KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI ...digilib.unila.ac.id/20401/1/SKRIPSI PRATIKA VIOGENTA 0617021058.pdf · menunjukkan zat antibakteri berupa protein, ... Imunitas

KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus

DARI TEMPOYAK

(Skripsi)

Oleh :

Pratika Viogenta

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2010

ABSTRAK

KARAKTERISTIK ANTIBAKTERI

ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK

Oleh

PRATIKA VIOGENTA

Antimikroba merupakan senyawa yang dikeluarkan oleh mikroorganisrne dan

dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme lain. Lactobacillus

merupakan salah satu genus bakteri yang mampu menghasilkan senyawa

antibakteri seperti asam organik, hidrogen peroksida (H2O2), karbon dioksida

(CO2), diacetyl dan bakteriosin. Terdapat empat jenis isolat Lactobacillus dari

tempoyak yaitu L1, L2, L3 dan L4. Keempat isolat Lactobacillus tersebut mampu

menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Namun, karakteristik antibakteri

yang dihasilkan oleh ketiga isolat belum diketahui.

Tujuan dari penelitian ini adalah mendeteksi senyawa antibakteri yang dihasilkan

isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4

dengan cara mengukur total asam dan berat molekul bakteriosin isolat

Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4.

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium

Biomolekuler FMIPA Unila. Penentuan karakterisasi jenis antibakteri dilakukan

dua tahapan yaitu penentuan asam organik dan protein sebagai senyawa

antibakteri. Asam organik ditetapkan dengan mengukur pH media kultur dan

total asam melalui titrasi menggunakan 0,1 N NaOH. Karakterisasi protein

antibakteri dilakukan secara observasi. Karakterisasi protein antibakteri

ditentukan dengan menetralkan supernatant kemudian diuji dengan metode difusi

sumuran terhadap bakteri uji yaitu Esherchia.coli, Salmonella paratyphii ,

Bacillus substilis dan Staphilococcus aureus. Terbentuknya zona jernih

menunjukkan zat antibakteri berupa protein, dilanjutkan dengan menetukan berat

molekul protein yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan

menggunakan teknik Sodium Dodecyl Sulfat Polyakrilamide Gel Elektoforesis

(SDS-PAGE).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa antibakteri yang dihasilkan dari isolat

Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4

berupa senyawa asam organik. Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4

menghasilkan asam organik maksimum berturut-turut yaitu sebesar 37,15 untuk

Lactobacillus L1, 36,13 untuk Lactobacillus L2, 29,94 untuk Lactobacillus L3,

dan 7,89 untuk Lactobacillus L4. Selama fermentasi berlangsung, total asam

organik yang diproduksi oleh keempat isolat Lactobacillus meningkat hingga hari

ke 5 waktu produksi. Dari hasil SDS-Page diperoleh pada isolat L1, L2 dan L3

tidak terdapat pita protein yang terbentuk, sedangkan isolat Lactobacillus L4

menghasilkan protein dengan berat molekul 15 kDa, 24 kDa, 53 kDa dan 169 kDa

akan tetapi bukan sebagai antibakteri

Key Word : Lactobacillus, Asam organik, Bakteriosin,Total Asam, SDS-PAGE

KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus

DARI TEMPOYAK

Oleh

Pratika Viogenta

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar

SARJANA SAINS

Pada

Jurusan Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2010

Judul Skripsi : KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT

Lactobacillus DARI TEMPOYAK

Nama Mahasiswa : Pratika Viogenta

Nomor Pokok Mahasiswa : 0617021058

Jurusan : Biologi

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

MENYETUJUI

1. Komisi Pembimbing

Dr. Sumardi, M.Si Dra. Christina.N Ekowati, M.Si

NIP 196503251991031003 NIP. 195808181985032001

2. Ketua Jurusan Biologi

Dra. Nuning Nurcahyani, M. Sc

NIP. 196603051991032001

MENGESAHKAN

1. Tim Penguji

Ketua : Dr. Sumardi, M. Si ...............

Sekretaris : Dra. Christina N. Ekowati, M. Si ...............

Penguji

Bukan Pembimbing : Kusuma Handayani, M. Si ...............

2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Sutyarso, M. Biomed.

NIP. 195704241987031001

Tanggal Lulus Ujian Skripsi : 18 November 2010

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kota Bandar Lampung pada tanggal 24

Maret 1989, dari pasangan Sanyoto dan Inah Lestari, S.Pd,

sebagai anak kedua dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan

pendidikan Taman Kanak-kanak di TK Al-Azahar Perumnas Way Halim pada

tahun 1994, pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 2000 di Sekolah Dasar Al-

Azahar Perumnas Way Halim, Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama diselesaikan di

SLTP Negeri 19 Bandar Lampung pada tahun 2003, dan Sekolah Menengah Atas

di SMA Negeri 2 Bandar Lampung pada tahun 2006. Penulis tercatat sebagai

mahasiswa di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung melalui jalur SPMB ( Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru)

pada tahun 2006.

Selama menjadi mahasiswa, penulis berkesempatan mengikuti berbagai kegiatan

keorganisasian di UKM. Rohani Islam tahun 2007-2009 sebagai anggota Biro

Akademik, di HIMBIO sebagai anggota Bidang Hubungan Masayarakat pada

tahun 2007-2008 dan sebagai seketaris Bidang Keilmuan pada tahun 2008-2009,

dan di BEM FMIPA sebagai seketaris Dinas Lingkungan Hidup pada tahun 2009.

Penulis juga pernah menjadi asisten dosen pada mata kuliah Fisiologi Tumbuhan,

Genetika, Mikrobiologi Pangan dan Industri, Mikrobiologi Umum, Mikrobiologi

Lingkungan, Fisiologi Mikrobiologi jurusan biologi FMIPA, Mikrobiologi

STIKES UMITRA, Mikrobiologi Umum guru-guru SMP tahun 2010, dan

Pengenalan SAINS kepada guru-guru SD tahun 2010. Pada tahun 2009 penulis

melaksanakan kerja praktek di Loka Penelitian dan Pengembangan Pengendalian

Penyakit Bersumber Binatang (Litbang P2B2) Banjarnegara, Jawa Tengah.

“Jika niat sudah tertuju karena Allah, tidak akan ada

halangan yang bisa menghentikan seseorang melakukan sesuatu. Niat karena Allah ialah motivator yang utama dan

seharusnya menjadi satu-satunya motivator kita.”

“Allah SWT memerintahkan kita untuk mau berpikir tentang penciptaan-Nya yang begitu menakjubkan, rumit, dan

kompleks. Namun semua itu telah Allah SWT tundukan untuk kita. Ini sebagai tanda bahwa manusia memiliki

kemampuan (dari Allah) untuk menundukan apa yang ada di langit dan di bumi.”

“Allah SWT, tidak akan pernah menjanjikan hari-hari kita berlalu tanpa sakit, berhias tawa tanpa kesedihan, senang

tanpa kesulitan, tapi Allah SWT menjajikan kekuatan kepada kita untuk dapat melewatinya”

Dengan Menyebut Nama Allah yang Maha Pengasih Dan Maha Penyayang

Dengan segala Cinta dan Kasih sayang kupersembahkan karya sederhana ini teruntuk orang-

orang yang akan selalu berharga dalam hidupku :

Ibu dan Bapak tercinta dan dicintai Allah SWT Masku : Septian D.C

Almamater yang ku banggakan

SANWACANA

Puji syukur penulis panjatkan kehadiran Allah SWT, yang telah melimpahkan

rahmat, taufik serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelelesaikan skripsi

yang berjudul “KARAKTERISTIK ANTIBAKTERI ISOLAT Lactobacillus

DARI TEMPOYAK” dengan tepat waktu. Penelitian ini merupakan rangkaian

dari penelitian “ISOLASI DAN KARAKTERISASI Lactobacillus DARI

TEMPOYAK YANG BERPOTENSI SEBAGAI PENGAWET HAYATI

BAHAN PANGAN” yang didanai oleh Dirjen Dikti Kementrian Pendidikan

Nasional melalui Hibah Penguasaan Teknologi (Strategis Unila). Shalawat serta

salam semoga selalu tercurah kepada suri taudalan terbaik umat manusia Nabi

Muhamammad SAW.

Penyelesaian ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak baik berupa bantuan

pemikiran ataupun bantuan moril sehingga pada kesempatan ini, penulis

menyampaikan terima kasih dengan setulus hati kepada.

1. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., selaku pembimbing satu atas ide, saran-saran,

motivasi, kesabarannya, waktunya serta bimbingannya kepada penulis dalam

penyelesaian hasil penelitian ini.

2. Ibu Dra. Christina. N. Ekowati, M.Si., selaku pembimbing kedua atas

kesabarannya dalam membimbing, mengkoreksi, kasih sayangnya, dan selalu

memotivasi penulis.

3. Ibu Kusuma Handayani, M. Si selaku penguji yang telah memberikan saran-

saran, kritik serta koreksinya kepada penulis.

4. Bapak dan Ibu tercinta yang senantiasa memanjatkan doa, memberikan

dukungan moril dan materil pada penulis. Semoga Allah SWT, senantiasa

memberikan kemuliaan di dunia dan akhirat.

5. Ibu Dra. Rumyati, M.Si., selaku dosen pembimbing akademik atas

bimbingannya selama penulis menjadi mahasiswa di Jurusan Biologi FMIPA

Unila.

6. Bapak Dr. Sutyarso, M.Biomed., selaku Dekan FMIPA Unila.

7. Ibu Dra. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA

yang telah memberikan kemudahan pada penulis.

8. Seluruh dosen dan staf karyawan FMIPA khususnya jurusan Biologi

9. Kakakku yang telah memberikan perhatian serta kasih sayang yang mengalir

tiada hentinya selama ini.

10. Teman seperjuanganku Kak Robi yang selalu membantu meski sudah lulus

terlebih dahulu.

11. Penghuni lab mikrobiologi (mbak wiwin, mbak nur, kak asep, deby, ros, ria,

mahendra) terima kasih atas bantuannya, perhatiannya, nasehatnya dan canda

tawa sehingga penulis tidak merasa jenuh.

12. Teman-temanku Dora, Nensi, Gina, Rima dan semua teman-teman angkatan

2006 yang tidak bisa disebutkan satu persatu atas kebersamaan, bantuannya

dan semua kenangan yang telah kita lalui bersama.

