Ionizacin por Electrospray

La ionizacin por electrospray (ESI) es una tcnica de ionizacin para pequeas cantidades de molculas grandes y/o lbiles tales como pptidos, protenas, organometlicos, y polmeros. La fuente de ESI opera a presin atmosfrica. Una solucin de la muestra es pulverizada a travs de un pequeo tubo dentro de un fuerte campo elctrico en presencia de un flujo de nitrgeno caliente para asistir a la desolvatacin. Las gotas formadas se evaporan en una regin mantenida a un vaco de varios torr causando que las cargas incrementen en las gotas. Los iones con carga se multiplican y luego entran al analizador. La ms obvia caracterstica de un espectro ESI es que los iones llevan mltiples cargas, que reduce su relacin marsa-carga comparada a una especie cargada individualmente. Esto permite que se obtengan espectros de masas para grandes molculas. Por ejemplo, la apo-mioglobina con un peso molecular de 16951.5 Da produce una serie de iones con estado de carga de +8 a +27 con picos de masas de alrededor de 600 a 2000 Da.

Normalmente se utiliza (H20/ACN = 50/50) como el flujo de fase mvil en ESI y las muestras son inyectadas utilizando una vlvula Rheodyne con un loop de 10 microlitros (figura 1).

Figura 1. Vlvula Rheodyne

Las muestras tambin pueden ser introducidas a travs de infusin directa utilizando una bomba de inyeccin. Adems, las mezclas complejas pueden ser analizadas mediante el acoplamiento de ESI MS con cromatografa lquida (LC-MS).

Pueden ser obtenidos espectros positivos y negativos de iones. Para el modo de ion-positivo, se aade usualmente 0.1% de cido frmico o cido actico dentro de la solucin de analito para mejorar la protonacin y aumentar la sensibilidad. Para el modo de ion-negativo, se aade usualmente 0.3% de NH4OH dentro de la solucin de analito para ayudar a la deprotonacin e incrementar la sensibilidad. Para protenas, tpicamente se utiliza una concentracin de 100 pmol/microlitro en (H20/ACN = 50/50) con 0.1% de cido frmico. Los compuestos tales como porfirinas y otros compuestos organometlicos son tpicamente corridos en CHCl3 a una concentracin alrededor de 100 pmol/microlitro.

Los buffers tales como fosfato, tris, y hepes no pueden ser utilizados. Incluso niveles de trazas de estos interfieren con el proceso ESI. Solo los buffers voltiles tales como acetato de amonio pueden ser utilizados. Excesos de Na+, K+, y detergentes son muy malos para ESI y frecuentemente no dan ninguna informacin. Los detergentes (PEG`s y PPG`s) son especialmente malos debido a que ellos trabajan muy bien por ESI y suprimen la ionizacin del analito. Es mejor no aadir cido a la muestra antes de someterla a ESI. Se diluye la muestra a la concentracin adecuada justo antes de correr la muestra.

Nota acerca de protenas y pptidos: protenas y pptidos no solucin no deben ser almacenadas en viales de vidrio. La experiencia indica que las protenas desaparecen irreversiblemente dentro del vidrio. Las muestras en solucin deben ser almacenadas en tubos centrifugas del tipo Eppendorf. Se debe utilizar los ms pequeos tubos disponibles (250 L) para muy pequeas cantidades de muestra.

Instrumentos ESI: Quattro, LCQ, Q-Tof. Tamao de muestra: 1-300 pmol/microlitro.La salida es en forma de serie de carga mltiple y datos transformados.

Finnigan LCQ Deca XP

Waters Quattro II

Micromass Q-Tof ltima

Cantidad de muestra necesaria para ESI

muestra seca (preferente)en Solucin

Protenas/Pptidos1g1g/100L

Polmeros1 mg1mg/250L

Dendrmeros1 mg1mg/250L

Organometlicos1 mg1mg/250L

Orgnicos1 mg1mg/250L

nterpretation of spectra - Atmospheric Pressure Ionisation (API)Electrospray - Positive IonMethod of choice for molecules that possess a basic site, i.e. a position to protonate, or preformed cations e.g. quaternary ammonium compounds.Ions observed:(M + H)+ => (M+ 1)(M + NH4)+=> (M + 18)(M + Na)+=> (M + 23)(M + K)+=> (M + 39)M+=> for quaternary ammonium species - very intense signal.If you see two ions separated by 5 amu then it suggests you have (M + NH4)+and (M + Na)+. Look for accompanying (M + H)+and (M + K)+. Similarly if you suspect (M + Na)+look for (M + K)+at 16 Da higher than (M + Na)+etc.If you see ions at much higher mass than you expect check for multimers e.g. (2M + H)+, (2M + NH4)+, (2M + Na)+, (3M + H)+etc. Generally multimers are observed if the sample is too concentrated, though some molecules 'self assemble' to give these higher mass species. (You can get 'mixed assemblies') Acetonitrile and methanol adducts (+ 41 & +32 Da respectively) are also sometimes observed.Electrospray - Negative IonFor molecules that possess an acidic site i.e. a position to deprotonate.(M - H)-=> (M - 1)-Deprotonation can be aided by addition of a trace of base, NH4OH, TEA, TPA. Formic acid and TFA adducts are often observed:(M + HCOOH - H)-=> (M + 45)-(M + TFA - H)-=> (M + 113)-Multiply Charged Molecules (Electrospray Only)Electrospray can produce ions of the type (M+nH)n+or (M-nH)-This capability allows molecules of mass greater than the mass range of the spectrometer to be analysed since the mass to charge ratio brings the peaks onto the range of the mass analyser.For the molecules that produce these multiple charge envelopes, acquire the data in continuum format. This allows the data to be post processed to provide a molecular ion on a real mass scale. This also simplifies determination of the charge states.N.B.Addition of ~ 0.1 to 1% HCOOH (or TFA) for positive ion or 0.1 to 1% NH4OH, TEA (TPA excellent for oligonucleotides) for -ve ion will aid ionization and is necessary to multiply charged species.