Univerzitet u NišuPrirodno–matematički fakultet

Odsek za hemiju

Seminarski rad

Primena optičkih i električnih metoda analize za kvalitativnu i kvantitativnuPrimena optičkih i električnih metoda analize za kvalitativnu i kvantitativnu analizu flavonoidaanalizu flavonoida

Kandidat Profesor Jovana Pavlović dr Gordana Miletić

UvodUvod

Flavonoidi su jedna od najbrojnijih i najrasprostranjenijih grupa prirodnih proizvoda koji su za nas važni ne samo kao biljne boje, već i zbog toga što je utvrđeno da su mnogi od njih fiziološki aktivni. Kako je uloga antocijanina kao biljnih pigmenata neosporna, bezbojni flavoni i flavonoli su izazivali pažnju istraživača kako bi se ispitale njihove funkcije. Flavonoidi predstavljaju sekundarne biljne metabolite. U ljudskoj ishrani najčešće se unose konzumiranjem voća, povrća, vina, čajeva i kakaoa (Heim et al., 2002). Što se tiče zastupljenosti flavonoida u hrani, katehini, flavonoli i proantocijanidini su uglavnom zastupljeni u voću. Za razliku od njih flavanoni i flavoni su ograničeni na citrusne vrste voća kao što su pomorandže i limun. Kod nekog voća (npr. jabuke), flavonoli su primarno zastupljeni u koži. Crno grožđe je najbogatiji izvor katehina, a zatim slede jabuke, šljive i kajsije. Estri galne kiseline sa katehinom (galotanini: epigalokatehin, epigalogalat i epikatehingalat) su vrlo retki u voću. U malim količinama javlaju se u jagodičastom voću, ribizlama i grožđu. Nađeno je da u jagodama imamo najkompleksniju smešu katehina, koja se sastoji od katehina (75% ukupne količine katehina), epikatehingalata (18% ukupne količine katehina), epigalokatehina (5% ukupne količine katehina) i galokatehina (3% ukupne količine katehina). Najzastupljeniji flavonol u voću je kvercetin, a najbogatiji izvori ovog flavonoida su crvena borovnica, ribizla i brusnica (Kyle & Duthie, 2006). U jagodičasto voću i ribizlama takođe imamo i kempeforla i miricetina. Povrće iz roda Allium (npr. luk), Brassica (npr. brokoli) i Lactuca (npr. kupus), kao i paradajz (vrsta Lycopersicon) su vrlo važan izvor flavonola, pre svega kvercetina i kempferola. Flavoni se takođe nalaze u pojedinom povrću kao što je: celer, slatka paprika i kupus. Katehini i proantocijanidini nisu nađeni u zelenom lisnatom ili korenastom povrću, ali se nalaze u nekim leguminozama. Paradajz je jedino povrće koje moguće sadrži flavanone naringeni i hesperetin. Zelena čili papričica je jedna od nekolicine voća koja sadrži i flavonole (kvercetin) i flavone (luteolin) (Kyle & Duthie, 2006).

Pošto su postojale mnoge još neotkrivene funkcije ovih jedinjenja, došlo je do velikog interesa za njihovo istraživanje u poslednjih 20 godina. Razni in vitro i in vivo eksperimenti pokazali su da flavonoidi poseduju antialergijske, anti inflamatorne, antiviralne i antioksidativne osobine (Rotelli et al., 2003; Knekt et al., 1997; Puupponen–Pimiӓ et al., 2005). Pored toga, delovanjem po nekoliko različitih mehanizama, pojedini flavonoidi pokazuju značajnu antikancerogenu aktivnost. Određeni flavonoidi imaju mogućnost inhibicije široke oblasti enzima, ali se posebno ispoljava njihova inhibitorna aktivnost na nekoliko enzimskih sistema, koji su povezani sa aktivacionim procesima u ćeliji, kao što su: protein kinaze, protein tirozin kinaze i fosfolipaze (Middleton, 1996). Zbog njihove mogućnosti inhibicije oksidacije LDL (low density lipoprotein) proteina, flavonoidi ispoljavaju jedinstveni efekat zaštite od kardiovaskularnih oboljenja i infarkta miokarda (Mazur et al., 1999 i Hertog et al., 1993). Inhibicija NADH–oksidaze karakteristična je za flavonoide koji poseduju keto grupu u C4 položaju, dvostruku C2–C3 vezu, kao i 3’, 4’, 5’–trihidroksilni sistem u prstenu B. Antiinflamatorna aktivnost se manifestuje mogućnošću inhibicije nekih enzima kao što su ciklo–oksigenaze i 5–lipooksigenaze, koji u svojim metaboličkim ciklusima izazivaju edeme, artritis, dermatritis i druga patološka stanja (Wang

et al., 1999). Neki flavonoidi kao što su kvercetagetin–3,6,7,4'–tetrametiletar i kvercetagetin, mogu da deluju kao antispazmolitički agensi, i da dovode relaksacije glatkih mišića tokom respiratornih komplikacija. Upotreba kvercetina u tradicionalnoj medicini u lečenju dijareje i dizenterije poznata je godinama. Zadnjih godina sve više se obraća pažnja na mogućnost flavonoida da inhibiraju ćelijski ciklus, proliferaciju ćelije i oksidativni stres, kao i da indukuju detoksifikacione enzime i aktiviraju imuni sistem. Većina dobrih efekata po ljudsko zdravlje povezani su sa njihovim antioksidativnim osobinama i sposobnošću helatizacije. Saznanja o tako raznovrsnim funkcijama flavonoida iziskivala su još veći rad na izučavanju raznih klasa flavonoidnih jedinjenja. Tako su se razvile i nove metode za izolovanje i razdvajanje ovih jedinjenja, kao i metode za određivanje njihove strukture, što je bitno za napredovanje u istraživanjima na ovom polju. Tokom godina istraživanja, napredak u hromatografskoj tehnologiji pri razvajanju i identifikaciji, omogućio je razdvajanje kompleksnih smeša na njihove poznate komponente. Usvaršavanjem spektroskopskih metoda u UV i Vis oblasti, i kombinacijom istih sa NMR i masenom spektroskopijom, došlo je do velikog napredka u praktičnom postupku pri radu sa vrlo malim količinama materijala za potpuno određivanje strukture i stereohemije jedinjenja.

FlavonoidiFlavonoidi

Hemijski, fenolna jedinjenja se mogu definisiati kao supstance koje poseduju aromatični prsten na kojem se nalazi jedna ili više hidroksilnih grupa. U biljkama se mogu naći veoma raznovrsna fenolna jedinjenja uključujući proste fenole, fenilpropanoide, derivate benzoeve kiseline, flavonoide, stilbene, tanine, lignane i lignine. Fenolna jedinjenja vode poreklo od jedne od glavnih klasa sekundarnih metabolita u biljkama, amino kiselina. Većina nastaje iz fenilalanina, a nešto manji deo iz tirozina. Fenilalanin–amonijum lijaza katalizuje reakciju otpuštanja amonijaka iz fenilalanina, što vodi nastajanju cimetne kiseline. Uvođenjem hidroksilne grupe u para položaj cimetne kiseline nastaje kumarinska kiselina. Dalja hidroksilacija kumarinske kiseline u položaju 3 vodi formiranju kafene, dok hidroksilacija u položaju 3 i 5 uz istovremeno metilovanje ovih položaja dovodi do formiranja ferulne i sinapinske kiseline. Kako ova jedinjenja sadrže fenil grupu i C3 bočni lanac jednim imenom se nazivaju fenilpropanoidi (C6–C3), i služe kao prekursori u sintezi lignina i mnogih drugih jedinjenja. Flavonoidi, uključujući flavone, izoflavone i antocijanidine nastaju kondenzacijom fenilpropanoida. Uz učešće tri molekula malonil–koenzima A, a zatim kondenzacijom novonastale jedinice sa p–kumarinskom kiselinom formira se čalkona, koji postepeno ciklizuje i dolazi do stvaranja naringenina (flavon). Ova tačka u biosintezi predstavlja “tačku grananja” i odavde dolazi do sinteze raznih strukturnih klasa flavonoida. Osnovnu strukturu flavonoida čini difenilpropan (C6–C3–C6), odnosno 2–fenil–hromen–4–on (osnovna struktura flavonoida); 3–fenil–hromen–4–on (osnovna struktura izoflavonoida) i 4–fenilkumarin (osnovna struktura neoflavonoida) (slika 1). Svi flavonoidi mogu biti hidroksilovani, alkilovani i glikozilovani sa monosaharidima i oligosaharidima, a često imaju i acil grupe u različitim položajima na osnovnoj flavonoidnoj strukturi ili glikozidnom delu (Harborne et al., 2000). Kod flavonoida postoji i velika sklonost ka umrežavanju i polimerizaciji, npr. tanini (Winkel–Shirley, 2001).

osnovna struktura

flavanoni flavan – 3 –oli falvoni

flavon – 3 –oli antocijanidin izoflavoni

Slika 1.Slika 1. Osnovna struktura i glavne grupe flavonoida Osnovna struktura i glavne grupe flavonoida

Flavonoidi (flavus–žut) su prirodne boje, najčešće biljnog porekla. Flavonoidi su jedni od najvažnijih biljnih pigmenata. Za razliku od flavonoida koji apsorbuju u UV oblasti i koji se ne mogu smatrati pravim biljnim pigmentima (obično su kopigmenti), antocijanini apsorbuju u Vis oblasti spektra i smatraju se za prave biljne pigmente. Antocijanini pokazuju širok opseg boja od svetlo roze preko crvene do plave.

