LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PERCOBAAN 4

MIKROBIOLOGI: ISOLASI DAN PENANAMAN MIKROBA

SERTA UJI ANTIBAKTERI

Disusun oleh:

Anis Komariah 24030110110022

Aswardi 24030110110066

Fatnawati Nur H 24030110130064

Khanang Eka P 24030110110000

Selfina Riska A 24030110120048

Zulfa Ifary Zain 24030110120000

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

2010

ABSTRAK

Telah dilakukan percobaan yang berjudul “MIKROBIOLOGI: ISOLASI

DAN PENANAMAN MIKROBA SERTA UJI ANTIBAKTERI”, bertujuan untuk

mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang

mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri, menentukan

konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat kemampuan anti bakteri dari

beberapa agen antibakteri. Metode yang digunakan adalah metode spread (Menyebar)

dan metode difusi cakram. Metode sebar atau spread plate merupakan metode

penanaman bakteri yang dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium

agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Sedangkan metode

difusi cakram adalah metode yang untuk uji aktivitas antibakteri yang bahan ujinya

(ekstrak antibakteri) dijenuhkan ke dalam kertas cakram (cakram kertas). Prinsipnya

adalah aktivitas anti bakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Pada

percobaan ini sampel yang digunakan adalah ekstrak bunga bungur, dan

menggunakan kontrol positif berupa alkohol. Dimana zona bening yang terbentuk

pada konsentrasi ekstrak 20% sebesar 1,1 cm ; ekstrak 40% tidak terbentuk ; ekstrak

60% sebesar 1,5 cm ; ekstrak 80% sebesar 1,2 cm : ekstrak 100% sebesar 1,2 cm ;

dan control positif (alkohol) sebesar 1,3 cm. Ekstrak bunga bungur mengandung

senyawa tanin, triterpenoid, protein, dan asam amino yang berperan sebagai

antibakteri dimana mempunyai KHM yang dapat menghambat pertumbuhan

antibakteri E.coli pada konsentrasi 80% dengan diameter 1,5 cm; dan presentasi

KHMnya sebesar 115,38%.

PERCOBAAN 4

MIKROBIOLOGI : ISOLASI DAN PENANAMAN MIKROBA

SERTA UJI ANTIBAKTERI

I. TUJUAN

1.1. Mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam

bidang mikrobiologi.

1.2. Mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri.

1.3. Mengisolasi bakteri untuk mendapatkan biakan murni.

1.4. Menentukan konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat kemampuan

antibakteri dari beberapa agen antibakteri.

II. TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Pengertian Mikrobiologi

Mikrobiologi adalah telah mengenai organisme hidup yang berukuran

mikroskopis. Dunia mikroorganisme terdiri dari 5 kelompok organisme yaitu

bakteri, protozoa, virus serta algae dan cendawan mikroskopis. Dalam bidang

mikrobiologi kita mempelajari banyak segi mengenai jasad-jasad renik ini

dimana adanya ciri-ciri kekerabatan antara sesamanya seperti juga dengan

kelompok organisme lainnya. Pengendalian dan peranannya dalam kesehatan

serta kesejahteraan kita. Mikroorganisme sangat erat kaitannya dengan

kehidupan. Beberapa diantaranya bermanfaat dan yang lainnya merugikan.

Banyak diantaranya menjadi penghuni dalam tubuh manusia. Beberapa

organisme menyebabkan penyakit dan yang lain terlibat dalam kegiatan

manusia seperti pembuatan anggur, keju, yogurt, produksi penicillin serta

proses-proses perlakuan yang berkaitan dengan pembuangan limbah.

(Michael, 1986)

Informasi yang diperoleh dari mikrobiologi memungkinkan kemajuan

besar dalam kemampuan kita untuk mengawasi banyak penyakit menular.

Disamping itu mikroorganisme telah digunakan untuk mempelajari berbagai

proses biokimia yang diketahui terjadi pada bentuk kehidupan yang lebih

tinggi. Jadi banyak fakta tentang metabolisme manusia yang diketahui

sekarang. Mula-mula diketahui terjadi pada mikroorganisme bidang baru

genetika molekuler yang menjelaskan bagaimana gen mengatur aktivitas sel

berasal dari studi tentang mikroorganisme. Oleh karena itu jelaslah bahwa

bidang mikrobiologi bukan hanya studi tentang mikroorganisme penyebab

penyakit tetapi merupakan studi tentang semua aktivitas hayati

mikroorganisme.

(Volk, 1993)

II.2. Identifikasi Sifat-sifat Mikroorganisme

II.2.1. Organisme Eukariot

1. Jamur

Fungsi bersel banyakyang dikenal sebagai jamur jauh lebih kompleks

dari pada khamir. Jamur secara khas berkembang sebagai

pertumbuhan bercabang seperti rambut dan sebagian besar

membentuk spora seksual dan aseksual. Beberapa jamur memberikan

rasa bagi keju yang baik (Roquefort, camembert dan brie). Dilain

pihak sedikit jamur menyebabkan penyakit gawat pada manusia.

2. Protozoa

Protozoa mempunyai bentuk dan ukuran, ada yang lonjong atau

berbentuk bola. ada yang memanjang dan ada yang berubah bentuk.

Sambil bergerak diatas permukaan. Beberapa jenis ada yang

berdiameter 1 sampai 2 mm, sehingga dapat dilihat dengan mata

telanjang. Kebanyakan protozoa dapat berkembang baik secara

seksual maupun aseksual.

(Volk, 1993)

2.2.2. Organisme Prokariot

1. Bakteri

Bersel tunggal, walaupun kadang ada gumpalan bersel banyak.

Bakteri lebih kecil ukurannya dari pada protozoa. Beberapa sel

bakteri yang umum panjangnya kira-kira 1 µm; 2000 bakteri

semacam ini akan mencapai liputan kepala jarum pentul pada titik

terlebar.

Bakteri adalah organisme sangat kecil yang mampu berada dimana

saja. Bakteri kadang menampakkan kehadirannya tetapi seelalu tidak

di sadari karena aktivitasnya yang tidak tampak karena terlalu kecil.

Bakteri dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop.

2. Algae

Dahulu dikenal dengan ganggang biru-hijau, tersebar diseluruh dunia

baik dalam air tawar/ air laut. Memperoleh energi dengan semacam

fotosintesis yang identik dilakukan oleh tumbuhan tingkat tinggi.

Klorofilnya tidak terdapat dalam kloroplas tetapi dalam lamella

disebut blakoid beberapa ganggang biru-hijau yang terbentuk benang

sewaktu-waktu menghasilkan sel yang menebal disebut heterosista.

Fungsi utama heterosista adalah mengubah nitrogen dalam atmosfer

menjadi ammonia dan menyediakan gas N2.

3. Virus

Virus adalah perantara yang terkecil dan dapat mengarahkan

pengadaannya sendiri. Bersifat ultra mikroskopis, terlampau kecil,

dapat dilihat dengan mikriskop cahaya konvensional. Klasifikasi

virus dipisahkan dalam suku berdasarkan bentuknya, ada tidaknya

membran, tipe asam nukleat dalam virion (DNA dan RNA) bentuk

asam nukleat (cabang ganda, benang tunggal, lurus, melingkar) dan

adanya asam nukleat multiple atau dalam virion.

(Volk, 1993)

2.3. Konsepsi Biakan Murni

Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan

campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-

pisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada

media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya

juga memungkinkkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni. Sekelompok

massa sel yang dapat dilihat dengan mata secara langsung. Semua sel dalam

koloni itu sama, dianggap kesemuanya itu merupakan keturunan (progeny) satu

mikroorganisme dan karena itu mewakili apa yang disebut mikrobiologi biakan

murni. Penggunaan agar pada media mikrobiologi yang semula diusulkan oleh

laboratorium Koch pada awal 1880-an tetap digunakan secara luas sampai kini.

