Instrumentalne metode analize farmaceutika

Seminarski rad: Fizičko hemijski principi

Profesor: Studenti:

Novi Sad, januar 2012. godine

Sadržaj

1. Uvod.......................................................................................................3

2. Hromatografija........................................................................................4

2.1 Vrste hromatografskih metoda......................................................5

2.2 Adsorpciona hromatografija..........................................................7

2.3 Podeona (particiona) hromatografija..............................................9

2.4 Podeona (particiona) hromatografija na tankom sloju......................11

3. Spektrometrija......................................................................................14

3.1 Masena spektrometrija...............................................................14

3.2 Tehnike snimanja masenih spektara................................................16

3.3 PBM (Probability Based Matching) system…….....………………...17

4. Najcesce metode analize farmaceutika................................................17

4.1 Gasna hromatografija i masena spektrometrija................................18

4.2 Tečna hromatografija........................................................................19

5. Zaključak..............................................................................................21

6. Literatura..............................................................................................22

1. Uvod

2

Savremena analitika lekova ne može da se zamisli bez separacionih tehnika. U analizi lekova glavni interes je da se razvije nova, brza, veoma specifična i ultra osetljiva metoda i tehnika za analizu lekova i njihovih metabolita u različitim biološkim uzorcima. Razvoj metoda razdvajanja su fokusirani na hiralna razdvajanja, brzu hromatografiju, izuzetne performanse tečne hromatografije i ultra tanak sloj hromatografije.

Metode se primenjuju u analizi smeša raznih supstanci, neurotransmitera i anaboličkih steroida. Glavne oblasti istraživanja su masena spektrometrija, tehnike odvajanja, mikročip tehnologije i spektrometrija mobilnosti jona. Istraživanja u masenoj spektrometriji se fokusiraju na razvoj tehnike jonizacije pomoću mikročipa na bazi atmosferskog pritiska i kombinovanjem mikrofluida ili kapilarno tečne hromatografije za masene spektrometrijske analize. Pored toga u kvalitativnoj i kvantitativnoj analizi lekova preko 90% su zastupljene hromatografske tehnike i to uglavnom HPLC tehnike.

U novije vreme ove tehnike su jako unapređene, posebno razvojem novih materijala za punjenje i novih stacionarnih faza koje su omogućile značajno skraćenje vremena trajanja analize i veliku uštedu veoma skupih rastvarača. Jedna od tih hromatografskih tehnika jeste unapređena metoda tečne hromatografije pod visokim pritiskom ultra visokih performansi ili UHPLC metoda (Ultra high performance liquid chromatography). Ova tehnika veliku primenu nalazi u toksikologiji, ispitivanju kontrole kvaliteta pomoćnih farmaceutskih supstanci, biljnih i dietetskih proizvoda.

2. Hromatografija

3

Pod hromatografijom se danas podrazumeva skup analitičkih metoda za analizu uzoraka, koji su po svojoj prirodi smeše komponenata, čija hemijska priroda može biti slična, ali i vrlo različita. Pod analizom ovakvih uzoraka se do skora podrazumevalo samo razdvajanje uzorka-smeše na njene sastavne komponente, ali je uvođenje najsavremenijih tipova detektora proširilo osnovno značenje hromatografije.

Hromatografija može biti analitička i preparativna. Preparativne hromatografske metode se bave razdvajanjem komponenti smeše radi dalje analize i smatraju se i metodom prečišćavanja. Sa druge strane analitičke hromatografske metode, gde se radi sa relativno malim količinama uzorka, određuju procentualni odnos komponenti neke smeše.

Naziv hromatografija potiče od grčke reči hromos – što znači boja i grapheiri – pisati. Sam pojam hromatografija datira još od početka 20. veka, kada je ruski naučnik Cveti (slika1) proučavao zeleni alkoholni ekstrakt iz lista. On usmerava svoju pažnju na mogućnost adsorpcionog upijanja hlorofila od strane tkiva lista. Cveti je razdvojio hlorofil na dve komponente poznate kao hlorofil A i B na taj način što je u staklenoj cevi (koloni) napunjenoj čvrstim nosačem (kalcijumkarbonatom) na vrh kolone stavio alkoholni ekstrakt hlorofila, a zatim lagano ispirao kolonu petrol-etrom i tako zapoceo spiranje hlorofila.

Slika 1: Mihail Cvet (1872.-1919.)

Prilikom ispiranja, pojedine komponente biljnog ekstrakta kretale su se kroz kolonu različitom brzinom i međusobno se razdvojile u obojene trake ili zone. Pokazalo se da je apsorpcija dva hlorofila različita u odnosu na čvrst nosač, tako da su se izdvojila dva sloja - dva hlorofila A i B. Pošto su razdvojene komponente bile obojene Cveti je ovu metodu nazvao hromatografija. Cveti opisuje i obrazlaže detaljno metod kojem daje naziv hromatografska analiza: „ Slicno sunčevim zracima u spektru različitih komponenti složenog obojivaća raspoređuju se zakonomerno jedan preko drugog na stubu upijača i postaju dostupni za kvalitativno i kvantitativno određivanje.“ Cveti pravilno ocenjuje značaj metoda odvajanja i analize ne samo obojenih, vec i bezbojnih materija. Trebalo je da prođe dosta vremena da bi se shvatili značaj i mogućnosti otkrivene metode odvajanja.

Hromatografske metode spadaju u fizičko - hemijske metode analize, poput spektroskopskih metoda (ultravioletne UV, infracrvene IC, masene MS, nuklearne magnetne rezonance NMR) ili raznih standardnih instrumentalnih metoda (polarimetrija, refraktometrija).

Krajem tridesetih godina prošlog veka razvijena je tankoslojna hromatografija, a 1941. godine Marin i Synge dobili su Nobelovu nagradu za radove iz oblasti hromatografije. Njihov fundamentalni rad postavio je osnove za razvoj tečne, gasne i papirne hromatografije. Prvi rad iz gasne hromatografije publikovan je 1952 (Martin i James), zatim se ova metoda razvila u veoma moćnu analitičku tehniku.

