Klonlanan Genin Anlatimi V

8/3/2019 Klonlanan Genin Anlatimi V

1/32

KLONLANAN GENLERN YABANCI

KONAKTA ANLATIMI

(REKOMBNANT PROTEN RETM)


2/32

(1) Klonlanan genin ilevsel analizinin yaplabilmesinden koul

genin iine sokulduu konakta baarl anlatmyapabilmesi

(2) Klonlanan genin uygun bir konakta anlatmnnsalanmas

genin protein rnnn saf ve bol miktarda eldeedilebilmesi

(Modern biyoteknolojinin hzl biimde ilerlemesi !!!)


3/32

Rekombinant proteinelde edilmesi ok kolay deildir.Bu amaca ynelik klonlama almalarnda yenitasarmlargelitirilmesi gerekli !!!

Engelleyici faktrler:

Gelimi yapl organizmalarn genlerinin bakterilerdegenellikle normal anlatmyapamamalar(transkripsiyon, translasyon ve translasyonsonrasilemlerde, proteinlerin hcrede gerekli blmeleregidilerindekifarkllk)


4/32

Ekspresyon(Anlatm)Vektrleri

Farkl gruplara ait organizmalarda gen anlatmnneitliaamalarndaki tanma sorunlarn ortadan kaldrmak vegenin yabanc bir konakta baarl anlatm yapmasnsalamak zere gelitirilmi olan vektr.

Ekspresyon (anlatm) vektr tad genin girdiiblgede konak hcre tarafndan tannabilecek genanlatm sinyalleriierir.


5/32

Ekspresyon vektrnn en nemlibileeni:promotr.

Basit tipteki ekspresyon vektrleri sadece transkripsiyon

sinyalleri (rnein,promotr) tarlar.

Transkripsiyon etkinliinin dzenlenmesinde promotrtipleri:

Kuvvetli promotrler, transkripsiyon etkinlii yksek,transkripsiyonun hzlyaplmasnsalarlar.

hcrede fazla miktarda retilmesi gereken proteinlereait genler iin uygun.Zayf promotrler, transkripsiyon etkinlikleri daha az.

hcrede rnlerine az miktarda gereksinim duyulangenler iin uygun.


6/32


7/32

Vektrdeki Promotrn levinin Dzenlenmesi

Sreklianlatma olanak veren (konstittif) vektrler

levi dzenlenebilen vektrlerndksiyon (Tetikleme) veya Represyon(Basklama)

Tetikleyici ya da basklayc maddelerin ortamaeklenmesiyle klonlanan genin anlatmnn dzenlenmesi.

Rekombinant proteinin retim miktarnnayarlanabilmesi

(1) Rekombinant protein konakta zararl etki yapyorsa

sentezinin hcrede toksik dzeyde birikiminiengelleyecek ekilde kontrol edilmesi

(2) Zararl etkisi olmasa da uzun sreli anlatm sonucureplikasyonu etkilenen plazmidin kltrden yok olmasnn

engellenmesi


8/32


9/32

E. colide sklkla kullanlanekspresyon vektrleri

lac. -galaktosidazifreleyen lacZ genininpromotr.

trp. Triptofan sentezi genkmesinin promotr.

tac. trp/lac promotrlerimelezi, kuvvetli promotr.

PL promotr. DNAsndaki promotrlerdenbiri, ok kuvvetli. T7promotr. T7 faj RNApolimerazna zg, kuvvetli.


10/32

Bileik(fusion)Protein

Vektrde konak hcreye uygun promotrle birliktepromotrn ait olduu genin balangcndaki belliuzunlukta bir dizinin de bulunmas

klonlanan genin proteiniyle birlikte promotre aitgenin rnnn (N-ucundaki amino asitleri tayan) birksmnnmeydana gelmesi.

Translasyon iin doru okunma erevesininoluturulmas nemli !!!

stenilen proteini elde etmek zere ounlukla bileikprotein daha sonra in vitrokesilir.


11/32

Kaset Vektrler

Gen anlatmylailikilitm sinyalleri bir kaset biimindetayan vektrler.

[promotr + ribozoma balanma dizisi + terminatr]

Klonlanacak gen kasetteki sinyal kmesinin ortasndabulunan tek restriksiyon enzimi kesme yerine sokulur.

Biyoteknolojik kullanmlarda gerekli olan ok etkinanlatmlarda nemli.


12/32

Bir yabanc geninE. colide anlatm

yapmasn salamadakaset tipi ekspresyon(anlatm) vektrnnkullanm


13/32

Bileik protein sentez eden kaset vektrler

Kaset vektrde klonlama yeri ile ribozoma balanma

dizisi arasnda konak hcreye ait bir genin birparasnnbulunmas.

