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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA
EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN SUBCRÓNICA DE LA APAMINA EN RATAS VIEJAS SOBRE LA MORFOLOGÍA NEURONAL DE LA CORTEZA PREFRONTAL, NÚCLEO
ACCUMBENS E HIPOCAMPO VENTRAL
Tesis
PRESENTA ALEJANDRA ROMERO CURIEL
DIRECTORES DE TESIS DR. SERGIO ROBERTO ZAMUDIO HERNÁNDEZ
DR. GONZALO FLORES ÁLVAREZ
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ÍNDICE
1.
Abreviaturas 4
2. Abstract 5
3. Resumen 6
4. Introducción 7
4.1 Apamina 7
4.2 Efectos sobre canales de K+ dependientes de Ca2+ 8
4.3 Corteza prefrontal 9
4.4 Núcleo Accumbens 10
4.5 Hipocampo 11
5. Justificación 13
6. Hipótesis 14
7. Objetivos 15
7.1 Objetivo general 15
7.2 Objetivos particulares 15
8. Diagrama de trabajo 16
9. Metodología 17
9.1 Modelo animal 17
9.2 Material químico 17
9.3 Actividad locomotora 17
9.4 Estudios morfológicos 18
9.4.1 Protocolo de la tinción de Golgi-Cox 19
9.4.2 Protocolo de revelado de la tinción de Golgi-Cox 19
9.4.3 Observación y trazado de neuronas contrastadas con la
tinción de Golgi-Cox 20
9.4.4 Análisis de las neuronas 21
9.5 Análisis estadístico 22
10. Resultados 23
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10.1 Actividad motora 23
10.2 Resultados morfológicos de las neuronas espinosas medianas del
NAcc 24
10.2.1 Resultados morfológicos de la longitud total de las neuronas
espinosas medianas del NAcc 24
10.2.2 Resultados morfológicos de la arborización de las neuronas
espinosas medianas del NAcc 26
10.2.3 Resultados de la densidad de espinas dendríticas de las
neuronas espinosas medianas del NAcc 27
10.3 Resultados morfológicos de las neuronas piramidales de la región
CA1 del HV 28
10.3.1 Resultados morfológicos de la longitud de las neuronas
piramidales de la región CA1 del HV 28
10.3.2 Resultados morfológicos de la arborización de las neuronas
piramidales de la región CA1 del HV 29
10.3.3 Resultados de la densidad de espinas dendríticas de las
neuronas piramidales de la región CA1 del HV 31
10.4 Resultados morfológicos de las neuronas piramidales de la CPF 32
10.4.1 Resultados morfológicos de la longitud de las neuronas
piramidales de la CPF 32
10.4.2 Resultados morfológicos de la arborización de las neuronas
piramidales de la CPF 33
10.4.3 Resultados de la densidad de espinas dendríticas de las
neuronas piramidales de la CPF 35
11. Discusión 36
12. Perspectivas 40
13. Conclusiones 41
14. Bibliografía 42
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1. ABREVIATURAS
AVT Área ventral tegmental
AHP Posthiperpolarización (afterpolarization)
BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro
CA1 Cuerno de Amón 1
CA3 Cuerno de Amón 3
CPF Corteza prefrontal
CREB Proteína de unión al elemento de respuesta del AMP cíclico
EEM Error estándar de la media
HV Hipocampo ventral
LTP Potenciación a largo plazo
MSSM Neuronas espinosas medianas
NAcc Núcleo accumbens
SK Canales de K+ dependientes de Ca2+
SNc Sustancia nigra compacta
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2. ABSTRACT
Apamin is a neurotoxin extracted from honey bee venom and is a selective
blocker of small conductance Ca2+ -activated K+ channels (SK). Several
electrophysiological and behavioral studies indicate that apamin may enhance
neuron excitability, synaptic plasticity, and long-term potentiation (LTP) in CA1
hippocampal region. However, the dendritic morphological alterations implied in SK
apamin-blockade are unknown. In the present work, Golgi-Cox stain protocol and
Sholl analysis were used to study the apamin effect on the dendritic morphology of
pyramidal neurons from ventral hippocampus and the prefrontal cortex, as well as
on the medium spiny neurons from nucleus accumbens. Sprague Dawley of 12 or
18 months of age were divided in three groups each: a control group and two
others with different doses of apamin (2 g/kg and 4 /kg) for 2 months, the control
groups received saline (NaCl 0.9%) in a similar volume to apamin groups. Motor
activity was determined in closed field, and the neuronal morphological analysis
was made by Golgi-Cox staining.
We found that only pyramidal neurons from ventral hippocampus were
altered in rats injected with apamin. Additionally, no changes in locomotor activity
were found in these animals. Our research suggest that apamin may increase the
dendritic morphology in hippocampus, which could be involved in the neuronal
excitability and synaptic plasticity enhancement induced by apamin.