Tečna hromatografija se razvila šezdesetih godina prošlog veka, da bi se danas izjednačila sa gasnom hromatografijom. Princip hromatografskog razdvajanja

4

smeše zasniva se na razlikama u raspodeli pojedinih komponenata smeše izmedu pokretne i nepokretne faze. Sama raspodela posledica je raznih fizičko-hemijskih procesa kao što su adsorpcija, desorpcija, apsorpcija, podela između dva rastvarača i jonska izmena.

2.1 Vrste hromatografskih metoda

Zavisno od mehanizma interakcije između rastvorka i stacionarne faze razlikuje se više vrsta hromatografskih metoda koji se nalaze u primeni. Za industrijske uslove najviše se primenjuje adsorpciono–eluaciona hromatografija. Većina ostalih hromatografskih postupaka imaju prvenstveno analitički značaj ili se koriste za izdvajanje i prečišćavanje malih količina veoma skupih proizvoda.

Adsorpciona hromatografija (ADC) se naziva i eluaciona hromatografija. Zasniva se na razlici među van der Valsovih sila, koje su karakteristične za slabo polarna jedinjenja. Rastvorena supstanca sa slabijim van der Valsovim silama brže se ispira (eluira) iz kolone. Kao punjenje kolone koriste se neorganski adsorbenti: infuzorijska zemlja, aluminijumoksid, silikagel, aktivni ugalj i porozne organske smole (na primer, Amberlite). Aktivni ugalj se obično koristi za uklanjanje pigmenata (obezbojavanje) i bistrenje rastvora.

Tečno – tečna podeona hromatografija (LLC) je zasnovana na različitim koeficijentima raspodele rastvorenih molekula između adsorpcione tečne faze i protočne tečne faze. Najčešće je adsorpciona tečnost nepolarna.

Jonoizmenjivačka hromatografija (IEC) je zasnovana na reverzibilnom vezivanju jedinjenja za aktivne suprotno naelektrisane grupe jonoizmenjivača, kojima je napunjena kolona. Postoje kolone sa anjonskim i katjonskim jonoizmenjivačima. Eluiranje se vrši rastvorom kiseline ili baze, zavisno od vrste punjenja kolone.

Afinitetna hromatografija (AFC) zasaniva se na visoko specifičnoj interakciji između rastvorka i punjenja kolone, na primer, interakcija enzim – supstrat, enzim – inhibitor, antigen – antitelo itd. Molekuli rastvorka (proizvoda) se vezuju za ligand zahvaljujući specifičnom afinitetu. Ligand je imobilisan na čvrstom nosaču (matriksu). Po završetku adsorpcije proizvoda kolona se ispira, a zatim se vrši eluiranje proizvoda pogodnim hemijskim agensom: rastvorom sa određenim pH ili određenom jonskom jačinom.

Gel–filtraciona hromatografija se naziva i hromatografija na molekulskim sitima. Molekuli se razdvajaju na osnovu njihovih veličina, odakle naziv molekulsko sito. Pri prolazu rastvora kroz kolonu samo molekuli koji su manjih dimenzija od veličine pora u gelu mogu preći u gel, a veći molekuli prolaze kroz kolonu. Ispiranje se vrši kontinualnim proticanjem čistog rastvarača kroz kolonu. Molekulska sita su obično umreženi dekstrani (Sephadex), agaroze (Sepharose) ili poliakrilamidi (Bio-Rad gelovi).

Hidrofobna hromatogtafija (HC) zasnovana je na hidrofobnoj interakciji između rastvorene supstance (na primer, proteini) i funkcionalnih grupa (na primer, alkil grupa) na stacionatnoj fazi. To znači da stacionarna faza ima manji polaritet od mobilne faze.

Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC) bazirana je na opštim principima adsorpcione hromatografije, s tim da tečna faza prolazi kroz kolonu

5

pakovanu adsorbensom pod pritiskom, velikom brzinom. Ova vrsta hromatografije je u sve većoj primeni zbog velike rezolucije razdvajanja komponenti.

Pored ove podele postoji još jedna opštija podela. Prema agregatnom stanju pokretne faze hromatografija se deli na tečnu i gasnu hromatografiju.

Na slici 2 je dat izgled hromatograma. Hromatogram daje informacije o:

- broju komponenata koje sadrži analizirana smeša na osnovu broja signala,

-koncentracijama pojedinih sastojaka na osnovu relevantnih površina signala (kvantitativna analiza) i

- jedinjenju koje je prisutno (na osnovu retencionih vremena – kvalitativna analiza).

Slika 2: Hromatogram

Kako se hromatografsko razdvajanje komponenata smeše zasniva na principu da se komponente zadržavaju u stacionarnoj fazi srazmerno intenzitetu sila koje vladaju između svake molekulske ili jonske vrste i stacionarne faze, hromatografski sistem će prvo napuštati najslabije vezana komponenta, a poslednja ona koja je najjače vezana za stacionarnu fazu.

Da bi hromatografsko razdvajanje bilo uspešno sistem mora biti takav da se komponente izdvajaju “diskretno” što znači da koncentacija jedne komponente u mobilnoj fazi mora da opadne pre nego što druga komponenta počne da se izdvaja iz sistema.

Raspodela komponente A između mobilne i stacionarne faze može se predstaviti ravnotežom jednačinom 1:

mobilna A⇄stacionarna A (1)

Prelazak komponente A iz jedne u drugu fazu traje do uspostavljanja ravnoteže, pri kojoj odnos ravnotežnih koncentracija u stacionarnoj (cs) i mobilnoj (cm) fazi dostiže konstantnu vrednost.

