1

Instrumentalne metode:Fluorescentna spektroskopija

i mikroskopijaŽeljko Jeričević, dr. sc.

Zavod za računarstvo, Tehnički fakultet & Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultet

51000 Rijeka, CroatiaPhone: (+385) 51-651 594

E-mail: zeljko.jericevic@riteh.hrhttp://www.riteh.uniri.hr/~zeljkoj/Zeljko_Jericevic.html

2011.05.31 2

Raspored predavanja i vježbi2011.05.31 15:13-17:00 Kemijski praktikum2011.06.01 13:15-15:00 Predavaona br. 5Po dogovoru: posjet Zavodu za fiziologiju da se vidi

rad na fluorescentnom mikroskopu

2

2011.05.31 3

Što se od studenata očekujeDa usvojite materijal relevantan za studij i

budući profesionalni rad• Značaj informacija na molekularnom nivou

(kemija!)• Značaj numeričke obrade podataka• Značaj poznavanja engleskog jezika

2011.05.31 4

Ukratko1. Udžbenici2. Povijest fluorescencije3. Fizikalni i kemijski procesi u fluorescenciji4. Fluorescentni spektrometar5. Fluorescentna mikroskopija6. Izabrane primjene

3

2011.05.31 5

1. Udžbenici

2011.05.31 6

Ukratko1. Udžbenici2. Povijest fluorescencije3. Fizikalni i kemijski procesi u fluorescenciji4. Fluorescentni spektrometar5. Fluorescentna mikroskopija6. Izabrane primjene

4

2011.05.31 7

Povijestmetode:William Herschel

On a case of superficial colour presented by a homogeneous liquid internally colourless. By Sir JohnFrederick William Herschel, Philosophical Translationof the Royal Society of London (1845) 135:143–145.Received January 28, 1845 — Read February 13, 1845

“Though perfectly transparent and colorless when held between the eye and the light, or a white object, it yet exhibits in certain aspects, and under certain incidences of the light, an extremely vivid and beautiful celestial blue color, which, from the circumstances of its occurrence, would seem to originate in those strata which the light first penetrates in entering the liquid, and which, if not strictly superficial, at least exert their peculiar power of analyzing the incident rays and dispersing those which compose the tint in question, only through a very small depth within the medium.”

2011.05.31 8

Povijestmetode:George Stokes

On the Change of Refrangibility of Light. By G. G.Stokes, M.A., F.R.S., Fellow of Pembroke College,and Lucasian Professor of Mathematics in theUniversity of Cambridge. Phil. Trans. RoyalSociety of London (1852) pp. 463-562.Received May 11, — Read May 27, 1852.

“It appears from the experiments of Sir John Herschel that the blue color comes only from a stratum of fluid of small but finite thickness adjacent to the surface by which the light enters. After passing through this stratum, the incident light, though not sensibly enfeebled nor coloured, has lost the power of producing the same effect, and therefore may be considered as in some way or other qualitatively different from the original light."

5

2011.05.31 9

Fluorescencija

2011.05.31 10

Povijest metode:Aleksandar Jablonski

Professor Alexander Jablonski, who is regarded as the father of fluorescence spectroscopy because of his many accomplishments, including descriptions of concentration depolarization and defining the term "anisotropy" to describe the polarized emission from solutions

6

2011.05.31 11

Povijest metode:Aleksandar Jablonski

His work continued beyond his retirement in 1968. Professor Jablonski created a spectroscopic school of thought that persists today through his numerous students, who now occupy positions at universities in Poland and elsewhere. Professor Jablonski died on September 9, 1980.

2011.05.31 12

Pitanja1. Ko je prvi opisao fenomen fluorescencije?2. Što je Stokesov efekt?3. Što je Jablonski dijagram?