Pojedina jedinjenja u okviru svake klase flavonoida, mogu se razlikovati uglavnom prema broju i položaju hidroksilnih grupa i metoksi supstituenata u dva benzenova prstena. Ovi supstituenti se obično nalaze u položaju 7, ili 5 i 7 prstena A i u položaju 4’, zatim 3’, 4’, 5’ prstena B (Miletić i Miletić, 1996). Flavonoidna jedinjenja obično postoje u biljkama u obliku glikozida. Broj flavonoidnih glikozida je veliki, a razlikuju se po vrsti šećera i položaju njihovog vezivanja za aglikon. Šećeri mogu biti proste heksoze i pentoze, kao i di– i tri– saharidi. U prirodi se najčešće nalaze monoglikozidi flavonoida dok su diglikozidi i triglikozidi znatno ređi. D–glukoza, D–glaktoza i L–ramnoza su šećeri koji se najčešće javlajaju. L–arabinoza, D–glukuronska kiselina i L–ksiloza su mongo ređe vezani, a mnogi od kombinovanih oligosaharida su asosovani sa flavonoidima (Miletić i Miletić, 1996). U gotovo svakoj biljci pronađeni su flavonoli (za razliku od flavona, flavonoli poseduju hidroksilnu grupu u položaju 3 pa se mogu nazvati i 3–hidroksiflavoni) i u manjoj meri flavoni (Harborne et al., 2000). Flavanoni i flavoni se često nalaze zajedno, za razliku od

O8

7

6

5 4

36'

5'

4'2'

O

O

O

O

O

OH

O

O

OH

O

OO

OH

flavonola i flavona koji se često isključuju u mnogim biljkama. Antocijanidini su gotovo odsutni u biljkama koje su bogate flavanonima.

AntocijaniniAntocijanini

Antocijanini predstavljaju najveću grupu flavonoidnih jedinjenja odgovorni za širok opseg boja, od ružičaste, preko crvene i ljubičaste do tamno–plave većine voća i povrća. Naziv antocijanini potiče od grčkih reči: antos (άνθός)–cvet i kianos (κυανός)–plav. To su O–heterociklična jedinjenja sa osnovnim C6–C3–C6 flavonoidnim skeletom (Lee i Schwartz, 2006). Glavni izvori antocijanina su biljne vrste iz familija Vitaceae (grožđe) i Rosaceae (višnje, šljive, maline, jagode, kupine, jabuke, breskve itd.). Druge familije koje sadrže antocijanine su: Solanaceae (tamarilo i plavi patlidžan), Saxifragaceae (crvene i crne ribizle), Cruciferae (crveni kupus) i Ericaceae (borovnica i jarebina) (Jackman i Smith, 1996). Antocijanini predstavljaju najveću grupu pigmenta rastvornih u vodi. U prirodi, antocijanini postoje u formi glikozida ili flavilijum (2–fenilbenzopirilijum) soli. Najčešće grade glikozide sa glukozom, ali i sa ramnozom, arabinozom ili galatkozom, kao i sa nekim disaharidima (Mateus i Freitas, 2009). Antocijanini se međusobno razlikuju zavisno od broja hidroksilnih ili metoksi grupa; tipa, broja i mesta vezanog šećera i tipa i broja alifatičnih ili aromatičnih kiselina koje su vezane za šećer. Neki antocijanini mogu biti vezani u kompleks sa metalima kao sto su Fe, Al i Mg (Wrolstad, 2000; Jackman i Smith, 1992).. Aglikon antocijanina (deo bez šećera) naziva se antocijanidin. Antocijanidini su veoma nestabilni. Glikozidacijom antocijanidina povećava se stabilnost i rastvorljivost u vodi ovih pigmenata. Najčešći položaj gde se vrši glikozidacija je C3–hidroksilna grupa. Povećanjem broja ostatka šećera u antocijaninima povećava se stabilnost. Acilovanjem ostatka šećera kod antocijanina takođe se povećava stabilnost ovih pigmenata. Acilovani antocijanini su jako obojeni iznad pH 4,0 dok su konvencionalni antocijanini bezbojni iznad pH 4,0 (Francis, 2000). Kiseline koje su nađene kod acilovanih antocijanina su: cimetne (p–kumarinska, kafena, ferulna) i alifatične (jabučna, ćilibarna i sirćetna) kiseline. Samo šest antocijanina se uobičajno javljaju u hrani, od poznatih dvadeset i dva aglikona i to: pelargonodin, cijanidin, delfinidin, malvidin, peonidin i petunidin. Sa porastom broja hidroksilnih grupa pojačava se plava boja antocijanina (pelargonidin→cijanidin→delfinidin), dok sa porastom broja metoksi grupa ili glikozidnih veza unutar antocijanina pojačava se crvena boja antocijanina (cijanidin→peonidin; pelargonidin→pelargonidin–3–glikozid) (Grosh, 1986).

Aglikon antocijanina je veoma reaktivan. Iako priroda i način hidroksilacije, metilacije i glikozidacije utiču na boju i reakcije antocijanina, ove grupe same ne reaguju. Supstitucija grupa antocijanina utiče na reaktivnost i boju tako što dovodi do promene elektronske gustine u molekulu. Povećana hidroksilacija dovodi do smanjenja stabilnosti, dok metilacija vodi ka povećanju stabilnosti, što je povezano sa blokiranjem reaktivnih hidroksilnih grupa. Pigmenti antocijanina su relativno nestabilini, a na njih najviše utiču pH i temperatura. Drugi faktori koji uticu na stabilnost antocijanina su enzimi, koncentracija kiseonika, askorbinska kiselina, SO2, metalni joni i šećeri (Lee i Schwartz, 2006).

U vodenoj sredini antocijanini podležu strukturnim transformacijama koje određuju njihovu boju i stabilnost. U zavisnosti od pH antocijanini u rastvoru egzistiraju kao: plava

hinoidalna baza, crveni flavilijum katjon, bezbojna karbinolna baza (hemiacetal) i bezbojni čalkon. Dva jedinjenja, crveni flavilijum katjon i bezbojni hemiacetal (karbinolna baza), važna su tokom promena pH od 1 do 6. Na niskom pH crveni flavilijum katjon je dominantan. Sa porastom pH povećava se koncentracija karbinolne baze i dolazi do slabljenja boje, tako da je na pH od 4–6 dominantan bezbojni hemiacetal. Gubitak boje povezan je sa pH–zavisnom hidratacijom C2 položaja crvenog flavilijum katjona. U baznim rastvorima (pH=8–10) formira se jako obojena, jonizovana anhidrovana baza, dok je na pH 12 dominantan potpuno jonizovani čalkon (slika 2). Ovo je ujedno i jedno od glavnih ograničenja kod upotrebe antocijanina kao pigmenta u hrani: redukcija intenziteta boje, promena nijanse i nestabilnost boje na višim pH vrednostima (Timberlake i Bridle, 1980; Starr i Francis, 1968).

Slika 2.Slika 2. Promena boje malvidin–3–glikozid sa promenom pH Promena boje malvidin–3–glikozid sa promenom pH

Antioksidativna aktivnost flavonoidaAntioksidativna aktivnost flavonoida

Redukcija atmosferskog kiseonika je jedan od načina formiranja slobodnih radikala (superoksidni anjon, peroksi radikal, alkoksi radikal, itd.). Slobodni radikali su visoko reaktivne oksidativne vrste, koje su sposobne da hemijski reaguju sa velikim brojem organskih jedinjenja u biološkim i hemijskim sistemima. Slobodno radikalske reakcije se navode u etiologiji mnogih bolesti, kao i u samom procesu starenja. Pored nekoliko “dobrih” slobodno radikalskih reakcija kao što su fotosinteza, redukcija nukleozida i fagocitoza većina slobodno radikalskih reakcija su povezane sa patološkim stanjima, koja dovode do oštećenja ćelije i pojačanja mutagenih i kancerogenih procesa. Kako hemijske reakcije koje uključuje slobodne radikale mogu uticati na fizičke, hemijske i biološke osobine hrane, farmaceutskih i kozmetičkih preparata i drugih produkata, istraživanja mogućnosti njihove inhibicije su od visoke važnosti. Danas je poznata činjenica da mnogi prirodni produkti, čija se strukura karakteriše postojanjem fenolnih ili kateholnih grupa, pokazuju aktivnost u oksidativnim

OHO

OH

O

OMe

OH

OMe

GLy

OHO

OH

O

OMe

OH

OMe

GLy

O-O

OH

O

OMe

O

OMe

GLy

+HO

-H+flavilijm katjon

crven

OH

karbinolna baza (hemiacetal)bezbojan

hinoidalna bazaplava

O

OH

HO

O

OMe

OMe

OH

OH

calkonbledozut

procesima sa kiseonikom iz vazduha, koji im daje antioksidativnu sposobnost. Sposobnost inaktivacije vazdušnog kiseonika takođe poseduju i enzimski sistemi, tokoferol, askorbinska kiselina, flavonoidi, karotenoidi i mnoga druga prirodna jedinjenja. Antioksidativna jedinjenja, pored sposobnosti hvatanja slobodnih radikala, mogu i da eliminišu singletni kiseonik, redukuju jedinjenja kreatina, završavaju propagacionu fazu u kojoj se formiraju hidro–peroksi lipidi i efikasno štite važne biomolekule (lipide, proteine, nukleinske kiseline) od oksidacije (Harborne & Williams, 2000; Cody et al., 1988). Pokazano je da su strukturne osobine veoma važne za visoku antioksidativnu aktivnost flavonoida. Dobijeni rezultati pokazali su da sposobnost hvatanja radikala zavisi od strukture i supstituenta na heterocikličnom prstenu B. Poznato je i da orto supstituenti na prstenu B, posebno oni sa elektron–donorskim osobinama, redukuju redoks potencijal molekula i povećavaju sposobnost gašenja slobodnih radikala. Među glavnim zahtevima za dobru antioksidativnu aktivnost je prisustvo karbonilne grupe u C4 položaju flavonoida, dvostruke veze između C2 i C3 koja je konjugovana sa 4–okso grupom i koja omogućava veću delokalizaciju elektrona, kao i prisusrtvo C3 hidroksilne grupe. Uočeno je da glikozidacija hidroksilne grupe, posebno C3 položaja, usled sternih efekata, znatno redukuje antioksidativni kapacitet određenih klasa flavonoida. Antioksidativna aktivnost flavonoida pored, pored direktne reakcije sa radikalom (hvatanja), uključuje i kopigmentaciju i helatirajuće reakcije sa metalnim jonima (Fiorani et al., 2002; Fernandez et al., 2002). Ove reakciije igraju važne i višestruke uloge u biološkim sistemima. Formiranjem flavonoid–DNA kopigmentacionog kompleksa sprečava se oksidativno oštećenje DNA molekula. Poznato je i da flavonoid–askorbinska kiselina kopigmentacioni kompleks sprečava oksidativnu degradaciju askorbata. Veliki broj flavonoida može efikasno graditi helate sa metalima u tragovima kao što su Fe(II), Fe(III), Cu(II) ili Zn(II). Helatiranjem metalnih jona flavonoidi sprečavaju generisanje slobodnih radikala koje je katalizovano metalima (Fernandez et al., 2002; Fiorani et al., 2002).