Konstanta ravnoteže ove reakcije K, naziva se koeficijent raspodele ili particioni koeficijent i dobija se primenom Nernstovog zakona raspodele (jednačina 2):

6

(2)

Komponenta smeše koja ima veći afinitet prema stacionarnoj fazi, duže se zadržava u hromatografskom sistemu od one koja pokazuje veći afinitet prema mobilnoj fazi. Kao posledica ovoga hromatografski sistem prvo napušta komponenta sa najmanjim koeficijentom raspodele.

2.2 Adsorpciona hromatografija

Razdvajanje komponenata iz smeše adsorpcionom hromatografijom vrši se na osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito adsorbuje komponente smeše. Kao stacionarna faza koriste se čvrste supstance – adsorbensi – koje su porozne i imaju veliku aktivnu površinu, a samim tim i površinsku energiju koju teže da smanje, tako što privlačnim silama vezuju molekule ili jone iz gasova ili tečnih rastvora.

Pri adsorpciji komponenata iz gasne smeše razlikuju se fizička i hemijska

adsorpcija koje se opisuju Langmuirovom (jednačina 3) i Freundlichovom (jednačina 4) adsorpcionom izotermom.

(3)

(4)

gde je:

P - ravnotežni pritisak gasa,V – zapremina adsorbovanog gasa,Vmax – kapacitet adsorbensa (maksimalna zapremina adsorbovanog gasa),x – broj molova adsorbovanog gasa,m – masa adsorbensa,b, k, n – karakteristične konstante koje zavise od prirode adsorbensa, adsorbata i temperature.

Fizička adsorpcija se zasniva na uspostavljanju elektrostatičkih (dipol-dipol, van der Waalsovih) i vodoničnih veza između stacionarne faze i komponenti, a pri hemisorpciji dolazi do stvaranja hemijskih veza usled čega se na površini adsorbensa obrazuje monomolekulski sloj adsorbata.

Jednačina (4) se može primeniti i na adsorpciju supstanci iz razblaženog rastvora, ako se pritisak zameni ravnotežnom koncentracijom adsorbujuće supstance.

Adsorpcija je pojava pri kojoj se na graničnoj površini između dve faze menja koncentracije date komponente. Kod adsorpcione hromatografije, gde se komponente raspodeljuju između čvrste i tečne faze, koncentracija rastvorene

7

komponente biće veća u graničnom sloju uz čvrstu fazu, nego u unutrašnjosti rastvora.

Adsorpciona hromatografija se najčešće izvodi u koloni koja je ispunjena adsorbensom. Na vrh kolone nanosi se mala količina analizirane smeše (smeša komponenata A i B kao na slici 3), a zatim se kroz kolonu vrši eluiranje, odnosno kontinuirano propuštanje mobilne faze čime se postiže razdvajanje komponenata.

Komponente smeše se selektivno adsorbuju na adsorbensu. Jednu komponentu adsorbens više adsorbuje (onu koja ima veći koeficijent raspodele, komponentu A), a drugu manje (onu koja ima manji koeficijent raspodele, komponentu B).

Slika 3: Adsorpciona hromatografija u koloni

Ako je u pitanju adsorpciona hromatografija na koloni, komponenta koju adorbens više adsorbuje nalaziće se pri vrhu kolone, dok će se komponenta za koju adsorbens ima manju moć adsorpcije spustiti dublje u kolonu. Ako se vrednosti koeficijenata raspodele ispitivanih komponenata dovoljno razlikuju, može se postići njihovo potpuno razdvajanje i pri procesu eluiranja iz kolone prvo izlazi komponenta B, koja se slabije vezuje za adsorbens.

Adsorbensi mogu biti nepolarni (aktivni ugalj, polistiren-divinilbenzen), ili polarni silika-gel, koji sadrži kisele grupe i aluminijum-oksid- koji sadrži bazne grupe). Silikagel (SiO2nH2O) je jedan od najčešće upotrebljavanih adsorbenasa u hromatografiji. Osnovnu strukturu ovog adsorbensa čine tetraedri silicijuma i kiseonika čiji polimeri obrazuju poroznu strukturu karakterističnu za njegovu unutrašnju površinu. Specifična površina iznosi oko 800 m2/g. Za adsorbciju su od značaja hidroksilne grupe vezane za silicijum koji gradi adsorpcionu površinu.

Mehanizam adsorpcije se najčešće ostvaruje preko vodonične veze između atoma vodonika iz silikagela i atoma kiseonika (ili nekog drugog elektronegativnog elementa) iz uzorka (slika 4).

8

Slika 4: Adsorpcija na silikagelu

Kada se razdvajanje komponenata u adsorpcionoj koloni završi, njihove zone se mogu odvojiti jedna od druge rezanjem delova kolone koja je prethodno pažljivo izvađena iz cevi. Nakon ovoga komponente se mogu ekstrahovati iz adsorbensa pogodnim rastvaračem, a zatim analizirati pogodnim fizičkohemijskim metodama kvalitativne i kvantitativne analize.

Još jednostavniji način njihovog razdvajanja je da se eluiranje nastavi do izlaska svih komponenata iz kolone, a sve pojedinačne frakcije istih zapremina se sakupljaju pomoću tzv, frakcionog kolektora i posle toga analiziraju.

2.3 Podeona (particiona) hromatografija

Razdvajanje komponenata particionom (podeonom) hromatografijom vrši se na osnovu različite rastvorljivosti komponenata smeše u dve tečne faze koje se ne mešaju od kojih je jedna stacionarna, a druga mobilna. Kako stacionarnu fazu čini tečni rastvarač vezan za neki čvrst nosač, pored procesa rastvaranja delimično se odigrava i proces adsorpcije na stacionarnoj fazi.