Yabanc genin, konaa ait gen parasndan sonra gelenrestriksiyon yerine sokulmasyla, okunmann vektrdekigenin ilk kodonundan balayp yabanc gende devamederek bir melez genoluturulmas.

Gen anlatmnn rn:yabanc protein + NH2 ucuna kaynamksa bir peptitbileik(fusion) protein.

Bu tip kaset vektrler rekombinant protein retimindenemli !!!!


14/32


15/32

Bileik protein sistemininavantajlar:

Okunma erevesinin bandaki dizi yardmyla etkintranslasyon.

Balangtaki peptidin yabanc proteinin konak hcredekiykmn engellemesi.

Ek parann sinyal peptit oluturup proteinin hcredeuygun blmeye gitmesini salamas. Proteinin hcre dnasalglanabilmesi (salglanma, rekombinant proteinlerinkltrden saflatrlmasn kolaylatrd iin istenilen birzellik !!!)

Ek parann proteinin afinite kromatografisi ilesaflatrlmasnayardm.


16/32

Bileik protein sistemineilikin sorunlar:

Vektrdeki ek gen parasna ait amino asit dizisininklonlanm genin ifreledii proteinin zelliklerinideitirebilmesi ve aktivitesinin tamamen yok olmasnayol aabilmesi.

Sorunun giderilmesi:

Bileik proteinin, iki bileeninin zel kimyasal/enzimuygulamasylaayrlmas.

(rn. metioninlerde kesen siyanojen bromid, arginindekesen trombin kullanm)


17/32

E. colide Rekombinant Protein retimindeki Sorunlar

Yabanc genin dizisinden kaynaklanan sorunlar.

(1) Gende intronlarn varl ( genin cDNAsnnkullanlmas).

(2) Genin okunma erevesi ierisinde transkripsiyonunerken tamamlanmasna neden olacak dizilerinbulunmas ( in vitro mutagenezle tamamlanmaiaretinindeitirilmesi).

(3) Gendeki kodon seiminin bakterideki translasyon iinuygun olmamas (in vitromutagenezle tercih edilenkodonlarnoluturulmas).


18/32


19/32

Konaktan (E. coli) kaynaklanan sorunlar

(1) Rekombinant proteinin doru ekilde ilenememesi(zellikle glikozillenmenin olmamas) ( en nemlikstlayc sorun !!!).

(2) Rekombinant proteinin doeu ekilde katlanamamas(zellikle slfit balarnn oluamamas) inclusioncisimleri oluumu ( fazla miktarda aperon proteinlerisentezleyen E. coli kullanm).

(3) Rekombinant proteinin ykm ( proteazlar kusurluE. colimutantlarkullanm).


20/32

Yabanc proteinlerinsalglanmas.

Biyoteknolojik uygulamalar iin nemli !!!! Sitoplazmik bir proteinin salglanacak biimdedeitirilmesi.

Ekspresyon vektr tasarmnda salg proteinlerinintmndeki ortak baz zelliklerin dikkate alnmasgerekir : N-ularnda polar amino asit dizisi; bu dizide pozitifykl bir amino asidin 10-15 hidrofobik amino asitlik

bir ekirdek tarafndan izlenmesi. C- ucundaki baz zel diziler.Ayrca, proteinin bazyapsal zellikleri.


21/32

Rekombinant Proteinlerin Konak HcrelerdekiKararllKlonlanm genlerin yabanc konaktaki rnleri oldukakararsz.

Rekombinant proteinlerin hcre ii yerleimlerikararllkzerinde etkilidir (rnein, fare proinsulininin E.colideki yar mr sitoplazmadayken ~2 dakika,periplazmada sre 10 kat uzuyor.)

Kararszl giderme amacyla gelitirilen bazstratejiler: Bileik protein oluturulmas ve daha sonra ekproteinin (rn. siyanojen bromidle) kesilmesi. Yntemindezavantaj doal bir proteinin her zaman meydanagelmemesi. Konak hcre olarak, hcre ii proteazlarindirgenmiolan bazmutantlarnkullanlmas vb.


22/32

karyotik Hcrelerden Rekombinant Protein retimiBakterilerde (rn.E. colide) klonlanm yabancgenlerden fazla miktarda rekombinant protein eldeedilmesine ilikineitlisorunlarnvarl.

karyotlar iin uygun vektrlerin gelitirilmesi

lkalmalar,mayalargibi basit karyotlara ynelik.


23/32

lk ve en yaygnekildekullanlanS. cerevisiae.

