Načelo metode

ULTRALJUBIČASTA I VIDLJIVA (UV-Vis) SPEKTROFOTOMETRIJA

� molekulska apsorpcijska spektroskopija

� mjerenje količine apsorbirane svjetlosti u UV (190-380 nm)

i vidljivom području (380-800 nm)

� apsorpcija UV i Vis zračenja u organskim molekulama

prijelaz e- iz osnovnog u jednu od vibracijskih i rotacijskih razina pobuđenog elektronskog energijskog stanja

� valna duljina pri kojoj molekula apsorbira ovisi o jakosti kojom su vezani njezini e-

� kromofori - nezasićene organske funkcionalne skupine

� auksokromi - grupe s jednim ili više nesparenih elektronskih parova

� batokromni i hiperkromni pomak

Čimbenici koji utječu na apsorpciju u UV/Vis području

Lambert-Beerov zakon

A = - log T = log Io / I = k × c × l

k = ε = molarna apsorptivnost

A = ε × c × l

UV-Vis-spektrofotometar

• izvor zračenja: vodikova ili živina lampa, volframova lampa

• monokromator: prizma ili rešetka s ulaznom i izlaznom pukotinom

• nosač uzorka

• detektor zračenja

UV-Vis-spektrofotometar

‘Diode array’ instrument

� skala valnih duljina

• otopina holmijeva perklorata• dozvoljeno odstupanje ±1nm (UV) i ± 3 nm (Vis)

Kalibracija instrumenta

UV spektar otopine holmijeva perklorata

� mjerna skala

• otopina kalijeva dikromata• dozvoljeno odstupanje

apsorbancije ± 0.01

UV spektar otopine kalijeva dikromata

� rezolucija (za kvalitativnu analizu)

• kontrolirana širinom pukotine • otopina toluena u heksanu,• omjer maksimuma (269 nm) i minimuma (266 nm)

1.kvalitativna ispitivanja

� potvrda identiteta lijekova: Ph. Eur.- Second identification

� u monografiji je definirana valna duljina maksimuma (± 2 nm) i specifična apsorbancija ili omjer apsorbancija na različitim valnim duljinama

specifična apsorbancija

1%

Primjena UV/Vis spektrofotometrije u analitici lijekova

A1cm = 10εεεε/Mr

apsorbancija otopine koja u 100 ml sadrži 1 g ispitivane tvari, debljina sloja 1cm

MERCAPTOPURINE

Mercaptopurinum

IDENTIFICATION

A. Dissolve 20 mg in 5 ml of dimethyl sulphoxide R

and dilute to 100 ml with 0.1 M hydrochloric acid.

Dilute 5 ml of the solution to 200 ml with 0.1 M

hydrochloric acid. Examined between 230 nm and

350 nm (2.2.25), the solution shows only one

absorption maximum, at 325 nm.

Primjeri u Ph. Eur.

MORPHINE HYDROCHLORIDE

Morphini hydrochloridum

IDENTIFICATION

A. Dissolve 10 mg in water R and dilute to 100.0

ml with the same solvent. Examined between 250

nm and 350 nm (2.2.25), the solution shows a

single absorption maximum, at 285 nm. The

specific absorbance at the maximum is about 41.

IBUPROFEN

Ibuprofenum

IDENTIFICATION

B. Dissolve 50.0 mg in a 4 g/l solution of sodium hydroxide

R and dilute to 100.0 ml with the same alkaline solution.

Examined between 240 nm and 300 nm (2.2.25), using a

spectrophotometer with a band width of 1.0 nm and a scan

speed of not more than 50 nm/min, the solution shows a

shoulder at 258 nm and two absorption maxima, at 264

nm and 272 nm. The ratio of the absorbance measured at

the maximum at 264 nm to that measured at the shoulder at

258 nm is 1.20 to 1.30. The ratio of the absorbance measured

at the maximum at 272 nm to that measured at the shoulder

at 258 nm is 1.00 to 1.10.

UV spektar hidrokortizona i betametazona

λλλλmax = 240 nmA1cm

435

390

1%

2. ispitivanje čistoće lijekova

OXYTETRACYCLINE

Oxytetracyclinum

TESTS

Absorbance (2.2.25). Dissolve 20.0 mg in buffer solution pH 2.0

R and dilute to 100.0 ml with the same buffer solution. Dilute

10.0 ml of the solution to 100.0 ml with buffer solution pH 2.0 R.

The specific absorbance determined at 353 nm is 290 to 310,

calculated with reference to the anhydrous substance.

a) specifična apsorbancija ( )

� ispitivano onečišćenje i ljekovita tvar imaju apsorpcijski maksimum na različitim valnim duljinama ili različitu specifičnu apsorbanciju na istoj valnoj duljini

A1cm1%

b) apsorbancija (A)

• ne smije prijeći određenu vrijednost

• ne smije biti veća od apsorbancije poredbene otopine koja sadrži gornju dozvoljenu količinu onečišćenja

ADRENALINE TARTRATE

Adrenalini tartras

TESTS

Adrenalone. Dissolve 50.0 mg in

0.01 M hydrochloric acid and dilute

to 25.0 ml with the same acid. The

absorbance (2.2.25) of the

solution measured at 310 nm is

not greater than 0.10.

RESERPINE

Reserpinum

TESTS

Oxidation products. Dissolve 20

mg in glacial acetic acid R and

dilute to 100.0 ml with the same

acid. The absorbance (2.2.25)

measured immediately at 388 nm

is not greater than 0.10.

TESTS

Absorbance (2.2.25). The absorbance of solution S

measured at 440 nm is not more than 0.10. (This limit

corresponds to 0.035 per cent of omeprazole

impurity F or omeprazole impurity G).