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3. RESUMEN
La apamina es un péptido antagonista selectivo de los canales de K+
dependientes de Ca2+ (SK) que atraviesa la barrera hematoencefálica. Son
canales activados por Ca2+ intracelular que participan en la generación de la
posthiperpolarización (AHP) y se encuentran principalmente en estructuras
límbicas. En estudios electrofisiológicos el bloqueo farmacológico de estos canales
reduce la AHP e incrementa la re-excitabilidad neuronal. En cortes hipocampales
de rata, el bloqueo de estos canales facilitan la inducción de la potenciación de
largo plazo, por otro lado después de inducir la LTP en la región CA1 del
hipocampo hay un incremento en el número de espinas dendríticas lo cual
constituye la base estructural de la memoria. En ratón la administración aguda de
apamina de 0.2 mg/kg provoca cambios cognitivos, mientras que en rata
incrementa la actividad locomotora y mejora el aprendizaje. Sin embargo, no hay
reportes que muestren las alteraciones que produciría una administración
subcrónica de un bloqueador de canales SK como es la apamina sobre la
morfología neuronal, siendo esta una técnica usada para evaluarla.
Por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue determinar los cambios
morfológicos en neuronas piramidales de la corteza prefrontal y de la región CA1
del hipocampo ventral, así como en neuronas espinosas medianas del núcleo
accumbens producidos por la administración de apamina por dos meses en ratas
con 12 y 18 meses de edad. Se utilizaron ratas de la cepa Sprague Dawley de 12
y 18 meses de edad. Se dividieron en tres grupos, un grupo control y otros dos
con diferentes dosis de apamina, (4 g/kg y 2 g/kg) durante 2 meses, al grupo
control se les aplicó un volumen similar de solución salina de NaCl al 0.9%. Se
determinó la actividad motora ante campo cerrado así como el análisis morfológico
neuronal usando la tinción Golgi-Cox.
Se determinó que la apamina (4 g/kg) provoca cambios morfológicos en la
región del hipocampo incrementando la longitud de las neuronas piramidales así
como la expresión de espinas dendríticas, en núcleo accumbens sólo aumento la
densidad de espinas mientras que en la CPF no se encontró ninguna alteración
morfológica. De acuerdo con los resultados obtenidos, se sugiere que el uso de
esta toxina favorece la plasticidad sináptica esto al aumenta las conexiones
neuronales principalmente en hipocampo, el cual a su vez se sabe que tiene un
importante papel en la formación de la memoria.
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4. INTRODUCCIÓN
4.1 APAMINA
La apamina es un péptido compuesto por 18 aminoácidos que se encuentra
en el veneno de la abeja (Apis mellifera), Figura 1, es un potente antagonista
altamente selectivo de los canales de K+ dependientes de Ca2+ (SK) (Hugues y
cols., 1982) que atraviesa la barrera hematoencefálica (Habermann, 1984).
Cuando se aplica apamina en ratón y rata a altas dosis (1.0 mg/kg), por vía
intraperitoneal, puede producir signos de envenenamiento como ataxia, tremores e
insuficiencia respiratoria. FJ Van der Staay en 1999, describe que las ratas viejas
podrían ser más sensibles a dichos efectos adversos.
Figura 1. Se muestra la estructura química de la apamina, péptido el cual está compuesto por 18
aminoácidos.
En ratón la administración de apamina en 0.2 mg/kg provoca cambios
cognitivos además de inducir la sobreexpresión de genes que se han relacionado
con procesos de memoria en condiciones normales principalmente en las regiones
CA1 y CA3 del hipocampo (Heurteaux y cols., 1993). En rata, una dosis mayor
(0.4 mg/kg) provoca una facilitación en la habituación, lo cual es reconocido como
una forma de aprendizaje. Por otro lado, esta neurotoxina provoca un incremento
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en la actividad locomotora en rata y mejora el aprendizaje en la prueba de
reconocimiento de objetos después de ser inyectada (Deschaux y Bizot, 1997).
4.2 EFECTO SOBRE LOS CANALES DE K+ DEPENDIENTES DE CA2+
Los canales SK son independientes de voltaje y se abren ante la
concentración intracelular de calcio, están acoplados a la calmodulina (CAM) la
cual le permite sensar el calcio intracelular, así uno de los posibles mecanismos
que se proponen es que la entrada de calcio a través de los receptores NMDA
activa a los canales SK (Luján y cols., 2009). Participan en la generación de la
posthiperpolarización (AHP), es decir intervienen en la fase tardía de los
potenciales de acción. (Hugues y cols., 1982, Romey, 1984). Existen tres tipos de
canales SK, los SK1, SK2 y SK3, que se expresan en el cerebro de los mamíferos
(Kohler y cols., 1996), como son la rata, el ratón, el cobayo, el conejo, el perro y el
humano (Habermannn y Fischer, 1979). Estos canales se encuentran
principalmente en la corteza y en estructuras límbicas, las cuales son áreas
involucradas en procesos cognitivos y de humor (Janicki, 1989).
En estudios electrofisiológicos, el bloqueo farmacológico de estos canales
reduce la AHP e incrementa la re-excitabilidad neuronal (Stackman, 2002). En
cortes hipocampales de rata, el bloqueo de estos canales aparentemente facilitan
la inducción de la potenciación a largo plazo (LTP) (Behnisch y Reymann, 1998).
Se ha propuesto que la inducción de LTP podría ser importante en el tratamiento
de los desordenes psiquiátricos y la demencia ya que en estos padecimientos es
evidente la disminución de la actividad neuronal (Van der Staay y cols., 1999).
