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Introducción y
Posibilidades de la
Espectrometría de Masas: LC-GC/MS y LC-GC/MS/MS
Jornada sobre Posibilidades de la
Espectrometría de Masas
en Laboratorios de Investigación.
“El poder” del análisis comparativo de
muestras en Alimentación, Proteómica y
Metabolómica.
Miguel A. Martínez
Inma Alvarez
ICTAN
PCiTAL-UdL
www.ictan.csic.es
Servicios del ICTAN
ESTUDIOS DE VALORIZACION TECNOLÓGICA
ESTUDIOS DE NUTRICION
SERVICIOS ANALITICOS (externos e internos)
• U.S. Técnicas Analíticas, Instrumentales y Microbiológicas (USTA)
• Laboratorio de espectrometría de masas
• Laboratorio de cromatografía general
• Laboratorio de análisis elemental y minerales
• Laboratorio de caracterización y propiedades físicas
• Laboratorio de instrumentación preparativa
• Laboratorio de espectroscopía
• Área de Microbiología
• Área de Cultivos Celulares
• Calidad y Calibraciones
Análisis instrumental en matrices alimentarias y muestras biológicas
Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160)
Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160)
Servicios del ICTAN
SERVICIOS DE PLANTA PILOTO
• Instalaciones para el procesamiento de distintos tipos de alimentos
• Tratamiento de atmósferas controladas, envasado, microinyección, etc.
• Sistemas de congelación
• Equipo de altas presiones
• -20ºC – 100ºC
• 0 a 900 Mpa
• 1,7 L
• Primer equipo europeo capacidad en rangos amplios de P., T., V.
•Nuevas instalaciones frigoríficas
• 34 cámaras
• 12 Cabinas de atmósferas controladas
• 230 m2 útiles
Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160)
Planta Piloto
Cámaras
Se pueden visitar las instalaciones después del coctel
Requisitos de las técnicas en un Servicio Análisis
Técnica/método Robusto ( reproducible, fiable, independiente del operador)
Preciso
Baja incertidumbre
Instrumental ( automatizable o poco dedicado.)
Versátil (aplicable a distintas muestras/matrices)
Requiera poca muestra, poca manipulación
Rápido
Interferencias nulas o controlables
Coste razonable
Separa
Identifica
Cuantifica
Información estructural
Masa [cuasi]Molecular
No necesita siempre una separación perfecta
Elección del método de análisis :
¿por qué invertir tantos recursos (€) en MS?
Separación de los analitos
Electroforesis
C E
Ultracentrifugación (polímeros)
E. Vis-UV
Absorción Atómica
Infrarrojo
RMN
Electroanálisis
Métodos Térmicos
Cromatografía
Separativa
Escasamente identificativa
No separativa
Identificativa
Qué puedo hacer con mi extracto?
E. Masas
Extracto
Herramienta mas versátil & eficaz:
ACOPLAMIENTO
CROMATOGRAFIA - E. MASAS
identificación cuantificación
Requisitos Técnicas Análisis en muestras biológicas
de alimentos
Pe
so
Mo
lec
ula
r
Polaridad del analito/
Solubilidad en Agua
LC/MS
API-Electrospray
LC/MS-APCI 1.000
100,000
10,000
no polar muy polar
LC/MS-
APPI
GC/MS
• Requiere técnicas con un muy amplio rango de aplicabilidad.
• Muy elevada selectividad, especificidad y sensibilidad.
• Poder cuantificar trazas de compuestos en complejas matrices.
El acoplamiento Cromatografía / Espectrometría de Masas (LC/MS y GC/MS) es la técnica que:
• Ofrece la mejor sensibilidad y versatilidad para el amplísimo rango de compuestos y matrices a analizar en un laboratorio.
• Permite obtener perfiles masivos de metabolitos y proteínas.