Sposobnost pojedinih komponenata da se rastvaraju u određenom rastvaraču definisana je njihovim particionim koeficijentom, K datim jednačinom 5. Rastvorljivost zavisi od prirode rastvarača i rastvorka (u prvom redu od njihove dielektrične konstante, ), tako da će se polarne supstance bolje rastvarati u polarnim rastvaračima, tj. u rastvaračima sa većom dielektričnom konstantom, a nepolarne u nepolarnim rastvaračima koji imaju manju vrednost dielektrične konstante. (“Slično se u sličnom rastvara”)

Particiona hromatografija se najčešće izvodi na hartiji ili tankom sloju pa se razlikuju:

papirna, tankoslojna hromatografija (Thin-Layer Chromatography TLC)

Ove dve tehnike su veoma slične u procesima nanošenja uzorka, razvijanja hromatograma, detekcije i analize uzorka. U prvom slučaju stacionarnu fazu

9

prestavlja voda kojom je natopljen filter papir, a u drugom tanak sloj silikagela sa kristalnom vodom.

Hromatografija na tankom sloju puno se koristi u analitici, prvenstveno zahvaljujući svojoj jednostavnoj i brzoj tehnici izvođenja. Često je propratna metoda ostalim metodama analitičke hemije. Na primer, u kombinaciji sa spektrofotometrijom: hromatografijom na tankom sloju se razdvajaju supstance, a spektrofotometrijskom metodom se iste identifikuju i kvantitativno određuju.

Hromatografija na tankom sloju je našla široku primenu u različitim industrijskim sferama. Na primer, u prehrambenoj industriji tom metodom se utvrđuje prisustvo nedozvoljenih boja u prehrambenim proizvodima, posebno zbog toga što se zna da su neke od njih kancerogenog dejstva. Zatim, veliku primenu hromatografija na tankom sloju ima u farmaceutskoj industriji, i to prvenstveno u procesima ispitivanja i kontrole lekova sa ciljem njihove identifikacije, određivanja čistoće, ali i ispitivanja stabilnosti aktivnih sastojaka lekova.

Zbog jednostavnosti izvođenja ova metoda u velikoj meri se koristi i za određivanje različitih organskih jedinjenja u biološkom materijalu. Takođe, koristi se i za određivanje različitih fizičko-hemijskih parametara jedinjenja. Mobilna faza je najčešće neki organski rastvarač ili smeša organskih rastvarača koji se ne mešaju sa vodom (stacionarnom fazom). Protok mobilne faze kroz papir ili tanak sloj ostvaruje se kapilarnim prodiranjem kroz poroznu strukturu datog nosača stacionarne faze.

Brzina kretanja mobilne faze zavisi od veličine pora u hartiji, odnosno prečnika čestica čvrstog adsorbensa. Pri horizontalnom protoku mobilne faze kada na molekule rastvarača deluju samo kapilarne sile put koji prelazi front rastvarača (z) za vreme t iznosi (jednačina 5):

(5)

gde je k konstanta koja zavisi od površinskog napona i viskoznosti sistema.

Ukoliko se za razdvajanje koristi uzlazna ili silazna tehnika, pored kapilarnih sila na kretanje mobilne faze utiče i gravitaciona sila koja u prvom slučaju smanjuje, a u drugom povećava brzinu kretanja rastvarača, a time i komponenata smeše koje su u njemu rastvorene. Da bi se postiglo dobro razdvajanje potrebno je uskladiti sastav mobilne faze sa vrstom i dužinom podloge.

Komponenta smeše koja se najbolje rastvara u mobilnoj fazi prelazi najduži put, pošto tu komponentu mobilna faza nosi sa sobom najdalje od starta. Komponenta koja se najbolje rastvara u stacionarnoj fazi, prelazi najkraći put, pošto je stacionarna faza vezana za podlogu.

Prema slici 5, komponenta C se najbolje rastvara u mobilnoj fazi, a komponenta A u stacionarnoj, što znači da ova komponenta ima veći particioni koeficijent.

10

S l i k a 5 : O d r e đ i v a n j e R f v r e d n o s t i

Komponente smeše se identifikuju na osnovu njihovih Rf vrednosti. Rf vrednost se naziva retencioni faktor ili faktor zadržavanja i definiše se kao odnos dužine pređenog puta komponente (a) i dužine pređenog puta rastvarača (d) (jednačina 6):

(6)

Rf vrednosti kreću se u opsegu od nule do jedinice (0 < Rf < 1). Najveću Rf vrednost imaće komponenta koja se najbolje rastvara u mobilnoj fazi, odnosno ona komponenta koja je prešla najduži put, RfC > RfB > RfA. Komponente su dobro razdvojene kada je 0,05 f R .

2.4 Podeona (particiona) hromatografija na tankom sloju

Podeona hromatografija na tankom sloju može se izvoditi horizontalnom, silaznom ili uzlaznom tehnikom. Na slici 6 predstavljena je komora za razvijanje hromatograma uzlaznom tehnikom. U komoru se sipa rastvarač koji predstavlja mobilnu fazu, unutrašnji zidovi se oblažu filtar-hartijom natopljenom rastvaračem i komora se zatvara da bi se postigla ravnomerna zasićenost parom u svim delovima komore. Na prethodno pripremljenu pločicu sa tankim slojem nanosi se mikropipetom ili kapilarom mala količina ispitivane smeše na rastojajanju od oko 1cm od kraja ploče i taj položaj se označava kao startna linija (S). Zatim se pločica postavi ukoso u komoru tako da nivo rastvarača ne pređe visinu na kojoj se nalazi analiza (sika 6 a), a razdvajanje počinje kada mobilna faza pod dejstvom kapilarnih sila počne da se kreće uzlazno (slika 6 b).

11

Slika 6: Komora za izvođenje uzlazne podeone hromatografije na tankom sloju

Priprema tankog sloja se vrši tako što suspenziju pogodnog adsorbensa (silikagel, aluminijum-oksid) u vodi se nanosi ručno ili pomoću specijalnog uređaja po Štalu kao tanak sloj određene i ujednačene debljine po površini staklene pločice. Nakon nanošenja sloja pločica se suši 10 minuta na vazduhu, a zatim još 30 minuta u sušnici na temperaturi od 100oC.