Ponovite prethodni materijal ako ne možete odgovoriti na pitanja

7

2011.05.31 13

Ukratko1. Udžbenici2. Povijest fluorescencije3. Fizikalni i kemijski procesi u fluorescenciji4. Fluorescentni spektrometar5. Fluorescentna mikroskopija6. Izabrane primjene

2011.05.31 14

Fluorescencija

8

15

Elektronski prelaziFrack-Condonov dijagram: Slika prikazuje apsorpcijuzračenja iz osnovnogelektronskog stanja (E0) u drugo vibracijsko stanje(v'=2) pobuđenogelektronskog stanja (E1). Emisija fotona je iz (v'=0) u drugo vibracijsko stanjeosnovnog elektronskogstanja (v”=2). (from Wikipedia)

2011.05.31 16

Fluorescencija

9

2011.05.31 17

Fluorescencija

Singlet state: All electrons in the molecule are spin-pairedTriplet state: One set of electron spins is unpaired

2011.05.31 18

Fluorescencija

10

2011.05.31 19

Beer-Lambertov zakon

l

2011.05.31 20

Beer-Lambertov zakondI I Ndz

σ= −

Promjena intenziteta svijetla po dubini dI/dzproporcionalna je intenzitetu upadnogsvijetla I, udarnom presjeku σ i brojumolekula N po cm3

11

2011.05.31 21

Beer-Lambertov zakon

0 0

0

0

0

ln

logln log log

log( log ) ln log lnlog

log

I l

I

kb

k

dI N dzIdI duN dz u CI u

xI Nl xI b

I xe Nl e xI e

I lc AI

σ

σ

σ

σ

ε

= −

= − = +

= − =

− = =

= =

∫ ∫ ∫

2011.05.31 22

Beer-Lambertov zakon0

-A

0

log

=10

IA lcI

ITI

ε= =

=

A je apsorbancija(ekstinkcija | optičkagustoća)ε je molarni koeficijentapsorbancijec je koncentracijaT je transmitacija

12

2011.05.31 23

Ograničenja za Beer-Lambertovzakon

Beer-Lambertov zakon vrijedi zakoncentracije kod kojih je međusobna

interakcija molekula zanemariva(c < 0.01 mol/l)

Raspršenje svijetla smatra se zanemarivim

2011.05.31 24

Pitanja1. Objasni razliku izmedu tripleta i singleta2. Što je Franck-Condonov princip?3. Izvedi Beer-Lambertov zakon4. Što je apsorbancija a što transmitacija?5. Koje su limitacije Beer-Lambertova zakona?

Ponovite prethodni materijal ako ne možete odgovoriti na pitanja

13

2011.05.31 25

Instrumentacija za fluorescenciju

2011.05.31 26

Fluorescencija

14

2011.05.31 27

Fluorescencija

2011.05.31 28

Tipični fluorofori

15

2011.05.31 29

Apsorpcija i emisija(zrcalna simetrija A&E)

2011.05.31 30

Apsorpcija i emisija(izuzeci zrcalne simetrije)

HPTS1-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonate)U pobuđenom stanjuionizacija OH grupe je favorizirana

16

2011.05.31 31

Apsorpcija i emisija(izuzeci zrcalne simetrije)

Stvaranje “charge transfer complex” između antracena i anilina dovodi do promjeneemisionog spektra

2011.05.31 32

Apsorpcija i emisija(izuzeci zrcalne simetrije)

Stvaranje “charge transfer complex”izmedu molekula pirenadovodi do promjeneemisionog spektra(6x10-3 do 9x10-5M)

17

2011.05.31 33

Kvantno iskorištenje

2011.05.31 34

Kvantno iskorištenje

je kvantno iskoristenje

je konstanta brzine depopulacije pobudenog stanja emisijom fotona

je konstanta brzine depopulacije pobudenog stanja nefotonskim procesima

Q

Q

nt

nt

k

k

Γ=Γ +

Γ

18

2011.05.31 35

Kvantno iskorištenje i vrijemeživota

Teški atomipoput I tipičnorezultiraju u kraćemvremenu životai nižemkvantnomiskorištenju

2011.05.31 36

Kvantno iskorištenje i vrijemeživota

je vrijeme zivota pobudenog stanja

postaje prirodno vrijeme zivota

1

1 za 0

Q

nt

n nt n

n

k

k

τ

τ

τ τ τ

ττ

=Γ +

= =Γ

=

19

2011.05.31 37

Fluorescencija

2011.05.31 38

Fluorofori, kvantno iskorištenje

• Compound Solvent Exc Em QYield• Acridine_Orange Ethanol 493 535 0.46• Benzene Ethanol 248 300-350 0.04• Chlorophyll-A Ethanol 440 685 0.23• Eosin Water 521 544 0.16• Fluorescein Water 437 515 0.92• Rhodamine-B Ethanol 555 627 0.97

20

2011.05.31 39

Gašenje fluorescencije

2011.05.31 40

Osjetljivost fluorofora na okolišTyr (slobodni) _______Tyr u kalmodulinu & Ca -----------Tyr u kalmodulinu, no Ca ………...

