Embed Size (px)
Citation preview
CARACTERIZACION DE
LAS PROTEINAS:
PESO MOLECULAR.
DETERMINACION DE LA
ESTRUCTURA PRIMARIA.
ELECTROFORESIS.
V = E z / f v: velocidad de migración de la molécula en un
campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z: carga neta
de la proteína. f = 6phr es el coeficiente friccional. h (eta) es la
viscosidad del medio y r es el radio de la partícula.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas
(PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pI).
Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE):
IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda.
ISOELECTROENFOCADO: Separación por pI.
Las proteínas se corren en un gradiente de pH preformado, que se obtiene
sometiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos (polímeros
pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de pI. En A se carga
la muestra y se aplica el voltaje, con lo cual las proteínas migrarán hasta
llegar al valor de su pI, donde, al no tener carga neta, quedarán
enfocadas, lo que se observa en B.
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEINAS.
Mr = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000)
Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa).
A) Proteína nativa:
1) Ultracentrifugación.
2) Filtración por gel.
3) Espectrometría de masa.
B) Subunidad:
1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).
ULTRACENTRIFUGACION.
Fc= fuerza centrífuga. r = radio del rotor.
w = velocidad angular. w2r = campo centrífugo. = volumen específico parcial
(inversa de la densidad de la proteína).
m’ (masa efectiva) es menor que m (masa real) porque el flúido desplazado
ejerce una fuerza opuesta (1 – r) .
f= coeficiente friccional de la partícula = 6phr , donde h es la viscosidad del
medio y r el radio de la partícula.
v = Fc / f = m(1 – r)w2r / f
s = coeficiente de sedimentación (unidades 10-13 seg = 1 Svedberg).
s = v / w2r = m (1 – r) / f
La velocidad de sedimentación (v) depende en parte de la masa de la
partícula; tambien depende de su forma (una partícula compacta tiene un
valor de f menor que el de una alargada); una partícula densa se mueve
mas rápido que una menos densa porque su valor de (1 – r) es menor; y
depende tambien de la densidad de la solución (r): si r es < 1, se hunde; si es
> 1, flota y si es = 1 no se desplaza.
Ultracentrifugación zonal (en gradiente)
La solución de proteína se corre en un gradiente de densidad (por ejemplo,
sacarosa), con proteínas de s conocido como marcadoras.
Peso molecular
de subunidad:
Determinacion
por SDS-PAGE
ESPECTROMETRIA DE
MASA: SUS APLICACIONES
EN LA DETERMINACION DE
PESOS MOLECULARES DE
PROTEINAS Y EN LA
SECUENCIACION DE
PEPTIDOS.
Espectrometría de Masa
• La Espectrometría de Masa es una tecnica que permitedeterminar la masa de moléculas por medio de la medidade la relacion masa/carga (m/z).
• La medida de masas moleculares involucra la produccion,separación y detección de iones moleculares en fasegaseosa.
• Cada molécula puede originar iones moleculares con
distinto número de cargas ( y distintas m/z).
Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:
1) Fuente de iones.
2) Analizador de masas.
3) Sistema de detección y adquisición de datos.
Técnicas actuales para trabajo biológico:
1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por
matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)
2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis de
masas por cuadrupolo)
La solución a analizar se pasa a través de una
aguja hipodérmica mantenida a un alto
potencial. Se forma un cono de gotitas muy
finas, altamente cargadas, que irradian de la
punta de la aguja. Se evaporan rápidamente,
pasando las moléculas a analizar a la fase
gaseosa. Si son moléculas grandes se
producen iones con cargas múltiples.
ES/MSGENERACION DE IONES MOLECULARESIONIZACION POR ELECTROSPRAY
(ESI MS)
Aqueous
solution
This ionization method arises in the attempt to couple the LC to MS
The effect of vacuum, temperature and curtain gas causes the formation of
increasingly smaller drops until the molecule is fully desolvated in vacuum.
Sir Geoffrey Taylor (1964). "Disintegration of Water Droplets in an Electric Field". Proc. Roy. Soc. London. Ser. A 280 (1382): 383.
dripping,
burst,
pulsating,
cone-jet
1914, John Zeleny
What is the ionization mechanism in ESI?
No tolerant to the presence of salts, surfactants, inorganic acids, TFA no so
good for sensitivity, (regularly desalting steps are required, acetic and formic
acids are used in the mobile phase).
Lord Rayleigh, 1882
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES
MOLECULARES.
