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Los Vectores de Clonaje
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Mapa de Restricción de pUC18 y pUC19 ( se diferencian la secuencia de MCS )
Los pUC son vectores típicos de Clonaje. Vemos que su tamaño es de 2686 bp
Ori C
AmpicilinResistencia
MCSMulti Cloning Site
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GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
5´ 396 3´ 455
Hind III Sph I Pst I Sal I Xba I BamH I Sma I Kpn I Sac I EcoR I
pUC18 MCS
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Supongamos que preparamos el vector para insertar un fragmento de DNA que tiene extremos Hind III y BamH I
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
CGGTTCGAACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
GCCA AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
CGGTTCGA ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
GCCA GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
CGGTTCGA GGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAG
ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAG
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Hind III BamH I
MCSMulti Cloning Site
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
Hind III BamH I
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Estamos linearizando el vector
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
Hind III BamH I
VECTOR LINEARIZADO
AGCTTG
AC
CCGGG
GGCCCCTAG
INSERTO DIGERIDO CON Hind III y BamH I
Hind III BamH I
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Ahora podemos unir Vector e inserto si ambos fueron digeridos con los mismos enzimas
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
VECTOR LINEARIZADO +AGCTTG
AC
CCGGG
GGCCCCTAG
INSERTO
LIGACIÓN
Ori C
INSERTO
AmpicilinResistencia
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Las Bacterias se transforman con el vector conteniendo el inserto
bacteria
Vector con inserto
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ampicilina
Al añadir el antibiótico solo resistirán y crecerán las bacterias antibiótico-resistentes, que tienen el vector con el gen de resistencia. A esto se le denomina selección.
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Una vez crecidas las bacterias, se lisan y se recoge el vector.
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
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Ahora tenemos “amplificado” el vector con el inserto. Tenemos un gran número de copias del inserto.
Al digerir con los enzimas de restricción adecuados ( Hind III y BamH I ) el vector, se libera un gran número de copias del inserto clonado.
HindIII BamH I
AGCTTG AC
CCGGGGGCCCCTAG
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Características de un vector de Clonaje
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid