren porque alcanzan sus potenciales de equilibrio másrápidamente y porque dependen menos de la temperatura que el de tiposaturado. Los valores para estos tres electrodos a 30 °C son:

Electrodo de calomel saturado (ECS) = 0.241 VElectrodo de calomel normal (ECN) = 0.280 VElectrodo de calomel décimo normal = 0.335 V

Si requiere mayor información sobre los valores de potencial de loselectrodos de referencia, consulte el Lange s Handbook ofChemistryo el Handbook Analytical Chemistry

Figura 4.1 Electrodo de referencia de calomel saturado.

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Electrodos de plata-cloruro de plata

El electrodo contiene un alambre de plata recubierto con una capa de clorurode plata y sumergido en una disolución de cloruro de potasio (de concentraciónconocida), la cual también está saturada con cloruro de plata.

AgCl (s) + e~ 4 Ag (s) + Cl-

E° = 0.222 VE (saturado con KC1) = 0.197 V

Electrodo de vidrio combinado de pH

Es el más utilizado en el análisis químico cuantitativo, y está clasificado entre loselectrodos selectivos de iones.

En la parte interna del electrodo de vidrio hay un alambre de plata con unextremo sumergido en una disolución de HC10.1 M (figura 4.2). El bulbo de laparte inferior del electrodo está fabricado con un vidrio de composición espe-cial. La superficie interior de esta membrana de vidrio está en contacto con ladisolución de HC10.1 M, y la superficie externa, con la disolución cuyo pH seva a determinar. En las dos superficies la membrana de vidrio absorbe agua,formando una capa de gel.

La zona del electrodo que responde a las variaciones de pH es la membranadelgada de constitución y construcción especial, ya que presenta una red desilicato con átomos de oxígeno cargados negativamente, los cuales se encuentrandisponibles para coordinarse con cationes monovalentes, en particular el Na+.Esta membrana tiene un espesor aproximado de 0.1 mm.

En estudios realizados con tritio (3H) como trazador radioactivo, se hademostrado que los iones hidrógeno no atraviesan la membrana de vidrio delelectrodo de pH. Las dos caras de la membrana están en equilibrio con H+, ylos iones Na+ transportan las cargas a través de la membrana. La diferencia depotencial entre los electrodos de plata, cloruro de plata interno y externo dependede la concentración del ion cloruro en el compartimento de cada electrodo, asícomo de la diferencia de potencial que existe entre las caras de la membrana.

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Como la concentración del cloruro es constante en cada compartimento, y laconcentración de H+ es fija en la parte interna de la membrana de vidrio, elúnico factor que provoca un cambio en la diferencia de potencial es la variacióndel pH de la disolución del analito en la parte externa de la membrana delelectrodo (Harris, 1992).

Un electrodo combinado de vidrio llega a responder en forma muy cercanaa lo indicado por la ecuación de Nernst. Es por esto que cada cambio de unaunidad de pH en un analito da como resultado un cambio de potencial de59.16mV.

Unión Electrodo de Agreemplazable

Protección de \ Membranala membrana de vidriode vidrio

Figura 4.2 Vista parcial de un electrodo de vidrio combinado.

Calibración del electrodo de vidrio

Un electrodo de pH debe calibrarse antes de ser utilizado. Para ello existen enel mercado muchas disoluciones patrón de pH. Se recomienda calibrar elelectrodo y el potenciómetro con una disolución reguladora o de preferenciacon dos, seleccionadas de manera que el pH del problema se sitúe dentro delintervalo de las disoluciones patrón. El procedimiento de calibración de cadapotenciómetro puede variar con la marca y el modelo, por lo que esrecomendable la lectura de los instructivos de cada aparato en particular.

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A continuación se describe el uso y manejo del potenciómetro, se explicacomo calibrar en dos puntos el medidor de pH Conductronic modelo 20 y elpotenciómetro de campo, Conductronic 10, modelo muy abundante en loslaboratorios de docencia de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud.

Operación del potenciómetroConductronic modelo 20 o modelo 10

Descripción

1. El o los electrodos se enjuagan con agua destilada y se secan suavementecon papel absorbente. Cuide de no frotar el electrodo (sobre todo si elcuerpo es de vidrio) porque esto produce electricidad estática en la su-perficie del vidrio.