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES
MOLECULARES
Los iones se dirigen al vacío del espectrómetro de
masa de cuadrupolo a través de un orificio o capilar
calentado. El cuadrupolo consta de cuatro barras
metálicas paralelas que generan un campo eléctrico
oscilatorio. Los iones se separan en este campo:
sólo los de una determinada m/z se dejan pasar a
una determinada amplitud y frecuencia de
oscilación de los potenciales eléctricos aplicados a
las barras, y llegan al detector.
Quadrupole Mass Analyzer
From: http://www.chem.vt.edu/chem-ed/ms/quadrupo.html
Ion transmitted along the quadrupole in
an stable trajectory
Ions do not have an stable trajectory
and is ejected from the quadrupole
•Limited mass range (4 000 Da).
•Were the first mass analyzer to
be coupled to ESI.
•Excellent mass filters.
•Acquisition every 0.2-1 Da.
radiofrequency
DC: Direct current
RF: Radio frequency
GENERACION DE IONES MOLECULARESPseudocristales mixtos de una matriz (p.ej.: ácido 3,5-
dimetoxi-4-hidroxicinámico). Se los irradia con un pulso
de laser. La sublimación rápida de los cristales lleva a la
formación de iones moleculares protonados en fase gaseosa.
MALDI-ToF MS
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES.Se aceleran a una energía cinética de aprox. 25 KeV y se los
deja volar a través de una distancia fija sin campo eléctrico.
Teniendo energía cinética idéntica, los iones chicos se
mueven más rápido que los grandes y llegan antes al
detector. M/z se determina a partir del tiempo de vuelo,
comparando con standards.
Camera
Laser
Sample
plate
Pumping Pumping
Beam guide
Timed ion selector Reflector
Linear
detectorExtraction
gridsReflector
detector
ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROMETRO DE MASA
MALDI-TOF
Espectrometro
de masa,
MALDI-ToF
MALDI is a pulsed ionization source
• Sample mixed with a strong UV
absorbing matrix.
• The matrix absorbs energy from the
laser causing the sample and matrix to
be volatilized.
• Ionized matrix molecules transfer a
proton to the sample.
• Sample ions are then accelerated down
the flight tube for mass analysis (TOF
MS).
MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization.
Matrix : Analyte
1000:1 – 10000:1
Excess of
MatrixEasy Sample
prep:
•Dried droplet
•Layered method
Nd:YAG (355nm)
N2 laser (337 nm)
Ionization by
laser (pulses
1-5nsec
but….high
potency: kW
MW).
Compatible
with TOF
analyzers
Highly efficient
ionization
method
Matrices absorb strongly l of the laser irradiation
cold matrix
hot matrix
La relación masa a carga de un ion es proporcional al cuadrado
de su tiempo de vuelo.
t = Tiempo de vuelo
L = Longitud recorrida por los iones
dentro del analizador
m = Masa
K = Energía cinética del ion
z = Número de cargas en el ion
2
22
L
Kt
z
m
MALDI-MS
1. MALDI-MS spectra are very simple, only singly-charged ions are
observed: (M+H)+ or (M-H)-.
2. Very efficient ionization method. High sensitivity in the analysis
of biomolecules and biopolimers.
3. Ideal for the analysis of mixture of tryptic peptides (ID of
proteins by PMF, peptide mass fingerprinting).
4. High throughput analysis.
5. Compatible with Time of Flight mass analyzer.
6. Laser intensity may help to induce fragmentations and obtain
structural information.
SECUENCIACION
DE PEPTIDOS Y
PROTEINAS
¿Cuales son lo objetivos de la secuenciación de péptidos?
• Comparar estructuras primarias de diferentes proteínas paraestablecer relaciones evolutivas (actualmente, se hace mayormenteusando secuencias traducidas de secuencias de nucleótidos).
• Obtener una secuencia de péptido de una proteína desconocidaproveniente de un organismo cuyo genoma no está secuenciado; estopermitirá la síntesis de oligonuclótidos degenerados para identificary clonar el gen que la codifica.
•Confirmar la identidad de una proteína sospechada a partir de unexperimento de PMF.
•Identificar modificaciones post-traduccionales.
Cont.
SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.
Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de la
proteína purificada. La purificación puede consistir en obtener la
proteína pura en un tubo, a través de los métodos de purificación
ya mencionados, o, aún si no está completamente homogénea,
como una banda discreta en un gel de SDS-PAGE.
Para secuenciar una proteína siempre se la debe fragmentar
para obtener péptidos de menor tamaño, secuenciables por
distintos procedimientos. Esta fragmentación se hace
enzimáticamente (proteasas) o químicamente (p.ej.: BrCN).