Por otro lado, se sabe que en ratas de 26 meses de edad (ratas viejas) los
sitios de unión a la apamina (canales de tipo SK) disminuyen en un 55% con
respecto a ratas jóvenes de 3 meses de edad, sin mostrar afinidad alterada. Por
otro lado, se ha encontrado que existe un decremento en canales tipo SK de
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alrededor del 30 al 40% en pacientes con Alzheimer (Ikeda y cols. 1991). Las
pruebas de memoria y aprendizaje han sido propuestas como modelos animales
para el envejecimiento cognitivo (Campbell y cols., 1980, Ingram, 1985).
4.3 CORTEZA PREFRONTAL
Es una región asociativa y crucial para las funciones cerebrales complejas
(Figura 2) como la memoria, el procesamiento de información externa sensorial y
emocional, así como la organización del habla y el planeamiento de acciones
(Fuster, 2001). Esta región está ampliamente interconectada con las regiones
corticales, además de relacionarse con el tálamo mediante proyecciones aferentes
y recibe información procedente de la vía mesocortical dopaminérgica del VTA. La
CPF controla la salida de información hacia regiones límbicas como son la
amígdala y el hipocampo.
Figura 2. Corte coronal del cerebro donde se muestran la corteza prefrontal (en gris oscuro) que
corresponde al área Cg1 y Cg3, lamina 7-9 del Paxinos y Watson (1986) y el núcleo accumbens
(en gris claro).
Las neuronas características de la corteza son de tipo piramidal cuyo soma
tiene la forma de una pirámide o de un triángulo isósceles cuyo vértice superior se
prolonga hacia la superficie del cerebro como dendrita apical o prolongación; del
cuerpo de la célula surgen un número de dendritas basales que se arborizan en la
vecindad de la célula las cuales reciben estímulos equitadores tanto de la misma
área como de áreas adyacentes. Tanto las dendritas apicales como las basales
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tienen espinas dendríticas y constituyen el sitio de sinapsis glutamatérgica, siendo
el número de espinas el número mínimo de contactos sinápticos de la neurona
(Spruston 2008) (Figura 3).
Figura 3. Fotografía que muestra una neurona piramidal de la capa III de la CPF impregnada con
la tinción de Golgi-Cox
Las neuronas piramidales de la tercera capa, las cuales se estudiaron en el
presente trabajo, reciben proyecciones corticales e información de los axones de
las neuronas del tálamo mediodorsal (Giguere y cols., 1988) de modo que pueden
modificar el flujo de la transmisión excitadora provenientes de los circuitos
talamocortical y corticortical (Lewis y cols., 2003).
4.4 NÚCLEO ACCUMBENS
El núcleo accumbens (NAcc) pertenece al estriado ventral (Voorn y cols., 2005),
donde participa en la integración de la motivación y la acción motora conocida
como interfase límbico-motora (Fernández Espejo, 2000). Lo anterior sugiere que
el papel neurobiológico principal del NAcc es transferir información motivacional
relevante para que se realicen actos motores. Está formado por dos áreas
diferentes tanto en sus conexiones como neuroquímicamente: el core (centro) y la
shell (corteza) (Meredith y cols., 1995) (Figura 2). La corteza recibe aferencias
glutamatérgicas provenientes del hipocampo y la amígdala, así como aferencias
dopaminérgicas del área ventral tegmental (AVT) (Voorn y cols., 2005), mientras
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que el centro recibe aferencias glutamatérgicas de la CMPF (Heidbreder, 2003) y
dopaminérgicas de la SNc. Alrededor del 95 % de la población neuronal del NAcc
son neuronas espinosas medianas (O´Donnell and Grace, 1993) las cuales son
neuronas de proyección que, como su nombre lo indica son de tamaño mediano
(MSSN: medium size spiny neurons) (Figura 4).
Figura 4. Microfotografía que muestra una neurona espinosa mediana del NAcc teñida con la
tinción de Golgi-Cox.
4.5 HIPOCAMPO
La formación hipocampal se encuentra en el lóbulo temporal, incluye el
complejo cunicular, el hipocampo propiamente dicho y la circunvolución dentada
(Figura 5).
Figura 5. Corte coronal del cerebro, se muestran el hipocampo ventral (en oscuro), tomadas del
atlas de Paxinos y Watson (1986).
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Se puede dividir en 3 regiones separadas (CA1, CA2, CA3) basándose en
el tamaño y las conexiones de las células piramidales que residen en ellas
(Kandel, 2000) (Figura 6).
Las principales aferencias y eferencias neocorticales se conducen a través
de la corteza entorrinal las cuales transmiten información hacia las células
granulosas de la circunvolución dentada mediante la vía perforante (formada por
un haz de axones), los axones de estas neuronas hacen contacto con las espinas
de las neuronas piramidales de la región CA3 conocida como la vía de las fibras
musgosas, y por medio de la vía colateral de Schaffer, las células de CA3
contactan con las neuronas de la región CA1. Estas neuronas proyectan fuera de
la formación hipocampal a través del subículo.
Figura 6. Fotografía de neurona piramidal del hipocampo con tinción Golgi-Cox.