2. Medir la temperatura de la disolución cuyo pH se desea conocer y ajustarel dato en el potenciómetro con el botón correspondiente.

3. Sumergir el electrodo en una disolución reguladora de pH 7 y dejar quealcance su equilibrio (entre 30 y 60 segundos). Se ajusta el aparato alvalor de pH de la disolución amortiguadora. Para realizar una lecturacorrecta, el electrodo de vidrio se debe sumergir en una disolución depH desconocido hasta una profundidad tal que la unión reemplazable(figura 4.2), situada en la parte inferior, se encuentre por debajo delnivel del líquido. Esto permite que los dos electrodos de plata midan ladiferencia del potencial entre las caras interna y externa de la membranade vidrio.

4. Colocar el selector de funciones del potenciómetro en standby y sacarel electrodo de la disolución, enjuagándolo con agua destilada; secarlo ysumergirlo en una segunda disolución amortiguadora de pH diferente (sise trabaja en intervalos ácidos, la segunda disolución puede ser de pH4, si es en la zona básica, el amortiguador puede ser de pH 10). Sevuelve a mover el selector de funciones del potenciómetro de standby apH y se hace la lectura. Si el electrodo responde siguiendo la ecuación

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de Nernst, el potencial debe variar en 0.05916 V por cada unidad depH a 25 °C. Si el valor de pH de esta segunda solución no coincide conla lectura, ésta se ajusta con el botón de temperatura. Los modelosConductronic 20 digitales tienen un tercer botón de "pendiente", ajustecon él.

Cuidados

Cuando el electrodo no se usa se debe guardar en una disolución acuosa, demanera que la capa del gel hidratado no se seque. Si el electrodo ya está seco,se reactiva sumergiéndolo en agua durante varias horas.

Los electrodos de vidrio se desgastan poco a poco, además de ensuciarsefácilmente con el mal uso, esto hace que la composición del vidrio cambie,provocando que la respuesta del electrodo se vuelva lenta o errónea; cuandoel problema ya es muy grave, ni siquiera se puede estandarizar. Si esto sucedese recomienda un lavado con HC16 M y luego enjuagar con agua destilada.

Si el lavado no funciona, reporte el electrodo con su profesor o a laCoordinación de Laboratorios para que procedan a un lavado más rigurosocon bifluoruro de amonio, NH4HF2, al 20 % p/p. Precaución: este compuestoprovoca quemaduras en la piel y disuelve el vidrio, por lo que se debe prepararen vaso de precipitados de plástico (Nalgen). El electrodo se sumerge en ladisolución durante un minuto, disolviendo un poco de la membrana de vidrio yexponiendo una superficie nueva. Enseguida se enjuaga el electrodo conabundante agua destilada y se calibra nuevamente (Harris, 1992).

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Práctica 8

Determinación potenciométrica deconstantes de ionización

Introducción

Objetivo

El método potenciométrico consiste en la medición de la diferencia de potencialentre el electrodo indicador y el electrodo de referencia, en diferentes intervalos,durante el transcurso de una valoración.

Un potencial de electrodo corresponde aun proceso de equilibrio y durantesu medición no debe alterarse, porque de otro modo el potencial obtenido seráincorrecto. Los dos tipos principales de electrodos usados en el trabajopotenciométrico son:

a) De referencia: Su potencial no se afecta al cambiar la composición de ladisolución que se estudia.

b) Indicador o de medición: Su potencial depende de la concentración deuno de los iones en la disolución.

Aunque se dispone de innumerables sistemas de electrodos, se recomiendanlos descritos en la tabla 4.1, porque proporcionan el mayor intervalo de utilidad(Meloan,1973).

El alumno aprenderá la instalación y el uso de una celda para la determinaciónpotenciométrica de las constantes de ionización.

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Tabla 4.1 Electrodos de referencia y medición.