Pasos a seguir para secuenciar una proteína pura
por el método de Edman.
1) Desnaturalizar, con urea por ejemplo, y reducir los puentes disulfuro.
2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo.
3) Fragmentar la proteína en péptidos mas pequeños, usando dos
métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN)
4) Separar los péptidos obtenidos por el primer método por HPLC en fase
reversa (RP-HPLC).
5) Tratar cada péptido purificado con el reactivo de Edman, isotiocianato
de fenilo, en un secuenciadorautomático.
6) Identificar los residuos de aminoácidos por RP-HPLC de los derivados
de feniltiohidantoína (PTH-aminoácido)on line en el secuenciador.
7) Hacer lo mismo con los péptidos obtenidos por el segundo método de
ruptura de la proteína.
8) Armar la secuencia por superposición de los péptidos obtenidos por
ambos métodos.
SECUENCIACION DE PROTEINAS Y
PEPTIDOS.
1) Método de Edman:
Previa separación de los péptidos por
HPLC en fase reversa, secuenciarlos
químicamente por reacción con el reactivo
de Edman (isotiocianato de fenilo), en un
secuenciador automático.
MDH-1
MDH-2
LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE
TRYPANOSOMA CRUZI
El Procise Protein Sequencing System de Applied Biosystems
Está compuesto por 4 módulos integrados: el Secuenciador propiamente dicho, el Microgradient Delivery
System, el detector de UV de longitud de onda variable, y la computadora equipada con Procise control
software y SequencePro software. El sistema controla la entrega precisa de hasta 12 solventes y reactivos
diferentes. Incluye el cartucho de reacción, donde se obtiene el primer derivado, el frasco de conversión
donde se lo transforma en el PTH-derivado, que luego se transfiere a la columna de HPLC en fase reversa,
donde se separan por el gradiente de solvente, se lo detecta en el detector UV/VIS por su absorbancia y se lo
identifica por el tiempo de retención en la columna. La calibración se hace en base a una corrida con los
PTH derivados de los 20 aminoácidos proteicos, además en algún caso de un derivado correspondiente a una
modificación post-traduccional que se quiere detectar.
1er.Ciclo
2
3er.
DEGRADACI
ON DE
EDMANREACCION DEL
RESIDUO N-
TERMINAL CON
ISOTIOCIANATO
DE FENILO
1er. Ciclo
2o. Ciclo
3er. Ciclo
Secuenciación
automática por
el Método de
Edman
(N-terminal de
la cruzipaína)
2) Espectrometría de masa:
Puede utilizarse para secuenciar péptidos o para identificar
proteínas.
2a) Secuenciación: Seleccionar un péptido determinado por
MS y fragmentarlo, obteniendo su secuencia a partir de las
masas de los fragmentos resultantes (CID, fragmentación en
cámara de colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente de
iones)
2b) Identificación: Sin separar los péptidos, determinar la
masa de cierto número de los mismos por MS e identificar a la
proteína en los bancos de datos, por comparación con las masas
de digeridos virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Se
conoce como peptide mass fingerprinting (PMF). Es óptimo
cuando el genoma del organismo de origen está completamente
secuenciado.
FRAGMENTACION DE LOS PEPTIDOS
Un péptido cargado puede ser fragmentado en dos trozos de tres maneras, que
pueden producir un par de iones a y x, un par de iones b e y, o un par de iones c
y z.
Teóricamente una fragmentación puede tener lugar en cualquier lugar de un
péptido, y se espera un espectro que contenga todos los posibles picos de iones.
En la práctica, debido a la fortaleza irregular de las ligaduras en las diferentes
posiciones, los diferentes iones aparecen con distintas frecuencias.
Los mas abundantes son los iones y, los cuales a menudo forman la serie
completa en un espectro. Los siguientes en frecuencia son los iones a y b, de
los cuales muchos no se observan. Los iones c, x y z se presentan mucho menos
frecuentemente. Adicionalmente, estos iones pueden formar nuevos iones por
pérdida de agua o de amonio.
La introducción de un grupo sulfónico en el N-terminal de un péptido tríptico
favorece la fragmentación que da lugar a los iones y, y suprime a los de la serie
b, dando un espectro simplificado, que facilita la determinación de la secuencia.
SECUENCIACION POR ESPECTROMETRIA DE MASA
The backbone fragmentation are the most intense signals in the
ESI-MSMS spectra of peptides fragmented by CID.