Kvalitativna i kavntitativna analiza flavonoidaKvalitativna i kavntitativna analiza flavonoida

Izolovanje i prečišćavanje flavonoidaIzolovanje i prečišćavanje flavonoida

Flavonoidi se nalaze u svim biljnim delovima. Metode za izolovanje falvonoida zavise od količine biljnog materijala i od vrste flavonoidnih jedinjenja koja se ispituju. U slučajevima kada se flavonoidi nalaze na površini voskova ili ulja, mogu se dobiti tako što se sastružu sa površine ili se ispiraju pogodnim rastvaračem. Rastvarač koji se koristi za ekstrakciju bira se prema polarnosti flavonoida koji se žele proučavati. Manje polarni rastvarači koriste se za ekstrakciju flavonoidnih aglikona, dok se polarniji rastvarači koriste za ekstrakciju flavonoidnih glikozida. Manje polarni aglikoni, kao što su izoflavoni, flavanoni i dihidroflavanoli, ili flavoni i flavanoli sa više metoksi grupa, obično se ekstrahuju benzenom, hloroformom, dihlormetanom ili etilacetatom (Stobiecki & Kachlicki, 2003). Prethodne ekstrakcije petroletrom ili heksanom često se koriste da bi se materijal oslobodio sterola, karotenoida, hlorofila, voskova, masti itd. Polarni glikozidi flavonoida i njihovi polarniji aglikoni ekstrahuju se acetonom ili metanolom, ili smešom ova dva rastvarača. Ponekad se

koristi i smeša vode i metanola za ekstrakciju flavonoida i njihovih konjugata iz čvrstog biološkog materijala (biljno ili životinjsko tkivo, ili različiti produkti hrane).

Flavonoidi (pre svega glikozidi) mogu se degradisati dejstvom enzima kada je biljni materijal svež ili neosušen. Iz tog razloga savetuje se sušenje, zamrzavanje ili liofilizacija materijala. Kada se upotrebljava sušeni material obično se usitni u obliku praha, a može se ekstrahovati u Soksletovom aparatu, prvo heksanom da bi se uklonili lipidi, a zatim sa etil–acetatom ili etanolom da bi se dobila fenolna jedinjenja (Marston & Hostettmann, 2006). Određeni flavanoni i glikozidi čalkona su teško rastvorljivi u metanolu, etanolu i smeši alkohol–voda. Njihova rastvorljivos zavisi od pH vodene smeše.

Flavan–3–oli (katehini, proantocijanidini i kondenzovani tanini) mogu se ekstrahovati direktno sa vodom. Ipak, sastav ekstrakta varira sa promenom rastvaračem, u zavisnosti da li je voda, metanol, etanol, aceton ili etil–acetat. Na primer, tvrdi se da je metanol najbolji rastvarač za katehine, a 70% aceton za procijanidine (Hussein et al., 1990).

Za ekstrakciju antocijanina obično se koristi metanol sa 1% hlorovodonične kiseline (u kiseloj sredini antocijanin pokazuju najači intenzitet boje i najstabilniji su). Koristi se i metoda ekstrakcije iz biljnog materijala sa više rastvarača različite polarnosti. Na taj način se može izvršiti parcijalno razdvajanje glikozida od aglikona, kao i razdvajanje polarnih od nepolarnih aglikona (Miletić i Miletić, 1996). Za kondenzovane tanine koristi se nekoliko sistema rastvarača uključujući, apsolutni metanol, etanol, zakišeljeni metanol, aceton, vodu i njihove kombinacije.

Sama efikasnost ekstrakcije može se poboljšati primenom magnetnog mešanja, ultrasonifikacije ili tečne ekstrakcije pod pritiskom, procedure koja se izvodi podizanjem temperature od 60° do 200°C (Rostagno et al., 2003; Herrera et al., 2004). Ipak, temperaturni uslovi tokom ekstrakcije moraju se pažljivo podesiti da ne bi došlo do termalne degradacije flavonoidnih derivata. U većini slučajeva, potrebno je i dalje prečišćavanje i/ili prekoncentracija željene frakcije jedinejnja. U tim slučajevima koristi se tečno–tečno ekstrakcija ili SPE (Solid Phase Extraction). Kako prilikom kalsičnih metoda ekstrakcije, opisanih u prethodnom tekstu, dobijamo kompleksnu smešu fenolnih i flavonoidnih jedinjenja, da bismo odvojili željena jedinjenja iz takvog ekstrakta potrebno je izvršiti seriju grubih hromatografskih razdvajanja, kao i izabrati pogodan sistem rastvarača. Pravilan izbor rastvarača uglavnom podrazumeva primenu sistema rastvarača (primenu gradijenta polarnijih (kod normal phase) i hidrofobnijih (kod reversed phase) rastvarača.

Gutzeit i saradnici (2007) su izolovali izoramnetin–3–O–β–D–glikozid, izoramnetin–3–O–β–D–grutinozid, kvercetin–3–O–β–D–glikozid, siringetin–3–O–β–D–glikozid i prokatehinsku kiselinu iz etanolnog ekstrakta pasjeg trna (Hippophae rhamnoides), upotrebom preparativne particione tečno–tečno hromatografije (High speed countercurrent chromatography) i dvofaznog sistema rastvarača (n–heksan, n–butanol, voda u odnosu 1:1:2). McKee i saradnici (1997) su u cilju dobijanja frakcije bogate izoflavonoidima iz leguminoza, ekstrakt u organskom rastvaraču rastvorili u 90% metanolu, a zatim vršili frakcionisanje sa heksanom. Ostatak metanolnog dela podešen je sa vodom do 30% i frakcionisan sa smešom t–butil metiletar–heksan (9:1). Ova smeša je hromatografisana da bi se dobila čista jedinjenja (poliamidna kolona, sefadeks kolona ili jonoizmenjivačka smola).

Jedan od glavnih problema kod preparativnog razdvajanja flavonoida je njihova mala rastvorljivost u rastvaračima koji se koriste u hromatografiji. Pored toga, flavonoidi postaju

sve manje rastvorljivi što se više prečišćavaju. Mala rastvorljivost u mobilnoj fazi koja se koristi kod hromatografskog razdvajanja, može dovesti do taloženja na početku kolone, što vodi slabom razdvajanju, smanjenju protoka rastvarača ili čak do blokiranja kolone. Može doći i do drugih komplikacija. Na primer kod razdvajanja antocijanina i frakcija bogatih antocijaninima, savetuje se izbegavanje acetonitrila i mravlje kiseline; acetonitril je težak za isparavanje i postoji rizik od formiranja estara sa mravljom kiselinom. Standardna hromatografija na otvorenoj koloni se i dalje široko koristi zbog svoje jednostavnosti kao početni korak razdvajanja. Materijal za kolonu može da bude poliamid, silika gel, Sefadeks LH–20, Sefadeks G–10, G–25 i G–50. Sefadeks LH–20 preporučuje se za razdvajanje proantocijanidina. Preparativna TLC je metoda razdvajanja koja zahteva najprostiju opremu. Primenjuje se za razdvajanje miligrama uzorka, mada može i za grame ako smeša nije suviše kompleksna.

Spektrofotometrijske metode za kvantifikaciju fenolnih jedinjenjaSpektrofotometrijske metode za kvantifikaciju fenolnih jedinjenja

Folin – Ciocalteu metoda za određivanje ukupnih fenolaFolin – Ciocalteu metoda za određivanje ukupnih fenola

Rutinska metoda koja se koristi za određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (fenoli, flavonoidi i neflavonoidi) je metoda Folin–Coicalteu, uz korišćenje Folin–Ciocalteu reagensa (fenolni reagens) (Singleton i Rossi, 1965). Folin–Ciocalteu reagens se kupuje kao gotov (sadrži natrijum–

volframat, natrijum–molibdat, brom, 85 % H 3 PO4, conc . HCl, Li2 SO4). Folinov reagens

predstavlja smešu kompleksa fosfomolibdenove i fosfovolframove kiseline sa sledećom formulom:

3 H 2O ∙ P2O5 ∙13 WO3 ∙5 MoO3 ∙ 10 H 2O

3 H 2O ∙ P2O5 ∙14 WO3 ∙4 MoO3 ∙ 10 H 2O

U reakciji sa fenolnim jedinjenjima dolazi do redukcije ovog kompleksa, a produkt redukcije ima plavu boju koja pokazuje maksimum apsorpcije na 765 nm. Ukupni fenoli kvantifikuju se na osnovu prethodno napravljene standardne krive, a rezultat se izražava kao mg ekvivalenata GA/100g fw.

Određivanje ukupnog sadržaja flavonoidaOdređivanje ukupnog sadržaja flavonoida

Flavoni i flavonoli sa aluminijum hloridom formiraju kompleks koji intenzivno apsorbuje na 415 nm, dok flavanoni imaju slabu apsorpciju na ovoj talasnoj dužini. Flavanoni (naringenin i hisperitin) sa 2,4–dinitrofenilhidrazinom, formiraju fenil hidrazone koji imaju jaku apsorpciju na 495 nm. Ove osobine flavonoida iskorišćene su za određivanje ukupnog sadržaja flavonoida pomoću dve komplementarne kolorimetrijske metode: aluminijum–hlorid kolorimetrijske metode (Woisky i& Saltano, 1998; Pourmorad et al., 2006; Zhisen et al., 1999) i 2,4–dinitrofenilhidrazin kolorimetrijske metode (Nagy & Grancai, 1996). Princip aluminijum–hlorid kolorimetrijske metode je da aluminijum–hlorid sa C4 keto grupom i C3 ili C5 hidroksilnom grupom flavona i flavonola, formira stabilan kiseli kompleks.