13. Adik-adikku penerus generasi mikrobiologi Ratna, Zahra, Dwi, Diah dan

Wiwik jangan mudah menyerah dan selalu semangat.

14. Pak Sungadi, Pak Tris, Pak Imron, Bu Endang dan seluruh saudaraku biologi

angkatan (’05-’09) serta semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu

terima kasih atas bantuan selama ini dan persahabatannya.

Semoga Allah SWT membalas segala bantuan yang telah diberikan kepada

penulis dan semoga penulisan skripsi ini dapat bermanfaat bagi yang membacanya

Bandar Lampung, November 2010

Pratika Viogenta

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL .......................................................................................... i

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... ii

I. PENDAHULUAN ................................................................................... 1

A. Latar Belakang .................................................................................... 1

B. Tujuan Penelitian ................................................................................ 3

C. Kerangka Pemikiran ............................................................................ 3

D. Hipotesis ............................................................................................. 4

E. Manfaat Penelitian .............................................................................. 5

II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 6

A. Lactobacillus ....................................................................................... 6

B. Antibakteri .......................................................................................... 7

C. Asam Organik ..................................................................................... 8

D. Hidrogen Peroksida ............................................................................. 11

E. Karbon Dioksida ................................................................................. 12

F. Bakteriosin .......................................................................................... 13

2.6.1. Karakteristik Bakteriosin .......................................................... 13

2.6.2. Penggolongan Bakteriosin ........................................................ 14

2.6.3. Mekanisme Kerja Bakteriosin ................................................... 18

2.6.4. Imunitas Bakteri Penghasil Bakteriosin .................................... 20

III. METODE PENELITIAN ....................................................................... 22

A. Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................. 22

B. Alat dan Bahan .................................................................................... 22

C. Metode Penelitian ............................................................................... 23

D. Prosedur Kerja .................................................................................... 24

1. Peremajaan Bakteri ....................................................................... 24

2. Produksi Senyawa Antibakteri ...................................................... 24

3. Karakterisasi Antibakteri Berupa Asam Organik ......................... 25

4. Uji Daya Antibakteri ..................................................................... 25

5. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyakrilamide Gel Elektoforesis

(SDS-PAGE) dan Identifikasi Aktivitas Pita Protein ................... 27

6. Diagram Alir ................................................................................. 30

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 31

A. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Asam Organik ............................ 31

B. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Protein ........................................ 37

V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 42

A. Kesimpulan ......................................................................................... 42

B. Saran ................................................................................................... 43

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 44

LAMPIRAN

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Klasifikasi Bakteriosin .............................................................................. 16

2. Penggolongan Bakteriosin Berdasarkan Kandungan Sistein .................... 17

3. Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan ................................................ 27

4. Analisis Ragam Total Asam yang Dihasilkan Isolat Lactobacillus L1,

L2, L3 Dan L4 Terhadap Waktu Produksi (Hari) ..................................... 33

5. Zona Hambat dari Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3

dan L4 Sebelum dan Sesudah Dinetralkan Terhadap Bakteri Uji ........ 38

6. Hasil Pengukuran pH Media Kultur Isolat Lactobacillus ......................... 48

7. Hasil Pengukuran Total Asam Media Kultur Isolat Lactobacillus ........... 48

8. Penetuan Kurva Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap

Mobilitas Relatif (rf) ................................................................................. 54

9. Penetuan Berat Molekul Protein Terhadap Mobilitas Relatif (Rf) Pada

Isolat Lactobacillus L4

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

10. Model Pembentukan Pori pada Membran, Barrel-Stave dan Carpet

Model ....................................................................................................... 20

11. Model Mekanisme Kerja Protein Imunitas ............................................... 21

12. Bentuk Sumur Dilihat dari Bagian Bawah Cawan Petri ........................... 27

13. Pola Perubahan pH Media Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang

Diamati Tiap Hari Sampai Hari Ke 5........................................................ 31

14. Total Asam Organik Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang

Diamati Tiap Hari Sampai Hari Ke 5........................................................ 32

15. Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L1 .................................. 34




19. SDS-PAGE Isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus

L3 dan Lactobacillus L4 ........................................................................... 40

20. Gel SDS-PAGE Ektrak Antibakteri L4 yang Diuji Terhadap St.Aureus .. 40

21. Isolat Lactobacillus L1 ............................................................................. 46




25. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4

Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus ............... 48


Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus ................ 48


Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis ......................... 48


Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis.......................... 49


Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli ........................... 49


Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli ............................ 49


Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii ................ 50


Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii ................. 50

33. Grafik Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap Mobilitas

Relatif ....................................................................................................... 52

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Lactobacillus merupakan salah satu mikroorganisme yang aman jika

ditambahkan dalam bahan pangan karena sifatnya tidak tosik dan tidak

menghasilkan toksik. Bahkan, Lactobacillus bermanfaat bagi kesehatan dan

meningkatkan keamanan bahan pangan melalui penghambatan secara alami

terhadap pertumbuhan mikroorganisme berbahaya yang menyebabkan

pembusukan pada makanan maupun menyebabkan penyakit.

Lactobacillus berfungsi sebagai pengawet makanan karena mampu

memproduksi senyawa antibakteri seperti asam organik, hidrogen

peroksida (H2O2), karbon dioksida (CO2), diacetyl dan bakteriosin

(Kusmiati dan Malik, 2002).

Lactobacillus ditemukan pada produk-produk makanan fermantasi seperti

thongcai, lemma, tempoyak, ikan fermentasi, tauco, rebung asin dan sawi asin

(Wulandari, 2005). Tempoyak merupakan salah satu jenis makanan

tradisional yang melibatkan bakteri Lactobacillus dalam prosesnya.

Tempoyak berasal dari daging buah durian yang diolah dengan cara

fermentasi secara spontan dengan menambahkan garam 6-16 % dalam wadah

tertutup. Tempoyak dikenal di Indonesia, terutama di Sumatera dan

Kalimatan serta Malaysia (Yuliana dan Garcia, 2010). Isolat yang ditemukan

di dalam tempoyak antara lain Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. mali, L.

fermentum L.casei, dan L. corynebacterium. Jenis bakteri asam laktat lain

yang juga ditemukan pada tempoyak yaitu Leuconostoc mesenteroides,

Pediacoccus acidilactici dan Weisella mesenteroides ( Yuliana dan Garcia,

2009).

Ekowati (2000) melaporkan bahwa dua jenis isolat Lactobacillus yang

diperoleh dari tempoyak mampu menghambat pertumbuhan Escherchia coli

dan Streptococcus haemoliticus. Konsentrasi filtrat kedua isolat

Lactobacillus tersebut mulai dari 40 % (v/v) efektif menurunkan jumlah sel

bakteri E. coli dan S. haemoliticus. Berdasarkan hasil analisis asam organik,

isolat Lactobacillus memproduksi asam laktat 0,4257 % (v/v), asam asetat

0,0717 % (v/v), asam propionat 0,0502 % (v/v), dan asam butirat 0,01 %

(v/v).

Ekowati (2009) memperoleh tiga jenis isolat Lactobacillus dari tempoyak

yaitu L1, L2 dan L3. Ketiga isolat Lactobacillus tersebut mampu

menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Daya hambat zat antibakteri dari

ketiga isolat terhadap pertumbuhan Escherichia coli relatif sama, yang

terlihat dari diameter zona hambat berkisar 1,65 cm-2,2 cm. Hal ini

menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut menghasilkan suatu senyawa

antibakteri tertentu. Menurut Ogunbawo et all (2003), Lactobacillus

plantarum ST194BZ menghasilkan senyawa antibakteri dalam bentuk asam

organik dan protein. Jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh ketiga

isolat belum diketahui. Berdasarkan permasalahan tersebut maka perlu

dilakukan penelitian mengenai karakteristik antibakteri yang dihasilkan oleh

isolat Lactobacillus dari tempoyak.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa antibakteri yang

dihasilkan isolat Lactobacillus dari tempoyak.

C. Kerangka Pemikiran

Lactobacillus dapat diisolasi dari makanan yang telah mengalami fermentasi

seperti tempoyak. Pada proses terbentuknya tempoyak, penambahan garam

dapur sebesar 3-7 % pada daging buah durian akan menyebabkan

Lactobacillus tumbuh dengan baik. Hasil metabolit Lactobacillus pada

tempoyak terbentuk asam-asam organik dari karbohidrat yang berasal dari

daging buah durian. Beberapa asam organik dapat bersifat toksik terhadap

mikroorganisme patogen ataupun mikroorganisme pembusuk pada makanan.

Isolat Lactobacillus yang diperoleh dari tempoyak berpotensi menghasilkan

senyawa antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan Escherichia

coli. Daya hambat zat antibakteri dari ketiga isolat terhadap pertumbuhan

Escherichia coli relatif sama, yang terlihat dari diameter zona hambat

berkisar 1,65 cm – 2,2 cm.

Lactobacillus yang berasal dari tempoyak mampu memproduksi jenis asam-

asam organik, yaitu asam laktat 0,4257 % (v/v), asam asetat 0,0717 % (v/v),

asam propionat 0,0502 % (v/v), dan asam butirat 0,01 % (v/v). Senyawa-

senyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan dari bakteri patogen dan

bakteri pembusuk makanan sehingga dapat digunakan sebagai zat antibakteri.

Pada umumnya tidak hanya asam organik yang dihasilkan Lactobacillus

mampu menghambat mikroorganisme lain tetapi terdapat senyawa lain yang

ikut berperan di dalam penghambatan pertumbuhan bakteri pembusuk dan

patogen seperti H2O2, diasetil, CO2, dan bakteriosin. Dalam metabolisme

Lactobacillus, ada kemungkinan Lactobacillus yang berasal dari tempoyak

mengubah asam-asam organik menjadi asam amino. Asam – asam amino

tersebut dapat digunakan oleh Lactobacillus untuk menyusun bakteriosin

atau protein penghambat. Bakteriosin merupakan substansi protein yang

dikode oleh plasmid, umumnya mempunyai berat molekul kecil serta

memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri lain (bakterisidal),

terutama yang memiliki kekerabatan erat secara filogenik.

Bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus antara fase logaritmik dan

awal fase stasioner. Faktor lingkungan sangat mempengaruhi pertumbuhan

bakteri Lactobacillus maupun hasil metabolitnya. Penambahan substrat

seperti ekstrak yeast (3%), NaCl (1.0-2.0%), glukosa (1.0%) dan Tween 80

(0.5%) menghasilkan bakteriosin dalam jumlah optimal. Substrat-substrat

tersebut digunakan Lactobacillus sebagai prekursor senyawa antibakteri.

Aktivitas maksimal bakteriosin dicapai pada awal pH 5.5 dan diinkubasi

antara 48 jam hingga 60 jam pada suhu 30 – 37 oC.

D. Hipotesis

Hipotesis yang diajukan yaitu isolat Lactobacillus dari tempoyak dapat

menghasilkan antibakteri berupa senyawa asam organik dan protein.

E. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jenis

senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus dari tempoyak

dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain. Selanjutnya informasi ini

diharapkan dapat bermanfaat sebagai biopreservatif terhadap bahan pangan.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Lactobacillus

Lactobacillus merupakan bakteri gram positif, tidak berspora, berbentuk

batang atau coccosbacilli. Pada umumnya mengandung guanin-citosin di

dalam DNA kurang dari 50 mol%. Lactobacillus dapat melakukan

fermentasi, bersifat aero-toleran atau anaerobik, aciduric atau acidophilic dan

memerlukan asupan nutrisi yang kompleks seperti karbohidrat, asam amino,

peptida, ester asam lemak, garam, derivat asam nukleat dan vitamin.

Lactobacillus tidak mensintesis porphyrinoids begitu juga dengan aktivitas

yang terkait dengan porphyrinoids. Namun, terdapat beberapa strain dari

Lactobacillus dapat menggunakan porphorinoid dari lingkungan dan

memperlihatkan aktivitas katalase, reduksi nitrit bahkan sitrokrom. Strain Lb.

mali mampu membentuk pseudocatalase (Wood dan Holzapfel, 1995).

Lactobacillus mampu merombak senyawa kompleks menjadi senyawa yang

lebih sederhana dengan hasil akhirnya yaitu asam laktat (Rostini, 2007).

Glukosa sebagai sumber karbon dimetabolisme membentuk 85 % asam laktat

oleh Lactobacillus yang bersifat homofermentatif atau menghasilkan asam

laktat, CO2, etanol oleh Lactobacillus yang bersifat heterofermentatif (Nur,

2005).

Apabila jumlah oksigen atau senyawa oksidan lain meningkat, sejumlah asam

asetat akan terbentuk dari asam laktat atau etanol melalui reaksi asetat kinase.

Demikian variasi metabolisme Lactobacillus membentuk metabolit. Berbagai

hasil metabolit seperti sitrat, malat, tartar, quinolat, nitrat, dan nitrit dapat

juga di metabolisme kembali dan digunakan sebagai sumber energi atau

penerima elektron terakhir (Wood dan Holzapfel, 1995)..

B. Antibakteri

Antibakteri adalah senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme hidup yang

mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain terutama bakteri,

bahkan dapat membunuhnya (Irianto, 2007). Suatu antibakteri yang ideal

memiliki toksisitas selektif, berarti obat antibakteri tersebut hanya berbahaya

bagi bakteri, tetapi relatif tidak membahayakan bagi hospes. Berdasarkan

sifat toksisitas selektif. Ada bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan

bakteri (bakteriostatik) dan ada yang bersifat membunuh bakteri (bakterisida).

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibakteri dibagi menjadi 5 kelompok,

yaitu:

1) Merusak dinding sel yaitu dengan menghambat pembentukan dan

mengubahnya setelah selesai terbentuk.

2) Mengganggu permeabilitas sel yaitu dengan merusak membran sel. Fungsi

membran sel adalah mempertahankan bahan-bahan dalam sel serta

mengatur aliran keluar masuknya bahan lain. Adanya kerusakan pada

membran ini mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya.

3) Merubah molekul protein dan asam nukleat yaitu dengan

mendenaturasikan protein dan asam nukleat sehingga kerusakan sel tidak

dapat diperbaiki lagi karena hidup suatu sel tergantung pada molekul

protein dan asam nukleat dalam keadaan alamiah.

4) Menghambat kerja enzim dengan mengganggu reaksi biokimiawi.

Penghambatan ini dengan mengakibatkan terganggunya metabolisme sel.

5) Menghambat sintesis asam nukleat dan protein. Gangguan pada

pembentukan atau fungsi-fungsi DNA, RNA dan protein dapat

mengakibatkan kerusakan total pada sel, karena zat-zat tersebut

memegang peranan penting dalam proses kehidupan normal sel

(Mulyanti, 2009).

Bakteri Lactobacillus berpotensi menghasilkan antibakteri yang mampu

menghambat pertumbuhan mikroorganisme berbahaya yang

menyebabkan pembusukan pada makanan maupun menyebabkan

penyakit melalui produk metabolik seperti asam organik, hidrogen

peroksida (H2O2), karbon dioksida (CO2), diacetyl dan bakteriosin

(Ogunbanwo et all, 2003).

C. Asam Organik

Ketika proses fermentasi glukosa, Lactobacillus mampu memproduksi asam

laktat secara homofermentasi atau sebanding dengan jumlah asam laktat,

asam asetat, etanol dan karbondioksida secara heterofermentatif. Apabila

proses tersebut diamati selama seminggu, asam organik yang dihasilkan

Lactobacillus memiliki suatu aktivitas antimikroba yang lebih besar pada pH

rendah dibandingakan dengan pH netral. Mengenai kedua asam yang

terbentuk, asam asetat memiliki aktivitas penghambat yang paling kuat dan

mempunyai suatu cakupan lebih luas dalam hal aktivitas menghambat

pertumbuhan khamir, kapang dan bakteri sedangkan asam propionat

memiliki efek antimikroba yang kuat khususnya untuk khamir dan kapang

(Salminen et all, 2004).

Aktivitas antimikroba asam asetat dan asam propionat lebih kuat

dibandingkan dengan aktivitas antimikroba dari asam laktat. Hal ini dapat

dijelaskan dari tingginya nilai pKa asam asetat ( pKa = 4,87) dan asam

propionat (pKa = 4, 75) dibandingkan dengan nilai pKa asam laktat (pKa =

3,08). Sebagai contoh, pada pH 4, hanya 11 % dari asam laktat yang tidak

terdisosiasi sedangkan 85 % asam asetat dan 92 % asam propionat tidak

terdisosiasi. Namun, ketika terbentuk campuran asam-asam organik, terjadi

kerja sama dalam meningkatkan aktivitas menghambat. Sebagian besar asam

laktat menyebabkan pH menurun disaat asam asetat dan asam propionat yang

tidak terdisosiasi menjadi agen antimikroba. Gabungan dari asam laktat dan

asam asetat mampu mengurangi laju pertumbuhan Salmonella enetric ser var

Typhimurium lebih baik daripada aktivitas masing-masing dari asam laktat

atau asam asetat sendiri (Salminen et all, 2004).

Asam laktat selain menurunkan pH juga dapat menggangu permeabilitas

membran, dengan demikian dapat meningkatkan aktivitas dari substansi

antimikroba lainnya. Mekanisme antimikroba asam laktat berdasarkan teori

"chemiosmotic" dan pH homeostasis. Ketika asam laktat yang diproduksi

disekresikan ke lingkungan, beberapa molekul terdisosiasi menjadi H+ dan

anion, sementara yang lain tidak terdisosiasi. Salah satu faktor yang

berperanan terhadap terdisosiasi atau tidaknya suatu molekul adalah pH

lingkungan dan pK (tetapan keseimbangan). Hal ini menyebabkan

peningkatan proton transmembran yang pada akhirnya menyebabkan gradient

proton. Perbedaan ini menyebabkan proton lebih cepat masuk ke dalam sel

sehingga meningkatkan kebutuhan energi untuk mempertahankan pH alkali

dalam sel. (Lunggani, 2007).

Banyak orang mengasumsikan bahwa molekul asam lemah yang tidak

terdisosiasi menjadi racun, walaupun asam yang terdisosiasi telah banyak

yang mengamati juga mampu menghambat pertumbuhan mikroba. Hal ini

dapat dijelaskan bahwa asam organik yang tidak terdisosiasi (netral) dapat

berdifusi melewati membran sel karena asam organik yang tidak terdisosiasi

larut dalam lipid. Setelah memasuki sel, asam akan terdisosiasi pada pH

sitoplasma yang biasanya mendekati netral (Salminen et all, 2004).

Banyak peneliti menyatakan bahwa pelepasan proton ke dalam sitoplasma

berperan penting di dalam proses pengasaman dan menghilangnya perbedaan

pH yang berlebih pada membran sehingga menyebabkan pertumbuhan

mikroba terhambat. Namun, beberapa peneliti lainnya menyatakan bahwa

hipotesis ini harus ditinjau kembali karena melihat bahwa proton tidak dapat

ditranslokasi. Menurut mereka, akumulasi anion yang menjadi faktor utama

menyebabkan pertumbuhan mikroba terhambat jika dilihat dari jumlah anion

berkurang pada sintesis makromolekul dan anion mempengaruhi sistem

transport pada membran sel. Seperti bakteri lainnya, bakteri asam laktat

memberikan efek penetralan dari akumulasi anion dengan cara mengurangi

pH sitoplasma mikroba patogen dan mikroba pembusuk (Salminen et all,

2004).

D. Hidrogen Peroksida

Dalam kondisi adanya oksigen, bakteri asam laktat menghasilkan hydrogen

peroksida melalui oksidasi molekul yang mengandung flavoprotein, oksidasi

NADH, dan superoxide dismutase. Bakteri asam laktat tidak menghasilkan

katalase yang berfungsi mungurai hydrogen peroksida. Pada sistem lainnya

bahwa penguraian hydrogen peroksida tidak seaktif dibandingkan dengan

produksi hydrogen peroksida itu sendiri sehingga terjadi akumulasi hydrogen

peroksida. Hydrogen peroksida tidak akan terakumulasi sebab hydrogen

proksida diuraikan oleh peroksidase, flavoprotein, dan pseudcatalase.

Pengaruh bakterisidal dari hydrogen peroksida dihubungkan dengan efek

oksidasi yang kuat di dalam sel bakteri seperti kelompok sulfidril dari protein

sel dan lipid membran dapat dioksidasi. Untuk menghasilkan hidrogen

peroksida dibutuhkan oksigen sehingga menyebabkan lingkungan menjadi

anerobik. Hal ini tidak baik untuk organisme yang bersifat aerobik (Salminen

et all, 2004).