C
O
N
H
COOHNH2
y¨n z´nxnC-terminal ions
bnan c”n
N-terminal
ions
Roepstorff, P., and Fohlmann J. Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)
Jhonson R. S., Martin S. A., Biemann K., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 86, 137 (1988).
N C
N C
Peptide fragmentation (2)
La ES/MS puede aplicarse directamente a la secuenciación de péptidos,
utilizando un ES MS/MS, es decir un espectrómetro de masa de electrospray en
tandem, que tiene dos analizadores de masa separados por una celda de
colisión, donde el péptido seleccionado se fragmenta y da iones “hijos” que se
separan en el segundo analizador y permiten determinar la secuencia.
Collision-induced dissociation (CID)
Es una técnica de fragmentación usada para obtener información
estructural. Se utiliza la colisión con las moléculas de un gas para obtener
la fragmentación de un ión seleccionado por su masa.
Es una técnica de fragmentación usada con
MALDI-ToF MS para obtener información
estructural, típicamente a partir de péptidos
menores que 2 kDa. El decaimiento de un ion
precursor seleccionado por su masa tiene
lugar después que el ión deja la fuente de
iones, en el tubo de vuelo, y los fragmentos
iónicos son separados por el reflectrón.
Post-source decay (PSD)
Detector
Ions of equal m/z with different velocities
Reflectron (ion mirror): compensates for the kinetic energy spread of ions
from the source (100 eV to 1 keV) by reflecting the ions back along the same
flight path prior to detection.
La trayectoria de vuelo de un ion puede ser incrementada incorporando un
“espejo iónico” o reflectron al final del tubo de vuelo. Tal dispositivo retarda y
luego revierte las velocidades iónicas para corregir diferencias menores en energía
cinética entre iones de la misma relación m/z, y así minimiza variaciones en los
tiempos de vuelo y mejora la resolución y la precisión de los valores de masa.
No.
de iones
Energía interna
Los fragmentos se obtienen por descomposición de los iones originales, que ocurre en el tubo de vuelo, es
decir, después de que los iones salieron de la fuente.
La descomposición se debe a la energía interna del ión precursor. Sólo una pequeña fracción de los iones
precursores tiene suficiente energía para fragmentarse. Esta energía puede aumentarse usando una
intensidad del laser mas elevada, o usando una celda de colisión.
EL FUNDAMENTO DE PSD
Cuando los iones precursores se fragmentan, la
velocidad de los fragmentos es igual a la del precursor,
por lo cual viajarán todos juntos en el tubo de vuelo.
Esto se debe a que la velocidad es determinada por la
aceleración inicial; si la energía inicial es 20 keV, las
energías de la unión química están alrededor de 10 eV,
de modo que la ruptura de una unión tendrá un efecto
mínimo sobre la velocidad.
Los aparatos usados tienen un selector de velocidad
(Bradbury-Neilson gate), que permite seleccionar al ión
precursor y a sus fragmentos para que pasen a su
través y lleguen al reflectrón.
El ión molecular precursor intacto tiene una energía cinética traslacional KEM = ½ Mv2, siendo M su
masa y v su velocidad. Un fragmento del ión precursor tiene una energía cinética traslacional KEm =
KEM (m/M), siendo M la masa del precursor y m la del fragmento.
Estas diferencias hacen que los iones precursor e hijos sigan diferentes caminos en el reflectrón. ¿Cómo
se hace para que los fragmentos que están viajando a la misma velocidad que el precursor pero tienen
una energía cinética reducida lleguen enfocados al detector? Variando la pendiente del gradiente de
voltaje del reflectrón a través del rango de masas de los fragmentos.
Los iones precursores y los fragmentos iónicos de PSD
siguen diferentes caminos en el reflectrón “normal“
Detector del
reflectrón
Reflectrón+20 kV0 V.
Fragment formado
por PSD
Ion precursor
intacto
+
+
MH+
BH+
AH+
MH+ ( 1,000) correctamente enfocado
AH+ (700) Pobremente enfocado
BH+ (300) Pobremente enfocado
A una relación de “espejo” = 1.00
MH+
BH+
A una relación de “espejo” = 0.7
MH+ ( 1,000) no enfocado
AH+ (700) correctamente enfocado
BH+ (300) pobremente enfocado
AH+
BH+
AH+ & MH+
MH+ ( 1,000) no enfocado
AH+ (700) no enfocado
BH+ (300) correctamente enfocado
A una relación de “espejo” = 0.3
AA sequencing using Post Source Decay MALDI has in principle been possible for many
years, but has not been much used due to difficult interpretation.