Rekombinant protein rn olduka yksek miktarda.Tpta ve besin olarak kullanlan proteinlerin retimi iingvenilir organizma. Genetik ve biyokimyasal zellikleri ok iyi biliniyor.

Ancak, Hayvansal proteinlerin glikozillenmesi kusurlu(hipergikozillenme)

Etkin bir protein salglama sistemi yok.

Pichia pastoris


24/32

Pichia pastoris

Rekombinant protein rn ok yksek (toplam hcreproteininin %30u). Glikozilleme zellii hayvan hcrelerine ok benzer. Rekombinant proteinlerin bazen saflatrlamadanykm.

Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Kluveromyceslactis

Aspergillus nidulansTrichoderma resei

Glikozilleme zellii iyi.

Salglama yetenekleri var.


25/32

Basit yapl karyotlara ait ekspresyonvektrlerinde sklkla kullanlan baz promotrler

Saccharomyces cerevisiaeGAL. Galaktoz epimeraz genininpromotr.

PHO5. Fosfat dzeyiyle

dzenlenir.CUP1. Bakrla tetiklenir.

Pichia pastoris

AOX. Alkol oksidaz promotr.

Aspergillus nidulans

Glukoamilaz promtr

Trichoderma resei

Sellobioz promotr.


26/32

Gelimi karyotlarda (bitkive hayvanlar)uygun ekspresyonvektrlerinin tasarmnda, son yllarda, hcre kltrlerindekihzlgelimeler etkili.

Gelimi karyotlarda gen klonlamasyaplan genin rnnnzelliklerini deitirmeye(rneinartrmaya) ynelik abalarbaskn. Ekspresyon vektrlerinde bulunan promotrler klonlanacakgenin kendi promotrnden genelde daha kuvvetli.

Hayvan Hcrelerinin Rekombinant Protein retiminde


27/32

Hayvan Hcrelerinin Rekombinant Protein retimindeKullanlmas

Karmak ve glikozillenmiyapl hayvansal proteinlerin aktif

ekilde sentez edilebilmeleri iin en uygun konak hayvanhcreleri.

Devamloalan byk lekte hcre kltrlerigerekli

oalmahz ve maksimum hcre younluu ok yksek deil rekombinant protein rnn snrl.Klonlanm genin ve ekspresyon vektrnn kullanm (geninnormal promotrnden ok daha kuvvetli olan promotrnkullanm) rn miktarnnartrlmas.En uygun promotrler SV40, cytomegalovirus (CMV),Rous sarcoma virus (RS) vb.den.

Rekombinant protein retiminde en pahal yol yol !!!

(Virus bulamasnakar kontrollu saflatrma gerekli)


28/32

Bcek Hcrelerinde Rekombinant Protein retimi

Hayvansal protein retiminde alternatif konak.Ekspresyon sistemleri:

Baculovirus genomundaki polihedrin geninin yerine

klonlanacak genin geirilmesi rekombinant protein rn>%50 total protein.Ancak, glikozillenme kusurlu.

Autographa californica multinucleocapsidnucleopolyhedrovirus (AcMNPV) memeli hcrelerine debular fakat genomu replikasyon geirmez; ancak klonlanmgenin anlatm iin yeterli sre kararl kalr; ayrcaglikozillenme baarl.


29/32

Transgenik Hayvanlarda Rekombinant Protein retimi

Dllenmi yumurtaya mikroinjeksiyon yoluyla klonlanacakgenin sokulmas Farelerde baarl.Dier memelilerde nukleusaktarm daha etkin:

Genin mikroinjeksiyonla somatik hcreye sokulmas; Hcrenin nukleusunun, nukleusu yok edilmi, bir oositeaktarlmas;

Ooositin sokulduu ana organizmada transgenik hayvan

eklindegelimesi.Uzun ve pahal bir yntem.

Ancak, rekombinant gende ve rnnde dller boyunca

sreklilik.


30/32


31/32

Transgenik Bitkilerde Rekombinant Protein retimi

Bitkiler rekombinant protein retimi iin byk olanaklar

salar: Bitki ve hayvanlarda translasyon sonras deiimler okbenzer birok hayvan proteininin bitkilerde retimibaarl.

Bitki hcre kltrlerinin kurulmas teknolojisi iyi gelimi. Bitkilerin tarlalarda bol miktarda retimi mmkn.

Rekombinant proteinlerin retiminde ucuz ve dk

teknoloji.rnein, bir genin tohumun balca proteinlerinden birineait gene zg promotrden sonra vektre sokulmasyla, zelolarak tohumda anlatm yapmas bol miktarda proteininkolaylkla eldesi ve saflatrlmas.


32/32

Documents

Klonlanan Genin Anlatimi V