(Michael, 1986)

Percobaan Koch dan penelitian di laboratorium membuktikan bahwa

jasad renik tertentu menyebabkan timbulnya penyakit tertentu. Postulat Koch

ialah:

1. Mikroorganisme tertentu selalu dapat dijumpai berasosiasi dengan penyakit

tertentu.

2. Mikroorganisme itu dapat diisolasi dan ditumbuhkan menjadi biakan murni

di laboratorium.

3. Biakan murni mikroorganisme tersebut akan menimbulkan penyakit itu bila

disuntikan pada hewan yang rentan (suseptibet)

4. Penggunaan prosedur laboratorium memungkinkan diperolehnya kembali

mikroorganisme yang disuntikan itu dari hewan yang dengan sengaja

diinfeksi dalam percobaan.

(Michael, 1986)

2.4. Teknik Biakan Murni

Untuk mendapatkan koloni bakteri sebagai sumber biakan murni ada dua

teknik yang dapat dipakai yakni :

2.4.1 Metode piringan goresan (streak-plate method)

Medium agar steril dicairkan, didinginkan 45°C, dituangkan

kedalam cawan petri steril dan dibiarkan menjadi padat, kemudian

dengan kawat penginokulasi yang penuh bakteri. Goresan dilakukan

diatas permukaan agar. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakan

kawat gelang. Kian kemari dari satu bagian ke bagian lain dari cawan

petri, bakteri yang tertinggal pada kawat gelang semakin berkurang. Jika

dilakukan dengan sempurna goresan akhir akan meninggalkan bakteri

individual cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami

pertumbuhan koloni dari bakteri individual akan benar-benar terpisah

satu sama lain, kemudian koloni tunggal dapat dipindahkan ke medium

steril dan tumbuhlah biakan murni.

2.4.2 Metode piringan tuangan (Pour Plate Method)

Metode ini terdiri atas penginokulasi bukan campuran kevdalam

tabung uvi yang mengandung agar mencair yang telah diinginkan

selama 450C. Isinya diaduk untuk memancarkan bakteri ke seluruh

medium. Campuran itu dituangkan kedalam cawan petri kosong dan

medium cair dituangkan diatasnya. Cawan diputar untuk mencampur

isinya sebelum medium menjadi padat.

Pertumbuhan koloni dalam medium. Tujuan kedua prosedur ialah

memisahkan sel-sel bakteri satu sama lain sehingga sel-sel itu tumbuh

menjadi koloni-koloni yang terpisah dari medium yang padat, kemudian

dapat diambil sel-sel dari koloni untuk mendapatkan biakan murni.

Dalam praktek sering piringan kedua digores kembali dengan organism

yang berrasal dari koloni yang diisolasi untuk menjamin bahwa hasil

yang diperoleh adalah biakan murni.

(Volk, 1993)

2.5. Macam-macam Media Biakan

Medium yang padanya bakteri ditumbuhkan akan beranak dalam

susunannya sesuai dengan kebutuhan jenis-jenis yang bersangkutan. Beberapa

bakteri dapat hidup pada medium yang sangat sederhana yang hanya

mengandung garam organik ditambah sumber karbon organik seperti gula.

Bakteri lain memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yang kepadanya

ditambahkan darah atau bahan kompleks lain.

(Volk, 1993)

2.5.1. Media Saringan (Infusion media)

Salah satu media paling lazim yang digunakan untuk memelihara

bakteri sehari-hari disebut air kalolu, dibuat dengan merebus daging

cacah dengan air kemudian menyaring materi padat sehingga diperoleh

cairan jernih yang disebut air saringan pepton, yang merupakan protein

yang mengalami degradasi sebagian ditambahkan air saringan itu

sebagai sumber karbon, nitrogen dan zat anorganik tertentu guna

pertumbuhan bakteri.

(Volk, 1993)

2.5.2. Media Karbohidrat

Berbagai gula (karbohidrat) dapat ditambahkan pada dasar kaldu

yang mengandung makanan. Medium macam ini dipakai untuk

menentukan apakah jenis bakteri yang diidentifikasi itu mampu

menggunakan gula untuk pertumbuhannya. Dalam media jenis ini yang

lazim dipakai adalah gula seperti glukosa, monosa, galaktosa, sukrosa,

maltose dan laktosa. Disamping itu, digunakan pula alkohol-alkohol

gula seperti manitol, gliserol, dan duisitol.

(Volk, 1993)

2.6. Fase-fase pertumbuhan Bakteri

Jika keadaan baik, hampir semua bakteri mampu berkembang biak

dengan amat cepat. Waktu yang diperlukan bagi satu organisme untuk

membelah menjadi dua disebut waktu generasi. Dalam mempelajari laju

pertumbuhan biakan bakteri, hasilnya dapat di proyeksikan sebagai logaritma

jumlah sel terhadap waktu pertumbuhan. Terdapat 4 fasa pertumbuhan, yaitu :

2.6.1. Fasa tenggang (Lag)

Fasa tenggang adalah periode penyesuaian pada lingkungan dan

lamanya dapat 1 jam hingga beberapa hari. Lama waktu ini tergantung

pada macam bakteri, umur biakan dan nutrient yang terdapat dalam

medium yang disediakan. Fasa tenggang ini hanya tenggang dalam

pembiakan saja karena sebenarnya sel itu sangat aktif dalam

metabolisme inklusi dihabiskan. Dan ada sintesis enzim dan konsituen

penting secara aktif. Pada bagian belakang fasa tenggang terjadi

perbesaran ukuran keseluruhan.

(Volk, 1993)

2.6.2. Fasa Logaritma (log)

Fasa ini adalah periode pembiakan yang cepat dan merupakan

periode yang di dalamnya biasanya teramati cirri-ciri khas sel-sel yang

aktif selama fasa inilah waktu generasi tetap tak berubah jenis, jika

dibuat proyeksi logaritma jumlah organisme terhadap waktu, fasa log ini

muncul sebagai garis lurus, jadi waktu generasi dapat ditentukan dalam

fasa ini.

(Volk, 1993)

2.6.3. Fasa Stasioner

Sementara biakan menjadi tua dan mendekati populasi bakteri

maksimum yang ditunjang medium, laju pembiakan berkurang dan

beberapa sel mati. Apabila laju pembiakan sama dengan laju kematian,

jumlah keseluruhan bakteri akan tetap. Hal ini dinamakan fasa stasioner.

(Volk, 1993)

2.6.4. Fasa Kematian

Apabila laju kematian melampaui laju pembiakan, banyaknya

bakteri yang sebenarnya menurun. Fasa kematian ini biasanya

pembiakan berhenti.

(Volk, 1993)

2.7. Mikroorganisme

Sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan

tanaman dan hewan. Mikroorganisme lebih menguntungkan karena

pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh substrat yang murah lebih mudah

ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan pertumbuhan dan rekayasa genetika.

Faktor yang menpengaruhi pertumbuhan bakteri adalah PH optimum dan suhu

yang sesuai untuk menumbuhkan bakteri digunakan suhu inkubasi 37°C.

(Akhdiya, 2003)

2.8. Penanaman mikroba

Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang

baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar

semua alat-alat yang sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi

(penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindarkan kontaminasi.

Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi mikroba adalah sebagai berikut :

1. Menyiapkan ruangan, ruangan tempat inokulasi harus bebas angin dan

bersih.

2. Pemindahan dengan kawat inokulasi, ujung kawat inokulasi sebaiknya dari

platina atau dari nikram, lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan sebelum

mengambil inokulum.

3. Pemindahan dengan pipet.

(Waluyo,2005)

Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor-faktor nutrisi

serta kebutuhan akan oksigen (gas O2 atau udara ). Cara menumbuhkan

mikroba anaerob sangat berbeda dengan aerob. Untuk semuanya itu ada cara-

cara tertentu yang harus diperhatikan. Menanam mikroba yang aerob relatif

lebih mudah daripada yang anaerob.