IMPURITIES

OMEPRAZOLE

Omeprazolum

F. R = OCH3, R′ = H: 1,3-dimethyl-8-methoxy-12- thioxopyrido

[1′,2′:3,4]imidazo[1,2-a]benzimidazol-2(12H)-one,

G. R = H, R′ = OCH3 : 1,3-dimethyl-9-methoxy-12-

thioxopyrido[1′,2′:3,4]imidazo[1,2-a]benzimidazol-2(12H)-one.

c) omjer apsorbancija (A1/A2) na dvije različite valne duljine (ispitivana tvar, onečišćenje)

BACITRACIN

Bacitracinum

TESTS

Bacitracin F and related substances. Dissolve 0.15 g in

0.05 M sulphuric acid and dilute to 100.0 ml with the same

acid. Dilute 2.0 ml of this solution to 10.0 ml with 0.05 M

sulphuric acid. The ratio of the absorbance (2.2.25) at

290 nm to that at 252 nm is not greater than 0.20.

• Kvantitativna analiza lijekova

� određivanje pomoću specifične apsorbancije

lA

Ac

cm ×=

11%

� određivanje pomoću poredbene otopine

� određivanje pomoću kalibracijske krivulje

• kalibracijska krivulja priređena pomoću poredbenih otopina

• linearan odnos apsorbancije i koncentracije

• sadržaj ispitivane tvari odredi se interpolacijom

Kalibracijska krivulja

CHLORAMPHENICOL

Chloramphenicolum

ASSAY

Dissolve 0.100 g in water R and dilute to 500.0 ml

with the same solvent. Dilute 10.0 ml of this solution

to 100.0 ml with water R. Measure the absorbance

(2.2.25) at the maximum at 278 nm.

Calculate the content of C11H12Cl2N2O5 taking the

specific absorbance to be 297.

Primjer u Ph. Eur.

DIENESTROL

Dienestrolum

ASSAY

Dissolve 25.0 mg in ethanol R and dilute to 100.0 ml with

the same solvent. To 5.0 ml of this solution add 10 ml

of ethanol R and dilute to 250.0 ml with 0.1 M sodium

hydroxide. Prepare a reference solution in the same

manner using 25.0 mg of dienestrol CRS. Measure the

absorbance (2.2.25) of the solutions at the maximum at

245 nm.

Calculate the content of C18H18O2 from the measured

absorbances and the concentrations of the solutions.

Određivanje sadržaja levonorgestrela; USP 30

� derivatizacija analita prije određivanja

• analiza adrenalina u prisutnosti lokalnih anestetika

Povećanje selektivnosti i osjetljivosti u kvantitativnoj analizi

Primjer

apsorpcijski maksimumi u istom UV području

Fe λλλλmax = 540 nm

kompleks adrenalina s Fe2+

� derivatizacija onečišćenja prije kvantitativne analize

CARBASALATE CALCIUM

Carbasalatum calcicum

TESTS

Salicylic acid. In a 100 ml volumetric flask, dissolve 0.200 g in 80

ml of water R and add 10 ml of a 10 g/l solution of ferric nitrate R

in a 80 g/l solution of dilute nitric acid R. Dilute to 100.0 ml with

water R. Immediately after preparation, measure the absorbance

(2.2.25) of the solution at the maximum of 525 nm using water R

as the compensation liquid. The absorbance is not greater than

0.115 (0.5 per cent, expressed as salicylic acid).

Primjer

� pomak apsorpcijskog maksimuma podešavanjem pH vrijednosti otopine analita

λλλλmax = 299 nm

Primjer

• analiza acetilsalicilne kiseline u prisutnosti kofeina i dekstropropoksifena

• značajan utjecaj kod širokih apsorpcijskih maksimuma slabog nagiba

� derivativni spektri

Apsorpcijski spektri cefotaksim natrija (A) i cefadroksil monohidrata (B)

cefotaksim natrij

cefadroksil monohidrat

Prva derivacija Druga derivacijaapsorpcijskih spektara

cefotaksim natrija (A) i cefadroksil monohidrata (B)

4. određivanje fizikalno-kemijskih svojstava lijekova(pretformulacijska i formulacijska istraživanja)

a) određivanje topljivosti lijeka

• otapanje lijeka u vodi ili puferu i mjerenje apsorbancijenakon uspostavljanja ravnoteže

• prevođenje lijeka u neionizirani oblik i mjerenje zamućenja

b) određivanje koeficijenta raspodjele lijeka

c) ispitivanje stabilnosti lijeka

• razgradni produkti imaju različit apsorpcijski maksimum od ishodne ispitivane tvari

• praćenje kinetike razgradnje lijeka

d) određivanje pKa vrijednosti

• pH ovisan UV pomak ionizirane i neionizirane grupe

AuA

AAipHpKa

−

−+= log

UV spektar fenilefrina u kiselom i lužnatom mediju

A - apsorbancija u puferu poznate pH vrijednosti

Ai - apsorbancija potpuno ionizirane vrste

Au- apsorbancija potpuno neionizirane vrste

e) određivanje oslobađanja lijeka iz formulacije

(dissolution testing)

• rutinska metoda za praćenje oslobađanja aktivne tvari

Oslobađanje pseudoefedrina iz dozirnog oblika

Posebnosti metode

Ograničenja metode

� jednostavna, jeftina, izdržljiva i precizna metoda za određivanje lijekova

� rutinska metoda za određivanje fizikalno-kemijskih svojstava lijekova

� uporaba derivativnih spektara rješava probleme osnovne metode

� umjereno selektivna; selektivnost ovisi o kromoforupojedinog lijeka

� slabo primjenjiva u analizi smjesa