• Combinado con la Bioinformática está “revolucionando” las posibilidades de la investigación multidisciplinar
LC + Nano LC
Solubles
GC + GC x GC
volatilizables
C E + Analitos
iónicos
TOF / q-TOF TRAP QqQ Q-TRAP
sQ
GC
MS
Ejemplos de Instrumentación en MS:
Instrumentos híbridos. Acoplamientos especiales
[lc] Orbi-TRAP
LC-ICP-MS (AGILENT 2007)
Maldi-TOF
Maldi-TOF-TOF
TÉCNICAS MULTIDIMENSIONALES [RP]LC-GC-MS
Acoplamiento directo de cromatografía de
líquidos, cromatografía de gases y espectrometría de masas
Laboratorio grupo Dra. Marta Herraiz
ICTAN
Instrumentos hibridos
GC HORNO
(3) (2)
(1) 1)1)
(1)
Interfaz TOTAD: (1) material absorbente o adsorbente; (2) lana de vidrio; (3) tapón calefactado; (EV1
y EV2) electroválvula 1 y 2; (EPC) controladores de presión electrónicos; (PR) regulador de presión;
(FR) regulador de flujo; (ST1) tubo de acero inoxidable, 0,25 mm d.i., para transferir el eluyente del
LC a la válvula de seis vías; (SCT) capilar de sílice fundida, 0,32 mm d.i.; (WT) tubo del desecho;
(NV) válvula de aguja; (W) desecho. (Villén y col., 1999)
Interfaz “TOTAD”
Minutos
20 40 60 80
1,2 mL
1,5 mL
(R)-limoneno
(S)-carvona
(S)-carvona
(R)-limoneno
Minutos 0 1 2 3 4 5
AU
0
1
2
3
4 0
,92
2,1
2
3,6
3
Transferencia de 0,92
min a 2,12 min
Transferencia de 2,12
min a 3,63 min
Carum carvi
RPLC
GC-MS
Laboratorio grupo Dra. Marta Herraiz
MINIMIZA (O ELIMINA) LA ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA
INTEGRA LA PRE-SEPARACIÓN DE MUESTRA EN EL ANÁLISIS
PERMITE EL USO DE FASE NORMAL (NP) Y FASE INVERSA (RP) EN LC
REDUCE EL USO DE DISOLVENTES
DISMINUYE EL TIEMPO TOTAL DE ANÁLISIS
PROPORCIONA BAJOS LÍMITES DE DETECCIÓN
PERMITE AUTOMATIZAR EL ANÁLISIS COMPLETO
LC-GC-MS
Un espectrómetro de masas consta principalmente de combinación de 3 componentes
Múltiples
diseños
sQ
QqQ
ToF
QToF
MaldiToF
Trap
etc
En
tra
da
Inte
rfa
se
s
ES
I,
AP
CI,
M
AL
DI,
…
ALTO VACíO
INTERFASES MS: Para poder ser detectadas, las moléculas
tienen que ser ionizadas.
Los iones son guiados al interior
del MS, sin capilar, mediante
campos electromagnéticos
Gas secante auxiliar aire caliente
TurboV ion Source (ESI)
Qjet ion Guide
La muestra es coprecipitada
en el seno de una matriz que
absorbe la energia del pulso
laser y la transfiere a la
muestra , que se carga con +1
INTERFASES MS: Para poder ser detectadas, las moléculas
tienen que ser ionizadas.
INTERFASES LC API ESI y APCI
SOLO LO QUE SE IONIZA PUEDE SER DETECTADO POR EL
ESPECTRÓMETRO DE MASAS
ESI Jet –Stream Agilent
TIC (Total Ion Chromatogram)
Información cuantitativa: - Área pico (TIC:no selectiva - EIC:selectiva)
Información cualitativa (ID):
-Tiempo Retención - Espectro de Masas
Información Proporcionada por LC-GC-CE /MS. Ejemplo Drogas de Abuso mediante LCMS-TOF Nota aplicación 5989-0667EN
Tr
m/z
Int. EIC ( =Ion extraído)
m/z 300.0-300.2
CROMATOGRAMA SELECTIVO
Utilizados para cuantificación
1
4
Isómeros => igual m/z
exacta
Se requerirá su
separación
cromatográfica
HPLC MS:QTOF
Espectros LC/MS (Ionización a Presión Atmosférica–API )
“versus” GC/MS (Ionización por Impacto Electrónico-EI)
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
4.0e5
4.5e5
5.0e5 5.4e5
Inte
nsid
ad
TOF MS: 5.672 to 5.833 min from TIC
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
277.087
279.084 [M+H]+=277.0874
m/z
Contribución del Cl(37) de aprox. 2/3 2 átomos Cl
Espectro LC/MS (API-ESI)
Clenbuterol
GC
MS
180 40 60 80 100 120 140 160 200 220 240 260 280 0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
m/z-->
Abundance #103730: Clenbuterol (PM = 276Da)
276
86
57 127
41
190 71 243 99 166 154 140 259
Espectro GC/MS (EI)
N H
N H 2
Cl
Cl
O H
C H 3
C H 3 C H 3
86
HPLC MS:QTOF
Espectros LC/MS (API-ESI ) : Iones carga múltiple
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
4.0e5
4.5e5
5.0e5 5.4e5
TOF MS: 5.672 to 5.833 min from TIC
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
277.087
279.084 [M+H]+=277.0874
Clenbuterol
m/z
m/z
Moléculas con varios grupos ionizables (ppdes. acido/base)
Aminoácidos ( lisina)
Péptidos
Proteínas
Adquieren múltiples cargas (ejem. nH+)
Cada molécula con n cargas origina una señal
El espectro muestra todas las posibilidades
Espectro de masa de
proteína ESI-TOF
La determinación de la Masa
Molecular requiere un programa de cálculo o
deconvolución.