1. Penanaman mikroba aerob

Ada beberapa cara penanaman mikroba aerob, tergantung pada tujuan

penanaman. Berdasarkan atas bentuk medium dan cara penanaman dapat

dibedakan menjadi :

a. Biakan agak tegak

b. Biakan agak miring

c. Biakan air

2. Penanaman mikroba anaerob

Untuk mikroba anaerob, oksigen dari udara bersifat toksik, karena itu

oksigen harus dikeluarkan dari dalam medium. Ada beberapa cara untuk

menumbuhkan meikroba anaerob, yaitu:

a. Menggunakan metode yang paling sederhana dan paling banyak

digunakan. Medium yang digunakan Chioglycollate-cair, Chioglycollate-

agar, glukosa otak dan lain-lain. Medium-medium tersebut mengandung

bahan-bahan yang dapat menyerap oksigen sehingga dalam suasana

dalam medium menjadi anaerob,misalnya medium Chioglycollate-agar

dalam cawan petri yang ditutup dengan penutup brewer.

b. Menutup oksigen bebas dengan pembakaran.

Alat yang digunakan misalanya eksikator, kedalam eksikator ini

ditambahkan phosphor murni (P4). Selama ada oksigen, fosfor akan

teroksidasi dan membentuk fosforpentaoksida. Untuk mempercepat

peracunana fosfor, maka pada dasar eksikator ditambahkan air yang akan

menyerap atau melarutkan fosfor pentaoksida tersebut.

c. Absorpsi Oksigen secara Kimia

Yang diperlukan adalah eksikator, asam pirogalel dan kolt. Untuk setiap

liter eksikator diberi 12,5 ml larutan KOH 20% dan 10 ml larutan asam

pirogalol 40%.

d. Menggunakan anaerob jari, anaerob pack atau inkubator anaerob.

(Waluyo, 2005)

2.9. Isolasi Bakteri

Mengisolasi suatu mikroba adalah memisahkan mikroba tersebut dari

lingkungan di alam dan menumbuhkanya sebagai biakan murni dalam medium

buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan

mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhan.

(Kingsburg, 1985)

Untuk mengisolasi bakteri dari alam menjadi biakan murni pada

umumnya ada dua cara yaitu:

1. Metode cawan Gores (Streak Plate Method)

Dilakukan dengan cara menggoreskan jarum ose penginokulasian yang

berisi biakan campuran pada permukaan cawan petri steril berisi medium

yang telah padat. Ada beberapa cara yang digunakan namun kesemuanya

meletakkan sebagian besar organisme pada beberapa goresan pertama dan

menyisakan bakteri individual yang cukup terpisah satu sama lain pada

goresan terakhir. Bakteri individual ini yang terpisah tumbuh menjadi koloni

bakteri yang saling terpisahkan antara satu spesies dengan spesies lainnya.

(Volk,1991)

2. Teknik Piringan tuangan (Pour Plate Method)

Dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:

a. Menginokulasikan biakan, campuran ke dalam tabung uji yang

mengandung agar mencair yang telah didinginkan sampai suhu 45°C.

tabung ini diketuk agar bakteri mencapai keseluruhan medium. Isi tabung

uji lalu dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan menjadi padat.

b. Dengan cara Shake Culture (cara penanaman mikroba melalui cara

piaraan adukan), yaitu dengan menuangkan inokulum kedalam cawan

petri kosong lalu ditambahakan medium agar cair ke atasnya dan

campuran ini diputar (wadah cawannya) untuk mencampur isinya

sebelum medium menjadi padat.

(Volk, 1973)

3. Disinfektan

Disinfektan atau yang sering disebut juga larutan sterilisasi dingin

yang dapat merusak mikroorganisme (virus, bakteri, kapang) tetapi tidak

dapat mematikan spora bakteri. Disinfektan ini tidak dapat menggantikkan

sterilisasi autoklaf.

Disinfektan dapat digunakan pada permukaan yang keras (baki, kursi,

meja dsb), alat-alat yang peka terhadap pemanasan seperti plastik, pipa

kapiler sebelum dan sesudah penggunaannya. Disinfektan dalam

penggunaannya harus memperhatikan prosedur yang dianjurkan. Beberapa

disinfektan bersifat toksik dan membutuhkan penanganan yang khusus

dalam pembuangannya.

(Pelczar, 1988)

4. Sterilisasi

Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka medium dan alat-alat yang

diperlukan harus disterilsasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu proses untuk

mematikan semua organisme yang dapat menjadikan kontaminan. Metode

yang lazim digunakan untuk memsterilisasikan media dan alat-alat ialah

dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-bersama dengan uap air

disebut sterilisasi basah (menggunakan autoklaf), sedangkan jika tanpa uap

air disebut Sterilisasai kering (menggunakan oven).

(Pelczar, 1988)

5. Inokulasi Bakteri

Menurut Pelezar dan Chan (1996), ada berbagai cara yang dapat

digunakan untuk penanaman bakteri, antara lain:

a. Pembiakan dengan Lempengan (Plate Culture atau Streak Culture)

Dibuat dengan menggeserkan sengkelit (ose) yang telah terinokulasi oleh

bakteri ke atas cawan Petri berisi media padat sampai meliputi seluruh

permukaan dengan gerakan ke kanan dan ke kiri, sehingga diperoleh

koloni yang menggerombol dan memenal.

(Salle, 1973)

b. Piaraan Agar Miring

Penanaman bakteri dapat dilakukan dengan cara menggerakkan ujung

kawat yang berisi bakteri satu kali dari ujung bawah ke ujung atas,

sehingga garis merupakan diameter memanjang pada permukaan miring

medium.

(Salle, 1973)

c. Piaraan Tusukan (Stab Culture)

Stab culture dibuat dengan cara menumbuhkan ose yang berisi bakteri

dari permukaan atas agar tegak, tegak lurus medium, tengah-tengah

medium. Bakteri yang tumbuh di dalam medium dapat berupa bakteri

yang memakan gelatin medium maupun tidak memakan gelatin medium.

(Salle, 1973)

d. Piaraan Adukan (Shake Culture)

Bakteri dari medium cair atau dari medium padat yang telah

diencerkan sehingga menjadi suspensi, dituangkan ke tengah-tengah

cawan petri kemudian ditambahkan gelatin atau agar-agar yang belum

beku, lalu cawan ditutup dan diputar sehingga suspensi bercampur

dengan medium. Jika bakteri telah tumbuh maka akan berupa koloni-

koloni yang berada pada permukaan medium yang pertama adalah

bakteri anaerob dan yang kedua adalah bakteri aerob.

(Salle, 1973)

2.10. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba

Kehidupan mikroba umumnya sangat dipengaruhi dan tergantung oleh

keadaan lingkungannya. Secara garis besar ada tiga faktor lingkungan yang

mempengaruhi, yaitu:

1. Faktor Fisik, misalnya: suhu, pH, tekanan osmotik, kandungan oksigen, dll.

2. Faktor Kimia, misalnya: senyawa racun.

3. Faktor biolagik, misalnya: interaksi dengan mikroba lainnya.

2.10.1. Faktor fisik

1. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri

Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhannya, mikroba dibagi tiga:

Psikofilik : tumbuh pada kisaran suhu -5˚C – 20˚C

Mesofilik : tumbuh pada kisaran suhu 20˚C – 45˚C

Termofilik : tumbuh di atas suhu 45˚C

2. Pengaruh pH

Setiap jenis mikroba memiliki kemampuan untuk hidup pada rentang

pH yang spesifik. Namun secara umum mikroba dapat tumbuh pada

kisaran pH antara 4–9 dengan pertumbuhan optimum pada pH 6.5–

7.5 selama pertumbuhan mikroba, pH medium akan berubah akibat

produk- produk metabolisme mikroba, yakni asam hasil degradasi

karbohidrat dan basa hasl penguraian protein.