El hipocampo está relacionado con la adquisición, retención y recuperación
del conocimiento. La estimulación de alta frecuencia en la vía perforante produce
incrementos estables y duraderos en la magnitud de la respuesta postsináptica, lo
cual se conoce como potenciación a largo plazo (LTP). La potenciación a largo
plazo es un mecanismo de plasticidad sináptica, lo cual permite que las sinapsis
se modifiquen de tal forma que la memoria a corto plazo se vuelva memoria de
largo plazo. Con todo esto se puede considerar a la LTP como un mecanismo
celular del aprendizaje y la memoria.
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5. JUSTIFICACIÓN
Durante los potenciales postsinápticos excitadores, el incremento en la
concentración de Ca2+ activa los canales SK en la espina dendrítica, y la remoción
del Mg2+ en los receptores de tipo NMDA, lo cual incrementa el flujo de Ca2+,
favoreciendo la LTP. Así, se considera que los SK participan en la regulación de
la plasticidad sináptica y el bloqueo de los canales en este caso por la apamina
produce un decremento en el tiempo de posthiperpolarización favoreciendo la
plasticidad sináptica en cortes de hipocampo (Stackman, 2002). El hipocampo es
asociado con la memoria a largo plazo y la CPF se asocia con la memoria
cognitiva, ambos procesos son afectados durante el curso del envejecimiento
(Peterson y cols., 2001).
La LTP incrementa la eficacia sináptica en el hipocampo, lo cual es un
modelo importante para el estudio de los mecanismos de la plasticidad neuronal,
la reorganización de los circuitos neuronales, el aprendizaje y la memoria.
Congruente con esto, se ha encontrado que después de inducir la LTP en la
región CA1 del hipocampo hay un incremento en el número de espinas dendríticas
(Engert and Bonhoeffer, 1999), lo cual constituye la base estructural de la
memoria. Por otro lado, se sabe que la mayoría de las sinapsis excitadoras en el
cerebro se localizan en las espinas dendríticas llevándose a cabo reacciones
bioquímicas que favorecen la activación de la sinapsis.
Por lo anterior, si los canales SK son bloqueados favoreciendo la LTP, se
podría esperar un cambio en la población de espinas dendríticas sobretodo en
estructuras relacionadas con el aprendizaje como es el hipocampo. Sin embargo,
no hay reportes que muestren los posibles cambios morfológicos que produciría la
administración subcrónica de apamina sobre esta región así como otras regiones
cerebrales relacionadas.
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6. HIPÓTESIS
La administración subcrónica de apamina en ratas de 12 y 18 meses de edad
produce cambios morfológicos en las neuronas de algunas regiones cerebrales
relacionadas con los procesos de memoria.
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7. OBJETIVOS
7.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar los cambios morfológicos producidos por la administración subcrónica
de apamina en neuronas piramidales de la corteza prefrontal y de la región CA1
del hipocampo ventral, así como en neuronas espinosas medianas del núcleo
accumbens de ratas.
7.2 OBJETIVOS PARTICULARES
Se administró apamina durante dos meses a ratas de 12 y 18 meses de edad para
determinar:
Cambios en la actividad motora.
Alteraciones en la arborización de las neuronas piramidales de la tercera
capa de la corteza prefrontal y de la región CA1 del hipocampo ventral, y en
neuronas espinosas medianas del núcleo accumbens.
Cambios en la densidad de espinas dendríticas de las neuronas
piramidales de la tercera capa de la corteza prefrontal, de la región CA1 del
hipocampo ventral y de las espinosas medianas del núcleo accumbens.
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8. DIAGRAMA DE TRABAJO
Ratas macho Sprague-Dawley 12 meses de edad
Grupo Control Administración subcutánea
de solución salina (NaCl) 0.9 % durante 2 meses
Tinción de Golgi-Cox
Cortes de 200 m
Análisis morfológico
Análisis estadístico
Sacrificio de animales
Obtención cerebros control Obtención cerebros experimentales
Actividad locomotora a los 14 y 20 meses respectivamente
Administración subcutánea
de apamina 2 g/kg/día durante 2 meses
Administración subcutánea
de apamina 4 g/kg/día durante 2 meses
Grupos Experimentales
Ratas macho Sprague-Dawley 18 meses de edad
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9. METODOLOGÍA
9.1 MODELO ANIMAL
Se utilizaron ratas de la cepa Sprague-Dawley de 12 y 18 meses de edad y con un
peso de entre 450-500 gramos, del bioterio central de la BUAP “Claude Bernard”,
bajo condiciones ambientales de temperatura y humedad controladas (18-23 ºC y
50-60 % respectivamente), con ciclo de luz oscuridad de 12 horas, encendiendo
las luces a las 8:00 horas. Mantenidas en cajas de acrílico transparente de
50x35x18 cm. Con libre acceso a alimento y agua.
Se utilizaron ratas de 12 y 18 meses de edad. El grupo de ratas de 12 meses de
edad se dividió en tres: uno con administración diaria de apamina (2 g/kg de
peso), otro con una dosis superior de la neurotóxina (4 g/kg de peso) y el grupo
control (con un volumen similar de vehículo (solución salina de NaCl al 0.9 %)); se
hizo lo mismo con los animales de 18 meses, quedando seis grupos con una n=5
cada uno de ellos.
9.2 MATERIAL QUÍMICO
Apamina de veneno de abeja, marca Sigma-Aldrich, pureza 99.7 %, disuelto en
solución de NaCl al 0.9 %.