A dramatic improvementwas the development of derivatizations of the peptide prior to PSD:
Acidification by sulfonation directs fragmentation to the b-y bond and as the b-fragments
becomeneutral, a unique seriesof y-ion results.
Two common reagents are ”CAF” or ”SPITC” –shown below:
N O
O
O
O
H2N
H
Pep
R2
+H
R2
Pep
O
NHS
O
OHO
S OH
O
O RT, pH>9
NHS-ester of 3-Sulfo-
propionic acid anhydrideMass addition, +136 Da
Adds 215 Da at the N-terminal AND free Lys side chain
How can sulfonation at the N-terminus of tryptic peptides improve PSD performance?
1. It favours bond breakage at the b/y position (the peptide bond)
2. It neutralizes the b-fragments (negatively charged sulfogroup + proton); therefore the b-fragments never leave the target.
3. The resulting series of y-ions is easily interpreted – the distance betwen adjacent peaks represents one amino acid.
The sulfonation reaction derivatizes the N-termini of the tryptic peptides (and the side chain of Lys in approximately half of the peptides)To avoid the Lys sulfonation, Lys is first blocked by an imidazole reaction, adding 68 Da/Lys. This is specific for the Lys side arm and does not affect the N-terminus.
•A tryptic digest (probably from an SDS-PAGE- or a 2-D-gel) is
analyzed by PMF.
•The Lys blocking (when CAF was used) and the sulfonation reactions
areperformed.
(One can ignore the Lys blocking and only look for Arg-peptides).
•The modified peptide mixture is analyzed again by MALDI.
•Look for masses representing Arg or Lys peptides.
(I. e. those that increased by 136 or 204 Da)
•Switch the MALDI to PSD and select THAT peptide mass.
•Perform the PSD analysis - this takes approximately 2’ in a TOF/TOF
MALDI
Peptide mass fingerprinting of Trypanosoma cruzi aconitase (- / + sulfonation)
Post Source Decay (PSD) sequencing of aconitase tryptic peptides
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR PEPTIDE
MASS FINGERPRINTING (PMF)
• La muestra reducida y alquilada (en un fragmento de gel o mancha) se digiere
con una proteasa (tripsina?).
•La mezcla de péptidos resultante se analiza por MALDI-ToF-MS.
•La lista de masas de péptidos se utiliza para escanear un digerido in-silica de
una base de datos de secuencias por Internet.
•El resultado de la búsqueda se presenta como probability scores y otras
medidas de confianza
•La homogeneidad de la muestra y la precisión de la medida son factores muy
improtantes para una interpretación segura de los resultados.
1326.8
05
1173.6
52
1394.8
46
1715.9
84
873.4
71
1786.8
88
835.4
27
1751.7
97
1587.9
00
1430.8
71
914.5
55
1135.6
51
2270.0
86
1927.9
41
2071.0
08
742.4
10
1366.6
84
1522.9
32
1106.5
92
1258.7
29
940.5
05
971.5
49
1055.6
14
2306.0
46
2497.3
09
1870.9
13
2110.0
59
1993.9
65
663.8
19
1557.7
46
1657.8
11
2211.1
07
2669.2
96
2319.1
40
2375.1
23
2991.5
41
3070.5
87
2872.3
56
0
1
2
3
4
5
4x10In
tens. [a
.u.]
750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000m/z
PMF of band # 3
MDH-1
MDH-2
LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE
TRYPANOSOMA CRUZI
MDH-1
MDH-2
EDMAN
SINTESIS QUIMICA DE PEPTIDOS
La sintesis quimica de peptidos es muy importante actualmente, pues
permite a) estudiar el plegamiento de regiones individuales de una
proteína; b) aislar, usandolos como ligandos para cromatografía de
afinidad, a receptores y otras proteínas, c) usarlos como drogas,
p.ej.: la 1-desamino-8-D-Arg-vasopresina, hormona antidiurética sin
efectos sobre la presión sanguinea; d) para generar anticuerpos
específicos.
La sintesis se realiza en fase sólida, aplicando el método
desarrollado por Merrifield, que le permitió sintetizar interferon (155
residuos) y ribonucleasa (124 residuos), ambos activos
Los aminoácidos que se introducen deben estar bloqueados en los
sitios en que no debe producirse reacción, y luego desbloquearlos
para continuar la etapa siguiente. Se efectúa con el residuo C-
terminal ligado a una resina, lo que permite eliminar facilmente
subproductos.