3. Pengaruh Oksigen bebas(O2)

Pada berbagai mikroba sangat bervariasi, hal ini mencerminkan

adanya perbedaan sistem enzim beroksidatif yang terdapat dalam

mikroba tersebut.

Berdasarkan kebutuhan O2, mikroba dapat dikelompokkan menjadi:

Aerob : mikroba yang membutuhkan O2 untuk pertumbuhannya

Anaerob : mikroba yang tidak membutuhkan O2 untuk pertumbuhanya

Fakultatif : mikroba yang dapat tumbuh dengan maupun tanpa adanya O2

Mikroaerofilik : mikroba yang membutuhkan O2 sangat sedikit.

4. Pengaruh Tekanan Osmotik

Medium yang dipergunakan untuk menumbuhkan suatu mikroba

mempunyai persyaratan tertentu, salah satunya adalah medium harus

bersifat isotonis terhadap mikroba. Kondisi medium yang hipertonis

atau hipotonik akan mempengaruhi sel mikroba sehingga

mengganggu pertumbuhan.

2.10.2. Faktor Kimia

Pada prinsipnya mikroba ada yang bersifat menguntungkan

maupun merugikan bagi kehidupan manusia. Beberapa metode

dikembangkan untuk mengendalikan mikroba yang bersifat merugikan

dengan menggunakan agen fisika dan kimia. Metode kimia untuk

mengendalikan pertumbuhan mikroba menggunakan:

1. Antiseptik : senyawa kimia yang digunakan untuk jaringan hidup

untuk menghambat pertumbuhan mikroba.

2. Disinfektan : senyawa kimia yang menghambat pertumbuhan pada

bahan yang tak hidup.

Untuk mengatur pengaruh senyawa kimia terhadap suatu bakteri

dapat dilakukan dengan menggunakan silinder kaca yang diletakkan

diatas medium yang telah diinokulasi dengan bakteri uji.

Penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan

timbulnya daerah bening disekitar cakram uji. Daerah bening

merupakan daerah yang tidak ditumbuhi mikroba. Hal ini terjadi

akibat adanya difusi senyawa kimia ke dalam media akan

menyebabkan penghambatan ukuran daerah bening sangat

dipengaruhi oleh variabel- variable teknis yaitu jumlah inokkulum,

waktu inokulasi, komposisi medium, pH, gas- gas udara, stabilitas

antimikroba, dsb.

3. Faktor Biologis

Beberapa jenis mikroba mampu menghasilkan suatu metabolit yang

dapat bersifat racun bagi mikroba lain, misalnya antibiotik. Pengaruh

terhadap metabolik mikroba terhadap mikroba lain dapat dilakukan

dengan teknik bioassay yang “melawankan” mikroba penghasil

metabolit dengan mikroba lain yang sensitif.

(Guchanan, 1992)

2.11. Kurva Pertumbuhan Jasad renik

Pada gambar diatas ,jika suatu bakteri memperbanyak diri menjadi dua

dalam waktu 20 menit. Bila sel tersebut diingkubasikan pada medium dengan

kondisi optimum untuk pertumbuhanya maka dalam waktu 40 jam sel tersebut

akan mengalami pembelahan sebanyak 48(60)/20 kali atau 144 generasi.

Jumlah sel setelah 40 jam secara teoritis mencapai 2^144 sel. Jika setiap sel

mempunyai berat 10-12 gram, maka secara teoritis berat sel setelah 48 jam akan

mencapai 2^144 X 10-12 gram atau 2.2 X 1031 gram , atau sama dengan 4000

kali berat bumi. Pada kenyataanya tidaklah demikian keadaanya, karena tidak

semua sel yang terbentuk terus hidup.

(Waluyo,2005)

2.12. Bakteri

Bakteri merupakan organism bersel tunggal tanpa klorofil, memiliki DNA

dan RNA, mampu menunjukkan proses dasar kehidupan misalnya tumbuh,

melakukan metabolism dan berkembang biak.

Berdasarkan komposisi selnya, bakteri dibedakan menjadi bakteri gram

positif dan bakteri gram negative bakteri gram positif cenderung lebih sensitive

terhadap komponen anti bakteri untuk masuk kedalam sel dan menemukan

sasaran untuk bekerja, sedangkan susunan struktur dinding bakteri gram

negative lebih kompleks dan berlapis tiga, yaitu lapisan luar yang berupa

lipoprotein, lapisan tengah yang berupa peptidoglikan dan lapisan dalam

lipopolisakarida.

(Chan, 1988)

2.13. Antibakteri

Substansi antibakteri atau mikroba merupakan suatu substansi yang

mempunyai pengaruh merusak atau mengganggu mikroorganisme. Substansi

antimikroba dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan daya kerjanya terdapat

bateriostatik dan bakteriosidik. Bakteriostatik merupakan zat yang hanya

menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan bakteriosidik merupakan zat

yang dapat mematikan bakteri.

(Chan, 1988)

Substansi antibakteri berpengaruh terhadap sel dengan mekanisme:

1. Menghambat sintesis dinding sel

Kerusakan terhadap dinding sel akibat terhambat pembentukannya

dapat mengakibatkan kepekaan antara bakteri gram positif dan gram

negative terhadap zat bakteri berbada dimana kepekaan ini bergantung pada

perbedaan susunan dinding sel.

2. Menghambat fungsi membrane sel

Sitoplasma merupakan pengendali susunan dalam sel. Adanya zat

antibakteri akan mengganggu integritas fungsi membrane sitoplasma yang

dapat menimbulkan kerusakan atau kematian sel.

3. Menghambat kerja enzim

Zat antibakteri mampu menggangu reaksi biomolekul yang

menyebabkan terganggunya metabolisme.

(Chan, 1988)

2.14. Uji Antibakteri

Pengukuran aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan beberapa metode

yaitu metode difusi dan metode pengenceran. Salah satu metode yang paling

umum digunakan adalah metode difusi.

Metode difusi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:

1. Metode silinder

Silinder steril dengan diameter 8 mm. ditetesi larutan uji dan ditempatkan

pada permukaan agar yang telah ditanami bakteri, daerah lambat yang

terbentuk terlihat sebagai daerah bening disekeliling silinder

2. Metode difusi cakram

Sejumlah mikroba uji difokuskan pada media agar dan cakram yang

mengandung larutan uji atau antibakteri tertentu diletakkan pada permukaan

media agar yang telah memadai setelah diinkubasi terlihat daerah hambatan

sebagai daerah bening yang tidak ditumbuhi. Mikroba dikelilingi cakram.

3. Senyawa Antibakteri dan Spektrum Aktivitasnya

Senyawa antibakteri merupakan suatu senyawa kimia yang mampu

membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri, dan berasal dari

mikroba, tumbuhan, atau disintesis secara kimiawi. Berdasarkan aktivitas

antibakterinya, maka senyawa antibakteri dapat dikelompokkan menjadi 2

kelompok, yaitu bakteriostatik dan bakteriosidal.

(Chan, 1988)

2.15. Spektrum aktivitas antibakteri

Spektrum aktivitas antibakteri dibagi menjadi dua macam :

a. Spektrum Luas (Brodd Spectrum)

Senyawa antibakteri memiliki aktivitas antibakteri yang aktif terhadap

berbagai jenis mikroba.

b. Spektrum Tak Luas (Narrow Spectrum)

Senyawa antibakteri hanya aktif terhadap satu atau beberapa jenis mikroba.

(Levinson, 2004)

2.16. Bakteri Eschericia coli

Bakteri E. Coli berbentuk batang pendek berukuran 1,1 sampai 1,4

mikrometer, gram negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora, katalase positif,

terdapat dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Koloni pada media agar

nutrien umumnya agak cembung, halus, permukaan licin, dan berwarna abu –

abu. Beberapa galus memiliki kapsul.