Sistema

Ácido base acuoso

Ácido base no acuoso

Red-ox orgánico

Red-ox inorgánico

Precipitación, ion Ag

Precipitación metales pesados

Referencia

Calomel

Ag-AgCI

Ni

W

Hg2so4

Calomel

Indicador

Vidrio

Vidrio

Pt

Pt

Ag

Metal pesado


PotenciómetroElectrodo combinado de vidrio para medir pH2 matraces aforados de 100 mi4 vasos de precipitados de 100 miPipeta volumétrica de 20 miPiseta con agua destiladaVidrio de relojEspátulaBalanza analíticaAgitador de vidrioBureta de 50 miSoporte universalPinzas para buretaParrilla con agitación magnéticaAgitador magnéticoÁcido tartáricoNaOHDisolución amortiguadora de pH 4 y 7

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Determinación potenciométrica de constantes de ionización

Normas de seguridad

Procedimiento

Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención deaccidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra enel capítulo 1.Para el manejo del NaOH es necesario el uso de lentes de seguridad yguantes de neopreno, nitrilo o vinilo. Siempre debe manejarse en lacampana y no deben utilizarse lentes de contacto al trabajar con estecompuesto. Recuerde que es irritante y corrosivo y que puede causardaño al tracto respiratorio, piel y ojos.

1. Prepare las siguientes disoluciones:

• 100 mi de ácido tartárico 0.1 M.• 100 mi de hidróxido de sodio 0.1 M, estandarizado.

2. Calibre el medidor de pH, provisto del electrodo combinado de vidrio,con las dos disoluciones amortiguadoras. Retire y lave muy bien loselectrodos con agua destilada.

3. Vierta 20 mi del ácido tartárico en un vaso de 100 mi y añada 3 0 mi deagua destilada. Sumerja el electrodo en la disolución y ajuste la agitacióncon una barra magnéticay una parrilla con agitación magnética, de maneraque no golpee los electrodos. Con una bureta agregue disolución deNaOH en proporciones de 1 mi, salvo cerca del punto de equivalencia,donde se han de agregar porciones de 0.1 mi.

4. Mida el pH después de cada adición de sosa y realice la determinaciónpor triplicado.

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Cuestionario

Trace la gráfica de los valores de pH en función de los mi de NaOH.Con base en el pH de cada punto de equivalencia, obtenido gráficamente,calcule Kax y Ka2 para el ácido tartárico y compare con los valoresreportados en la literatura. Explique cualquier diferencia que puedaencontrarse.

1. ¿Qué características debe tener un electrodo para que pueda utilizarsecomo electrodo indicador en un potenciómetro?

2. ¿Qué son los electrodos de referencia?

3. ¿Qué es una celda galvánica y cómo se representa?

4. Una celda preparada de la siguiente manera:

Pt, H2(l atm), HA (0.15 M) // KC1 sat, Hg2Cl2, Hg,

dio un potencial de 0.575 v. Calcular la constante de ionización del ácido.

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Práctica 9

Titulación potenciométrica del ferrocianuro con cerio

Introducción

El curso de la reacción de titulación potenciométrica se sigue, midiendo con unpotenciómetro la concentración de una o de varias especies. En esta prácticase estudia la titulación del Fe (II) con el Ce (IV), en donde la variación de lasconcentraciones durante la titulación es la siguiente:

Fe2+ + Ce4+ » Fe3+ + Ce3+

Inicio Co

Agregado

A.P.E.

P.Eq.

D.P.E.

XCo

Co(l-X)

sCo

sCo

eCo

eCo

Co(X-l)

XCo

Co

Co

XCo

Co

Co

A.P.E. antes del punto de equivalenciaP. Eq. punto de equivalenciaD.P.E. después del punto de equivalencias valor pequeño de concentración debido al equilibrio reversibleCo concentración inicial de [Fe2+]X relación de la concentración del [Fe2+]/[Ce3+]

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En el inicio sólo se tiene Fe2+, de manera que el valor de potencial no sepuede calcular teóricamente.Antes del punto de equivalencia (A.P.E.) se encuentran las cuatro especies(Fe2+

? Ce4+, Fe3+, Ce3+), y aunque la cantidad de Ce4+ es muy pequeña,el valor de potencial se puede medir en estos puntos utilizando la ecuaciónde Nernst y el par: Fe 37Fe2+.En el punto de equivalencia (P. Eq.) los reactivos se terminan y el valordel potencial está dado por la ecuación:

E =

Después del punto de equivalencia (D.P.E.), la especie que impone elvalor del potencial es el reactivo titulante Ce 47Ce3+.