9.3 ACTIVIDAD LOCOMOTORA
Al finalizar el tratamiento con apamina (2 g/kg ó 4 g/kg) a los 14 ó 20 meses de
edad junto con sus controles se les evaluó su actividad motora por un lapso de
dos horas, se utilizaron cajas de acrílico de 44 cm de largo por 22 cm ancho y 22
cm de altura, estas cajas tienen acoplados ocho fotodiodos a lo largo de su eje
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longitudinal de modo que cuando la rata tiene movimiento, el haz de luz infrarroja
se corta, activando un contador, de esta forma se obtuvieron el número de
movimientos por unidad de tiempo. La actividad motora de los animales se
determinó bajo control de luz y temperatura (21 a 24 º C) a las 10:00 am.
9.4 ESTUDIOS MORFOLÓGICOS
Al término de las pruebas de actividad locomotora, las ratas se sacrificaron y el
cerebro se utilizó para el análisis morfológico de las neuronas. Para lo cual los
cerebros fueron sometidos a la tinción de Golgi-Cox.
9.4.1 Protocolo de la tinción de Golgi-Cox.
o Se anestesió al animal con Pentobarbital sódico a una dosis de 65 mg/kg,
realizando después una incisión toráxica para exponer el corazón (Figura
7A).
o Se perfundió el corazón por el ventrículo izquierdo con solución salina de
NaCl al 0.9%, previo corte de la aurícula derecha, con la finalidad de
eliminar los eritrocitos del tejido cerebral (Figura 7B).
Figura 7. A) Se anestesió la rata con pentobarbital sódico. B) Perfusión intraventricular de la rata
con solución salina.
A B
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o Se removieron los cerebros y se colocaron en 20 ml de la solución de
Golgi-Cox almacenándolos durante 20 días en obscuridad. Después de
este tiempo se reemplazó la solución de Golgi-Cox por una solución de
sacarosa al 30%, siendo almacenados en oscuridad por 2 días antes de
cortar.
o Se montó el cerebro en la platina del vibrotomo y fue sumergido en
solución de sacarosa al 6%, una vez colocado en la cámara del vibrotomo,
con suficiente solución de sacarosa para cubrir el tejido y la navaja.
o Se cortó el tejido haciendo rebanadas de 200 µm de grosor.
o Éstas fueron montadas en laminillas gelatinizadas al 2 %, presionándolas
uniformemente con papel filtro (Figura 8).
o Se conservaron las laminillas en una cámara húmeda por toda la noche.
o Se procedió al día siguiente a revelar la tinción.
Figura 8. Montaje de los cortes en las laminillas gelatinizadas.
9.4.2 Protocolo de revelado de la tinción de Golgi-Cox.
Todo el procedimiento se realizó en total oscuridad.
o Inicialmente se realizó un lavado en agua destilada durante un minuto.
o Se mantuvo durante 30 minutos sumergidas las laminillas en hidróxido de
amonio
o Se realizó un lavado con agua destilada durante un minuto.
o Después se sumergieron durante 30 minutos en fijador rápido de Kodak
para película fotográfica. Se utilizó una dilución 1:2 con agua destilada.
o Se volvieron a lavar con agua destilada durante un minuto.
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o Se deshidrató con concentraciones crecientes de etanol:
1 minuto con alcohol al 75 %
1 minuto con alcohol al 95 %
10 minutos con alcohol al 100 %
15 minutos con xileno.
o Se montaron los cubreobjetos con resina sintética en los cortes ya
revelados.
o Los cortes fueron conservados en oscuridad para su secado y posterior
observación.
9.4.3 Observación y trazado de neuronas teñidas contrastadas mediante la
tinción de Golgi-Cox.
Una vez localizadas las áreas de interés, en este caso la CPF, NAcc y HV, se
procedió a identificar las neuronas piramidales de la capa III para la CPF, las
neuronas espinosas medianas para el NAcc y las neuronas piramidales de la
región CA1 del HV, se dibujaron mediante su observación a 40X utilizando un
microscopio óptico marca Leica modelo DMSL acoplado a una cámara lúcida
marca Leica. Las espinas dendríticas de estas neuronas se dibujaron en el mismo
equipo con un objetivo de 100X y aceite de inmersión (Figura 9).
Figura 9. Cámara lucida acoplada a un microscopio de luz blanca, mediante el cual se dibujan las
neuronas de la región de interés (40X) y las espinas dendríticas en la porción distal, usando una
amplificación de 100X (modificado de Kolb, 1998).
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9.4.4 Análisis de las neuronas
De cada rata se dibujaron con ayuda de una cámara lúcida (1x) y un objetivo de
40X, 5 neuronas de cada hemisferio y región, obteniendo 10 neuronas de cada
una de las zonas de interés por cerebro, para el análisis de las espinas se eligió
una dendrita distal de la neurona que previamente había sido dibujada, utilizando
el objetivo de 100X.