(Orskov, 1987)

2.16.1. Regenerasi E. Coli

Dari stock E. Coli diambil satu masa ose dan diinokulasikan ke

erlenmeyer yang berisi 40 ml media nutrienth broth (NB) steril.

Selanjutnya tabung tersebut diinkubasi ke dalam inkubator bergoyang

(shater) selama 24 jam pada suhu 37oC.

(Hidayanti, 2004)

2.16.2. Pengujian Antibakteri

Ekstrak sampel diuji konsentrasi berbeda (0%, 20%, 40%, 60%,

80%, 100%) terhadap pertumbuhan bakteri E. Coli. Biakan bakteri E.

Coli yang akan diuji dengan cara mencelupkan cakram kertas saring

berdiameter 0,5 cm. Kemudian cakram basah tersebut diletakkan di

atas media petridish yang sebelumnya sudah diinokulasikan bakteri E.

Coli dengan metode sebar. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC

selama 24 jam. Zona terbentuk di sekeliling cakram kertas diukur

diameter rata – ratanya menggunakan penggaris.

(Hidayanti, 2004)

2.17. Antibiotik

Antibiotik adalah zat yang membunuh atau menghambat pertumbuhan

bakteri. Ada banyak cara menggolongkan antibiotik, salah satunya adalah

berdasarkan struktur kimianya. Berdasarkan struktur kimianya, antibiotik

dikelompokkan sebagai berikut :

a. Golongan aminoglicosida

Diantaranya, amikasin, dibekasin, gentamisin, kanamisin.

b. Golongan betalactam

Diantaranya golongan karbapenem (ertapenem, imipenem), golongan

sepalosporim (sepalepsim, sepazolim), golongan betalactam mono siplic,

dan golongan penisilin.

Antibiotik yang lain yang penting seperti asam fusidat, berdasarkan

mekanisme aksinya, yaitu mekanisme bagaimana antibiotik secara selektif

meracuni sel bakteri.

(Anonim, 2008)

2.18. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu metode empiris

untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif

dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan sifat fisik dinding sel mereka.

Untuk mempelajari sel – sel makhluk hidup lainnya menggunakan mikroskop,

bahan yang aka diperiksa terlebih dahulu dinamai dengan suatu metode

pewarnaan gram. Metode pewarnaan gram memberi hasil ada dua kelompok

bakteri. Bakteri – bakteri pada pewarnaan gram tampak berwarna biru disebut

gram positif dan bakteri yang nampak berwarna kemerahan disebut gram

negatif.

(Anonim, 2008)

2.19. Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM)

Konsentrasi hambatan minimum adalah konsentrasi terendah dari sebuah

antimicrobial yang akan menghambat pertumbuhan yang tampak dari sebuah

mikroorganisme setelah diinkubasi semalaman, konsentrasi hambatan minimum

sangat penting dalam diagnosis laboratorium untuk mengkonfirmasi ulang

resistensi dari mikroorganisme pada agen microbial antibacterial dan untuk

memantau aktivitas agen anti microbial.

(Anonim, 2008)

2.20. Analisa bahan

2.20.1. Agar

Ekstrak dari sejenis rumput laut merat yang digunakan sebagai

bahan pembuat gel (gelling agent) dalam media biakan

mikroorganisme, makanan, obat-obatan dank krim kosmetik serta jelli.

Agar nutrient terdiri dari kalau yang terbuat dari ekstrak daging, darah

sapi, yang menjadi gel bersama agar kemudian digunakan untuk

membiakan bakteri, jamur, dan beberapa alya.

(Daintith, 1994)

2.20.2. Bakteri

Berbentuk batang pendek, berukuran 1,1 – 1,4 mikrometer, gram

negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora, katalase positif, terdapat

dalam bentuk tunggal atau berpasangan.

(Orskov, 1997)

2.20.3. Pepton

Fragmen belgar yang dihasilkan pada awal proses hirolisis protein,

pencemaran bahan protein dicapai dengan asam atau enzim, sumber

utama nitrogen organik.

(Chan, 1988)

2.20.4 Ragi (Ekstrak yeast)

Jamur bersel 1 yang tersebar luas; sebagian besar masuk

ascomycorina; berkembang biak dengan proses pertunasan; digunakan

untuk industry pembuatan minuman beralkohol dan roti; juga

digunakan secara komersial sebagai sumber protein dan vitamin;

sebagai inang pada beberapa tekhnik bioteknologi untuk pengklonan

DNA.

(Abercrombie, 1997)

2.20.5 Aquadest

Air murni dari penyulingan; titik didih 1000C; titik bekunya 00C;

rumus molekul H2O; tidak berwarna (bening); tidak berasa; tidak

berbau; biasanya sebagai pelarut.

(Amiruddin, 1993)

2.20.6 NaCl

Padatan Kristal tanpa warna; larut dalam air dan sedikit larut

dalam etanol; titik didih 14130C; sebagai bahan pengawet dan bumbu

masakan.

(Daintith, 1994)

2.20.7 Alkohol

Dibuat melalui fermentasi gula, larutan tidak berwarna, c : 0,6

gr/ml, titik didih : -102oC, titik leleh : -169oC.

(Basri, 1996)

III. METODE PERCOBAAN

III.1. Alat dan Bahan

III.1.1. Alat

1. Cawan petri steril 9. Kompor listrik

2. Tabung reaksi 10 ml 10. Tutup kapas

3. Erlenmeyer 100 ml 11. Kertas coklat

4. Autoklaf 12. Benang kasur

5. Inkubator 13. Pengaduk

6. Jarum Ose 14. Mixer

7. Alumunium foil 15. Plastik

8. Penangas air

III.1.2. Bahan

1. Ekstrak ragi

2. Pepton

3. NaCl

4. Bubuk agar

5. Akuadest

6. Bakteri E. Coli

III.2. Skema Kerja

III.2.1. Pembuatan Medium Nutrien Broth

Penambahan 50 ml aquadest

Pengadukan

Pensterilan dengan autoklaf selama 20 menit

Pendinginan

III.2.2. Regenerasi bakteri E. Coli

Pengambilan satu mata ose stok biakan E. Coli

Penginkubasian selama 24 jam pada suhu 37oC

0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g NaClErlenmeyer

Hasil

50 ml biakan nutrien broth

Erlenmeyer

Hasil

III.2.3. Pembuatan media nutrien agar

Penambahan 50 ml aquadest

Pengadukan

Pensterilan dengan autoklaf

Pendinginan hingga 50oC

Penuangan secara aseptik ke dalam

petridish

Pendiaman hingga memadat

0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g Erlenmeyer

Hasil

III.2.4. Pengujian antibakteri

Variasi konsentrasi (20%, 40%, 60%, 80%,

100%)

Alkohol 70% 4ml sebagai kontrol positif

Pengambilan 20 mml bakteri E. Coli dari media

broth dengan pipet mikro secara aseptik.

Penyemprotan bakteri E. Coli ke dalam

permukaan medium agar dalam petridish.

Penyebaran bakteri menggunakan spreadtor

Pencelupan cakram kertas saring (diameter 0,5

cm) ke masing masing sampel.

Peletakkan cakram ke permukaan media agar

dan diberi label.