Razvijanje hromatograma predstavlja proces razdvajanja komponenata na tankom sloju i završava se kada front rastvarača dođe do unapred određene dužine pri kraju pločice (rastojanje d na slici 5). Tada se pločica vadi iz komore, zabeleži se front rastvarača i vrši određivanje položaja zona.

Određivanje položaja zona podrazumeva procese kojima zone na hromatogramu postaju vidljive, a to se može postići prskanjem odgovarajućim reagensima koji će nagraditi obojena jedinjenja sa komponentama, osvetljavanjem fluorescentnih supstanci UV lampom, ili merenjem radioaktivnosti radioaktivnih komponenata.

Identifikacija, odnosno kvalitativna analiza razdvojenih komponenata, vrši se izračunavanjem Rf vrednosti, a kvantitativna analiza nekom od fizičkohemijskih metoda direktno na podlozi, ili posle ekstrahovanja komponente i njenog prevođenja u odgovarajući rastvor.

Na slici 7 sa R je označen rezervoar za rastvarač ili eluent (smešu rastvarača), koji za upotrebu u HPLC mora biti bez čvrstih suspendovanih čestica i bez rastvorenog gasa. Čvrste čestice se uklanjaju filtracijom kroz ultrafiltre, dok se rastvoreni gasovi uklanjaju ključanjem u vakuumu, uz pomoć ultrazvuka ili barbotiranjem helijuma. Filter F služi za uklanjanje slučajno prisutnih čvrstih čestica prečnika oko 10 μm. Pumpa PU služi da se obezbedi ulazni pritisak mobilne faze, najčešće između 30 i 300 bar, uz odgovarajući protok kroz hromatografski sistem (oko 1 ml/min). Najčešće su u upotrebi klipne pumpe sa linearnim (jednosmernim) ili naizmeničnim kretanjem klipa. Upotreba pumpi sa naizmeničnim kretanjem klipa ima jedan nedostatak, a to je pulsiranje pritiska, odnosno protoka. Zbog toga se neposredno iza pumpe ugrađuje prigušivač oscilacija (PO).

M predstavlja manometar za merenje ulaznog pritiska, a DR ventil za ispuštanje nepotrebne tečnosti (drain) i za uklanjanje gasa iz prethodno opisanih delova. Injektor (I) predstavlja kritični deo aparature za HPLC jer treba da omogući unošenje uzorka pri visokom unutrašnjem pritisku bez promene režima strujanja (protoka). Pri nižim ulaznim pritiscima (do 70 bar) može se koristiti rešenje sa septumom, dok se za više pritiske koristi rešenje kao što je gasna slavina, koja se pomera ručno ili pomoću elektromagneta ili pneumatskog izvršnog organa. Može se koristiti i rešenje u kombinaciji septuma i gasne slavine.

12

Najčešća zapremina probe je 10-50 μl. Pretkolona (PK) ima iste karakteristike kao kolona i zadatak joj je da ukloni nečistoće unete sa uzorkom i na taj način spreči začepljenje kolone. Pretkolone obično imaju dužinu od nekoliko cm.

Kolona (K) može biti izrađena od stakla (ređe), nerđajućeg čelika ili tantala. Na oba kraja kolone nalaze se proširenja na kojima je narezan navoj na koji se navrće posebna navrtka (nut) namenjena za spajanje kolona sa metalnim kapilarama za dovod i odvod tečnosti. Ove navrtke takođe služe za učvršćivanje sita na početku i kraju kolone koja služe za uklanjanje grubih nečistoća i kao porozni čep pri punjenju kolone.

Detektor (D) služi za prevođenje signala mase (koncentracije) u električni signal, koji se zatim pojačava, moduliše i meri (registruje). Najčešće su u primeni UV-detektori (zasnovani na apsorpciji zračenja iz UV i vidljive oblasti elektromagnetnog spektra), slabije detektori na bazi merenja fluorescencije, indeksa refrakcije, elektrohemijski i ostali. UV detektori mere apsorbanciju pri konstantnoj talasnoj dužini (ili rasponu talasnih dužina) koristeći protočne kivete kroz koje protiče eluat (rastvarač + komponenta) i eluent (rastvarač).

Slika 7: Šema aparature za HPLC

13

3. Spektrometrija

Hromatografijom je moguće vrlo precizno razdvojiti sastojke smeše, ali ih nije moguće precizno identifikovati ili odrediti im preciznu strukturu. Taj posao obavlja se pomoću nekoliko metoda od kojih su osnovne masnena spektrometrija, infracrvena, ultraljubičasta i nuklearno-magnetna rezonantna spektroskopija. Od nabrojanih tehnika najzstupljenija u analizi farmaceutika je masena spektrometrija u kombinaciji sa gasnom fotogrametrijom (GC - MS). Farmakopeja je skup propisa koji utvrđuju zahteve i postupke za izradu i proveru kvaliteta farmakološki aktivnih supstanci, pomoćnih supstanci i gotovih proizvoda.

U farmakopejskim postupcima koriste se:

masena spektrometrija (eng. Mass Spectrometry – MS), spektrofotometrija u ultraljubičastom i vidljivom delu spektra (UV/VIS),

spektrometrija u bliskoj infracrvenoj oblasti (eng. Near–Infrared – NIR), spektrofluorimetrija atomska apsorpciona i atomska emisiona spektrometrija (eng. Atomic

Absorption Spectrometry – AAS, Atomic Emission Spectrometry – AES), nuklearna magnetna rezonantna spektrometrija (eng. Nuclear Magnetic

Resonance – NMR) i spektrometrija u infracrvenoj oblasti (eng. Infrared – IR).