INTRODUCCION
A LA
PROTEOMICA
GENOMA Y PROTEOMA
GENOME: “GENes and ChromosOMEs” (Winkler,
1920): Conjunto completo de los cromosomas y sus
genes.
PROTEOME: Conjunto completo de las proteínas de
un organismo (el conjunto de proteínas codificadas
por un genoma, Wilkins y Williams, 1994; Wasinger et
al., 1995).
La secuenciación de los genomas se hizo posible con la
introducción de los métodos de secuenciación del ADN, a partir
del establecimiento del método utilizando dideoxynucleótidos
por Frederick Sanger, en 1975, que le permitió secuenciar el
genoma completo del bacteriófago X174, con 5,375 pares de
bases, en 1977. La primera secuenciación completa del genoma
de un organismo de vida libre fué la de Haemophilus influenzae
(1.8 Mb), en 1995. El Human Genome Project comenzó en
1990 y se completó en 2003; la estimación del número total de
genes en el genoma humano se estima entre 20,000 y 25,000. Al
28 de Marzo de 2017 la Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes (KEGG) registraba ya 360 genomas eucarióticos
completos, además de 4128 genomas de bacterias y 248 de
Archaea.
DETERMINACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LOS GENES
Determinación de las características químicas, bioquímicas y
biológicas de las proteínas.
1) Estructura molecular.
2) Modificaciones post-traduccionales.
3) Capacidad de unir ligandos.
4) Velocidad de síntesis y degradación. Concentracion
intracelular.
5) Especificidad de tejido, célula y organela.
6) Especificidad de sexo.
7) Especificidad de estadío de desarrollo embrionario, post natal
y de envejecimiento.
Se estima en 252 el número de tipos celulares diferentes que se encuentran
en el hombre. Todas esas células tienen el mismo DNA, pero todas
ellas presentan diferencias cuali y cuantitativas en sus proteínas. El
DNA almacena información; las proteínas hacen todo lo demás.
¿HAY IGUAL NUMERO DE PROTEINAS QUE DE GENES?
NO. Hay frecuentemente mas de una proteína proveniente de un único
gen.
Causas principales:
1) Splicing alternativo:
A nivel de la maduración del mRNA. Diferentes proteínas armadas usandodiferentes combinaciones de exones.
2) Modificación post-traduccional:
La proteína es modificada después de la traducción, ya sea procesándolaproteolíticamente, o modificando quimicamente residuos de aminoácidos,
o de ambas maneras.
ADN
Transcripción
Pre-mARN
“Splicing” alternativo
mARN 1 mARN 2 mARN 3
Traducción
Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3
Modificación
Post-traduccional
y/o Proteólisis
Prot. 1’ Prot. 1’’ Prot. 2’ Prot. 2’’ Prot. 3’ Prot. 3’’
Para la funcionalidad adecuada de una proteína se requiere
mucho mas que la integridad del gen estructural que la codifica. Si
este está mutado, y el producto es inactivo, naturalmente la proteína
no será funcional. Pero puede suceder algo parecido si el gen
estructural está intacto, pero hay mutaciones en otros genes que
participan en lo que realmente le interesa a la célula, que es la
proteína perfectamente plegada, con las modificaciones post-
traduccionales requeridas y localizada en el compartimento
subcelular correcto.
Se requerirá la integridad y funcionalidad correcta de otros
genes:
LA NATURALEZA POLIGENICA DE LAS PROTEINAS.
a) Los que codifican a enzimas que introducen modificaciones
post-traduccionales.
b) Los que codifican proteinasas de procesamiento.
c) Los que codifican proteínas requeridas para el transporte e
integración de la proteína en el compartimento correcto.
d) Los que codifican enzimas que catalizan la degradación de la
proteína.
e) Los genes regulatorios que codifican factores de transcripción
necesarios para la expresión de la proteína.
f) Secuencias regulatorias, como enhancers, etc.
g) Genes involucrados en metilación del DNA, estructura de la
cromatina, etc.
Gen estructural
Genes que codifican factores de transcripción. Genes que codifican chaperonas necesarias
para el plegamiento correcto.
Genes que codifican proteínas regulatorias. Genes que codifican enzimas que modifican
post-traduccionalmente a la proteína.
Genes que codifican proteínas que modifican Genes que codifican proteasas de
la estructura de la cromatina. procesamiento.
Genes que codifican proteínas de
transporte e integración a organelas.
Secuencias regulatorias en el ADN Genes que codifican proteasas
(“enhancers”) que degradan a la proteína
Proteína madura,
correctamente localizada,
en la concentración necesaria
DESAFIOS TECNICOS DE LA PROTEOMICA.