M = 16992.8
TOF MS 6.45 to 6.78min from TIC
Mioglobina
El espectro de masas (intensidad de señal “versus” relación masa/carga (m/z)) y el perfil isotópico
son la base de la Bioinformática aplicada a estudios de proteómica y metabolómica
Espectros LC/GC/MS
¿Cómo Lograr Información Estructural en LC/MS?: MSn
SCAN MS2 [579]
579- 433 =146
coincide con perdida hexosa
MS3 [433]
[MH+] -162 -146
[MH+] - 433-162= 271
coincide con perdida 2 hexosas
MS4 [271]
Fragmentación final estructura tipo flavona
Lc-Trap
¿Cómo Obtener Información Estructural en LC/MS de Compuestos No Aislados?: LC/MS/MS
Filtro
Masa
nº 1
SIM
Filtro Masa nº 2
SCAN
MS/MS del ión aislado (m1) en Q1
m1
m2
m1
Celda Colisión
rompe
+
+
+
+ Sistemas LC/MS/MS (QqQ / Q-TOF / TRAP):
se fragmenta en celda de colisión o
en la trampa de iones. Muy útil
cuando existe coelución de
compuestos (p.ej. en matrices complejas)
+TOF 5.688 to 5.849 min
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 1.5e5 1.6e5 1.7e5 1.8e5 1.9e5 132.0624
168.0385 203.0076
205.0046
170.0359 149.0898 133.0675 140.0202
[M+H]+=277 (Clenbuterol
totalmente
fragmentado.
con PERFIL ISOTOPICO)
NH
NH2
Cl
Cl
OH
CH3
CH3CH3
2Cl 1Cl
0Cl
Clenbuterol
170 210 250 290
210
222
268 280 165
Espectro con
iones del “fondo” (API: ESI, APCI,…)
Q1 sólo deja pasar
el ión “precursor”
210 pass
190 210
210
Q3 monitoriza sólo los
fragmentos 158 y 191
característicos del ión
210 para cuantificar y
cualificar con máx.
sensibilidad
160
158
190
191
sin “fondo químico”
Espectro de
una
fenilurea
Celda Colisión
rompe el ión
210 (y sus
productos)
150 170 190 210
210 158
191
Transición: 210 158
QqQ- MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con
Máxima Sensibilidad, Selectividad y Rapidez
QqQ 3m
MS/MS con “masa exacta”: Q-TOF. Ideal para Identificación de picos desconocidos y su confirmación estructural.
170 210 250 290
210
222
268 280 165
Espectro con
iones del
“fondo” (API:
ESI, APCI,…)
Q1 sólo deja
pasar el ión
“precursor”
210 pass
190 210
210
Celda Colisión
rompe el ión
210 (y sus
productos)
Tubo de Vuelo monitoriza con “masa exacta” TODOS los
fragmentos característicos del ión 210 para cuantificar
y cualificar con máxima información
y seguridad.
DC Quad
Octopole 2
Ion Pulser
Ion Mirror
Detector
Turbo
Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión
150 170 190 210
210.122
158.123
191.021 Espectro completo
sin “fondo químico” y con “masa exacta”
Tipos Cuantificación por LC-GC/MS: Se cuantifican múltiples compuestos en 1 análisis con
cromatogramas de iones selectivos.
- Relativa: proporcional a la intensidad de señal en otra
muestra. Utilizada en estudios comparativos.
- Absoluta: construcción de curvas de calibrado con
patrones a distinta concentración..
x103
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Abundance vs. Acquisition Time (min)
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
0.05 ng/µL (LLOQ)
0.25 ng/µL
0.50 ng/µL
2.50 ng/µL
5.00 ng/µL 0.15min
MRM 198.1108
A X mta
C X mta
Ácido Clavulánico 5 Levels, 5 Levels Used, 15 Points, 13 Points Used, 0 QCs
Concentración (Absoluta o Relativa)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
-4 x10
-0.25 0
0.25
0.5
0.75 1
1.25
1.5 1.75
2
2.25 2.5
2.75
3 3.25
3.5
3.75 4
4.25
4.5 4.75
Are
a p
ico
)
y = 4.1936E-005 * x - 2.7931E-007
R2 = 0.99474559
LLOQ: 0.05 ng/µL Clavulanic Acid in Plasma
ULOQ: (not determined)
Range: 0.05 ng/µL 5.0 ng/µL
LINEALIDAD 5 ORDENES
Posibilidades de la Espectrometría de Masas: Detección “Universal” de cualquier Compuesto Ionizado
1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 3.0e5 3.5e5 4.0e5 4.5e5 5.0e5 5.4e5
+TOF MS: 5.672 to 5.833 min lowhigh03.d Agilent
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
277.087
279.084
Clenbuterol C12H18Cl2N2O
[M+H]+=277.0874
Con Herramientas de Deconvolución Cromatográfica (MFE) y Análisis
Estadístico Multivariante (MPP) adecuadas:
• Permite obtener un perfil de centenares/miles de compuestos.