21

2011.05.31 41

Osjetljivost fluorofora na okolišApomioglobin (imahidrofobni džep za hem)Model membrane DMPCdimyristoyl-l-α-phosphatidylcholineVoda

2011.05.31 42

Osjetljivostfluorofora na okoliš

Dostupnost floroforamolekulama koje gasefluorescenciju. Q je ion I-

22

2011.05.31 43

Pitanja1. Što su florofori?2. Što je kvantno iskoristenje?3. Što je vrijeme života florofora?4. Što je spektralno prekrivanje?

Ponovite prethodni materijal ako ne možete odgovoriti na pitanja

2011.05.31 44

Fluorescentna anizotropija

23

2011.05.31 45

Fluorescentna anizotropijaEfekt asocijacijeproteinskih molekula i mikroviskozitetamembrane naanizotropijufluorescencije

2011.05.31 46

Fluorescentna anizotropija i polarizacija

||

||

||

||

anizotropija2

polarizacija

I Ir

I II I

PI I

⊥

⊥

⊥

⊥

−=

+

−=

+

24

2011.05.31 47

RET (Resonance Energy Transfer)

2011.05.31 48

RET6

0

1

1

EfikasnostrR

=⎛ ⎞

+ ⎜ ⎟⎝ ⎠

R0 nmDonor-Acceptor

4.5Flu-Rho

2.5Trp-NADH

2.5Tyr-NADH

6.0DNS-heme

0.9DNS-DNS

2.2Trp-ANS

2.0Trp-DNS

2.0Tyr-DNS

2.8Trp-heme

2.5Tyr-heme

0.6Trp-Trp

1.5Tyr-Trp

0.8Tyr-Tyr

1.4Phe-Tyr

0.6Phe-Phe

25

2011.05.31 49

RET

2011.05.31 50

RET

26

2011.05.31 51

RET

2011.05.31 52

Stacionarna fluorescencija i fluorescencija u vremenu

27

2011.05.31 53

Fluorescencija u vremenu (kinetika 1 reda)

(0) 0

( ) ( )

( ) ln( )

( )ln ( ) ln (0) ln(0)

( ) (0)

F t

F

kt

dF t F t kdtdF t duk dt u CF t u

F tF t F ktF

F t F e−

− =

= − = +

− = = −

=

∫ ∫ ∫

2011.05.31 54

Fluorescencija u vremenu (kinetika 1 reda)

(0)( ) FFe

τ =

Vrijeme života τ=1/kSvojstveno vrijeme života τ0=1/k (pretpostavlja Q=1)

28

2011.05.31 55

Biokemijski flurofori

2011.05.31 56

Kovalentno vezani flurofori

29

2011.05.31 57

Flurescentni indikatori

2011.05.31 58

Asocijacija

30

2011.05.31 59

Multifotonska pobuda

2011.05.31 60

Ukratko1. Udžbenici2. Povijest fluorescencije3. Fizikalni i kemijski procesi u fluorescenciji4. Fluorescentni spektrometar5. Fluorescentna mikroskopija6. Izabrane primjene

31

2011.05.31 61

Zadatak:Povući i pročitati poglavlje 2 iz:

Joseph R. Lakowicz“Principles of Fluorescence Spectroscopy”

3rd ed., 2006, XXVI, 954 p. 1255 illus., 1210 in color., ISBN: 978-0-387-31278-1

http://www.springer.com/chemistry/analytical/book/978-0-387-31278-1

2011.05.31 62

Hvala na pažnji!

Željko Jeričević, dr. sc.Zavod za računarstvo, Tehnički fakultet &

Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinskifakultet

51000 Rijeka, CroatiaPhone: (+385) 51-651 594

E-mail: zeljko.jericevic@riteh.hrhttp://www.riteh.uniri.hr/~zeljkoj/Zeljko_Jericevic.html