Chang et al. (2002), su merili apsorbancu kompleksa petnaest različitih flavonoida (flavoni: hrisin, apigenin i luteolin; flavonoli: rutin, morin, kvercetin, miricetin, kempferol, kvercitrin i galangin) sa aluminijum–hloridom i došli do toga da je, izuzev hrizina i apigenina, apsorbanca kompleksa koji su formirali flavoni i flavonoli znatno veća od apsorbance kompleksa koji su formirali flavanoni i izoflavoni. Sa druge strane, iako je prisustvo C5 hidroksilne grupe kod flavanona kao što su naringin, naringenin, hesperitin i genistein omogućilo kompleksiranje ovih jedinjenja sa aluminijum–hloridom, apsorbanca ovih jedinjenja na 415 nm je bila isuviše mala da bi doprinela značajnijem porastu ukupne apsorbance. Ukupan sadržaj flavonoida se izražava kao mg katehin ekvivalenata/mg kvercetin ekvivalenata po g uzorka. Flavanoni kao što su naringenin i hisperitin reaguju sa 2,4–DNPH i daju 2,4–dinitrofenilhidrazone. Interesantno je da flavoni, flavonoli i izoflavoni sa C2–C3 dvostrukom vezom ne reaguju sa 2,4–DNPH.

Vanilinska metoda za određivanje kondenzovanih tanina Vanilinska metoda za određivanje kondenzovanih tanina

Ova metoda se široko koristi za kvantifikaciju proantocijanina (kondenzovanih tanina). Kondenzovani tanini predstavljaju polimere flavonolnih jedinica. Metoda je specifičan za flavan–3–ole, dihidročalkone i proantocijanine koji poseduju jednostruku vezu u položaju 2,3 i slobodne meta–hidroksi grupe u prstenu B. Katehin, monomerni flavan–3–ol, se često koristi kao standard u ovoj metodi. Uspeh metode zavisi od tipa rastvarača, tipa i koncentracije kiseline, reakcionog vremena, temperature, koncentracije vanilina. U vanilinskoj metodi sumporna kiselina je bolji katalizator od hlorovodonične istog normaliteta.Vanilinska metoda u metanolu je osetljivija prema polimernim taninnima nego prema monomernim flavan–3–olima. Kod ove metode postoji mogućnost smetnji usled prisustva dihidročalkona i antocijanina, kao i askorbinske kiseline ili askorbata i hlorofila (Sarkar i Howarth, 1976; Sun et al., 1998). Antocijanini, pri koncentracijama u kojima su prisutni u biljnom ekstraktu ne reaguju sa vanilinom. Međutim, njihovo prisustvo dovodi do većih rezultata kod utvrđivanja tanina, zato što se maksimum apsorpcije tanin–vanilin adukta podudara sa antocijaninima. Ove smetnje mogu se eliminisati upotrebom odgovarajuće slepe probe. Sama metoda zasniva se na kondenzaciji vanilina sa proantocijanidinima u kiselom rastvoru. Protonovani vanilin, slabi elektrofilni radikal, reaguje sa flavonoidnim prstenom u položajima 6 i 8. Intermedijarni produkt ove reakcije se odmah dehidratiše i daje svetlo ružičasto do tamno crveno obojeni produkt koji apsorbuje na 500 nm.

Slika 3.Slika 3. Modalna struktura za kondenzovane tanine. Ako je R=H ili OH, onda struktura Modalna struktura za kondenzovane tanine. Ako je R=H ili OH, onda struktura predstavlja procijanidin ili prodelfinidin. predstavlja procijanidin ili prodelfinidin.

Određivanje antocijaninaOdređivanje antocijanina

Rečeno je da se antocijanini u biljkama nalaze u obliku glikozida, kao i to da imaju i izraženu sposobnost polimerizacije i kopigmentacije. Takođe antocijanini u rastvoru podležu reverzibilnim strukturnim promenama sa promenom pH, što se manifestuje u upadljivoj promeni apsorpcionih spektara. Ove osobine antocijanina iskorišćene su za spektrofotometrijsko kvantifikovanje monomernih antocijanina i određivanje stepena polimerizacije. Monomerni antocijanini kvantifikuju se pH diferencijalnom metodom (Wrolstad, 1982). Na pH 1 predominantan je crveno obojeni flavilijum jon, a na pH 4,5 bezbojna hemiacetalna baza. Sama pH–diferencijalna metoda zasniva se na ovoj transformaciji i omugućava brzo i tačno merenje ukupnih antocijanina čak i u prisustvu polimerizovanih i degradiranih pigmenata, kao i u prisustvu drugih ometajućih komponeni. Nakon izolovanja antocijanina, metanolni ekstrakt antocijanina se razblaži KCL (pH 1) i acetatnim (pH 4,5) puferom. Potrebno je napomenuti da se mora naći odgovarajući faktor razblaženja za uzorka i to tako što se uzorak razblaži KCl puferom sve dok apsorbanca uzorka na λmax ne bude unutar linearnog opsega spektrofotometra. Zatim se konačna zapremina uzorka podeli sa početnom zapreminom da bi se dobio odgovarajuci faktor razblaženja. Nakon 15 min od razblaženja uzorka meri se apsorbanca uzorka na dve talasne dužine, λmax=520 nm i na λ=700 nm (radi korekcije) u odnosu na slepu probu (destilovana voda). Apsorbancija razblaženog uzorka se računa na sledeći način:

A=( Aλ vis−A λ700

)pH 1−(A ¿¿ λvis−Aλ700

)pH4,5¿

Iz dobijene vrednosti apsorbancije, računa se koncentracija monomernog pigmenta antocijanina po formuli:

c (mg¿¿ l)= A × Mr × Df ×1000εxl

¿

gde je Mr–molekulska masa, Df –faktor razblaženja a ε–molarna apsorptivnost. Treba napomenuti da Mr i ε u formuli odgovaraju predominantnom antocijaninu u uzorku. U slucaju da ε predominantnog pigmenta nije dostupan ili se ne zna sastav uzorka, sadržaj pigmenta se računa kao sadržaj ekvivalenta cijanidin–3–glikozida na jedinicu mase uzorka.

Za određivanje stepena polimerizacije antocijanina koristi se bisulfitna metoda izbeljivanja (Giusti i Wrolstad, 2001). Polimerizovani antocijanini (antocijanin–tanin kompleksi) su otporni na dejstvo bisulfita, dok će reakcija monomernih antocijanina brzo ići do kraja sa bisulfitom (monomerni antocijanini sa bisulfitom grade bezbojni adukt sulfonske kiseline). Ekstrakt antocijanina stavi se u dve kivete: u jednu se doda natrijum–bisulfit a u drugu ddH2O (kontrolni uzorak). Nakon 15 minuta meri se apsorbanca oba uzorka na tri talasne dužine: λ=420 nm (vrednost apsorbance na ovoj λ služi kao indeks tamnjenja), λmax=520 nm i λ=700 nm. Na osnovu vrednosti apsorbancije računa se: intezitet boje (gustina boje kontrolnog uzorka), polimerna boja i procenat polimerne boje, a na osnovu odnosa monomernih i ukupnih antocijanina može se izračunati indeks degradacije.

Intenzitet boje kontrolnog uzorka (uzorak tretiran vodom):

Intenzitet boje=¿

Polimerna boja izbeljenog uzorka tretiranog bisulfitom:

Polimernaboja=¿

Procenat polimerne boje :

Procenat polimerne boje= polimerna bojaintenzitet boje

×100 %

Strukturna karakterizacija i/ili identifikacija flavonoida i njihovih konjugataStrukturna karakterizacija i/ili identifikacija flavonoida i njihovih konjugata na osnovu LCna osnovu LC––UV/Vis spektaraUV/Vis spektara

Već smo rekli da su flavonoidi fenolna jedinjenja, veoma rasprostranjena u biljkama koja imaju dobre efekte na ljudsko zdravlje. Osnovna struktura flavonoida čine dva aromatična prstena (obeleženi kao A i B). koja su povezana sa tri ugljenika, koji obično formiraju oksigenovani heterociklus (prsten C) (slika 4).

Slika 4.Slika 4. Opšta struktura flavonoida i raspodela apsorpcionih traka I i II povezanih sa Opšta struktura flavonoida i raspodela apsorpcionih traka I i II povezanih sa apsorpcionim spektromapsorpcionim spektrom

UV/Vis spektri najvećeg broja flavonoida sastoje se od dva glavna apsorpciona maksimuma. Apsorpcija u oblasti spektra od 320–385 nm (apsorpciona traka I) potiče od cinamoil sistema prstena B, dok apsorpcija u oblasti 240–285 nm (apsorpciona traka II) potiče od benzolil sistema prstena A (slika 5).

Slika 5.Slika 5. UV/Vis spektri kvercetina i kompleksa metal–kvercetin u metanolu UV/Vis spektri kvercetina i kompleksa metal–kvercetin u metanolu

Na osnovu položaja apsorpcione trake I, u većini slučajeva mogu se razlikovati flavoni od flavonola. Apsorpciona traka I javlja se kod flavona u oblasti od 304–350 nm, dok je kod flavonola (3–hidroksi flavona) pomerena ka većim talasnim dužinama od 352–385 nm. Do batohromnog pomeranja apsorpcione trake I dolazi pri uvođenju svake nove hidroksilne grupe u prsten B flavona i flavonola. Ove promene nemaju efekta na pomeranje apsorpcione trake II. Izoflavoni, flavanoni i dihidroflavonoli mogu se grupusati zajedno jer kod njih ne dolazi do konjugacije između A i B prstena. Njihovi spektri se lako razlikuju od UV spektra flavona, jer pokazuju manji intenzitet apsorpcione trake I. Tipična apsorpcija flavanona je na oko 290 nm, izoflavona na oko 236 ili 260 nm. UV spektri čalkona i aurona su okarakterisani prisustvom dominantne apsorpcione trake I i relativno slabije apsorpcione trake II. Apsorpcioni maksimum čalkona nalazi se na 340–360 nm, dihidročalkona na 280 nm, katehina na 210 ili 280 nm. Za razliku od ostalih flavonoida, antocijanini apsorbuju u vidljivoj oblasti na oko 502 ili 520 nm. U poređenju sa apsorpcionim spektrima flavonoida,

apsorpcioni spektri kompleksa flavonoida su pomereni ka većim talasnim dužinama. Ovo batohromno pomeranje objašnjava se produženjem konjugacije usled kompleksiranja.