1) Si suponemos alrededor de 22,000 genes en el genoma humano, y
que cada gen da origen a entre 3 y 6 o más proteínas, el número total
de proteínas en un organismo superior puede variar entre 50,000 y500,000.
2) Las proteínas tienen una heterogeneidad mucho mayor que los
ácidos nucleicos. La composición y secuencia de aminoácidos de una
proteína determina: a) su masa molecular; b) su carga total a
diferentes valores de pH; c) su hidrofobicidad; d) su forma, es decir
el plegamiento de la proteína nativa. Esto a su vez determina lasolubilidad de las proteínas en diferentes solventes, su
comportamiento en los métodos de separación y purificación, y su vida
media in vitro. La diversidad de propiedades fisicoquímicas es
muchísimo mayor que la de los ácidos nucleicos.
3) Los valores de pI de las proteínas varían entre menos de 3 y más de
12, con dos grandes agrupamientos, uno alrededor de 5.5 y el otro
alrededor de 8.5. Los ácidos nucleicos tienen un rango estrecho de pI,
en la zona ácida.
4) Los ácidos nucleicos son muy solubles en soluciones acuosas, en
tanto que muchas proteínas son muy hidrofóbicas, y por ello insolubles
en agua. Se estima que más del 15 % de las proteínas totales nunca
entrarán en un gel de 2D-PAGE por su extrema hidrofobicidad.
5) La masa molecular de las proteínas varía entre unos pocos miles y
varios millones de Daltons, y su tamaño no puede predecirse con
certeza a partir de la secuencia de aminoácidos derivada de la
secuencia de DNA, por las modificaciones post-traduccionales.
6) La concentración de las proteínas varía dentro de un rango muy
amplio, probablemente mayor que el rango de los mRNAs. La
diferencia en concentración de proteínas abundantes y raras en los
flúidos corporales es mayor que 12 órdenes de magnitud.
MACROMOLECULAS DE UNA CELULATIPICAHUMANA:
1) DNA: unos 22,000 genes.
2) mRNAs: Alrededor de 40,000 moléculas en todo
momento, pertenecientes a alrededor de 5,000 especies
moleculares diferentes. Un 80 % están en bajos niveles.
3) Proteínas: Unos 1.000.000.000 de moléculas, de las
cuales las 100 proteínas más abundantes constituyen
alrededor del 90 % de la masa proteica total celular. La
diferencia entre las proteínas de mayor abundancia, como la
actina, y las de menor abundancia, como proteínas
regulatorias, es de alrededor de 10.000.000 de veces.
LAS HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DEL
PROTEOMA
La técnica clásica, y hasta hace unos pocos años, la
principal utilizada, es la separación de las proteínas por
electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, seguida de
identificación de dichas proteínas por secuenciación o, en general
actualmente, por espectrometría de masa, después de hidrólisisenzimatica parcial.
Actualmente lo mas utilizado para estudios amplios de
proteómica son otras combinaciones de técnicas, por ejemplo
cromatografía de alta resolución (HPLC) combinada con
espectrometría de masa, o electroforesis capilar tambien combinada
con espectrometría de masa. Este tipo de técnicas permite laidentificación de proteínas en mezclas complejas, previa hidrólisis
enzimática parcial.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Electrophoresis 2000, 21, 2610-16
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
EN EL ESTUDIO DEL PROTEOMA.
Ventajas:
Excelente resolución: pueden identificarse a veces hasta 10,000 proteínasen un solo gel. Ninguna otra técnica es capaz de analizar
simultáneamente miles de proteínas.
Desventajas:
1)Pueden ser necesarios varios geles, corridos en diferentes condiciones
de rango de pH y de concentración de acrilamida, para resolver las
mezclas muy complejas.2) Es difícil detectar proteínas muy grandes o muy chicas, muy ácidas o
muy básicas, o proteínas de membrana (muy hidrofóbicas).
3) Se detectan sólo las proteínas de alta y mediana abundancia en el
material en estudio. En cualquier célula, sus proteínas pueden variar en
concentración en seis órdenes de magnitud. Para ver proteínasminoritarias, es necesario en general purificar la organela en que se
encuentran y trabajar con ese material. Tambien se puede trabajar previa
marcación radioactiva, para aumentar la sensibilidad de detección.
NUMERO DE MANCHAS PROTEICAS REVELADAS EN GELES
GRANDES DE 2-D A PARTIR DE TRES ORGANOS DE RATON.