Di dalam kondisi normal, pengaruh antimikroba dari hidrogen proksida

kemungkinan ditingkatkan karena adanya lactoperoksidase dan thiocyanate

(SCN-).

SCN- +H2O2

lactoperoxidase OSCN

- + H2O

OSCN- menyebabkan kerusakan struktural dan perubahan pada membran sel

bakteri. Namun yang menjadi faktor utama hidrogen peroksida menjadi

senyawa antimikroba yaitu menghambat proses glikolisis. Hidrogen

peroksida menghambat pengangkutan glukosa, aktivitas heksokinase, dan

aktivitas glyceraldehyde-3-phosphat dehidrogenase dengan cara

mengoksidasi sulfhydryl yang terdapat didalam enzim tersebut (Salminen et

all, 2004).

E. Karbon Dioksida

Karbon dioksida dihasilkan selama proses fermentasi glukosa dan respirasi

berlangsung. Karbon dioksida memiliki pengaruh antimikroba ganda.

Karbon dioksida dapat menyebabkan lingkungan menjadi anaerob dan karbon

dioksida itu sendiri bersifat antimikroba. Mekanisme penghambatan dari

karbon dioksida belum banyak diketahui tetapi karbon dioksida mampu

menghambat aktivitas enzim dehidrogenase dan terjadinya akumulasi karbon

dioksida di dalam lipid bilayer menyebabkan tidak berfungsinya

permeabilitas membran. Pada konsentrasi karbon dioksida dalam keadaan

rendah dapat merangsang pertumbuhan beberapa organisme sedangkan pada

konsentrasi yang lebih tinggi dapat menghambat pertumbuhan (Salminen et

all, 2004).

F. Bakteriosin

2.6.1 Karakteristik Bakteriosin

Bakteriosin merupakan antimikrobia yang berupa protein dan disintesis

secara ribosomal (Suparjo, 2008). Bakteriosin memiliki pengaruh

bakterisidal dan bakteriostatik terhadap bakteri yang mempunyai

hubungan dekat dengan bakteri penghasilnya (Kusmiati dan Malik,

2002). Bakteri target memiliki sifat pengikatan spesifik (specific

binding site) (Usmiati,2009).

Bakteriosin biasanya tahan terhadap panas, dan aktivitasnya masih tetap

ada dalam lingkungan asam misalnya pada suhu 100˚C atau 121˚C

selama 15 menit (Ogunbawo et all, 2003), demikian pula suhu yang

sangat rendah dalam penyimpanan tidak mempengaruhi aktivitas

bakteriosin. Umumnya, bakteriosin memiliki sifat mudah didegradasi

enzim proteolitik seperti protease (Usmiati,2009).

Bakteriosin dihasilkan baik oleh bakteri gram positif maupun bakteri

gram negatif. Bakteriosin gram positif mengandung 30 sampai 60

asam amino dengan aktifitas yang bervariasi dari spektrum sempit

sampai luas delam melawan bakteri gram positif lainnya

(Suparjo,2009).

Bakteriosin disintesis selama fase eksponensial pertumbuhan sel

mengikuti pola sintesis protein. Sistem ini diatur oleh plasmid DNA.

Pada umumnya, bakteriosin non lantibiotik disintesis melalui jalur

ribosomal, sedangkan kelompok lantibiotik disintesis secara ribosomal

sebagai prepeptida kemudian mengalami modifikasi. Sekresi

prepeptida dilakukan pada fase eksponensial dan diproduksi secara

maksimal pada fase stasioner. Prinsip regulasi sintesis bakteriosin

diatur oleh adanya gen pengkode produksi dan pengkode immunitas.

Aktivitas produksi bakteriosin oleh bakteri asam laktat dipengaruhi oleh

faktor pH, suhu, sumber karbon, serta fase pertumbuhan. Jenis sumber

karbon maupun sumber nitrogen yang digunakan dalam medium

produksi mempengaruhi laju pertumbuhan sel bakteri asam laktat,

selanjutnya berpengaruh terhadap metabolisme produksi bakteriosin.

Selain itu, tingkat salinitas medium produksi seperti kandungan garam

dari media turut mempengaruhi metabolisme produksi bakteriosin.

Secara umum kondisi optimum produksi bakteriosin selain dipengaruhi

oleh fase pertumbuhan, pH media, suhu inkubasi, jenis sumber karbon

dan sumber nitrogen juga konsentrasi NaCl (Kim, 1990).

2.6.2 Penggolongan Bakteriosin

Bakteriosin berdasarkan sifat kimia, struktur dan fungsinya dibagi

menjadi 4 kelas yaitu

a. Kelas I : Lantibiotik, peptida molekul kecil dengan berat molekul

kurang 5 kDa mengandung lanthionine (Lan), β-metyl lanthionine

(MeLan), dehydroalanine dan dehydrobutyrine serta mengandung

19 sampai 50 asam amino. Kelas ini dibagi lagi menjadi menjadi 2

tipe berdasarkan struktur kimia dan aktifitas antimikroba, yaitu tipe

A dan tipe B. Tipe A memiliki bentuk ulir, bermuatan positif,

aktifitasnya berhubungan dengan pembentukan pori pada membran

sel. Tipe B memiliki bentuk globular bermuatan negatif atau netral,

aktifitas mikrobanya terkait dengan penghambatan enzim spesifik.

b. Kelas II : peptida yang stabil terhadap panas, berat molekul lebih

kecil dari 10 kDa, tidak memiliki asam amino lantionine dan tidak

terjadi perubahan asam amino. Kelas ini dibagi menjadi tiga

subkelas, yaitu bakterosin yang mempunyai efek antilisterial (IIa),

bakteriosin dengan dua peptida (IIb), dan bakteriosin yang

disekresikan melalui sec-dependent (IIc). Namun menurut van

Belkum dan Stiles dalam Supajo (2009) membagi kelas bakteriosin

ini menjadi enam subkelas antara lain IIa : cystibiotics dengan dua

ikatan disulfida yang dihasilkan dari empat asam amino sistein.

Contoh pediosin PA-1, pediosin AcH, Enterocin A dan Divercin

V41. IIb : Cyntibiotics dengan satu ikatan disulfida dari dua residu

sistein pada N-section peptida, contoh pada leucocin A. IIc :

cyntibiotics dengan satu ikatan disulfida pada N- dan C-section

peptida, contoh pada carnobacteriocin A dan enterocin B. IId :

peptida yang mengandung satu (thiolbiotics) atau tanpa sisten,

contoh pada lactococcin A dan B. IIe : bakteriosin yang memiliki

dua peptida, contoh pada thermophilin 13, lactacin F, plantaracin S,

plantaracin A, plantaracin EF, plantarain JK, lactococcin G dan

lactococcin M. Iif : bakteriosin khas, contoh entrocin 4.

c. Kelas III : protein labil terhadap panas dengan molekul lebih besar

dari 30 kDa

d. Kelas IV : suatu kelompok bacteriocin kompleks. Protein ini

mengandung lipid atau karbohidrat (glikoprotein dan lipoprotein),

Bakteriosin yang bersifat hidrofobik dan stabil terhadap panas.

(Alpay et all, 2003 ; Suparjo, 2008).

Tabel 1. Klasifikasi Bakteriosin

Kelompok Karakteristik Contoh Bakteriosin Bakteri Penghasil

I A Molekul kecil (2-5 kDa),

mengandung asam amino

lanthionine dan β-

methyllanthionine,

bermuatan positif,

berbentuk ulir

Nisin Lactococcus lactis

Pep 5 Stapylococcus epidermidis

Epidermin Stapylococcus epidermidis

Lactoccin S Lactobacillus sake

Gallidermin Stapylococcus gallinarum

Lacticin 481 Lactococcus lactis

B Molekul kecil (< 2 kDa),

bermuatan negatif atau

netral, berbentuk globular

Marsacidin Bacillus subtilis

Actagardin Actinoplasnes sp

Cinnamycin Streptomyces cinnamoneus

II a Peptida anti-listerial Pediosin PA-1/AcH Pediococcus acidilactici H /

PAC1.0

Sakacin A Lactobacillus sake LB706

Sakacin P Lactobacillus sake LTH 674

Leucocin A-

UAK187

Leuconostoc gelidium

UAL187

Carnobacteriocin B2 Carnobacterium piscicola

LV17B

Mesentrecin Y105 Leuconostoc mesenteroides

Lactococcin MMFII Lactococcus lactis

B Bakteriosin 2-peptida Lactococcin G Lactococcus lactis

Lactococcin M Lactococcus lactis

Lactacin F Lactobacillus johnsonii

Plantacirin A Lactobacillus plantarum

Plantacirin EF Lactobacillus plantarum

Plantacirin JK Lactobacillus plantarum

C Bakteriosin yang

disekresikan melalui sec-

dependent

Acidin B Lactobacillus acidophilus

Carnobacteriocin A Carnobacterium piscicola

LV17A

Divergicin A Arnobacterium divergens

LV13

Enterocin P Enterococcus faecum

Enterocin B Enterococcus faecum T136

Lactococcin A Lactococcus lactis LMG2130

Lactococcin B Lactococcus lactis WMA4

Acidocin B Lactobacillus acidophilus

M46

Cerein 7 / 8 Bacillus cereus Bc7

III Molekul besar (> 30 kDa)

sensitif terhadap panas

Helveticins J Lactobacillus helveticus

Helveticins V-1829 Lactobacillus helveticus

IV Mengandung protein dan

lipid

Lactococcin 27

Lacstrecins

(Suparjo,2008)

Bakteriosin berdasarkan kandungan sistein atau ikatan disulfida

dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu

1. Cystibiotic; mengandung dua atau lebih asam amino sistein untuk

ikatan disulfida

2. Thiobiotic ; mengandung satu sistein

3. Tanpa sistein

Tabel 2. Penggolongan Bakteriosin Berdasarkan Kandungan Sistein

Bakterosin Berat Molekul

(kDa)