Una vez realizado el dibujo se analizaron por medio de la técnica de análisis de
Sholl, que consiste en lo siguiente: (Sholl, 1953) se pintaron de diferentes colores
las dendritas de acuerdo con su grado de ramificación, iniciando a partir del soma
siendo estas de primer orden hasta que se ramifica, estas serán de segundo orden
y así sucesivamente hasta n orden. Después de esto se colocó una plantilla
transparente que cuenta con una serie de círculos concéntricos en los cuales el
círculo del centro debe coincidir con el soma y de esta manera determinar el
número de dendritas que interceptan cada uno de los círculos, esto nos permite
evaluar el número total de ramificaciones dendríticas el cual será contado a partir
de órdenes de bifurcación comenzado del cuerpo celular hacia la punta de las
dendritas (Coleman and Riesen, 1968), y la longitud dendrítica la cual fue
estimada contando el número de intersecciones de las dendritas en anillos
concéntricos que representan 10 m (Figura 10).
Figura 10. Muestra el dibujo de una neurona piramidal acoplado a la laminilla de círculos
concéntricos para realizar el análisis de Sholl.
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Para obtener la densidad de las espinas dendríticas, se buscó la dendrita más
distal de la neurona antes dibujada. Con el calcado de la dendrita con sus
respectivas espinas, se marca la prolongación de la dendrita cada 1.6 cm que
equivalen a 10 m, para la cámara lucida utilizada (Leica). Se contaron las espinas
que hay en cada 1.6 cm.
9.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todas las pruebas estadísticas se realizaron usando el programa GraphPad Prism
4.0. Los datos de longitud total dendrítica, orden mayor de ramificación,
arborización y densidad de espinas dendríticas se analizaron por medio de una
análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, cuando fue pertinente, se aplicó una
prueba Post-hoc de Bonferroni para las comparaciones múltiples. Se consideró
significativa la diferencia cuando p<0.05.
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10. RESULTADOS
10.1 ACTIVIDAD LOCOMOTORA
La actividad motora se realizó después de dos meses de administración de la
apamina a los 14 y 20 meses de edad de cada grupo de acuerdo con el protocolo
antes mencionado, obteniéndose la suma acumulada de la actividad de cada
grupo; donde los animales de 14 meses tratados con apamina no mostraron
cambios motores con respecto a su grupo control (Figura 11).
Figura 11. Gráfica de actividad motora acumulada en campo cerrado de ratas con 14 meses de
edad. Se muestra la suma acumulada de los movimientos que realizaron el grupo control y los
grupos tratados con apamina (2 y 4 µg/kg) durante 120 minutos en registros de 10 min.
De igual manera la actividad motora en animales de 20 meses no muestra
cambios entre los tres grupos estudiados (Figura 12), sugiriéndose que la apamina
no altera la actividad motriz independientemente de la dosis y la edad a la que sea
administrada, al menos bajo las condiciones establecidas en este trabajo.
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Figura 12. Gráfica de actividad motora acumulada en campo cerrado de ratas de 20 meses. Se
muestra la suma acumulada de los movimientos que realizaron el grupo control y los grupos
tratados con apamina (2 y 4 µg/kg) durante 120 minutos. Sin mostrar cambios motores.
10.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS DE LAS NEURONAS ESPINOSAS
MEDIANAS DEL NAcc
10.2.1 Resultados morfológicos de la longitud total de las neuronas espinosas
medianas del NAcc
Los datos obtenidos (n=5) muestran que la longitud dendrítica total de las
neuronas espinosas medianas del NAcc tanto en los animales de 14 como de 20
meses de edad (Figura 13), no fue alterada por la administración de apamina
(Figura 14).
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A) B) C)
Figura 13. Fotografías de neuronas del NAcc. A) Fotografía de neurona espinosa mediana de NAcc
con tinción Golgi tomada con microscopio óptico acoplada a cámara lúcida con objetivo de 20X del
grupo de animales tratados con dosis baja de apamina. B) Imagen de las espinas dendríticas de
cerebro control con objetivo de 100X. C) Fotografía de espina dendrítica de cerebro tratado con
dosis alta de apamina (4 µg/kg).
Figura 14. Gráfico que muestra la longitud dendrítica total (media ± EEM) de las neuronas
espinosas medianas del NAcc de los animales de 14 y 20 meses de edad con sus respectivos
grupos controles, donde el uso de apamina no modificó la longitud dendrítica total de dichas
neuronas.
- 27 -
10.2.2 Resultados morfológicos de la arborización de las neuronas espinosas
medianas del NAcc
De la misma manera usando el análisis de Sholl se mostró que el tratamiento con
apamina no alteró la arborización de las neuronas espinosas medianas así como
la longitud dendrítica con respecto al orden de ramificación tanto a los 14 como a
los 20 meses (Figura 15).
B
C D
Figura 15. A) Gráfica que muestra la arborización de las neuronas espinosas medianas del NAcc a
los 14 meses. B) Gráfica de análisis de Sholl en animales con 20 meses de edad, cada punto
representa la media ± EEM. C) Gráfica que muestra la longitud de las dendritas del NAcc con
respecto al número de orden (n=5 por grupo) de animales de 14 meses. D) Gráfica que muestra la
longitud de las neuronas espinosas medianas con respecto al orden de ramificación de animales
con 20 meses de edad.
A
- 28 -
10.2.3 Resultados morfológicos de la densidad de espinas dendríticas de las
neuronas espinosas medianas del NAcc
El análisis de la densidad de espinas dendríticas de NAcc mostró que la
administración subcrónica de la dosis alta de la toxina (4 µg/kg) aumentó la
expresión de espinas en animales de 14 meses de edad (*p<0.05 ANOVA) con
respecto a su grupo control, no así en animales de 20 meses de edad (Figura 16).