LC–UV je vrlo važna metoda za identifikaciju izoflavona. Apsorpcioni spektri izoflavona se razlikuju od spektara ostalih flavonoida. Oni poseduju C2–C3 dvostruku vezu sa B prstenom na C3, što sprečava konjugaciju fenil grupe sa karbonilnom grupom pirona. Ovo redukuje doprinos B prstena UV spektru i rezultuje pojavom pika vrlo malog intenziteta u oblasti od 300–330 nm. Analiza katehina i proantocijanidina LC–UV metodom je problem. Uopšteno, samom monomeri i oligomeri mogu se razdvojiti i detektovati kao određen pik. Polimerni oblici, koji se sastoje od velikog dela proantocijanidina u velikom broju biljnog materijala, se ne razdvajaju dobro. Proantocijanidini dovode do pojave skretanja na osnovnoj liniji i formiranja ispupčenja u hromatogramu. Pored toga spektralne karakteristike ovih jedinjenja ne dozvoljavaju njihovu laku detekciju i identifikaciju. Flavan–3–oli imaju apsorpcioni maksimum na nespecifičnoj talasnoj dužini (270–290 nm) i imaju manji ekstincioni koeficijent od ostalih fenolnih jedinjenja. Zbog toga njihova kvantifikacija nije laka. Iako je moguće identifikovati pikova u LC–UV hromatogramu, poređenjem sa UV spektrima autentičnih uzoraka (standarda), ipak može doći do nemogućnosti identifikacije jedinjenja sa bliskom strukturom. Da bi se potpuno okarakterisala fenolna jedinjenja, potreban je reagens koji dovodi do pomeranja UV apsorpcionog maksimuma.

Strukturna karakterizacija i/ili identifikacija flavonoida i njihovih konjugataStrukturna karakterizacija i/ili identifikacija flavonoida i njihovih konjugata na osnovu HPLC–MS spektarana osnovu HPLC–MS spektara

Masena spektrometrija je jedna od najosetljivijih metoda molekulske analize. Usled velike moći razdvajanja masa, može se postići velika selektivnost. Kuplovanje između HPLC i MS nije direktno usled uslova rada ova dva instrumenta: maseni spektrometar (visoki vakuum, visoka temperatura, rad u gasovitoj fazi i male brzine protoka), tečni hromatograf (visoki pritisak, visoke brzine protoka, rad u tečnoj fazi i relativno niske temperature). U LC–MS postoje tri generalna problema: količina eluenta sa kolone koji treba da se uvede u vakuumski sistem masenog spektrometra, sastav eluenta i tip jedinjenja koja treba da se analiziraju. Iz tog razloga razvijeni su mnogi spojevi da bi se zadovoljili svi faktori. Sam spoj (interfejs) mora da obezbedi raspršivanje i isparavanje tečnosti, jonizaciju uzorka, uklanjanje viška pare rastvarača i ekstrakciju jona u maseni analizator. Do danas nije razvijen univerzalni interfejs; svaki od njih poseduje karakteristike koje zavise od prirode jedinjenja za koja se koriste. Veliki broj interfejsa radi sa reversed phase HPLC sistemom, a veliki broj njih je odgovarajućn za analizu biljnih sekundarnih metabolita. Ovo uključuje termosprej (TSP), elektrosprej (ES) i bombardovanje brzim elektronima sa kontinualnim protokom interfejs (CF–FAB). Ovi spojevi pogodni su za jonizaciju jedinjenja, od relativno malih nepolarnih produkata (aglikoni MW 200) do visoko polarnih molekula (glikozida MW 2000). Za razliku od TSP i CF–FAB, gde se izvor nalazi u vakuumskom delu masenog spektrometra, kod ES jonizacioni izvor je na atmosferskom pritisku. Jonizacija pod atmosferskim pritiskom (API) čini LC–MS znatno osetljivijom i lakšom za rukovanje. API interfejs ili izvor sastoji se od pet dela: (a) uređaj za uvođenje tečnosti ili sprej sonda; (b) prava oblast izvora jona pod atmosferskim pritiskom, gde se joni stvaraju sredstvima elektrosprej jonizacije; (c) otvor za

uzorkovanje jona; (d) interfejs atmosferski pritisak–vakuum; (e) jonski optički sistem, gde se joni zatim transportuju u maseni analizator. ESI i APCI su nežne jonizacione tehnike koje uglavnom stvaraju molekulske jone iz relativno malih metabolita kao što su flavonoidi.

Podaci iz masenih spektara obezbeđuju strukturne informacije o flavonoidima, a koriste se za određivanje molekulskih masa i za utvrđivanje rasporeda supstituenta između A i B prstena. Pažljivo proučavanje obrasca fragmentacije, može biti od velike važnosti pri određivanju vrste i mesta vezivanja šećera kod O– i C– glikozida. Za aglikone flavonoida i glikozide sa ograničenim brojem jedinica šećera (ne više od tri), TSP LC–MS analiza dovodi do nežne jonizacije, i daje isključivo intenzivne [M +H]+ za aglikone i slabe [M + H]+ jone za glikozide (mono i disaharide), zajedno sa intenzivnim fragmentnim jonima koji nastaju usled gubitka jedinice šećera, a vode nastajanju aglikona [A + H]+.

Na primer, LC–UV–MS analizom metanolnog ekstrakta korena Gentianella cabrerae nastaju dva pika u HPLC hromatogramu (slika 6), od kojih jedan ima UV spektar karakterističan za ksanton (jedinjenje 2), a drugi spektar karakterističan za flavonoid (jedinjenje 1). U TSP masenom spektru, 1 pokazuje protonovani molekulski jon [M +H]+ na m/z 463 i fragmente [M +H – 90]+ i [M +H – 120]+ na m/z 373 i m/z 343, koji su karakteristični za cepanje flavon C–glikozida. Prema ovim podacima, 1 je verovatno flavon C–glikozid supstituisan sa tri hidroksilne grupe i jednom metoksi grupom. Ovim podacima odgovaraju dva izomerna flavona izoskoparin i svertiajaponin (Hostettmann et al., 1997). Uopšteno, HPLC kuplovana sa detektorom sa diodnim nizom i masenim spektrometrom obezbeđuje efikasnu metodu za brzu identifikaciju flavonoida u smeši. Na ovaj način, 14 ksantona i glikozida flavonola u prethodno prečišćenom ekstraktu manga, okarkaterisani su upotrebom ESI MS (Schieber et al., 2003).

I ES i TSP su nežne metode jonizacije i ne daju mnogo jona. Korisne su za kvantitativnu analizu ili određivanje molekulske mase, ali su od male koristi u utvrđivanju strukture. U ovom slučaju primenjuje se disocijacija indukovana kolizijom (CID) ili kolizijom aktivirana disocijacija. Na ovaj način indukuje se fragmentacija molekula. Fragmentni joni koji nastaju CID se efikasno transportuju u maseni analizator, i na ovaj način obezbeđuju prostu MS–MS metodu. Kod tandem masene spektrometrije, prva operacija je izolovanje roditeljskih jona, a druga određivanje m/z odnosa jona koji su nastali nakon CID od roditeljskih jona. Operacija izolovanja jona i CID može se ponoviti nekoliko puta MSn. CID MS–MS i MSn spektri flavonoida sistemataski su proučavani korišćenjem hibridnog Q–TOF i IT (Ion Trap) masenih analizatora, pod raznim uslovima za dobijanje fragmentnih jona (Wolfender et al., 2000). Pokazano je da su, u slučaju hidroksilovanih flavonoida, spektri dobijeni od strane oba instrumenta veoma slični, dok su za delimično metoksilovane derivate pokazivali značajne razlike. Uopšteno, fragmente koji su nastali od cepanja C prstena, bilo je lakše posmatrati u Q–TOF instrumentu, dok je gubitak malih molekula uočljiviju kod IT–MS. Primena tandem MS (LC–TSP MS–MS) može se ilustrovati za karakterizaciju flavonoida iz Gentianella Cabrerae.

Slika 6.Slika 6.11 LC–UV–MS analiza metanolnog ekstrakta LC–UV–MS analiza metanolnog ekstrakta Gentianella CabreraeGentianella Cabrerae. Deo UV. Deo UV spektra je sniman na 254 nm a UV spektar od 200 do 500 nm. LC–UV–MS sniman je od 250spektra je sniman na 254 nm a UV spektar od 200 do 500 nm. LC–UV–MS sniman je od 250 do 1000 μm. HPLC: kolona Novpak Cdo 1000 μm. HPLC: kolona Novpak C1818 (150 × 3,9 nm, 4 μm); gradijent CH (150 × 3,9 nm, 4 μm); gradijent CH33CN–HCN–H22O (saO (sa 0,1% TFA) 5:95 →63:35 u 50 min; brzina protoka 1 ml/min; 0,5 M NH4OAc (0,2 ml/min)0,1% TFA) 5:95 →63:35 u 50 min; brzina protoka 1 ml/min; 0,5 M NH4OAc (0,2 ml/min) van kolone. TSP: pozitivni jonski mod; vlakno isključeno; isparivač 100°C; izvor 280°C.van kolone. TSP: pozitivni jonski mod; vlakno isključeno; isparivač 100°C; izvor 280°C.

1 Preuzeto iz Hostettmann et al., Rapid Detection and Subsequent Isolation of Bioactive Constituents of Crude Plant Extract, Planta Med., 1997.

Slika 7.Slika 7.22 Online LC–TSP MS–MS analiza svertiajaponina ( Online LC–TSP MS–MS analiza svertiajaponina (11) iz metanolnog ekstrakta) iz metanolnog ekstrakta Gentianella Cabrerae. CID [M +H – 120]Gentianella Cabrerae. CID [M +H – 120]+ + jona na m/z 343 pokazuje karakterističnujona na m/z 343 pokazuje karakterističnu fragmente usled supstitucije B prstena i glikozidacije položaja C6. fragmente usled supstitucije B prstena i glikozidacije položaja C6.