Asam

Amino

Bakteri Penghasil

Cystibiotics

Pediosin AcH/PA1

Leucocin A/UAL 187

Mesentericin Y 105

Sakacin A

Sakacin P

Lactacin F

Carnobacteriocin A

Carnobacteriocin BM1

Carnobacteriocin B2

Cerein 7/8

4,6

3,9

3,8

4,3

4,4

5,6

6,1

4,5

4,9

4,9

44

37

37

41

43

57

53

43

48

56

Pediococcus acidilactic H/PAC1.0

Leuconostoc gelidium UAL 187

Leuconostoc mesenteroides Y 105

Lactobacillus sake LB706

Lactobacillus sake LTH 674

Lactobacillus acidophilus 11088

Carnobacterium piscicola LV 17A

Carnobacterium piscicola LV17B

Carnobacterium piscicola LV17B

Bacillus cereus Bc7

Thiolbiotics

Lactococcin B 5,3 47 Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4

Non Sistein

Lactococcin A

Lactococcin M

Lactococcin N

Lactococcin Gα

Lactococcin Gβ

5,8

4,3

4,4

4,3

4,1

54

48

47

39

65

Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4,

Lac. lactis subsp cremoris LMG 2130

Lac. lactis subsp lactis bv diacetylactic

WM4

Lac. lactis subsp cremoris 9 B4

Lac. lactis subsp cremoris 9 44

Lac. lactis subsp lactis LMG 2081

Lac. lactis subsp lactis LMG 2081

(Suparjo,2008)

2.6.3 Mekanisme Kerja Bakteriosin

Usmiati (2009) menyebutkan bahwa target utama bakteriosin adalah

membran sitoplasma sel bakteri karena reaksi awal bakteriosin adalah

merusak permeabilitas membran dengan membentuk pori pada

membrane sel dan menghilangkan gaya gerak proton (proton motive

force (PMF)). Gaya gerak proton merupakan gradien elektrokimia

membran sitoplasma yang mengatur sintesis dan penimbunan ATP.

Kegagalan gaya gerak proton menyebabkan kematian sel melalui

penghentian semua reaksi yang membutuhkan energi, biosintsesis

protein atau asam nukleat (Suparjo, 2008).

Pembentukan pori pada membran sel menyebabkan destabilitas

membran sehingga dapat mengganggu kesetimbangan ADP/ATP

intraseluler akibat kebocoran pospat anorganik, mengurangi daya gerak

proton dan jumlah kation bivalensi ( Mg2+

atau Ca2+

) yang

menyebabkan penetralan muatan negatif fosfolipid dan memungkinkan

perembesan ion ( K+ dan Mg

2+ ), asam amino dan ATP (Suparjo, 2008).

Aktivitas penghambatan bakteriosin membutuhkan reseptor spesifik

permukaan sel. Lipid membran sitoplasma yang bermuatan negatif

merupakan reseptor utama bakteriosin dalam proses pembentukan pori.

Interaksi elektrostatik bakteriosin yang bermuatan positif yang bersifat

hidrofobik dengan gugus fosfat bermuatan negatif pada membran sel

target merupakan tahap awal pengikatan bakteriosin dengan membran

target. Bagian hidrofobik bakteriosin masuk ke dalam membran

membentuk pori. Konduktivitas dan stabilitas pori pada bakteriosin

lantibiotik ditingkatkan melaui pengikatan molekul (molecule docking)

sedangkan pada bakteriosi kelas II, reseptor membran target bekerja

terhadap spesifikasi tertentu (Suparjo, 2008).

Proses pembentukan pori pada membran fosfolipid oleh peptida

membran aktif umumnya terjadi melalui dua mekanisme yaitu metode

tong kayu (barrel-stave model) dan model baji atau karpet (wedge

model or carpet model) (Gambar 1). Pada model tong, peptida

menghadap hampir tegak lurus terhadap membran, kemudian masuk

dan membuat saluran ion sepanjang membran diikuti dengan

pengikatan monomer tambahan membentuk pori. Pada model karpet,

peptida berikatan dengan permukaan membran, jika konsentrasi

ambang batas monomer peptida tercapai, membran ditembus dan pori

sementara terbentuk (Zhao,2003).

Gambar 1. Model Pembentukan Pori pada Membran, Barrel-Stave dan

Carpet Model (Zhao, 2003).

2.6.4 Imunitas Bakteri Penghasil Bakteriosin

Salah satu perbedaan bakteriosin dengan antibiotik adalah adanya

mekanisme perlindungan bakteri penghasil terhadap kerja

bakteriosinnya. Perlindungan pada bekteriosin lantibiotic dapat

dimediasi melalui protein imunitas, LanI dan lanFEG. Terdapat dua

sistem yang bekerja secara sinergis untuk melindungi sel penghasil dari

bakteriosinnya sendiri. LanI, yang sebagian besar berikatan pada sisi

luar membran sitoplasma, memberikan imunitas dengan mencegah

pembentukan pori oleh bakteriosin. LanFEG bekerja melalui

pengangkutan molekul bakteriosin yang telah masuk ke dalam

membran kembali ke medium sekeliling dan menjaga konsentrasi dalam

membran di bawah tingkat kritis (Suparjo, 2008).

Protein imunitas bakteriosin non-lantibiotics disandikan oleh suatu gen

yang terdapat pada bagian hilir gen bakteriosin, kecuali gen imunitas

bakteriosin kelas IIc. Sistem imunitas bakteriosin sejauh ini belum

berhasil dijabarkan semuanya kecuali LciA, protein imunitas

Lactococcin A (Gambar 2). LciA dapat mencegah aksi Lactococcin A

dengan mengikat kemudian menetralisir bakteriosin atau dengan

berinteraksi dan merintangi reseptor bakteriosin. Melalui interaksi

Lactococcin A- reseptor dalam LciA menjangkau kedalam membran

sitoplasma. Ujung C protein imunitas berada di luar sel sedangkan

ujung N berada didalam sitoplasma. Dengan mengikat reseptor, LciA

mencegah lactococcin A masuk ke dalam membran tetapi ikatan

lactococcin A pada reseptor tetap terjadi (Suparjo, 2008).

Gambar 2. Model Mekanisme Kerja Protein Imunitas

(Suparjo, 2008)

III. METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium

Molekuler Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung. Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2010 hingga

Juli 2010.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain tabung reaksi,

cawan petri dengan diameter 15 cm dan 30 cm, erlenmeyer ukuran 500 mL,

250 mL, 100 mL dan 50 mL, gelas ukur, ose, spatula, bunsen, vortex mixer,

neraca analitik, kompor listrik, autoklaf, laminar air flow, inkubator dengan

suhu 37oC, inkubator shaker, piranti elektroforesis protein (Mini Protean

Tetra Cell Biorad, USA), mikrotube, tip, mikropipet, pH meter, syringe,

pipet tetes, sarung tangan dan peralatan lainnya.

Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus

L2, dan Lactobacillus L3 yang diperoleh dari penelitian sebelumnya serta

isolat Lactobacillus L4 yang diperoleh dari hasil isolasi terbaru dari tempoyak

dengan ciri-ciri bentuk batang, gram positif, katalase negatif dan motil,

biakan Escherchia coli, Staphylococcus aures, Bacillus substilis, dan

Salmonella paratyphii yang diperoleh dari koleksi biakan Laboratorium

Mikrobiologi FMIPA Unila, media deMan Rogosa and Sharpe (MRS) Broth,

media Nutrient Broth (NB), bacteriological agar, akuades, akubides,

alumunium foil, kasa dan kapas.

C. Metode Penelitian

Penentuan karakterisasi jenis antibakteri dilakukan dua tahapan yaitu

penentuan asam organik dan protein sebagai senyawa antibakteri. Untuk

mengkarakterisasi senyawa asam organik yaitu dengan mengukur pH media

kultur sampai hari kelima fermentasi. Terjadinya penurunan pH

menunjukkan terbentuknya asam, maka akan dilanjutkan dengan menghitung

total asam yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus melalui titrasi dengan

0,1 N NaOH. Perlakuan disusun dalam faktorial dengan rancangan acak

kelompok lengkap (RAKL) dengan 2 kali pengulangan. Faktor pertama

adalah jenis isolat bakteri Lactobacillus, yakni L1, L2, L3 dan L4. Faktor

kedua adalah lama produksi senyawa antibakteri dari isolat Lactobacillus,

yakni hari ke-1, ke-2, ke-3, ke-4 dan ke-5. Variabel yang diamati yaitu

perubahan pH dan total asam yang dihasilkan oleh keempat isolat

Lactobacillus. Data yang diperoleh diuji dengan analisis ragam. Adanya

perbedaan nyata (p<0.01), maka dilanjutkan dengan uji Polynomial

Ortogonal.

Karakterisasi protein antibakteri dilakukan secara observasi. Karakterisasi

protein antibakteri ditentukan dengan menetralkan supernatant kemudian diuji

dengan metode difusi sumuran terhadap bakteri uji yaitu E.coli, Sa.

paratyphii, B. substilis dan St aureus. Jika terbentuk zona jernih diduga zat

antibakteri dapat berupa protein, maka dilanjutkan dengan menetukan berat

molekul protein yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan

menggunakan teknik Sodium Dodecyl Sulfat Polyakrilamide Gel

Elektoforesis (SDS-PAGE). .

D. Prosedur Kerja

1. Peremajaan Bakteri

Isolat bakteri Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan

Lactobacillus L4 dibiakkan dengan cara digores pada media MRS agar

miring, sedangkan untuk bakteri uji dibiakkan dengan cara digores pada

media NA miring.

2. Produksi Senyawa Antibakteri

Media produksi antibakteri disiapkan dengan komposisi MRS cair

ditambah 3 % glukosa (pH 6,2 ± 0,2). Masing-masing isolat Lactobacillus

L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4

diinokulasikan ke dalam lima erlenmeyer yang berisi 20 mL media

produksi. Setiap erlemeyer diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37o C

sesuai dengan lama produksi yaitu 1 hari, 2 hari, 3 hari, 4 hari dan 5 hari.

Setiap hari kultur dideteksi karakteristik senyawa antibakteri hingga hari

ke-5 fermentasi.

3. Karakterisasi Antibakteri Berupa Asam Organik

Asam organik dapat dideteksi melalui penurunan pH media kultur dan

dilanjutkan dengan mengukur total asam yang dihasilkan Lactobacillus

L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4. Media

kultur diambil sebanyak 5 mL secara aseptis dan diukur pH media dengan

menggunakan pH meter. Kemudian 5 mL kultur tersebut ditambahkan

sebanyak 10 mL aquades netral dan dititrasi dengan 0,1 N NaOH hingga

larutan menjadi netral. Total asam dapat dihitung dengan menggunakan

persamaan berikut :

Keterangan :

Jumlah NaOH = volume NaOH yang dibutuhkan untuk menetralkan

media.