3.1 Masena spektrometrija

Masena spektrometrija je tehnika kojom se analiziraju molekuli na temelju njihove mase (i naboja). Prvi korak pri analizi molekula je jonizacija molekula u jonizatoru. Nastali joni se provode kroz analizator, koji razdvaja jone u prostoru i/ili vremenu. Iz analizatora, joni idu na detektor gde proizvode električni signal koji se može registrovati na oscilposkopu, računaru ili na nekom drugom uređaju. Masena spektrometrija se koristi za:

određivanje sastava nepoznatog uzorka (kvalitativna analiza), određivanje izotopskog sastava uzorka, određivanje strukture molekula posmatrajući fragmentaciju molekula, određivanje molarne mase molekula, određivanje količine određene tvari u uzorku (kvantitativna analiza), određivanje fizičkih I hemijskih svojstava stvari, proučavanje ponašanja jona u vakuumu, identifikacija strukture biomolekula (UH, NK, steroida, proteina) i

kvantitativnu analizu složenih organskih smeša (posebno niskih koncentracija supstanci),

utvrđivanje metabolizma lekova in vivo, praćenje disanja pacijenata za vreme operacija (sastav vazduha), forenzicke analize, detekcija upotrebe steroida kod sportista, praćenje procesa fermentacije u biotehnologiji, otkrivanje oštecenja gena nastalih usled faktora okoline,

14

analiza zagađivaca okoline, detekcija dioksina u kontaminiranoj ribi, utvrđivanje falsifikovanja meda

kukuruznim sirupom, odredivanje starosti i porekla predmeta u geohemiji i arheologiji (na

površini ili pod zemljom na osnovu izloženosti kosmičkom zračenju).

Slika 8: Maseni spektrometar

U masneni spektrometar (vakuum) molekuli jedinjenja se bombarduju elektronima velike energije što rezultuje stvaranjem pozitivnih ili negativnih jona molekula. Ovi joni su nestabilni i brzo se raspadaju na više manjih jona koji se razdvajaju u odnosu na količnik mase i naelektrisanja (m/q) pomoću električnog ili magnetnog polja kao što je predstavljeno na slici 8.

Najvažniji delovi aparature su: sistem za unošenje uzorka (veza GC-MS), jonski izvor, maseni analizator i detektor. Da bi formirani joni na svom putu od jonskog izvora do detektora izbegli sudare sa drugim česticama sistem se nalazi pod visokim vakuumom, pritiska ispod 10-6 mbar. Nekontrolisani sudari mogli bi da izazovu dalje reakcije jona, interferencije bi bile velike, pa samim tim, maseni spektri neadekvatni.

Pre upotrebe maseni spektrometar se mora uravnotežiti. Ovo podrazumeva postizanje stabilne temperature i pritiska, najčešće tokom 24 časa. Sledeća operacija

15

koja predhodi radu je kalibracija. Cilj kalibracije je postizanje optimalnih rezultata tokom analize. U ovom postupku podešavaju se brojni parametri masenog spektrometra, npr. napon ili struja u jonskom izvoru, detektroru i masenom analizatoru, a cilj je podešavanje “masene skale”. Uređaj je najčešće snabdeven programom za automatsku kalibraciju – autotune. Referentna supstanca za kalibraciju kvadrupolnih instrumenata obično je perfluorotributil-amin – PFTBA.

Kao rezultat maseno-spektrometrijskih merenja dobija se grafik zavisnosti inteziteta struje pojedinačnih jona (abundance) od m/z vrednosti. Ovaj grafik naziva se maseni spektar. Iz njega se mogu dobiti sledeće informacije, bitne za određivanje strukture nepoznatog jedinjenja:

Koji su joni prisutni u uzorku, Kako su nastali pojedini joni,

U kojim se međusobnim odnosima nalaze koncentracije tih jona.

Maseni spektri uobičajeno sadrže sledeće vrste jona:

Molekulski joni, čija masa predstavlja molekulsku masu jedinjenja koje se isputuje,

Fragmentni joni, koji nastaju usled raskidanja pojedinih veza u molekulskom jonu,

Preuređeni joni, koji nastaju premeštanjem jednog ili grupe atoma iz jednog jona u drugi,

Metastabilni joni, (pikovi su im razvučeni i slabog inteziteta).

3.2 Tehnike snimanja masenih spektara

Postoje dva načina prikupljanja podataka tokom MS analize:

SCAN – podrazumeva snimanje kompletnog masenog spektra, SIM (Selected ion monitoring) – prate se samo odabrani joni.

SCAN tehnika podrazumeva skeniranje mase u zadatom opsegu uz istovremeno praćenje retencionog vremena. Ovo omogućava identifikaciju analita. Zadati maseni opseg i brzina skeniranja hromatograma određuju vreme praćenja određene mase (dwell time). U toku jednog ciklusa svaka masa iz zadatog opsega se registruje samo jednom, a ciklusi se tokom hromatografisanja ponavljaju. Totalni jonski hromatogram predstavlja grafik zavisnosti ukupnih abundanci sabranih tokom analize, od vremena. Iz njega se dobijaju podaci o kvalitetu (retenciona vremena) i kvantitetu (površina pika), kao i svi hromatogrami dobijeni hromatografisanjem pri konstantnoj dužini. Svaka tačka u TIC predstavlja zbir abundanci svih detektovanih jona. S druge strane, za svaku tačku u memoriji računara postoji ceo maseni spektar dobijen SCAN tehnikom. Na bazi ovih podataka može se prikazati jonski homatogram (IC). Njegovom upotrebom povećava se selektivnost kod pikova koji se preklapaju u velikoj meri, ako su karaktreristični joni preklopljenih komponenti različiti.

16

Skeniranje se najčešće izvodi brzinom od 0,5 do 1 scan/s. SCAN tehnika se više koristi pri kvalitativnoj analizi.