Figura 16. Gráfica que muestra la densidad de espinas dendríticas distales de las neuronas
espinosas medianas del NAcc de animales de 14 meses de edad (n=5 por grupo). Donde la
administración de 4 µg/kg de peso de apamina incrementa el número de espinas con respecto a su
grupo control (*p<0.05, ANOVA de dos vías). Mientras que en animales más viejos este efecto no
se observa.
- 29 -
10.3 RESULTADOS MORFOLÓGICOS DE LAS NEURONAS PIRAMIDALES
DEL HV
10.3.1 Resultados morfológicos de la longitud dendrítica de las neuronas
piramidales de la región CA1 del HV
Los resultados obtenidos a través del análisis de Sholl, nos muestran que la
longitud total de las dendritas de las neuronas piramidales de la región CA1
(Figura 17) del hipocampo ventral de los grupos tratados con apamina a los 14
meses es mayor con respecto a su grupo control *p<0.05 (ANOVA de dos vías
prueba Post-hoc de Bonferroni) (Figura 18). Sin embargo, esto no se observa
cuando se evaluaron los animales de 20 meses de edad.
A
B C
Figura 17. Fotografías de HV. A) Fotografía de neurona piramidal de la región CA1 del hipocampo
ventral con tinción Golgi con objetivo de 20X del grupo de animales tratados con dosis alta (4
µg/kg) de apamina de rata de 14 meses. B) Imagen de las espinas dendríticas de cerebro control
con objetivo de 100X. C) Fotografía de las espinas dendríticas de cerebro tratado con dosis alta de
apamina
- 30 -
Figura 18. Gráfica que muestra la longitud dendrítica total de las neuronas piramidales de la región
CA1 del hipocampo ventral en animales de 14 y 20 meses por separado (n=5 por grupo), donde la
administración de apamina (2 y 4 µg/kg) en animales de 14 meses “middle aged” incrementa la
longitud dendrítica total con respecto al control *p<0.05 (ANOVA de dos vías, prueba Post-hoc de
Bonferroni) mientras que ésta no es alterada en animales más viejos.
10.3.2 Resultados morfológicos de la arborización de las neuronas piramidales de
la región CA1 del hipocampo ventral
Usando el análisis de Sholl se mostró que el tratamiento con apamina no alteró la
arborización de las neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo ventral
(Figura 19). Por otro lado al determinar la longitud dendrítica con respecto al orden
de ramificación se encontró que hay una tendencia de incremento en los animales
de 14 meses, sin embargo estos cambios no son significativos (Figura 20).
- 31 -
A B
Figura 19. Grafico del análisis de Sholl. A) Arborización de neuronas piramidales de la región CA1
del hipocampo ventral (n=5 por grupo) sin algún cambio provocado por el uso de apamina. B)
Arborización neuronal del HV en animales de 20 meses de edad.
A B
Figura 20 A) Muestra la longitud de las neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo
ventral con respecto al número de orden, cada punto representa la media ± EEM de animales con
14 meses. B) Gráfica de longitud de neuronas piramidales del HV con respecto al número de orden
en ratas de 20 meses (n = 5 por grupo).
- 32 -
10.3.3 Resultados morfológicos de la densidad de espinas dendríticas de las
neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo ventral
La densidad de espinas dendríticas distales se obtuvo de acuerdo al protocolo
antes mencionado mostrando un claro efecto de la apamina sobre la expresión de
espinas, la administración subcrónica de la toxina (4 µg/kg) aumentó la expresión
de espinas en ratas de 14 meses (**p<0.01 ANOVA de dos vías Post-hoc de
Bonferroni) con respecto al grupo control pero este efecto no se observó en
animales de 20 meses de edad (Figura 21).
Figura 21. Gráfica que muestra la densidad de espinas dendríticas distales de las neuronas
piramidales del HV de animales de 14 meses de edad (n=5 por grupo), donde la administración de
apamina altera la expresión de espinas de manera dosis dependiente, siendo el grupo tratado con
4 µg/kg de apamina el que presenta mayor densidad con un valor de **p<0.01 con respecto al
control.
- 33 -
10.4 RESULTADOS MORFOLÓGICOS DE LAS NEURONAS PIRAMIDALES
DE LA CPF
10.4.1 Resultados morfológicos de la longitud dendrítica de las neuronas
piramidales de la CPF
Usando el análisis de Sholl se determinó que la longitud dendrítica total de las
neuronas piramidales de la tercera capa de la CPF no fue alterada por la
administración de apamina tanto para los animales de 14 como para los de 20
meses de edad (Figura 22).
Figura 22. Gráfica que muestra la longitud dendrítica (n=5 por grupo) de neuronas piramidales de
CPF de ratas de 14 y 20 meses de edad, donde la administración de la toxina no modificó la
longitud dendrítica total.
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10.4.2 Resultados morfológicos de la arborización de las neuronas piramidales
de la CPF
Los datos obtenidos muestran que la arborización dendrítica de las neuronas
piramidales de la CPF no fue alterada por la administración de apamina
independiente de la edad de los sujetos de estudio (Figura 23), de igual manera la
longitud dendrítica con respecto al orden de ramificación no presentan cambios
con respecto a sus respectivos grupos controles (Figura 24).