Penginkubasian selama 24 jam pada suhu 37oC

Pengamatan dan analisis data

Ekstrak sampel bunga bungur

Botol vial

Medium agar dalam petridish

Hasil

IV. DATA PENGAMATAN

No. Perlakuan Hasil

1. Pembuatan Media Nutrien Broth

- 0,5g ragi + 0,25g pepton + 0,25g NaCl dalam

erlenmeyer

- Penambahan 50 ml aquadest

- Pengadukan

- Pensterilan dengan autoklaf

- Pendinginan

Larutan berwarna kuning

jernih

2. Regenerasi Bakteri E.Coli

- 50 ml biakan notrien broth dalam Erlenmeyer

- Pengambilan satu mata ose stok biakan E.Coli

- Pengingkubasian selama 24 jam, suhu 37 0 C

Larutan berubah menjadi

kuning keruh yang

menunjukkan adanya

pertumbuhan bakteri E.coli

3. Pembuatan Media Nutrien Agar

- 0,5g ragi + 0,75g pepton + 0,75g NaCl + 2,25g bubuk

agar dalam Erlenmeyer

- Penambahan 50 ml aquadest

- Pengadukan

- Pensterilan dengan autoklaf

- Pendinginan hingga 50 0C

- Tuangkan secara aseptik kedalam petri dish

- Diamkan hingga memadat

Terbentuk medium nutrien

agar yang memadat berwarna

kuning jernih

4. Pengujian Antibakteri

- Pembuatan ektrak sampel bunga bungur dengan

konsentrasi berbeda (20% ,40% ,60%, 80%, 100%)

- Mencelupkan 5 kertas cakram dalam ekstrak sampel

untuk masing-masing konsentrasi

- Meletakkan kertas cakram diatas media nutrien agar

petridish yang sebelumnya sudah diinokulasi bakteri

E.coli dengan metode sebar (spread)

- Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC

- Pengamatan

Terbentuk zona bening pada

masing-masing cakram.

5. Analisis Data

- Konsentrasi 20%

- Konsentrasi 40%

- Konsentrasi 60%

- Konsentrasi 80%

- Konsentrasi 100%

- Kontrol (alkohol)

Diameter

- 1,1 cm

- tidak terbentuk

- 1,5 cm

- 1,2 cm

- 1,2 cm

- 1,3 cm

IV. HIPOTESA

Akan dilakukan percobaan yang berjudul “Mikrobiologi: Isolasi dan

Penanaman Bakteri Serta Uji Antibakteri”, bertujuan untuk membuat berbagai

macam medium yang digunakan dalam bidang mikrobiologi, mengenal dan

melakukan teknik penanaman bakteri, mengisolasi bakteri untuk mendapatkan biakan

murni, dan menentukan konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat

kemampuan antibakteri dari beberapa agen antibakteri. Prinsip yang mendasari

adalah aktivitas antibakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Metode

yang digunakan dalam percobaan ini yaitu metode spread (sebar) dan metode difusi

cakram. Teknik percobaan penanaman bakteri menggunakan media biakan yaitu

medium nutrien cair dan medium nutrien agar, kemungkinan yang terjadi bakteri

akan lebih mudah diamati pada medium nutrien agar karena agar merupakan media

padat. Berdasarkan data, akan diketahui perbandingan diameter rata – rata dari zona

bening yang terbentuk pada hasil percobaan dengan variasi konsentrasi ekstrak

sampel. Penentuan konsentrasi hambatan minimum dari ekstrak sampel diukur

berdasarkan diameter terbesar dari zona bening yang terbentuk.

VI. PEMBAHASAN

Percobaan yang berjudul “MIKROBIOLOGI: ISOLASI DAN

PENANAMAN MIKROBA SERTA UJI ANTIBAKTERI” bertujuan untuk

mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang

mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri, menentukan

konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat kemampuan anti bakteri dari

beberapa agen antibakteri. Metode yang digunakan adalah metode spread (Menyebar)

dan metode difusi cakram. Metode sebar atau spread plate merupakan metode

penanaman bakteri yang dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium

agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Dengan ini

diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni

tunggal. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat trsebar

merata pada bagian permukaan media agar (Ghoni, 2012). Sedangkan metode difusi

cakram adalah metode yang untuk uji aktivitas antibakteri yang bahan ujinya (ekstrak

antibakteri) dijenuhkan ke dalam kertas cakram (cakram kertas). Prinsipnya adalah

aktivitas anti bakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri tertentu.

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat

yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan

mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan

kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme

dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung

garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan

mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu

berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk, dan

Wheeler,1993).

Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang

merupakan substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air.

Nutrien ini adalah degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien

dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air,

karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh (Label, 2008).

Untuk menelaah bakteri di dalam laboratorium , pertama- tama kita harus

dapat menumbuhkan bakteri tersebut di dalam suatu biakan murni. Untuk

melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis nutrient yang disyartakan oleh bakteri

dan juga macam lingkungan fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi yang

optimum bagi pertumbuhannya tersebut (Pelczar, 1986).

Pada percobaan ini, sebelum dilakukan pengujian antibakteri, dilakukan

beberapa perlakuan terlebih dahulu, diantaranya:

6.1 Pembuatan Medium Nutrient Cair (Broth)

Tujuan percobaan ini adalah sebagai tempat atau media untuk

menumbuhkan bakteri E.Coli yang di dalamnya terdapat nutrisi yang

memenuhi kebutuhan perkembangbiakan bakteri tersebut. Pada pembuatan

medium nutrient cair digunakan nutrien-nutrien berupa ekstrak ragi, pepton,

dan NaCl. Ekstrak ragi digunakan karena ekstrak ragi mengandung natrium

karbinat dan natrium bikarbonat yang berfungsi sebagai sumber karbon

(Tarigan, 1988 ). Ragi disini juga berfungsi sebagai sumber makanan bagi

bakteri. Hal ini karena sejumlah mikroorganisme membutuhkan sejumlah

karbon dalam bentuk karbondioksida tetapi kebanyakan diantaranya juga

membutuhkan beberapa senyawa karbon organik, seperti gula, dan karbohidrat

(Waluyo, 2005 ). Pepton juga berfungsi sebagai protein karena pepton

merupakan senyawa organic dalam bentuk asam-asam amino yang merupakan

sumber nitrogen (N), yang penting bagi pertumbuhan bagi bakteri (Waluyo,

2005 ). NaCl berfungsi sebagai sumber ion logam Natrium karena semua

organisme hidup membutuhkan beberapa unsure logam seperti natrium, kalium,

magnesium, mangan, besi, tembaga, dan kobalt. Berbagai sumber tersebut

digunakan untuk pertumbuhan yang normal, tidak terkecuali kuman (Waluyo,

2005). Ketiganya merupakan nutrien-nutien atau unsur hara yang diperlukan

bakteri agar dapat tumbuh dengan baik. Ketiga nutrien ini lalu dicampur dengan

akuades didalam erlenmeyer yang berfungsi sebagai pelarut.

Medium nutrien cair (broth) ini kemudian disterilkan dengan dimasukkan

kedalam autoklaf. Sebelum medium-medium tersebut dimasukkan kedalam

autoklaf, erlenmeyer yang berisi bahan untuk nutrien cair tersebut harus

tertutupi dengan aluminium foil untuk mencegah kontaminasi dari udara luar,

kemudian dibungkus juga dengan plastik. Hal ini dimaksudkan agar erlenmeyer

tidak basah karena terkena uap air dari autoklaf karena erlenmeyer harus berada

dalam kondisi tetap kering dan steril.

Sterilisasi dilakukan dengan memanaskan seluruh alat, seperti cawan

petri, ose, tabung reaksi, dll di dalam autoklaf. Hal ini dilakukan agar sel-sel

vegetatif bakteri mati, sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi.

Autoklaf merupakan alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan

uap air. Autoklaf memiliki suatu ruangan yang dapat menahan tekanan diatas 1

atm. Dalam autoklaf, yang mensterilkan adalah panas basah, bukan pada

tekanannya. Oleh karena itu, setelah air di dalam tangki mendidih dan mulai

terbentuk uap air maka uap air ini akan mengalir keruangan pensterilan guna

mendesak keluar semua udara di dalamnya. Bila masih ada udara yang tersisa,

maka udara ini akan menambah tekanan didalam ruangan pensteril yang akan

mengganggu naiknya suhu dalam ruangan tersebut (Waluyo, 2005 ).