LC–UV–MS analizom metanolnog ekstrakta dokazano je prisustvo različitih flavonoidnih C–glikozida. Međutim, ovi podaci bili su nedovoljni da se odredi da li je 1 (slika 7) izoskoparin ili svertiajaponin, dva izomerna glikozida koji imaju metoksi grupu u položajima C3’ ili C7. LC–TSP MS–MS analiza jedinjenja 1 izvedena je na intenzivnom jonu [M +H – 120]+. Eksperiment je izveden na instrumentu sa tri kvadrupola (triple Quadrupol), kod kojeg prvi kvadrupol služi za filtraciju jona [M +H – 120]+. Ovaj jon je kasnije selektivno fragmentisan CID sa argonom u kolizionoj komori (drugi kvadrupol). Konačno spektar je sniman analizom nastalih jona u trećem kvadrupolu.

Klasična fragmentacija ostatka aglikona flavonoida daje jon na m/z 137. Ovaj fragment je indikovao postojanje B prstena supstituisanog sa dve hidroksilne grupe, i potvrdio lokalizaciju metoksi grupa na jedinjenju 1 na A prstenu. Joni m/z 163 i 191 su specifični za flavon C–glikozide koji imaju ostatak šećera na C6.

Strukturna karakterizacija i/ili identifikacija flavonoida i njihovih konjugataStrukturna karakterizacija i/ili identifikacija flavonoida i njihovih konjugata na osnovu HPLC–NMR spektarana osnovu HPLC–NMR spektara

Kuplovanje HPLC sa NMR spektroskopijom, koje je počelo 1978 godine, predstavlja veoma moćnu metodu za kombinovano razdvajanje i strukturno određivanje nepoznatih jedinjenja u smeši (Albert, 1999 i Wilson, 2000). Glavni problem kuplovanja LC–NMR

2 Preuzeto iz Hostettmann et al., Rapid Detection and Subsequent Isolation of Bioactive Constituents of Crude Plant Extract, Planta Med., 1997.

predstavlja teškoća u posmatranju rezonancije analita u prisustvu znatno veće rezonancije mobilne faze. Ovaj problem je znatno veći pod normalnim uslovima, pod kojima radi reversed phase HPLC sistem, gde se koristi više od jednog protonovanog rastvarača, i gde dolazi do promene frekvencije usled rezonancije rastvarača prilikom upotrebe gradijenta. Ovi problemi su rešeni razvojem brzih, pouzdanih i moćnih tehnika supresije rastvarača. Za tipične reversed phase analize koriste se nedeutrisani rastvarači kao što su metanol i acetonitril, dok se umesto vode koristi D2O (Marston & Hostettman, 2006).

Informacije koje se dobijaju primenon LC–NMR su uglavnom 1H spektri. LC–NMR analiza može da se izvodi na dva načina: tokom protoka i sa zaustavljenim protokom. Kod prvog načina spektri se dobijaju kontinualno tokom razdvajanja. Podaci se zatim obrađuju i dobija se dvodimenzionalni NMR. Glavni problem ovakve analize je mala osetljivost. Iz tog razloga, ova metoda se koristi isključivo za direktno određivanje glavnih konstituenata kompleksnog ekstrakta. Sa druge strane, kod analize sa zaustavljenim protokom, protok rastvarača nakon HPLC razdvajanja se zaustavlja na određeno vreme, onog trenutka kada željeni pik stigne do NMR ćelije. Na ovaj način omogućeno je da se dobije veliki broj tranzijenata za dati pik i poboljšava se granica detekcije (Marston & Hostettman, 2006).

Kombinacija HPLC sa UV, MS ili NMR detekcijom pokazala se kao veoma važna u analizi prirodnih produkata u ekstraktu ili smeši. LC–NMR informacije se dobijaju iz 1H NMR spektara odabranih pikova u HPLC hromatogramu. Iz LC–MS spektara može se zaključiti kakva je supstitucija na A ili B prstenu, na osnovu načina fragmentacije, ali tačan položaj supstituenata se ne može odrediti. Ipak za flavonoid kao što je apigenin, koji ima samo jedan supstituent na B prstenu (OH grupa), 1H NMR daće položaj susptitucije zato što svaki od tri položaja na kojima može da se nađe hidroksilna grupa ima jedinstveni način cepanja. Mnogo više informacija može se dobiti o vrsti i položaju vezanog šećera. Kako je D2O prisutan kao eluent, promenljivi signali se ne uočavaju u NMR spektru (Marston & Hostettman, 2006).

Wolfender i saradnici (1998) koristili su LC–NMR analizu sa prekinutim tokom u analizi polifenola iz čileanske biljke Gentiana ottonis. Preliminarnom LC–UV analizom metanolnog ekstrakta korena utvrđeno je prisustvo nekoliko ksantona (2, 4, 6–8, slika 8), iridoid i dva jedinjenja (3, 5) koja pokazuju UV spekar karakterističan za flavonoide. TSP LC–MS analiza obezbedila je podatke o molekulskoj težini zadnja dva jedinjenja, kao i fragmente karakteristične za C–glikozide (gubitak mase od 90 i 120). Na osnovu njihovih UV spektara, jedinjenja 3 i 5 (MW 448 i 446) su tri i tetra oksigenovani flavon C–glikozidi.

Slika 8.Slika 8.33 Online LC–UV metanolnog ekstrakta Gentiana ottonis, sa protonovanim Online LC–UV metanolnog ekstrakta Gentiana ottonis, sa protonovanim molekulskim jonima glavnih konstituentata, dobijenih TSP LC–MS analizommolekulskim jonima glavnih konstituentata, dobijenih TSP LC–MS analizom

Da bi se dobilo još informacija za karakterizaciju polifenola u ekstraktu, LC–NMR analiza izvršena je pod uslovima identičnim za LC–UV–MS. LC–1H NMR spektri snimani su za sve glavne pikove. Za flavon C–glikozide u LC–1H NMR spektru (slika 9) uočeni su signali za: šest aromatičnih protona (od δ 6,8 do 8,1), jednu metoksi grupu (δ 4,0) i za C–glikozid ostatke (δ 3,5 do 5,0). Par simetričnih orto–kuplovanih protona (2H, δ 7,06, J = 8,3, H–3', 5' i 2H δ 8,0. J = 8,3, H–2', 6') bili su karakteristični za supstituciju prstena na C4'. Singlet na δ 6,8 pripisan je H–3. Singlet na δ 6,9 pripada protonu ili na poziciji C6 ili C8 u prstenu A. Prema tome ni LC–UV–MS ni LC–NMR nisu bile dovoljne za potpuno utvrđivanje strukture jedinjenja 5. Da bi se sa sigurnošću utvrdio položaj glikozidacije vršena je LC–MS–MS analiza roditeljskog [M +H – 120]+ jona. Ovaj jon daje fragmente na m/z 163 i 191, koji su karakteristični za 6–C–glikozilovane falvone (ranije opisano). Fragment na m/z 121 indikuje postojanje monohidroksilovanog B prstena, i potvrđuje postojanje metoksi grupe na A prstenu. Ova kombinacija podataka omogućuje identifikaciju jedinjenja 5 kao 5,4'–dihidroksi–7–metoksi–6–C–glikozilflavona (svertisin).

. .

3 Preuzeto iz Wolfender, J. L., et al., in Methodes in Polyphenol Analysis, Santos–Bulega, C. & Williamson, G., eds., Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003.

SlikaSlika 9.9.44 LC– 1H NMR

spektar svertisina (5) iz metanolnog ekstrakta korena biljke Gentiana ottonis, zajedno sa TSP LC–MS (a) i TSP LC–MS (b) spektrima. LC MS–MS analiza izvršena je korišćenejm fragmenta [M +H – 120]+ (spektar a) kao roditeljskog jona. Posmatrani su karakteristični produkt joni (daughter ions) nastali na m/z 121, 163 i 191.

4 Preuzeto iz Wolfender, J. L., et al., in Methodes in Polyphenol Analysis, Santos–Bulega, C. & Williamson, G., eds., Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003.

Primena LC–MS obezbeđuje najvrednije strukturne informacije u proučavanju smeše flavonoida prirodnog porekla i dozvoljava pravilniu identifikaciju jedinjenja koja se drugim metodama ne mogu razlikovati. Hansen i saradnici (1999) pokazali su da u biljci Hypercium perforatum postoje dva različita glikozida kvercetina, koji se koeluiraju sa RP kolone i maju iste MS i MS–MS spektre. Međutim, pomoću razlika u NMR spektrima, mogli su da se identifikuju kao kvercetin 3–β–D–glikozid i 3–β–D–galaktozid. U istom materijalu našli su i tri kvercetin pentozida koji su identifikovana kao: 3–α–L–arabinofuranozid, i 3–β–D–ksilozid i najverovatnije 3–α–L–arabinopiranozid.

Instrumentalne metode za kvantitativnu analizu flavonoidaInstrumentalne metode za kvantitativnu analizu flavonoida

HPLC kvantitativna analiza flavonoidaHPLC kvantitativna analiza flavonoida

Kompjuterski kontrolisana HPLC postala je analitička metoda izbora za kvalitativnu i kvantitativnu analizu flavonoida. Prvi put su je za analizu flavonoida upotrebili Fisher i Wheaton (1976), a od tada razvijeni su mnogi sistemi za detekciju i kvantifikaciju flaavonoida uinutar jedne, dve ili više podklasa.

Sama priprema uzorka za HPLC analizu različita je za različite uzorke. Sirupi i vina ne zahtevaju prethodnu pripremu. Čajevi se kuvaju, a ponekad se koristi i SPE ili tečno–tečno ekstrakcija. Ponekad je potrebna i ekstrakcija u cilju uklanjanja lipida, karotenoida i hlorofila (Guyot et al., 1998). Jagodičasto voće se homogenizuje (Gao i Mazza, 1995) itd. Glikozidi flavonoida često zahtevaju hidrolizu radi uklanjanja ostatka šećera. Koristi se kisela, bazna ili enzimska hidroliza. Kako je najteže dobiti uzorke antocijanina, potrebno je hidrolizu izvršit refluktovanjem HCL rastvora sa 50 % metanolom–2N HCl (v/v) (Gai i Mazza, 1995). Slični uslovi se koriste i za hidrolizu glikozida falvona i flavonola.