Fracción tisular Número de manchas
Hígado Cerebro Corazón
(A) Sobrenadante (buffer) 9,204 8,458 4,790
(B) Extracto del pellet
(urea, CHAPS) 1,975 1,692 1,470
(C) Pellet suspendido, DNA
digerido. 73 50 40
Manchas totales por órgano 11,252 10,200 6,300
NOTA: Las manchas contadas en (A) no están en (B) ni en (C), y así
sucesivamente. (A) son probablemente proteínas citosólicas; (B) de
organelas, y (C) proteínas cromosomales, como las histonas.
LOS EXTRACTOS CONCENTRADOS DE ORGANELAS REVELAN
MUCHAS PROTEINAS MINORITARIAS.
EDMAN DEGRAD. MALDI-ToF-MS
SensitivityLow pmole (6x1011
moléculas; 67 ng albúmina)
Low fmole (6x108
moléculas; 67 pg albúmina)
Running cost US$ 150/peptide < 1 ¢/analysis
Analysis time Overnight A few min
# Cell culture flasks needed
100-150 1
ID OF PROTEINS BY EDMAN vs MALDI-ToF-MS
DIFFERENCE GEL ELECTROPHORESIS (DIGE).
Fluorescent tagging of the two protein samples to be compared
with two different dyes, amino reactive, and designed to keep the
same relative mobility.
The tagged protein samples are mixed and run in the same 2D gel.
After the run fluorescence imaging of the gel is used to create two
images, which are superimposed to identify pattern differences.
This technique makes unnecessary to compare different gels.
It is commercially available.
The ICAT method for measuring
differential protein expression. (A)
Structure of the ICAT reagent. ICAT
consists of a biotin affinity group, a
linker region that can incorporate
heavy (deuterium) or light (hydrogen)
atoms, and a thiol-reactive end group
for linkage to cysteines. (B) ICAT
strategy. Proteins are harvested from
two different cell states and labeled on
cysteine residues with either the light
or heavy form of the ICAT reagent.
Following labeling, the two protein
samples are mixed and digested with
a protease such as trypsin. Peptides
labeled with the ICAT reagent can be
purified by virtue of the biotin tag by
using avidin chromatography.
Following puri fication, ICAT-labeled
peptides can be analyzed by MS to
quantitate the peak ratios and proteins
can be identified by sequencing the
peptides with MS/MS.
Isotope-coded affinity tags (ICAT)
Si bien la idea última detrás de los estudios de
proteómica es llegar algún día al conocimiento completo
de las proteínas de un organismo, lo mas frecuente
actualmente es hacer proteómicas parciales: la
proteómica de un tipo celular determinado; la proteómica
de una organela aislada; la proteómica de las proteínas
blanco de una determinada modificación post-
traduccional; las diferencias en la expresión de proteínas
antes y después de la diferenciación de un estadío a otro
en un organismo que tiene un ciclo de vida complejo; las
diferencias en la expresión de proteínas de una misma
célula antes y después de un determinado tratamiento.
Veremos a continuación dos ejemplos.
Cromatografía líquida en 2 dimensiones acoplada a espectrometría de masa (2D LC MS/MS)
Identificación de proteínas potencialmente SUMOiladas en
Trypanosoma cruzi
Resuspensión en UreaReducción con DTT+ Alquilación con IAADigestión con TripsinaDesalado en Columna fase reversa C18 (DSC-18, Supelco, Sigma-Aldrich)
Lleva muestra a sequedadResuspende en 2% ACN/0.1%FA 20 μg proteínaColumna intercambio ionico(SCX 5 uL opti-pak)
Eluidos 0,25,50,100,200 y 500 mM NaClSistema de nano-HPLCTrap loading C18-columnTrap separation C18-column
Elución en gradiente 5–40% ACN/0.1% FA en 100 min
Análisis de péptidos en línea con un espectrómetro de masa(LTQ XL/ETD, Thermo Fisher Scientific).
Proteínas potencialmente SUMOiladas
Distribución por categoria funcional
Se identificaron 7178 péptidos en ambas muestras. Corresponden a 2686 proteínas .
236 resultaron enriquecidas en la Muestra vs. Control
Proteínas potencialmente sumoiladas
Metacaspasa 3 in vivo
Validación de proteínas SUMOiladas
Protein expression profiling by 2-DE. Whole-cell lysates from nontransformed and
Abelson murine leukemia virus (AMuLV)-transformed mouse fibroblasts were resolved by
2-DE, and proteins were visualized by silver staining. Differentially expressed proteins were
excised from the gel and identified by MS.