Medium tempat penginokulasian bakteri memiliki fungsi masing-masing.

Medium cair ini digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Medium agar

digunakan untuk memperoleh biakan murni dan medium agar miring digunakan

untuk menyimpan (stock) bakteri untuk digunakan lagi di lain waktu.

Setelah pengautoklafan, didapatkan hasil cairan kuning bening berupa

medium nutrien broth/ cair didalam Erlenmeyer.

6.2 Regenerasi Bakteri E.coli

Tujuan pada percobaan ini adalah untuk mengaktifkan kembali bakteri

E.coli yang inaktif karena penyimpanan dalam suhu dingin dan mengembang

biakan bakteri E.coli. Dilakukan dengan pengambilan stok biakan E.coli

dengan jarum ose dan diinokulasi ke erlenmeyer yang telah berisi medium

nutrient broth (NB) steril. Pada saat diinokulasi semua alat maupun media yang

digunakan harus steril, dikarenakan agar tidak terkontaminasi dengan unsur-

unsur lain ataupun mikroorganisme lain yang nantinya akan mempengaruhi

perkembangbiakan bakteri E.coli. Pensterilan ini dilakukan didalam inkas

dengan cara membakar ujung jarum ose yang digunakan untuk mengambil

bakteri E.coli dan menanamnya di medium Nutrient Broth yang terdapat

erlenmeyer, dimana erlenmeyer ini ujung mulut erlenmeyer juga dibakar agar

steril. Setelah itu medium nutrient cair yang telah ditanam bakteri E.coli di

inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC dalam inkubator. Hal ini dikarenakan

agar E.coli tumbuh dan berkembang biak dimana E.coli mengalami fasa

tenggang (lag).

Fasa tenggang (lag) merupakan fasa penyesuaian pada lingkungan dan

lamanya dapat 1 jam hingga beberapa hari. Lama waktu ini tergantung pada

macam bakteri, umur biakan dan nutrient yang terdapat dalam medium yang

disediakan. Fasa tenggang ini hanya tenggang dalam pembiakan saja karena

sebenarnya sel itu sangat aktif dalam metabolisme inklusi dihabiskan. Dan ada

sintesis enzim dan konsituen penting secara aktif. Pada bagian belakang fasa

tenggang terjadi perbesaran ukuran keseluruhan (Volk, 1993).

Proses inokulasi dilakukan pada suhu 37oC , karena suhu yang sesuai

untuk menumbuhkan bakteri E.coli digunakan suhu inkubasi yaitu 37°C

(Akhdiya, 2003).

Inkubator merupakan alat dimana proses inkubasi dilakukan.

Peninkubasian adalah proses memelihara kultur bakteri pada suhu tertentu

dalam jangka waktu tertentu untuk memantau pertumbuhan bakteri.

6.3. Pembuatan Medium Nutrient Agar (padat)

Tujuan dilakukan percobaan ini adalah sebagai media untuk melakukan

uji antibakteri. Media agar ini dibuat dengan menggunakan pepton, ekstrak ragi,

NaCl, dan bubuk agar. Semua bahan dicampur dalam erlenmeyer dan dilarutkan

dengan aquades agar bahan-bahan tersebut menjadi larutan yang homogen.

Ekstrak ragi digunakan karena ekstrak ragi mengandung natrium karbinat

dan natrium bikarbonat yang berfungsi sebagai sumber karbon (Tarigan, 1988).

Ekstrak ragi disini juga berfungsi sebagai sumber makanan bagi bakteri. Hal

ini karena sejumlah mikroorganisme membutuhkan sejumlah karbon dalam

bentuk karbondioksida tetapi kebanyakan diantaranya juga membutuhkan

beberapa senyawa karbon organik, seperti gula, dan karbohidrat (Waluyo,

2005). Pepton juga berfungsi sebagai protein karena pepton merupakan

senyawa organic dalam bentuk asam-asam amino yang merupakan sumber

nitrogen (N), yang penting bagi pertumbuhan bagi bakteri (Waluyo, 2005).

NaCl berfungsi sebagai sumber ion logam Natrium karena semua organisme

hidup membutuhkan beberapa unsure logam seperti natrium, kalium,

magnesium, mangan, besi, tembaga, dan kobalt. Berbagai sumber tersebut

digunakan untuk pertumbuhan yang normal, tidak terkecuali kuman (Waluyo,

2005). Ketiganya merupakan nutrien-nutien atau unsur hara yang diperlukan

bakteri agar dapat tumbuh dengan baik. Sedangkan penambahan bubuk agar

yang berasal dari alga berfungsi sebagai bahan pemadat media.

Setelah larutan homogen, kemudian larutan dan alat-alat lainnya seperti

petridish, trigalski, ujung pipet volume, kertas cakram dan lain-lain di sterilkan

menggunakan autoklaf. Hal ini dilakukan agar sel-sel vegetatif bakteri mati,

sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi. Ketika di autoklaf, alat-alat

atau media di dibalut dengan aluminium foil dan dibungkus dengan plastik.

Hal ini bertujuan agar media tidak basah dan tidak mengkontaminasi medim

yang telah dibuat.

Setelah itu medium di diamkan sebentar sampai hangat, kemudian

dituang ke dalam petridish. Hal ini dikarenakan agar penuangan tidak terlalu

panas dan tidak memadat jika dalam keadaan dingin. Penuangan dilakukan

didalam inkas, agar terhindar dari bakteri atau unsur-unsur lain yang tidak

diinginkan. Lalu medium dibiarkan memadat didalam inkas, hal ini untuk

memudahkan penanaman bakteri dan pengujian antibakteri dalam medium agar

(padat).

6.4 Pengujian Antibakteri

Tujuan dari pecobaan ini adalah untuk mengetahui tingkat kemampuan

antibakteri yang berasal dari ekstrak bunga bungur terhadap bakteri E.coli.

Dalam percobaan ini terlebih dahulu dipersiapkan zat antibakteri yang

berasal dari sampel bunga bungur. Digunakan tanaman bungur karena

mengandung zat aktif utama meliputi senyawa tanin, triterpenoid, protein, dan

asam amino (Ambujakshi, 2009).

Tanin merupakan salah satu jenis senyawa yang termasuk ke dalam

golongan polifenol. Senyawa tanin ini banyak di jumpai pada tumbuhan. Tanin

dapat mengikat alkaloid dan glatin. Tanin secara umum didefinisikan sebagai

senyawa polifenol yang memiliki berat molekul cukup tinggi (lebih dari 1000)

dan dapat membentuk kompleks dengan protein. Tanin memiliki peranan

biologis yang kompleks. Hal ini dikarenakan sifat tannin yang sangat kompleks

mulai dari pengendapan protein hingga pengkhelat logam. Tanin juga dapat

berfungs isebagai antioksidan biologis.

Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam

satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C-30 asiklik,

yaitu skualena, senyawa ini tidak berwarna, berbentuk kristal, bertitik leleh

tinggi dan bersifat optis aktif (Harborne,1987).

Gambar Struktur Triterpenoid (Joseph, 2008)

Bunga bungur diambil ekstraknya dengan cara ditumbuk untuk

penghomogenasian dengan memecah sel – sel bunga bungur. Ekstrak yang

telah diperoleh dibuat variasi konsentrasi sebesar 20%, 40%, 60%, 80%, dan

100%. Variasi konsentrasi ini bertujuan untuk mengetahui Konsentrasi

Hambatan Minimum (KHM) ekstrak bunga bungur terhadap pertumbuhan

bakteri E. Coli. Konsentrasi hambatan minimum adalah konsentrasi terendah

dari sebuah antimikrobial yang akan menghambat pertumbuhan yang tampak

dari sebuah mikroorganisme. Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM) sangat

penting dalam diagnosis laboratorium untuk mengonfirmasi ulang resistansi

dari mikroorganisme pada agen mikroba antibakterial dan untuk memantau

aktivitas agen anti mikrobial (Anonim, 2008). Kontrol positif yang digunakan

pada percobaan ini adalah alkohol 70%. Kontrol ini berfungsi sebagai

pembanding senyawa antibakteri yang sesuai dalam menghambat pertumbuhan

E. Coli karena alkohol merupakan senyawa antibiotik yang dapat membunuh

atau menghambat pertumbuhan bakteri.