SIM tehnika se koristi u kvantitativnim određivanjima. Pre njene upotrebe, da bi se postigli optimalni uslovi, mora se izvesti anliza SCAN metodom. SIM tehnikom detektuju se vrednosti m/z samo reprezentativnih jona posmatranog molekula. Vreme praćenja jona je veće pa se samim tim povećava i osetljivost čak od 100 do 1000 puta. Karakteristični joni, vreme početka snimanja (start time) i vreme praćenja jona (dwell time) odabiraju se na osnovu podataka dobijenih pomoću SCAN tehnike.

Hromatogram se dobija kao zavisnost ukupne abundance sabrane tokom analize od vremena, a daje podatke o kvalitetu (retenciono vreme) i kvantitetu (površina pika) posmatrane komponente. Svaka tačka u hromatogramu predstavlja zbir abundanci posmatranih jona. SIM tehnika se može koristiti i za kvalitativna određivanja komponenata u tragovima.

3.3 PBM (Probability Based Matching) sistem

PBM sistem identifikuje komponentu poredeći spektre koji se nalaze u postojećoj bazi podataka sa nepoznatim spektrom ispitivane supstance. Za prepoznavanje komponente koristi se postupak vrednovanja na bazi verovatnoće zasnovan na McLafferety-jevom algoritmu. Ovaj sistem primenjuje povratnu metodu pretraživanja, pa se tako celokupni sadržaj biblioteke može uporediti sa nepoznatim spektrom. Pri odabiru najznačajnijih pikova referentnog masenog spektra jednako se vrednuju i masa i abundanca [23].

Reverznim pretraživanjem utvrđuje se da li su pikovi u referentnom masenom spektru prisutni u spektru ispitivane supstance. Ako se u ispitivanom spektru pojavi višak pikova, oni se ignorišu, pa se tako mogu analizirati i maseni spektri smeše analita i prisutnih nečistoća. U većini drugih sistema maseni spektar nepoznatog jedinjenja poredi se sa već poznatim spektrima.

4. Najčešće metode analize farmaceutika

U farmaceutskoj analizi lekova moraju se primenjivati osetljive metode koje obezbeđuju odgovarajuću selektivnost. Najčešće se za razdvajanje, identifikaciju i kvantitativnu analizu višekomponentnih farmaceutskih oblika, kao i za ispitivanje stepena čistoće primenjuju:

1. gasna hromatografija (eng. Gas Chromatography – GC) i2. tečna hromatografija pod visokim pritiskom (eng. High Performance LiquidChromatography – HPLC).

Osetljivost hromatografskih metoda zavisi od vrste detektora. Najčešće se koriste fotoelektrični detektori na principu fotodioda (photodiodearray detector – PDA) ili sa definisanom talasnom dužinom detekcije (fixed wavelength detector).

Za identifikaciju propisuju, ekonomski opravdanu i jednostavniju, metodu tankoslojne hromatografije (TLC).

17

4.1 Gasna hromatografija i masena spektrometrija

Kompleksne smeše se mogu veoma lako razdvojiti gasnom hromatografijom, a MS se koristi za identifikaciju individualnih komponenata, jer maseni spektar daje informacije o njihovoj strukturi. Pojedinačne komponente smeše se pojavljuju na gasnom hromatogramu u vidu zasebnih pikova. Retenciono vreme može poslužiti kao veličina za kvalitativno definisanje, ali ovo nije pouzdan način, pa se nikako ne sme koristiti za određivanje sastava nepoznatih i ranije neidentifikovanih jedinjenja

Ono što je veoma bitno za GC – MS je da obe tehnike koriste približno istu količinu uzorka u gasovitom stanju (manje od 1 ng). Nedostatak se ogleda u ograničenju po pitanju upotrebe. GC – MS mogu se analizirani samo komponente čiji je napon pare veći od 10-10 mbar, a maseni spektri izomernih komponenti se ne razlikuju. Drugi nedostatak se često prevazilazi hromatografskim razdvajanjem izomera.GC se može direktno vezati za MS, što predstavlja kontinualni postupak vezivanja.

Postoji više modela interfejsa koji povezuju ova dva instrumenta. U diskontinualnom postupku komponente se prvo razdvajaju pomoću GC, zatim se kondenzacijom u kapilarnoj cevi na izlazu izdvajaju, a potom se svaki uzorak unosi zasebno u MS. Kada se MS direktno vezuje za GC, postoji problem u razlici pritisaka. Na izlazu iz GC pritisak iznosi oko 1 bar, a MS radi pri visokom vakuumu, pritiska od 10-4 do 10-6 mbar. Danas je pojava viška gasa nosača prevaziđena, jer se koriste kapilarne kolone kod kojih je protok gasa nosača relativno mali. U sistemu GC – MS koriste se različiti sistemi za injektovanje, kolone, gasovi nosači, jonski izvori i maseni analizatori.

Tokom analize dobija se veliki broj podataka, koji se ne mogu obraditi ručno, pa je neophodno povezivanje instrumenata sa računarskim sistemom.Opšta šema aparature, bez obzira na navedene razlike, može se prikazati na način pokazan na slici 9, pri čemu su brojevima označeni sledeći delovi:

1. boca sa gasom nosačem,2. injektor,3. kapilarna kolona,4. veza između GC i MS,5. jonski izvor,6. maseni analizator,7. detektor,8. vakuum sistem,9. računar.

18

Slika 9: Opšta šema aparature GC – MS

Problem razlike pritisaka prilikom direktnog vezivanja MS za GC nekada je prevazilažen upotrebom separatora. Zadatak ovih uređaja bio je uklanjanje malih molekula (atoma) gasa nosača iz eluata i propuštanje veće količine krupnijih organskih molekula u jonski izvor. Pri tome je dolazilo do gubitaka analita u velikoj količini.