Normalitas NaOH = 0,1 N

Jumlah Bahan = 5 mL

BM asam laktat = 90

4. Uji Daya Antibakteri

Setelah Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan

Lactobacillus L4 diinkubasi selama lima hari pada media kultur, media

tersebut diambil sebanyak 2 mL. Untuk memisahkan zat antibakteri

Jumlah NaOH x Normalitas NaOH x BM asam laktat

Total Asam =

Jumlah Bahan

dengan sel penghasil maka kultur disentrifuge dengan kecepatan 11.000

rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak

antibakteri yang diduga mengandung asam organik dan protein

penghambat. Untuk menghilangkan pengaruh aktivitas asam organik di

dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji maka supernatan dinetralkan

dengan menggunakan 1 N NaOH. Larutan tersebut digunakan untuk uji

daya hambat terhadap bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan, yakni E.coli,

Sa.paratyphii, B. substilis, dan St. aureus.

Bakteri uji diinokulasi sebanyak 1 ose ke dalam tabung reaksi yang berisi

5 mL aquades steril sampai diperoleh kekeruhan yang sama dengan

Standar Mac Farlan ( 3 x 108 CFU/mL ). Kemudian sebanyak 1 mL bakteri

uji dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan ditambahkan 25 mL media

NA steril. Supaya bakteri menyebar rata pada media maka cawan petri

diputar sesuai angka 8 sebelum media NA memadat. Setelah media

memadat, di dalam media dibuat lubang membentuk sumur dengan

diameter 1 cm. Sebelum larutan antibakteri dimasukkan ke sumur, bagian

bawah cawan petri dibuat 3 garis yang saling bersilangan dan pusat sumur

sebagai titik persilangan tiga garis tersebut ( gambar 3). Setelah itu,

larutan antibakteri dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 100 µL. Kultur

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Kemudian diukur diameter

zona bening yang dihasilkan sesuai dengan garis yang telah dibuat.

Gambar 3. Bentuk sumur dilihat dari bagian bawah cawan petri

5. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE)

dan Identifikasi Aktivitas Pita Protein

Masing-masing supernatan antibakteri yang akan diindentifikasi dicampur

dengan 5 x buffer sampel (lampiran) di dalam mikrotube. Supaya

tercampur dengan rata, campuran tersebut disentrifuge dengan kecepatan

10.000 rpm selama 10 detik. Elektroforesis protein menggunakan gel

pemisah ( 8 % polyakrilamide) dan gel penahan (4 % polyakrilamide)

(tabel 3). Setelah gel dipasang pada perangkat elektroforesis, 500 mL 5 x

buffer elektroforesis pH 8,3 dituangkan ke dalam chamber. Sebanyak 20

µL campuran sampel tersebut dimasukkan ke dalam gel penahan, dan

untuk standar sebanyak 2 µL ke dalam sumur gel penahan.

Tabel 3 . Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan

Komposisi 8 % Gel Pemisah

(mL)

4 % Gel Penahan

(mL)

Akuades 4,80 1,54

1,5 M buffer tris-HCl pH 8,8

+SDS

2,55 -

0,5 M buffer tris-HCL pH 6,8 - 0,65

30 % akrilamide 2,66 0,67

10 % APS 0,10 0,05

TEMED 0,01 0,01

Elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 100 volt 50 mA selama 1-

2 jam hingga migrasi bromo fenol biru berada dibagian bawah gel

pemisah. Gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromo

fenol biru diukur dari batas atas gel pemisah. Gel untuk mengetahui berat

molekul protein diwarnai dengan pewarnaan perak nitrat (AgNO3). Dalam

pewarnaan perak nitrat, mula-mula gel direndam dalam larutan fiksasi

selama 1 jam hingga semalam dengan diinkubasi bergoyang kecepatan

3.000 rpm. Kemudian gel tetap dalam keadaan bergoyang di rendam 50 %

etanol selama 20 menit. Setelah itu, gel tersebut direndam sebanyak dua

kali di larutan 30 % etanol (masing-masing selama 20 menit).

Selanjutnya gel direndam dalam larutan enhancer selama 1 menit.

Kemudian gel tersebut dicuci tiga kali dalam akuabides masing-masing 20

detik. Setelah dicuci, gel direndam dalam larutan perak nitrat selama 30

menit. Untuk memunculkan pita protein, gel direndam dengan larutan

natrium karbonat selama 3-5 menit sampai muncul pita protein. Untuk

menghentikan munculnya pita protein tersebut, gel direndam dengan

larutan fiksasi. Agar gel tidak menyusut ketika dalam penyimpanan,

maka gel direndam pada akuades selama semalam. Setelah itu, pita

protein yang muncul diukur jarak migrasinya. Berat molekul protein

diukur dengan menggunakan standar berat molekul rendah, yaitu

fosforilase b (otot kelinci) 94 kDa, albumin (serum bovin) 67 kDa,

ovalbumin (putih telur) 45 kDa, karbonat anhidrase (eritrosin bovin) 30

kDa, tripsin inhibitor (kedelai) 20,1 kDa, dan α-laktal-bumin (susu bovin)

14,4 kDa.

Gel untuk identifikasi pita protein penghambat kemudian direnaturasi

untuk menghilangkan SDS sesuai dengan Osmanagaoglu et all (1998).

Mula-mula gel direndam dalam larutan 20 % isopropanol selama 1 jam

dan dilanjutkan pada larutan 10 % asam asetat. Kemudian gel direndam

akuabides selama semalam dalam shaker dengan kecepatan 3.000 rpm

untuk menghilangkan pengaruh dari isopropanol dan asam asetat. Untuk

mengetahui daya hambat masing-masing protein penghambat, gel

diletakkan di atas media NA yang telah mengandung bakteri uji yang

paling sensitif terhadap protein penghambat (disesuaikan dari hasil uji

supernatan antibakteri yang dinetralkan). Media tersebut diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 37 oC. Di sekitar pita protein penghambat akan

bebas dari bakteri uji.

E. Diagram Alir

lam supernatan di

Produksi senyawa antibakteri dari isolat

Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 dengan lama

produksi, yakni hari ke-1, ke-2, ke-3, ke-4 dan

ke-5

Mengukur pH media

kultur

Memisahkan senyawa antibakteri

dari sel bakteri dengan cara

disentrifuge 11.000 rpm selama 5

menit

Mentitrasi 5 mL

media kultur dengan

0,1 N NaOH

Menghitung total

asam yang

dihasilkan isolat

Lactobacillus L1,

L2, L3, dan L4

Supernatan dinetralkan

dengan 1 N NaOH.

Larutan tersebut diujikan

terhadap bakteri E.coli,

Sa.paratyphii, B.

substilis, dan St. aureus

dengan metode difusi

sumur

Protein penghambat yang

terdapat di supernatant di

deteksi berat molekulnya

dengan teknik SDS-PAGE

Pewarnaan

perak nitrat

Uji daya

hambat pita

protein Menghitung

berat

molekul

protein

Menghitung

berat

molekul

protein

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Asam Organik

Selama penyimpanan 5 hari, pola perubahan pH pada keempat isolat

Lactobacillus dari tempoyak disajikan pada Gambar 4, sedangkan data

pengukuran pH dan total asam dapat dilihat pada Tabel 6.

Gambar 4. Pola perubahan pH media isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4

yang diamati tiap hari sampai hari ke 5

Nilai pH media produksi pada awal fermentasi adalah 6,2 untuk keempat

isolat. Gambar 4 menunjukkan terjadi penurunan pH hingga hari ke 5 waktu

produksi pada isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3

sedangkan Lactobacillus L4 hanya mengalami penurunan pH hingga hari ke 3

waktu produksi. Pada 4 hari dan 5 hari waktu produksi, pH media kultur

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

0 1 2 3 4 5 6

pH

Waktu Produksi (1 x 24 jam)

L1

L2

L3

L4

isolat Lactobacillus L4 mengalami kenaikan. pH terendah dari masing-

masing isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan

Lactobacillus L4 yaitu 3,50, 3,47, 3,54 dan 4,67. Penurunan pH yang

terbentuk berkisar 5,40 pada isolat Lactobacillus L4 dengan waktu produksi 1

hari hingga 3,47 untuk isolat Lactobacillus L2 dengan waktu produksi 5 hari.

Terjadinya penurunan pH media menunjukkan bahwa keempat isolat

Lactobacillus dari tempoyak menghasilkan asam-asam organik yang dapat

digunakan oleh isolat tersebut untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain.

Grafik perubahan total asam yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus L1,

Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 dalam membentuk

asam organik pada media MRS disajikan pada Gambar 5. Data yang

diperoleh dianalisis dengan analisis ragam yang dapat dilihat pada Tabel 4.

. Gambar 5. Total asam organik isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang

diamati tiap hari sampai hari ke 5

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

0 1 2 3 4 5 6

Tota

l Asa

m (

%)


L1

L2

L3

L4

Tabel 4. Analisis ragam total asam yang dihasilkan isolat Lactobacillus L1,

L2, L3 dan L4 terhadap waktu produksi (hari).

Sumber

Keragaman db jk kt F Sign

Ftb

1%

Ftb

5 %

Perlakuan 19 4.808,45 253,08 17,46 Sign * 2,97 2,14

isolat 3 3.256,64 1.085,55 74,90 Sign * 4,94 3,10

waktu 4 1.255,72 313,93 21,66 Sign * 4,43 2,87

iso x wak 12 296,08 24,67 1,70 tn 3,23 2,28

Galat 20 289,86 14,49

Total 39 5.098,30

Keterangan : * = berbeda nyata pada taraf 1% dan 5%

tn = tidak berbeda nyata

Hasil analisis ragam data total asam menunjukkan hubungan antara setiap

jenis isolat Lactobacillus yaitu berbeda nyata. Hal ini menjelaskan bahwa

setiap isolat Lactobacillus yang ditemukan dari tempoyak memiliki

kemampuan yang berbeda dalam hal menghasilkan asam-asam organik.

Perbedaan kadar asam organik tidak terlepas dari karakter dari masing-

masing isolat Lactobacillus. Setiap isolat memiliki kondisi optimum yang

berbeda dalam pertumbuhannya, antara lain pH, suhu dan kebutuhan nutrisi.