Sebelum dilakukan pengujian anti bakteri, terlebih dahulu dilakukan

penanaman bakteri E.coli dengan metode spread (sebar). Metode sebar atau

spread plate merupakan metode penanaman bakteri yang dilakukan dengan

menyemprotkan suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya

secara merata dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara

individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal. Kelebihan teknik

ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian

permukaan media agar.

Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram kertas.

Kertas cakram secara steril dicelupkan pada zat antibiotik dengan variasi

konsentrasi yang telah dibuat, lalu diletakkan pada petridish yang berisi media

nutrient agar yang telah ditanami bakteri E. Coli dengan metode spread (sebar).

Kontrol positif (alkohol 70%) juga dicelupkan cakram kertas dan

kemudian diletakkan di tengah – tengah permukaan media agar dengan tujuan

untuk mempermudah proses pembandingan hasilnya. Petridish diletakkan

dalam inkubator guna untuk proses inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.

Proses inkubasi ini bertujuan agar bakteri dapat berkembang biak. Petridish

diletakkan secara terbalik dengan tujuan untuk mencegah terjadinya tetesan air

pada permukaan agar dari hasil kondensasi. Hasil positif yang diperoleh yaitu

tebentuk lapisan bening pada bagian luar kertas cakram yang merupakan zona

antibakteri.

Dari data hasil percobaan menunjukkan terbentuknya daerah (zona)

bening di sekitar cakram. Pada konsentrasi KHM ekstrak bunga bungur 60%

menghasilkan zona bening dengan diameter 1,5 cm, yang merupakan diameter

terbesar dari konsentrasi KHM yang lain. Ekstrak bunga bungur dengan

konsentrasi 20%, 40%, 80%, dan 100% menghasilkan zona bening dengan

diameter 1,1; tidak terbentuk; 1,2; dan 1,2 cm. Kontrol positif (alkohol 70%)

menghasilkan zona bening dengan diameter 1,3 cm. Adanya zona bening pada

agen bakteri tersebut menunjukkan bahwa agen bakteri tersebut mengandung

senyawa yang dapat bertindak sebagai antibakteri, seperti tanin dan triterpenoid

(Ambujakshi, 2009).

Dari data di atas pada %KHM ekstrak bunga bungur didapatkan hasil

115,38%. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak bunga bungur ini mempunyai

kandungan senyawa antibakteri yang lebih baik dari kontrol positif (alkohol

70%).

6.5 Analisis Data

Untuk menganalisis data hasil percobaan dilakukan dengan membandingkan

diameter rata-rata dari zona bening yang terbentuk pada hasil percobaan dengan variasi

konsentrasi ekstrak sampel (20% ,40% ,60%, 80%, 100%). Penentuan Konsentrasi

Hambat Minimum (KHM) dari ekstrak sampel diukur berdasarkan konsentrasi

terkecil ekstrak sampel yang mampu menghambat secara signifikan

pertumbuhan bakteri E.coli . Hal ini dapat ditentukan berdasarkan terbentuknya

zona bening yang nyata (viable) pada konsentrasi ekstrak terkeceil tersebut.

Untuk menentukan tingkat kemampuan antibakteri, dilakukan dengan

membandingkan diameter rata-rata zona bening dari ekstrak sampel dengan

antibiotik.

Pada percobaan ini sampel yang digunakan adalah ekstrak bunga bungur,

dan menggunakan kontrol positif berupa alcohol. Dimana zona bening yang

terbentuk pada konsentrasi ekstrak 20% sebesar 1,1 cm ; ekstrak 40% tidak

terbentuk ; ekstrak 60% sebesar 1,5 cm ; ekstrak 80% sebesar 1,2 cm : ekstrak

100% sebesar 1,2 cm ; dan control positif (alcohol) sebesar 1,3 cm.

VII. Penutup

7.1. Kesimpulan

7.1.1. Percobaan isolasi dan penanaman bakteri E.coli dapat digunakan dengan

menggunakan medium Nutrient Broth dan medium Nutrient Agar dengan

metode spread (sebar).

7.1. 2. Pengujian antibakteri dapat dilakukan dengan menggunakan metode difusi

cakram.

7.1.3. Ekstrak bunga bungur mengandung senyawa tanin, triterpenoid, protein,

dan asam amino yang berperan sebagai antibakteri dimana mempunyai KHM

yang dapat menghambat pertumbuhan antibakteri E.coli pada konsentrasi 80%

dengan diameter 1,5 cm; dan presentasi KHMnya sebesar 115,38%.

7.2 Saran

7.2.1. Perhatikan langkah kerja dengan baik dan teliti.

7.2.2. Sebaiknya mengetahui tujuan dari masing-masing bahan yang digunakan.

7.2.3. Sebaiknya alat yang akan digunakan sebelum dan sesudah percobaan

diautoklaf terlebih dahulu.

DAFTAR PUSTAKA

Anantharayan dan R.P. Jayaran.1979. ”Textbook of Microbiology”.Bombay Calcuta :

New Delhi

Arsyad, M.2001.”Kamus Kimia”.Gramedia : Jakarta

Basri, Sarjoni.1996.”Kamus Kimia”. Rineka Cipta : Jakarta

Burrows, W. 1961.”Textbook of Microbiology”. WB Soundeng Company:

Phyladelphhia

Daintith, John.1994.”Kamus Lengkap Kimia”. Erlangga : Jakarta

Ghoni, Achmad, 2012, “Isolasi dan Inokulasi Bakteri”, dalam

http://www.achmadghoni.com/2012/05/isolasi-dan-inokulasi-bakteri.html.,

diakses 27 Desember 2012

Guchanon, E.R dan E.N Gibsons.1992.”Bergeys Manual of Deteminate

Bacteriology,8 th Edition” . The Willians and Wilkins Company : New York

Handoko, Sriani.2000. “ Mikrobiology Dasar “. Universitas Diponegoro : Semarang

Joseph D. Connolly and Robert A. Hill,  Nat. Prod. Rep., 2008, 25, 794, dalam situs

http://www.rsc.org/Publishing/Journals/NP/article.asp?

Type=Issue&Journalcode=NP&Issue=4&SubYear=2008&Volume=25&GA=o

n, diakses 27 Desember 2012

Kingsburd, Dtetal.1985.” Microbiology “. John Willey & Sons : New York

Mulyono.2005.” Kamus Kimia”. Ganessa Siratama: Bandung

Pelezar, J.M and E.C.S. Chan.1996.” Dasar-dasar Mikrobiology”. UI Press : Jakarta

Pudjaatmaka, Hadyana.2002.”Kamus Kimia”. Balai Pustaka : Jakarta

Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Penerjemah: Kosasih

Padmawinata. Bandung: ITB

Salle,A.J.1973. “Fundamental Principle of Bacteriology”. Mc Graw Hills : USA

Sutedjo, M. 1996. “Mikrobiology Tanah”. Rineka Cipta: Jakarta

Volk, W.A.1991. “Microboilogy Dasar alih bahasa”. Erlangga : Jakarta

Waluyo, L. 2004. “Microbology Umum”. UMM Press : Malang

Lampiran Perhitungan

Menghitung KHM ekstrak bunga bungur sebagai sampel antibakteri dalam menghambat

aktivitas bakteri.

KHM sampel Lagerstromeia yaitu:

= 115,38 %