Métodos para determinar el punto de equivalencia

Existen varios métodos para la determinación del punto de equivalencia, sedescriben los tres más utilizados:

1. El método más simple se aplica principalmente a las valoraciones deácidos y bases fuertes, donde hay cambios muy grandes de pH en elpunto final. Se traza la gráfica de pH en función de los mililitros dedisolución valorante, como se muestra en la figura 4.3, se escoge el pun-to medio en el pH como punto de equivalencia y finalmente se baja unalínea perpendicular a la línea base. El punto de intersección con ésta esel volumen gastado.

2. Método de la primera derivada: Este segundo método es más preciso yes aplicable en todos los casos de neutralización. Se traza la gráfica delos valores de ApH/Aml, en función de los mi de disolución valorante.Se obtiene una curva como la que se muestra en la figura 4.4.

118




pH

1

/!11/ i

/ |

' j

H

mi de disolución valorante

Figura 4.3 Método gráfico para obtener el volumen en el punto deequivalencia.

ApHAml


Figura 4.4 Método de la primera derivada.

119




Método de la segunda derivada: Consiste en trazar la gráfica de losvalores de A2pH/A2ml en función de los mi de valorante, como se observaen la figura 4.5. El punto de equivalencia en la segunda derivada esnuméricamente igual a cero, pues el valor de la ordenada pasa con granrapidez de un número positivo a uno negativo (Willard, 1981).

A2pHA2ml


Figura 4.5 Método de la segunda derivada.

Objetivo

El alumno efectuará una titulación potenciométrica redox, para el estudio ex-perimental de la curva de valoración del ferrocianuro de potasio con nitratocérico amoniacal.

120





PotenciómetroElectrodo de vidrio para medir pHElectrodo de referencia de calomel normal3 matraces aforados de 100 mi3 vasos de precipitados de 100 miPipeta volumétrica de 20 miPiseta con agua destiladaVidrio de relojEspátulaBalanza analíticaAgitador de vidrioBureta de 50 miSoporte universalPinzas para buretaParrilla con agitación magnéticaAgitador magnéticoFerrocianuro de potasio trihidratadoNitrato cérico amoniacalHCl concentradoDisolución reguladora pH 4Disolución reguladora pH 7

Normas de seguridad

Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención deaccidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra enel capítulo 1.Para el manejo del HCl es necesario el uso de lentes de seguridad y deguantes de neopreno. Siempre debe manej arse en la campana y no debenutilizarse lentes de contacto al trabajar con este compuesto. Recuerdeque es irritante, corrosivo y que puede causar daño al tracto respiratorio,piel y ojos.

121




Procedimiento

1. Prepare las siguientes disoluciones:

• 100 mi de ferrocianuro de potasio trihidratado 0.1 M.• 100 mi de nitrato cérico amoniacal 0.1 M en HCl 1 M.• lOOmldeHCllM.

2. Empleando el aparato de la figura 4.6, instale su sistema de titulación.3. Calibre el potenciómetro.4. Vierta 20 mi de disolución de ferrocianuro de potasio en un vaso de

precipitados de 100 mi. Agregue 20 mi de HCl 1 M, para cubrir loselectrodos. Titule con la disolución de cerio con adiciones de 1 mi hastacerca del punto final, alrededor del cual deberán hacerse adiciones de0.1 mi. Efectúe la titulación por triplicado.

Potenciómetrro

Electrodoindicador

Electrodo decalomel saturado

Figura 4.6 Titulación potenciométrica.

122





Trace las gráficas de:

Cuestionario

a) Potencial (E, V) en función de los mi de disolución de cerio.b) La primera derivada en función de los mi de disolución de cerio.c) La segunda derivada en función de los mi de disolución de cerio.

Con base en los resultados calcule la concentración del hierro (II).Utilizando las gráficas, encuentre el punto de equivalencia empleando elmétodo de la segunda derivada.

1. Enumere las condiciones experimentales que se requieren para la titulaciónpotenciométrica del vanadio (II) con permanganato de potasio.

2. Investigue cómo se representa una celda galvánica para la siguientereacción, según la IUPAC:

Sn4+ + Fe2+ » Sn2++ Fe3+

en concentraciones Sn4+ 0.2 M y Fe2+ 0.2 M.

3. Se titulan 50 mi deFe2+ 0.12 M con una disolución de Ce4+ 0.12 M. Latitulación se efectúa potenciométricamente con electrodos de platino ycalomel saturado. Con base en los siguientes datos, encuentre el volumenen el punto de equivalencia, empleando una gráfica de equivalencia contrael volumen del titulante, una gráfica de la primera derivada y una gráficade la segunda derivada.

123




V mi de Ce adicionado

12.5

25.0

37.5

45.0

47.5

48.5

49.5

49.55

49.7

49.8

49.9

50

50.1

50.2

50.3

50.4

50.4

51

55

62.5

75

E(v)

0.496

0.524

0.552

0.58

0.559

0.613

0.641

0.644

0.655

0.665

0.683

0.944

1.205

1.22

1.233

1.24

1.24

1.263

1.305

1.328

1.346

124



Bibliografía

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126






se terminó de imprimir en febrero de 1999

en Grupo Gráfico.

La edición consta de 1 000 ejemplares.



Alberto Reyes Dorantes estudió enla Facultad de Química de laUNAM la licenciatura de químicofarmacéutico biólogo, orientaciónen Tecnología de Alimentos. Poste-riormente realizó estudios enviticultura y enología en la Univer-sidad Politécnica de Madrid, y

estudió la maestría en Biología en la Facultad deCiencias de la UNAM. Ingresó a la UAM-Iztapalapaen 1980 como profesor investigador de tiempocompleto, y ha impartido cursos de Química de Ali-mentos, Análisis de Alimentos y Alimentos Fermen-tados. Actualmente imparte el curso de Enología en lalicenciatura de Ingeniería de los Alimentos. Ha cola-borado como asesor y director en proyectos de investi-gación para la obtención de vinos de mesa, vinos espe-ciales y fabricación de licores. Actualmente, en cola-boración con estudiantes de la licenciatura en Ingenieríade los Alimentos, se dedica a aislar, seleccionar y ca-racterizar cepas naturales de la familia Streptococcaceaepara inducir la fermentación maloláctica en vinos tintosde la zona vinícola del estado de Zacatecas, México.

Frida P. Malpica Sánchez realizósus estudios de licenciatura en laUniversidad Autónoma Metropo-litana, Unidad Iztapalapa, Divisiónde Ciencias Básicas y de la Salud,obteniendo el título de Ingenieríaen Alimentos. Comenzó como pro-fesora-investigadora en este mismo

plantel en 1993, colaborando en diferentes proyectosde investigación para la obtención de vinos de mesa yespeciales y la fabricación de licores, así como en laelaboración de notas de curso de temas relacionadoscon la química analítica, por ejemplo: espectroscopiainfrarroja, potenciometría y cromatografía líquida dealta resolución. Así mismo, ha impartido los cursosde Microbiología General y de Alimentos y Labora-torios de Química Analítica I y II, así como la materiade Enología. Ha sido responsable de convenios esta-blecidos entre la industria privada y la UAM-I para eldesarrollo de diferentes investigaciones, que ademásde su importancia intrínseca permiten a estudiantes opasantes de la licenciatura realizar su servicio social, ala vez que establecen un mayor vínculo con la industriaalimentaria. La licenciada Malpica imparte actualmenteel laboratorio de la materia de Enología.



Este manual va dirigido a todas las personas interesadas en conocer los principios y fundamentosdel análisis instrumental.

Las técnicas actuales de control de calidad se basan en gran parte en la cromatografía de gases.La industria en general requiere de personal capacitado en el manejo de cromatógrafos no sólo degases sino también de líquidos de alta resolución.

En este manual se encontrarán los fundamentos de ambas técnicas, así como prácticas para el uso delanálisis cualitativo y cuantitativo en las cuales se manejan las técnicas de uso común en patrones in-ternos y externos.

En cuanto al análisis espectral, se lleva de la mano al lector para que pueda hacer un análisiscompleto, desde la selección de la longitud de onda de máxima absorción hasta la cuantificación deuna muestra problema.

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UAM-Iztapalapa Librería

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Manual de practicas instrumentales y analiticas