Tidak semua isolat Lactobacillus pertumbuhannya optimum berada pada pH

6,2 sehingga akan mempengaruhi fase pertumbuhan. Isolat Lactobacillus L1

mampu menghasilkan total asam sebesar 37,15 dan isolat Lactobacillus L2

sebesar 36,13 kemungkinan memiliki pH optimum pada pH 6,2 sehingga

lebih mudah untuk beradapatasi dan mencapai fase logaritmik secara optimal

dibandingkan dengan isolat Lactobacillus L3 sebesar 29,94 dan isolat

Lactobacillus L4 sebesar 7,98. Pada fase logaritmik, metabolit primer yang

diantaranya yaitu asam-asam organik banyak dihasilkan pada fase ini.

Isolat Lactobacillus L1 memiliki kemampuan terbesar untuk menghasilkan

asam organik, sedangkan isolat Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3

memiliki kemampuan menghasilkan asam organik lebih rendah dari isolat

Lactobacillus L1 serta isolat Lactobacillus yang memiliki kemampuan

menghasilkan asam organik terkecil yaitu isolat Lactobacillus L4.

Gambar 6. Uji polinomial orthogonal isolat Lactobacillus L1


y = -1.004x2 + 10.71x + 7.852R² = 0.975

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

0 1 2 3 4 5

Tpta

l Asa

m (

%)

Waktu Produksi ( 1 x 24 jam)

y = -1.177x2 + 11.62x + 6.214R² = 0.935

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

0 1 2 3 4 5

Tota

l Asa

m (

%)

Waktu Produksi (1x 24 jam)



Keragaman waktu produksi juga menunjukkan adanya perbedaan yang nyata

terhadap kadar asam organik yang diproduksi oleh keempat isolat

Lactobacillus. Selama fermentasi berlangsung, total asam organik yang

diproduksi oleh keempat isolat Lactobacillus meningkat hingga hari ke 5

waktu produksi. Waktu fermentasi menunjukkan beda nyata dengan

y = 0.075x2 + 4.859x + 3.276R² = 0.992

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

0 1 2 3 4 5

Tota

l Asa

m (

%)

Waktu Produksi (1x 24 jam)

y = -0.25x2 + 2.32x + 2.408R² = 0.930

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

0 1 2 3 4 5

Tota

l Asa

m (

%)


membentuk garis lengkung (kuadratik) dengan persamaan regresi

y = -1,004x2 + 10,71x + 7,852, R² = 0,975 untuk isolat Lactobacillus L1,

y = -1,177x2 + 11,62x + 6,214,R² = 0,935 untuk isolat Lactobacillus L2 dan

y = -0,25x2 + 2,32x + 2,408, R² = 0,930 untuk isolat Lactobacillus L4. Hal

ini berarti bahwa dengan semakin lama waktu fermentasi, total asam organik

memiliki kecendrungan untuk meningkat dan menurun pada hari tertentu.

Penurunan total asam disebabkan karena asam organik yang dihasilkan

keempat isolat Lactobacillus ada yang bersifat volatil. Menurut Ekowati

(2000), hasil analisis asam organik isolat Lactobacillus dari tempoyak

terdapat asam-asam organik antara lain asam laktat, asam asetat, asam

propionat dan asam butirat. Asam butirat merupakan asam organik yang

bersifat volatil sehingga tidak terjadi akumulasi asam butirat. Selain itu, asam

organik yang tidak volatil kemungkinan juga dimanfaatkan oleh bakteri untuk

metabolisme selanjutnya (Mayasari, 2007).

Berdasarkan persamaan regresi, isolat Lactobacillus L1 menghasilkan asam

organik maksimum pada hari ke 5 waktu produksi yaitu sebesar 37,15.

Begitu juga dengan isolat Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L4

menghasilkan asam organik maksimum pada hari ke 5 waktu produksi yaitu

36,13 untuk Lactobacillus L2 dan 7,89 untuk Lactobacillus L4.

Peningkatan produksi asam organik terbesar pada hari ke-5 waktu produksi

menunjukkan bahwa aktivitas ketiga isolat bakteri Lactobacillus mencapai

fase pertumbuhan logaritmik. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Kartika

(2000) bahwa fase logaritmik isolat Lactobacillus yang berasal dari tempoyak

mulai pada hari ke-0 sampai hari ke-7.

Total asam yang dihasilkan isolat Lactobacillus L3 terhadap waktu produksi

(hari) menunjukkan pola linier dengan persamaan regresi y = 0,075x2 +

4,859x + 3,276, R² = 0,992. Hal ini berarti produksi asam organik oleh isolat

Lactobacillus L3 selama 5 hari fermentasi mengalami peningkatan.

Interaksi antara isolat dengan waktu produksi tidak berbeda nyata. Hal ini

berarti bahwa interaksi setiap isolat dengan keragaman waktu adalah sama.

Data total asam terbesar dihasilkan oleh isolat Lactobacillus L1 pada hari

kelima sedangkan total asam terkecil dihasilkan oleh isolat Lactobacillus L4

pada hari pertama.

B. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Protein

Ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus

L3 dan Lactobacillus L4 sebelum dinetralkan mampu menghambat

pertumbuhan dari bakteri Stapylococcus aureus, Bacillus substilis,

Escherchia coli, dan Salmonella paratyphii dengan terbentuknya zona hambat

disekitar sumur. Namun, ketika ekstrak antibakteri keempat isolat tersebut

dinetralkan dengan NaOH hanya ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L4

terhadap St. aureus yang masih membentuk zona hambat sedangkan yang

lainnya kemampuan ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus

L2 dan Lactobacillus L3 terhadap St aureus, B. substilis, E. coli dan Sa.

paratyphii dan ektrak antibakteri L4 terhadap B. substilis, E. coli dan

Sa. paratyphii hilang atau tidak menghasilkan zona hambat ( Tabel 5 ).

Fungsi penetralan bertujuan untuk menghilangkan pengaruh dari asam

organik yang digunakan oleh keempat isolat Lactobacillus untuk

menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri uji.

Tabel 5. Zona hambat dari ekstrak antibakteri isolat Lactobacillus L1, L2, L3

dan L4 sebelum dan sesudah dinetralkan terhadap bakteri uji

Bakteri Uji

Ekstrak antibakteri

sebelum dinetralkan

Ekstrak antibakteri

sesudah dinetralkan

L1 L2 L3 L4 L1 L2 L3 L4

Staphylococcus aureus + + + + - - - +

Bacillus substilis + + + + - - - -

Escherchia coli + + + + - - - -

Salmonella paratyphii + + + + - - - -

Keterangan : + = terbentuk zona hambat ( ekstrak antibakteri menghambat

pertumbuhan bakteri uji) ,

- = tidak terbentuk zona hambat (ekstrak antibakteri tidak

menghambat pertumbuhan bakteri uji)

Hasil dari elektroforesis gel polyakrilamid, SDS PAGE, dapat dilihat bahwa

pada isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3 tidak

terdapat pita protein yang terbentuk, sedangkan isolat Lactobacillus L4

terdapat empat pita protein dengan berat molekul 15 kDa, 24 kDa, 53 kDa

dan 169 kDa akan tetapi protein tersebut tidak mampu menghambat

pertumbuhan St. aureus ( Gambar 6 dan 7). Tidak terbentuknya zona hambat

pada pita protein Lactobacillus L4 kemungkinan disebabkan karena kadar

protein yang terlalu sedikit untuk menghambat pertumbuhan St. aureus yang

tumbuh pada gel.

Keempat isolat Lactobacillus yang ditemukan pada tempoyak tidak memiliki

protein penghambat yang dapat menghambat pertumbuhan St. aureus,

B. substilis, E. coli dan Sa. paratyphii.. Menurut Kusmiati dan Malik (2002),

protein penghambat memiliki pengaruh bakterisidal dan bakteriostatik

terhadap bakteri yang mempunyai hubungan dekat dengan bakteri

penghasilnya karena bakteri target memiliki sifat pengikatan spesifik (specific

binding site) sehingga kemungkinan isolat Lactobacillus L4 memiliki protein

penghambat yang menghambat pertumbuhan bakteri selain bakteri St aureus,

B. substilis, E. coli dan Sa. paratyphii.

Ekstrak antibakteri Lactobacillus L4 yang telah dinetralkan membentuk zona

hambat disebabkan karena ada senyawa lain selain protein dan asam organik

yang berperan dalam menghambat pertumbuhan Sa aureus pada isolat

Lactobacillus L4, seperti hydrogen peroksida, etanol, diasetyl dan karbon

dioksida.

169 kDa

53 kDa

24 kDa

15 kDa

M a b c d

Gambar 6. SDS-PAGE isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4

Keterangan : M = protein standart

a = protein dari isolat Lactobacillus L1

b = protein dari isolat Lactobacillus L2

c = protein dari isolat Lactobacillus L3

d = protein dari isolat Lactobacillus L4

Gambar 7. Gel SDS-PAGE ektrak antibakteri L4 yang diuji terhadap

St.aureus.

Jenis – jenis Lactobacillus yang mampu menghasilkan protein penghambat

dalam bentuk bakteriosin antara lain L. plantarum ST194BZ menghasilkan 2

bakteriosin dengan berat molekul 3,3 kDa dan 14 kDa (Todorov dan Dick,

2005), L. amylovorus LMPGP-13139 menghasilkan bakteriosin dengan berat

molekul 4,5 dan 6 kDa (Contreras et all, 1996) , L. sake menghasilkan

sakacin B dengan berat molekul 6,3 kDa (Samelis et all, 1994), L.

acidophilus menghasilkan acidophilin 801 dengan berat molekul 6,5 kDa

(Zamfir et all, 2001), L. bavaricus M1401 menghasilkan bavaricin A dengan

berat molekul 3,5-4 kDa (Larsen et all, 1993), L. gaseri KT7 menghasilkan

gassericin KT7 dengan berat molekul 4,5-5 kDa (Zhu et all, 2000). Namun,

ada juga jenis Lactobacillus yang tidak menghasilkan protein penghambat

berupa bakteriosin seperti L. fermentum, L. delbrueckii dan L. reuteri (Sanni

et all,1999)

Bakteriosin disintesis mengikuti pola sintesis protein. Sistem ini diatur oleh

plasmid DNA. Pada umumnya, bakteriosin non lantibiotik disintesis melalui

jalur ribosomal, sedangkan kelompok lantibiotik disintesis secara ribosomal

sebagai prepeptida kemudian mengalami modifikasi. Sekresi prepeptida

dilakukan pada fase eksponensial dan diproduksi secara maksimal pada fase

stasioner. Prinsip regulasi sintesis bakteriosin diatur oleh adanya gen

pengkode produksi dan pengkode immunitas (Kim, 1990).