Sa upotrebom kapilarnih kolona problem je nestao jer je omogućeno direktno vezivanje, to jest uvođenje analita direktno u jonski izvor MS. Celokupna količina analita, u ovom slučaju, dolazi u MS, što je naročito značajno kada se analiziraju supstance čije su koncetracije u uzorku izuzetno male. Interfejs mora biti inertan i na njemu ne bi trebalo da ima hladnih tačaka, da bi se izbegla kondezacija uzorka.

Direktno vezivanje pokazuje niz nedostataka. Protok gasa nosača u jonskom izvoru nije konstantan, jer zavisi od dimenzija kolone i temperaturnog programa. Retenciona vremena dobijena upotrebom klasičnih detektora ne mogu se porediti. Izbor kolone prema veličini i optimalni protok ograničeni su na maksimalni protok pri kojem MS može da radi, a pri zameni kolone aparat se mora isključiti.

4.2 Tečna hromatografija

Kod tečne hromatografije pokretna faza je uvek tečna, dok nepokretna može biti ili čvrsta ili tečna. U zavisnosti od toga razlikuju se dva tipa tečne hromatografije:

• tečno-čvrsta i• tečno-tečna hromatografija.

Kod tečno-čvrste hromatografije do razdvajanja dolazi usled razlike u apsorpcionoj sposobnosti molekula različitih komponenata smeše na površini nepokretne faze. S obzirom da je u osnovi razdvajanja apsorpcija, drugi naziv za tečno-čvrstu hromatografiju je apsorpciona hromatografija. Kao nepokretna faza u apsorpcionoj hromatografiji najčešće se koriste supstance neorganskog porekla, kao što su: silika gel, aluminijum-oksid i slično.

19

U apsorpcionoj hromatografiji retencija se menja u zavisnosti od zapreminskog udela polarnije komponente pokretne faze (φ) prema jednačini 7

RM = m + nlogϕ (7)

gde je m odsečak, a n nagib u jednačini 7.

U tečno-tečnoj hromatografiji retencija je posledica raspodele između dvetečne faze koje se ne mešaju. Jedna tečna faza je pokretna, dok je druga nepokretna i vezana (fizički ili hemijski) za površinu nosača, obično silika gela. Zavisnost između retencije i sastava pokretne faze u tečno-tečnoj hromatografiji može se opisati kvadratnom jednačinom 8:

RM = Aϕ2 + Bϕ + R0M (8)

u kojoj su:A i B – konstante za datu kombinaciju rastvorak-pokretna-nepokretna faza,φ – zapreminski udeo organskog rastvarača u pokretnoj fazi,R0

M – retencija rastvoraka u pokretnoj fazi pri φ = 0.

Dokazano je da je konstanta A najčešće mala, pa se prvi član u kvadratnoj jednačini može zanemariti. Ovo se posebno odnosi na pokretnu fazu metanol-voda. U tom slučaju jednačina 8 dobija oblik:

RM = R0M + Sϕ

Obe konstante R0M i S karakteristične su za dati rastvorak, pokretnu i

nepokretnu fazu i koriste se za definisanje odgovarajućih osobina kako različitih hromatografskih sistema, tako i samih rastvoraka.

Hromatografija visoke efikasnosti je vrsta tečne hromatografije (Liquid Chromatography, LC) koja je znatno poboljšana u pogledu selektivnosti i rezolucije komponenata smeše. To je postignuto primenom kolone punjene stacionarnom fazom sastavljenom od sfernih mikro-čestica prečnika 2–5 μm, ili poroznih monolitnih materijala koji značajno dovode do pada pritiska u koloni. U cilju dobijanja kontinualnog protoka mobilne faze i uspostavljanja dinamičke ravnoteže sa stacionarnom fazom, potrebno je na mobilnu fazu delovati visokim ulaznim pritiskom.

Otuda se HPLC skraćenica prvobitno odnosila na tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom (High Pressure Liquid Chromatography). Nazivana je i tečnom hromatografijom visoke rezolucije (high-resolution) kao i tečnom hromatografijom velike brzine (high-speed). Danas se skraćenica HPLC odnosi na kolonsku hromatografiju visoke efikasnosti (High Performance Liquid Chromatography).

HPLC koristi izabranu strukturnu osobinu supstanci i tokom analize ne menja njihovu hemijsku prirodu. U zavisnosti od hemijske strukture, sastojci smeše provode različito vreme u koloni jer imaju različite afinitete zadržavanja na nepokretnoj fazi. Nakon razdvajanja konstituenata smeše sledi njihovo određivanje preko električnog signala primenom odgovarajućeg detektora pri čemu se dobija hromatogram–kriva zavisnosti jačine signala od vremena. Površinu zavisnosti direktno određuje koncentracija jedinjenja, a fizičkohemijske osobine jedinjenja određuju njegov položaj na hromatogramu, vreme zadržavanja (retenciono vreme, tR). Ovaj parametar se meri od trenutka kada se uzorak/standard ubace u kolonu do njihovog izlaska iz kolone.

20

5. Zaključak

Danas kada je farmaceutska industrija postala jedna od vodećih industrija u svetu i kada se svaki dan proizvede na stotine novih lekova, potrebno je sa tim razvijati i metode analize farmaceutika.

Kvantitativna analiza lekova i ostalih farmaceutskih preparata je sastavni deo kontrole ovih proizvoda obzirom na činjenicu da delotvorne koncentracije nisu uvek i bezbedne. Njihova primena je ograničena rokom trajanja, jer se tokom vremena mogu hemijski promeniti, pri čemu dolazi do gubitka njihovog aktivnog dejstva, a u nekim slučajevima i do pojave toksičnih efekata.

21

6. Literatura

1. Gasna hromatografija – masena spektrometrija (GC-MS) | Tehnologija hrane

2. Spektroskopija i spektrometrija | Hemija | Svet hemije

3. Masena spektrometrija 2010

4. Masena spektrometrija - Wikipedija

5. Infracrvena identifikacija molekula donosi napredak u medicini

6. [es] - instrumentalne metode

7. Spektroskopija - Wikipedija

22