Za analitičku primenu određenih potklasa flavonoida (flavoni, flavonoli, izoflavoni, antocijanini itd.) stacionarna faza, rastvarač i gradijent moraju se optimizirati. Najveći deo razdvajanja vrši se na oktadecilsilil vezanim fazama (ODS, RP–18 ili C18). Flavonoid glikozidi se eluiraju pre aglikona na ovim fazama, a flavonoid sa više hidroksilnih grupa eluiraju se pre manje supstituisanih. Kao rastvarači koriste se smeše acetonitril–voda ili metanol–voda, sa ili bez dodatka malih količina kiselina. Ponekad se koriste i neki drugi rastvarači kao što su THF, izopropanol, n–propanol. Kiseli modofokatori su potrebni da bi potisnuli jonizaciju hidroksilnih grupa fenola, što vodi pojavi oštrijih pikova i manjem zaostajanju. Za razdvajanje jako polarnih analita, koji se ne zadržavaju dovoljno na uobičajnim reversed fazama, napravljene su oktadecilsilil stacionarne faze sa hidrofilnim krajevima. Normal phase (nemodifikovane faze od silicijum oksida) se ne upotrebljavaju tako često, osim kod povremenog razdvajanja slabo polarnih aglikona falvonoida, polimetoksilovanih flavona, flavanona ili izoflavona. Flavon C–glikozidi eluiraju se sa kraćim retencionim vremenima nego O–glikozidi. Prema tome, viteksin (8–C–glikozilapigenin) eluira se sa kraćim retencionim vremenom nego apigenin 7–O–glikozid. Dalje 8–C–glikozilflavoni eluiraju se pre 6–C–glikozilflavona. Flavanoni eluiraju se pre odogvarajućih flavona, usled nezasićenja u položaju 2–3. Antocijanini u rastvoru postoje u različitim strukturnim oblicima u ravnoteži, zavisno od pH i temperature. Da bi se dobili

reproduktivni rezultti vrlo je važno kontrolisati pH mobilne faze i raditi sa termostatički kontrolisanom kolonom. Za najbolju rezoluciju, ravnoteža antocijanina mora biti pomerna ka flavilijum jonu; tada je minimalno zaostajanje pika i pojava repa, a poboljšana oštrina pika. Poređenjem reversed phase kolona (C18, C12 i sa vezanom fenil grupom) za razdvajanje antocijanina iz vina, uključujući monoglikozide, diglikozide i acilovane derivate, Berente i saradnici (2001) našli su da se najbolji rezultati dobijaju na C12 koloni sa veličinom čestica 4 μm, sa mobilnom fazom acetonitril–fosfatni pufer, na pH 1,6 i 50 ºC. Primena HPLC u analizi medicinskih i drugih biljaka sumarizovana je od strane Cipman i Gocan (2002). Iz metoda koje su korišćene, zaključeno je da se oko 90 % razdvajanja izvodi na C18 koloni. Važnost flavonoida u hrani, znači da je neosporno posedovanje odgovarajućih sredstava za određivanje njihovog sadržaja. Pregled koji su dali Merken i Beecher (2000) sadrži odličan sažetak (uključujući i pun opis detalja o razdvajanju flavonoida) o primeni HPLC u analizi flavona, flavonola, flavanona, izoflavona, antocijanidina, katehina i njihovih glikozida u hrani. Po njima hromatografski uslovi su sledeći: kolone su skoro uvek reversed phase (RP), dužine od 100–300 mm i sa unutrašnjim prečnikom 4,6 mm. Stereohemijsko razdvajanje flavonoida je često problem, pa se u tim slučajevima koristi kolona sa β–ciklodekstrin (Ciklobond I) vezanom fazom. Na ovoj koloni razdvajaju se 2R i 2S dijastereoizomeri flavanon glikozida (Krause & Galensa, 1990). Eluacioni sistem je obično binarni, sa vodenim zakišeljenim rastvaračem (rastvarač A) kao što su vodeni rastvor sirćetne kiseline, perhlorna kiselina ili mravlha kiselina, i manje polarnim organskim rastvaračem (rastvarač B) kao što su metanol ili acetonitril, po mogućnosti zakišeljeni. Trifluorosirćetna kiselina u oba rastvarača poboljšava rezoluciju i eliminiše pojavu repa na piku katehina (Dalluge et al., 1998). UV/Vis detekcija je standardna metoda za detekciju flavonoida. Kako su flavonoidi polifenoli, dve apsorpcione trake su karakteristične za ovu klasu jedinjenja. UV spektri flavanona, izoflavona i katehina karakterišu se intenzivnom trakom II (240–285 nm) i slabom trakom I (300–550 nm) usled slabe konjugacije ili nepostojanja konjugacije između prstena A i B. Fluorescentni detektor (280 nm za apsorpciju, 310 nm za emisiju) koji je spojen sa serijom UV detektora takođe se koristi (Arts & Hollman, 1998). Opseg pH u analizi flavonoida je mali obično od 2–4. Retencija jedinjenja zavisi od relativne hidrofobnosti jedinjenja. U ovom slučaju jedinjenja se eluiraju po opadajaućoj polarnosti. Polarnost je povećana hidroksilnom grupom u položaju 4, praćeno onim u položaju 2 i 3. Dostune metil grupe i supstitucija akrilnom grupom smanjuju polarnost i povećavaju retenciona vremena.

Uopšteno rečeno, ne postoji HPLC metoda koja može da reši sve probleme u razdvajanju falvonoida. Međutim, Sakakibara i saradnici (2003), tvrde da su našli metodu koja je sposobna za kvantifikaciju svakog polifenola u voću, povrću i čajevima. U ovu svrhu koristili su Capcell pak C18UG120 (250 × 4,6 mm, S–5, 5 μm) kolonu na 35ºC. Gradijent eluacija sa brzinom protoka 1 ml/min izvedena je u trajanju od 95 min, sa rastvaračima A (50 mM natrijum–fosfat, pH 3,3 i 10% metanol) i B (70% metanol), po sledećem redosledu: početno 100% rastvarača A; narednih 15 min, 70% A; 30 min, 65% A; 20 min, 60% A; 5 min, 50% A; i na kraju 100% B oko 25 min. Povrće je ekstrahovano sa 90% metanolom koji je sadržavao 0,5% sirćetne kiseline. Tipičan HPLC profil dvadeset i osam referentnih fenola pokazan je na slici 10. Metoda je omogućila određivanje aglikona odvojeno od glikozida.

Slika 10.Slika 10.55 HPLC profil dvadeset i osam različitih polifenola na C HPLC profil dvadeset i osam različitih polifenola na C1818 koloni. Klase koloni. Klase jedinjenja pokazane su u gornjem delu hromatograma.jedinjenja pokazane su u gornjem delu hromatograma.

Upotreba HPLC najbolje je ilustorvana na primeru prikazanom na slici 11. U ovom eksperimentu smeša ekstrakta cveća korišćena je za prikazivanje spektra raznih tipova jedinjenja. Detekcija u opsegu od 340–360 nm je odgovarajuća za flavone i flavonole. U složenoj smeši, serija pikova može se grupisati na osnovi linijskog spektra. HPLC analiza smeše nakon alkalne hidrolize (uklanja bilo koju acil grupu) i kisele hidrolize (dovodi do kidanja O–glikozida) pomaže u identifikaciji pika.

Kvantifikacija flavonoida je još jedna prednost UV detekcije. Grubo utvrđivanje količine falvonoida može se postići upoređenjem podataka nakon integrisanja hromatograma sa podacima koji su dobijeni nakon injektiranja poznate količine dostupnog standarda. Kako je samo nekoliko glikozida flavonoida komercijalno dostupno za svrhe referentnog standarda, direktna kvantitativna analiza je često nepraktična. Česta praksa, kada se analizira biljni ekstrakt, je hidroliza glikozida i identifikacija i kvantifikacija otpuštenih aglikona. Ova procedura korišćena je u analizi belog luka i belog celera. Liofilizirani biljni materijal ekstrahovan je 60% vodenim metanolom i hidroliziran sa 1,2 M HCl pre HPLC analize na C18

Symmetry 150×3,9 mm (5 μm) koloni. Kao mobilna faza korišćen je gradijent od 15 do 35% acetonitrila u vodi podešen na pH 2,5 sa THF. U nehidroliziranom ekstraktu luka bila su prisutna dva neidentifikovana pika flavonoid glikozida. Kada je ekstrakt hidrolizovan, ova dva pika zamenjena su glavnim pikom koji odgovara kvercetinu.

5 Preuzeto iz Sakakibra, H. et al., Simultaneous determination of all polyphenols in vegetable, fruits and teas, Journal of Agricultur and Food Chemistry, 2003.

Slika 11.Slika 11.66 HPLC hromatogram (apsorbanca na 352 nm u funkciji od vremena) (a) smeša HPLC hromatogram (apsorbanca na 352 nm u funkciji od vremena) (a) smeša flavonoida pokazuje različite grupe jedinejenja: kempefrol triglikozid (1), grupa apigeninflavonoida pokazuje različite grupe jedinejenja: kempefrol triglikozid (1), grupa apigenin glikozida (2), kempferol diglikozid (3), luteolin glikozid (4), grupa acilovanih kempferolglikozida (2), kempferol diglikozid (3), luteolin glikozid (4), grupa acilovanih kempferol glikozida (5), čalkon (6) i luteolin (7). (b) Arodukti bazne hidrolize iste smeše pokazujuglikozida (5), čalkon (6) i luteolin (7). (b) Arodukti bazne hidrolize iste smeše pokazuju relativno povećanje pika 3 i gubitak pika acilovanih glikozida kempferola. (c) Smeša nakonrelativno povećanje pika 3 i gubitak pika acilovanih glikozida kempferola. (c) Smeša nakon kisele hidrolize pokazuje luteolin i kempferol (8). kisele hidrolize pokazuje luteolin i kempferol (8).