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, maka didapatkan kesimpulan

sebagai berikut :

1. Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh keempat isolat Lactobacillus

yaitu berupa asam organik.

2. Isolat Lactobacillus L1 paling berpotensi menghasilkan asam organik

sebesar 37,15 dibandingkan dengan isolat Lactobacillus L2 sebesar 36,13,

isolat Lactobacillus L3 sebesar 29,94 dan isolat Lactobacillus L4 sebesar

7,98.

3. Waktu dalam mencapai total asam maksimum isolat Lactobacillus L1,

Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 pada hari ke-5

waktu produksi.

4. Isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2 dan Lactobacillus L3 tidak

menghasilkan protein sedangkan isolat Lactobacillus L4 menghasilkan

protein dengan berat molekul 15 kDa, 24 kDa, 53 kDa dan 169 kDa akan

tetapi bukan sebagai antibakteri.

B. Saran

Perlu diadakan penelitian lanjutan untuk mengetahui kadar potein penghambat

dan nilai optimum dari asam organik yang dihasilkan isolat Lactobacillus dari

tempoyak dengan memperbanyak waktu produksi dan mengetahui kondisi

optimum pertumbuhan dari keempat isolat Lactobacillus seperti suhu dan pH.

Tabel 6. Hasil Pengukuran pH Media Kultur Isolat Lactobacillus

Lactobacillus L1 L2 L3 L4

Hari

1 4,03 3,99 4,84 5,40

2 3,63 3,65 4,24 4,80

3 3,55 3,53 3,83 4,67

4 3,53 3,50 3,80 4,71

5 3,50 3,47 3,54 4,77

Tabel 7 . Hasil Pengukuran Total Asam Media Kultur Isolat Lactobacillus

Perlakuan Ulangan

X X2 X

1 2

L1H1 16,65 17,28 33,93 575,82 16,97

L1H2 29,07 23,40 52,47 1.392,62 26,24

L1H3 32,94 30,31 63,25 2.003,74 31,63

L1H4 34,02 31,57 65,59 2.154,03 32,80

L1H5 37,31 36,99 74,30 2.760,30 37,15

L2H1 17,46 13,32 30,78 482,27 15,39

L2H2 31,14 23,49 54,63 1.521,48 27,32

L2H3 32,38 28,42 60,80 1.856,16 30,40

L2H4 32,94 29,88 62,82 1.977,86 31,41

L2H5 36,16 36,09 72,25 2.610,03 36,13

L3H1 9,86 6,12 15,98 134,67 7,99

L3H2 16,56 10,44 27,00 383,23 13,50

L3H3 21,78 16,74 38,52 754,60 19,26

L3H4 28,26 17,26 45,52 1.096,54 22,76

L3H5 37,44 22,43 59,87 1.904,86 29,94

L4H1 4,25 4,21 8,46 35,79 4,23

L4H2 5,94 7,20 13,14 87,12 6,57

L4H3 5,76 8,32 14,08 102,40 7,04

L4H4 6,66 7,87 14,53 106,29 7,27

L4H5 7,56 8,39 15,95 127,55 7,98

Total 823,87 22.067,35 411,94

Gambar 9. Isolat Lactobacillus L1




L1 L2

L3 L4

Gambar 13. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan

L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus

L1 L2

L3 L4


L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus

L1 L2

L3 L4


L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis

L1 L2

L3 L4


L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis

L1 L2

L3 L4


L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli

L1 L2

L3 L4


L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli

L1 L2

L3 L4


L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii

L1 L2

L3 L4


L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii

Tabel 8. Penetuan kurva logaritma berat molekul protein standart terhadap

mobilitas relatif (rf)

Standart Berat Molekul

(Da) (Y) Log (Y) Mobilitas

Relatif (rf) (X)

α-lactal-bumin 14.400 4,16 0,956

Trypsin inhibitor 20.100 4,30 0,911

Carbonic an-hydrase 30.000 4,48 0,856

Ovalbumin 45.000 4,65 0,822

Albumin 66.000 4,82 0,778

Fosforilase b 97.000 4,99 0,722

Keterangan :

1. Jarak migrasi bromofenol biru untuk standart protein diukur dari batas atas

gel pemisah yaitu 4,5 cm

2. a. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Fosforilase b yaitu 3,25 cm

b. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Albumin yaitu 3,5 cm

c. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Ovalbumin yaitu 3,7 cm

d. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Carbonic an-hydrase yaitu 3,85 cm

e. Jarak dari batas atas gel pemisah ke Trypsin inhibitor yaitu 4,1 cm

f. Jarak dari batas atas gel pemisah ke α-lactal-bumin yaitu 4,3 cm

y = -3.652x + 7.636R² = 0.995

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

5.00

0.600 0.700 0.800 0.900 1.000

Log

Be

rat

Mo

leku

l (D

a)

Mobilitas Relatif (rf)



Linear (Mobilitas Relatif (rf))

Gambar 8. Grafik Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap

Mobilitas Relatif

Perhitungan Berat Molekul Protein

Untuk mengetahui berat molekul protein, mobilitas relative dimasukkan kedalam

persamaan y = -3,652x + 7,636

Tabel 9. Penetuan Berat Molekul Protein Terhadap Mobilitas Relatif (Rf) Pada

Isolat Lactobacillus L4

Mobilitas Relatif

(x) Log (y)

Berat Molekul

(Da) (y)

0,947 4,178 15.066,07

0,894 4,373 23.604,78

0,798 4,722 52.722,98

0,660 5,227 168.655,30

Keterangan :

1. Jarak migrasi bromofenol biru untuk sampel L4 diukur dari batas atas gel

pemisah yaitu 4,7 cm.

2. Jarak dari batas atas gel pemisah ke protein pada sampel L4 adalah 3,1

cm, 3,75 cm, 4,2 cm, dan 4,45 cm

Reagent yang digunakan

1. Larutan Standar Mac Farlan

Larutan 1 % asam sulfat (H2SO4) sebanyak 9,9 mL dicampur dengan 1 %

barium klorida (BaCl2.2H2O) sebanyak 0,1 mL. Kocok terlebih dahulu sebelum

digunakan.

2. 0,1 N NaOH

Sebanyak 40 g NaOH dilarutkan dalam1000 mL akuades. Larutan disimpan

dalam suhu ruang.

3. 1 % phenophetylen

Sebanyak 1 gram phenophetylen dilarutkan dalam 50 mL alkohol 96 % .

Setelah larut ditambahkan 50 mL akuades. Larutan disimpan dalam suhu

ruang.

4. 5 x buffer sampel

Larutan ini terdiri dari 0,12 mL 1 M buffer tris-HCl pH 6,8 (konsentrasi akhir

60 mM), 1 mL 50 % gliserol (konsentrasi akhir 25 %), 0,4 mL 10 % SDS

(2%), 0,1 mL β-merkaptoetanol (14,4 mM), 0,2 mL 1 % bromofenol biru

(0,1%) dan 0,18 mL akuabides. Sampel protein diencerkan dengan perbadingan

1:4 dengan 5x larutan stok. Larutan disimpan pada suhu 4oC.

5. 5 x buffer elektroforesis pH 8,3

Larutan terdiri atas 9 g tris basa, 43,2 g glisin, 3 g SDS yang dilarutkan hingga

600 mL akuades. Untuk membuat 300 mL larutan, 60 mL 5 x larutan stok

diencerkan dengan akuades sebanyak 240 mL. Larutan disimpan pada suhu

4oC.

6. Elektroforesis gel polyakrilamide 30 % ( 29% : 1 % )

Sebanyak 29,2 g akrilamida dicampur dengan 0,8 g N’N’-bis-akrilamida dan

dilarutkan dengan akuades hingga 100 mL. Campuran disaring dengan kertas

saring, dan disimpan dalam botol gelap pada suhu 4oC. Sebelum digunakan

campuran tersebut divakum selama 15 menit pada suhu kamar.

7. 1,5 M buffer tris-HCl pH 8,8

Ke dalam 50 mL akuades dimasukkan 18,15 g tris (hidroksimetil) aminometan

(tris basa), pH diatur 8,8 dengan 1 N HCl. Akuades ditambah hingga 100 mL.

Larutan disimpan pada suhu 4oC.

8. 0,5 M buffer tris-HCl pH 6,8

Ke dalam 60 mL akuades dimasukkan 6 g tris basa, pH diatur 8,8 dengan 1 N

HCl. Akuades ditambah hingga 100 mL. Larutan disimpan pada suhu 4oC.

9. 10 % SDS

Sebanyak 0,1 g SDS dilarutkan dalam 1 mL akuades. Larutan disimpan pada

suhu 4oC dan dibuat segar setiap minggu.

10. 10 % Amonium Persulfat (APS)

Satu mL akuades mengandung 1 g APS. Larutan ini tersedia harus dalam

keadaan segar.

11. Larutan fiksasi

Larutan ini terdiri atas 25 % metanol, 12 % asam asetat, dan 63 % akuades.

Larutan ini disimpan dalam botol gelap pada suhu kamar.

12. Larutan enhancer

Sebanyak 0,02 g Na2S2O3.5H2O dilarutkan dalam 100 mL akuabides.

Larutan ini disimpan dalam botol gelap pada suhu kamar.

13. Larutan perak nitrat

Larutan ini terdiri atas 0,2 g AgNO3, 35 µL formaldehida, dan dilarutkan

dalam 100 mL akuabides. Larutan ini disimpan dalam botol gelap pada suhu

kamar.

14. Larutan natrium karbonat

Larutan ini terdiri dari 6 g NaCO3 dan 48 µL formaldehida dalam 100 mL

akuabides. Larutan ini tersedia dalam keadaan segar.

Documents

KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI ...digilib.unila.ac.id/20401/1/SKRIPSI PRATIKA VIOGENTA 0617021058.pdf · menunjukkan zat antibakteri berupa protein, ... Imunitas