• “Caracterizar” los compuestos a comparar por su tiempo retención y:
• LC/MS: por su masa exacta (3-4decimales).
• GC/MS: por su espectro de EI
deconvolucionado (o su masa exacta).
• Correlacionar:
• Variaciones en la concentración de metabolitos/peptidos.
• Con distintas propiedades de 2 o más grupos de
muestras comparadas (organismo, órgano, tejido, célula,
fluido,…).
Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su
Acoplamiento con HPLC o GC en Alimentación
• Identificar y Cuantificar compuestos presentes en un alimento, incluyendo trazas de contaminantes.
• Realizar cribados masivos de centenares/miles de compuestos.
• Correlacionar cambios en la composición de alimentos con sus propiedades:
– Autentificar muestras, detectar fraudes.
– Evaluar el impacto de un tratamiento en la composición / conservación de un alimento.
– Evaluar el impacto de la composición de un alimento (p. ej. alimento funcional) en el metaboloma.
• Evaluar el impacto de una dieta o alimento en las rutas metabólicas de un organismo.
• ....
Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su
Acoplamiento con HPLC en Metabolómica
• Identificar y cuantificar metabolitos a muy bajo nivel.
• Comparar la concentración de los metabolitos presentes en varias muestras, p.e. para localizar potenciales biomarcadores.
• Evaluar el impacto en el metaboloma de factores exógenos (dieta/ fármaco/ entorno/…) o endógenos (p.e. enfermedad), a través del descubrimiento de las rutas metabólicas alteradas, o del seguimiento de los metabolitos involucrados en rutas concretas.
• ....
Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su
Acoplamiento con HPLC en Proteómica
• Identificar las proteínas presentes en una muestra. Requiere de motores de búsqueda que identifiquen en bases de datos, a que proteínas pertenecen las m/z de los espectros de MS/MS (MS) de los mapas péptidicos.
• Comparar los niveles de expresión de las proteínas presentes en varias muestras, p.e. para localizar potenciales biomarcadores. Requiere motores de búsqueda que admitan esta opción (p.e. SpectrumMill)
• Cuantificar péptidos y proteínas a muy bajo nivel de concentración
• Determinar con gran precisión el peso molecular de un proteína
• Determinar el peso y secuencia de aminoácidos de un péptido
• Detectar PTM’s en proteínas (por búsquedas en modo homología o por secuenciación de péptidos con MS/MS)
• Estudiar interacciones –no covalentes- entre biomoléculas: complejos proteína-proteína, proteína-fármaco, proteínas-metal, enzima-inhibidor,,…..
• ....
DISEÑO EXPERIMENTAL
PREPARACIÓN DE
MUESTRAS
Pesada
conservación 3. Si está en concentración muy inferior a interferentes
puede que no lo veamos
El equipo más preciso
no podrá aportar precisión si
no cuidamos la preparación
de la muestra ANÁLISIS = USTA
1. Si no está (perdida en filtrado, extracción)
no podremos analizarlo
2. Si está por debajo del limite de detección,
no podremos detectarlo
4. Si no sabemos lo que buscamos
pueden darse las tres anteriores
La selección adecuada de la muestra:
• Tiempo de exposición al tratamiento
• Recolección y conservación de la muestra etc.
La Muestra
SÓLO LO QUE SE IONIZA ES DETECTADO POR EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS
La Muestra
Alimentos
Fluidos biológicos
Tejidos
Cultivos celulares
• Compatibilizar la matriz con el análisis
• Todos los pasos previos de preparación de muestra sesgan los resultados
• Distintas técnicas aportan información complementaria: LC-MS, GC-MS
• Consideraciones prácticas:
• Utilización de controles: alícuotas de todas y cada una de las muestras analizadas
• Utilización de patrones internos
• En estudio con muestras de orina, corregir la dilución de las muestras
• Utilización de blancos: todos los reactivos de preparación de muestra aplicados sobre una matriz blanca sin muestra
La Muestra
Tipos de Muestra
Muchas
Gracias
Dra. Inma Alvarez
D. Miguel A. Martínez (J.U.)