Kao unutrašnji standard korišćen je kempferol. Analizom nehidrolizovanog ekstrakta celera (izoramnetin korišćen kao unutrašnji standard) uočeno je nekoliko pika. Nakon hidrolize glavni pikovi bili su apigenin, luteolin i nepoznata komponenta. Kvantifikacija aglikona u svežem biljnom materijalu izvedena je ekstrapolacijom (Crozier et al., 1997).

Kuplovanje HPLC sa DAD (Diode Array Detector) omogućava online kvantifikaciju flavonoida u uzorku koji se analizira. Justesen i saradnici (1998) kvantifikovali su flavonole, flavone i flavanone u voću, povrću u pićima na sledeći način: materijal je ekstrahovan i zatim hidrolizovan da bi se dobili odgovarajući aglikoni flavonoida. Analiza je izvršena na

6 Preuzeto iz Sivam, G., Analysis of Flavonoids, In: Methods of Analysis for Functional Foods and Nutraceuticals, ed., Hurst, .W. J., CRC Press LLC, 2002.

Phenomenex C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) koloni, uz korišćenje mobilne faze metanol–voda (30:70) sa 1% mravlje kiseline (rastvarač A) i 100% metanol (rastvarač B). gradijent je bio 25 do 86% B u 50 min sa brzinom protoka 1 ml/min. UV spektri su snimani od 220 do 450 nm. Za svako jedinjenje, površine pikova određene su na talasnoj dužini koja daje maksimum apsorbancije. Kvantifikacija je izvršena na osnovu spoljašnjeg standarda. Smeša standarda poznate koncentracije anilizirana je dva puta pre i posle uzorka. Površine pikova korišćene su za izračunavanje sadržaja flavonoid aglikona u hidroliziranom ekstraktu.

LiteraturaLiteratura

Albert, K., Liquid chromatography–nuclear magnetic resonance spectroscopy, Journal of Chromatography A, 856: 199–211, 1999.

Arts, I. C. W. & Hollman, P. C. H., Optimization of a quantitative method for the determination of catechins in fruits and legumes, Journal of Agricultulural Food Chemistry, 46: 5156–5162, 1998.

Berente, B., Reichenba¨cher, M., and Danzer, K., Improvement of the HPLC analysis of anthocyanins in red wines by use of recently developed columns, Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 371: 68, 2001.

Cimpan, G. and Gocan, S., Analysis of medicinal plants by HPLC: recent approaches, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 25: 2225, 2002.

Cody, V.; Middleton, E. J. R.; Harborne, J. B. & Beretz, A., Plant Flavonoids in Biology and Medicine II: Biochemical, Cellular, and Medicinal Properties, Alan R. Liss Incorporated, New York, 107–121, 1988.

Crozier, A. et al., Quantitative analysis of flavonoids by reversed-phase high performance liquidchromatography, Journal of Chromatography A, 761: 315, 1997.

Fernandez, M. T.; Mira, M. L.; Florenco, M. H. & Jenings, K . R., Iron and copper chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study, Journal of Inorganic Biochemistry, 92: 105–111, 2002.

Fiorani, M.; De Sancitis, R.; De Bellis, R. & Dacha, M., Intracellular flavonoids as electron donors for extracellular ferricyanide reduc tion in human erythrocytes, Free Radical Biology & Medicine, 32: 64–72, 2002.

Francis, F. J., Anthocyanins and betalains: Composition and application, Cereal Foods World, 45: 208–213, 2000.

Gao, L. & Mazza, G., Characterization, quantitation, and distribution of anthocyanins andcolorless phenolics in sweet cherries, Journal of Agricultural Food Chemistry, 43: 343–346, 1995.

Giusti, M. M.; Wrolstad, R. E., Characterization and measurement of anthocyanins by UV-visible spectroscopy, in Handbook of Food Analytical Chemistry: Pigments, Colorants, Flavors, Texture, and Bioactive Food Components, Hoboken, N. J., ed., John Wiley & Sons: New York, 19–31, 2005.

Grosh, B., Food Chemistry, Springer–Verlag, Heidelberg, Germany, 569–570; 596–602, 1986.Gutzeit, D; Wray, V.; Winterhalter, P. & Jerz, G, Preparative Isolation and Purification of Flavonoids and

Procatechuic Acid from Sea Bucktorn Juice Concentrate (Hippophe Rhamnoides L. ssp. rhamnoides) by High–Spped Counter–Current Chromatography, Chromatographia, 65: 1–7, 2007.

Guyot, S.; Marnet, N.; Laraba, D.; Sanoner, P. & Drilleau, J. F., Reversed–phase HPLC following thiolysis for quantitative estimation and characterization of the four main classes of phenolic compounds in different tissue zones of a French cider apple variety (Malus domestica var. Kermerrien), Journal of Agricultural Food Chemistry, 46:1698–1705, 1998.

Harborne, J. B.; Williams, C. A., Advances in flavonoid research since 1992., Phytochemistry, 55: 481–504, 2000.

Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R. & Bobilya, D. J., Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure–activity relationships, The Journal of Nutritional Biochemistry, 13(10): 572–584, 2002.

Hertog, M. G. L.; Feskens, E. J. M.; Hollman, P. C. H.; Katan, M. B. & Kromhout, D., Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study, Lancet, 342, 1993.

Jackman, R. L.; Smith, J. L., Anthocyanins and betalains, in Natural Food Colorants, Hendry, G. A. F.; Houghton, J. D., eds., AVI , New York, 184–241, 1992.

Justesen, U.; Knuthsen, P. & Leth, T., Quantitative analysis of flavonols, flavones, and flavanones in fruits, vegetables and beverages by high-performance liquid chromatography with photodiode array and mass spectrometric detection, Journal of Chromatography A, 799: 101, 1998.

Kayle, J. A. M. & Duthie, G., G., Flavonoids in Food, in Flavonoids: Chemistry, Boichemistry and Applications, Andersen, Ø. M. & Markham, K. R., eds., CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida, 2006.

Knekt, P.; Jӓrvinen, R.; Seppӓnen, R., et al., Dietary flavonoids and the risk of lung cancer and other malignant neoplasms, American Journal of Epidemiology, 146: 223–230, 1996.

Krause, M. & Galensa, R., Improved chiral stationary phase based on cellulose triacetate supported in a non-macroporus silica gel diol for the high-performance liquid chromatographic separation of racemic flavonones and diastereomeric flavanone glycosides, Journal of Chromatography, 502: 287–296, 1990.

Lee, J. H.; Schwartz, S. J., Pigments in Plant Foods, In: Handbook of Food Science, Technology and Engineering, Hui, Y. H., ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 5–10, 2006.

Marston, A. & Hostettmann, K., Separation and Quantification of Flavonoids, in Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Application, Andersen, M. Ø. & Markham, K. R., eds., CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida, 2006.

Mateus, N.; de Freitas, V., Anthocyanins as Food Colorants, In: Anthocyanins: Biosynthesis, Functions and Applications, Gould, K.; Davies, K.; Winefield, C., eds.,Springer Science+Business Media LLC, New York, USA, 282–298, 2009.

Mazur, A.; Bayle, D.; Lab, C.; Rock, E. & Rayssiguier, Y., Inhibitory effect of procyanidin-rich extracts on LDL oxidation in vitro, Atherosclerosis, 145, 1999.

Merken, H.M. and Beecher, G.R., Measurement of food flavonoids by high-performance liquid chromatography: a review, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48: 577, 2000.

Middleton, E., Biological Properties of Plant Flavonoids: An Overview, Pharmaceutical Biology, 34(5): 344–348, 1996.

Mira, L.; Fernandez, M. T.; Santos, M.; Rocha, R.; Florencio, M. H. & Jennings, K. R., Interactions of Flavonoids with Iron and Copper Ions: A Mechanism for their Antioxidant Activity, Free Radical Research, 36: 1199–1208, 2002.

Nagy, M. & Grancai, D., Colorimetric determination of flavanones in propolis, Pharmazie, 51: 100-101, 1996.

Pourmorad F, Hosseinimehr S, Shahabimajd N (2006). Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants, African Journal of Biotechnology, 5: 1142-1145.

Puupponen–Pimiӓ, R.; Nohynek, L.; Hartmann–Schmidlin, S. et al., Berry phenolics selectively inhibit growth of intestinal patogens, Journal of Applied Microbiology, 98: 991–1000, 2005.

Rotelli, A. E.; Guardia, T.; Juarez, A. O.; de la Rocha, N. E.& Pelzer, L. E., Compararive study of flavonoids in experimental models of inflamation, Pharmacological Research, 48: 601–606, 2003.

Sakakibara, H. et al., Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits and teas, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51: 571, 2003.

Singleton, V. L.; Rossi, J. A., Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic–phosphotungistic acid reagent, American Journal of Enology and Viticulture, 16: 144–157, 1965.

Starr, M. S.; Francis, F. J., Oxygen and ascorbic acid effect on the relative stability of four anthocyanin pigments in cranberry juice, Food Technology, 22: 1293–1295, 1968.

Timberlake, C. F.; Bridle, P., Anthocyanins, in Developments in Food Colours—1, Walford, J., ed., Applied Science Publishers LTD, London, 115–149, 1980.

Wang, H.; Nair, M. G.; Strasburg, G. M.; Chang, Y. C.; Booren, A. M.; Gray, J. I. & Dewitt, D. L., Antioxidant and Antiinflammatory Activities of Anthocyanins and Their Aglycon, Cyanidin from Tart Cherries, Journal of Natural Products, 62: 294–301, 1999.

Wilson, I. D., Multiple hyphenation of liquid chromatography with nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry and beyond, Journal of Chromatography A, 892: 315–27, 2000.

Winkel–Shirley, B., Flavonoid biosynthesis: a colorful model for genetics, biochemistry, cell biology and biotechnology, Plant Physiology, 126: 485–493, 2001.

Woisky, R. & Salatino, A., Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical quality control, J. Apic. Res, 37: 99-105, 1998.

Wrolstad, R. E., Anthocyanins, In: Natural Food Colorants, Lauro, G. J.; Francis, F. J., eds., Marcel Dekker, New York, 237–252, 2002.