A
B C
Figura 23. A) Fotografía de neurona piramidal de la CPF de rata de 14 meses de edad con tinción
de Golgi. B) Fotografía de espinas dendrítica de CPF con tinción de Golgi del grupo control. C.
Fotografía de espinas dendríticas de CPF del grupo administrado con 4 µg/kg de apamina.
- 35 -
A B
C D
Figura 24. A) Gráfica que muestra la arborización de neuronas piramidales de la CPF de ratas de 14 meses sin presentar alteraciones por la administración durante dos meses con apamina. B) Arborización de neuronas de la tercera capa de la CPF de ratas de 20 meses de edad (n=5 por grupo). C) Imagen de la longitud dendrítica con respecto al orden de ramificación sin cambios entre los tres grupos analizados. Cada punto representa la media ± EEM. D) Gráfica de la longitud dendrítica con respecto al orden mayor de ramificación sin mostrar alteraciones entre los grupos analizados por el efecto de la toxina.
- 36 -
10.4.3 Resultados morfológicos de la densidad de espinas dendríticas de las
neuronas piramidales de la CPF
La densidad de espinas dendríticas de las neuronas piramidales de la CPF usando
en análisis de Sholl mostró que la administración subcrónica de la toxina no alteró
la expresión de espinas tanto en animales de 14 meses como en animales de 20
meses de edad (Figura 25).
Figura 25. Gráfica de densidad de espinas dendríticas de la CPF de ratas de 14 y 20 meses sin
presentar cambios por la administración subcrónica de la toxina (n=5 por grupo).
- 37 -
11. DISCUSIÓN
El objetivo principal del presente trabajo fue determinar si el uso de una
toxina que altera la excitabilidad neuronal a través de acortar la
posthiperpolarización como es la apamina, podría alterar la morfología de algunas
regiones cerebrales en animales viejos, donde se sugiere que dicho proceso
podría ser importante en el deterioro de las funciones cognitivas propias del
proceso de envejecimiento.
De acuerdo con los datos obtenidos, la administración de la apamina
produjo cambios morfológicos sólo en las neuronas del hipocampo ventral, donde
el incremento en la longitud dendrítica total fue estadísticamente significativo con
las dosis de 2 y 4 µg/kg de peso, evaluándose en animales de 14 meses de edad;
sin embargo, este comportamiento no se mantuvo cuando se evaluó en animales
de 20 meses de edad, sugiriéndose que a esa edad la acción de la apamina sobre
el bloqueo de los canales SK puede no afectar la morfología neuronal del
hipocampo ventral. Este efecto no se observa en la arborización dendrítica la cual
no sufrió alteraciones por la acción de la apamina independientemente de la dosis
usada y de la edad de los animales. No obstante la expresión de espinas
dendríticas si fue estimulada por la acción de la toxina siendo la dosis de 4 µg/kg
la que provocó cambios evidentes con respecto al grupo control. El incremento de
longitud total dendrítica en neuronas piramidales del hipocampo ventral
acompañado de una mayor expresión de espinas dendríticas nos sugiere que el
bloqueo subcrónico de canales SK favorece la plasticidad sináptica, es decir, es
probable que estos animales tengan una mejor comunicación neuronal en el
hipocampo. Nuestros datos apoyan reportes previos donde la administración
aguda de apamina revierte el déficit de navegación en ratas con lesión en el
hipocampo en la prueba de Morris (Van der Stay, 1999; Stackman, 2002), así
como mejorar el aprendizaje en la prueba de caja de Skinner (Messier, 1991).
- 38 -
Por otro lado sólo la dosis alta de apamina provocó un cambio en la
densidad de espinas dendríticas de NAcc con respecto al grupo control en
animales de 14 meses, pero estos cambios no se observaron en los animales de
20 meses. La longitud dendrítica no presenta alteración entre los grupos
estudiados, así como la arborización neuronal independientemente de la edad y la
dosis empleada. Es probable que el poco efecto observado en las neuronas del
núcleo accumbens sea porque estos presentan una mayor expresión de canales
SK3 los cuales son menos sensibles a la apamina que los canales SK2 (IC50: 2
nmol/L para SK3 (Ishii y cols., 1997) y 63 pmol/L para SK2 (Köhler y cols., 1996)),
siendo estos últimos los predominantes en el hipocampo.
La CPF no presentó ningún cambio morfológico, en este momento es difícil
saber por qué esta región parece ser insensible al bloqueo de canales SK, pero no
se descarta que la acción de la apamina se vea reflejada en cambios morfológicos
en otras regiones del cerebro.
El deterioro de la transmisión y la plasticidad sináptica han sido reportadas
en varias regiones cerebrales, siendo el hipocampo una de las regiones más
estudiadas por ser altamente susceptible al envejecimiento y por estar relacionada
con la memoria. Así, Foster en 1997 describe que la pérdida de la memoria se ve
afectada por el decline de las sinapsis hipocampales básicamente por alteraciones
en la procesos de plasticidad sináptica dependientes de calcio, de ahí la
importancia del estudio de procesos que son afectados por la presencia de Ca2+
intracelular como es la posthiperpolarización.
Por otro lado, en estudios previos se ha determinado que los factores
neurotróficos podrían controlar la plasticidad cortical en procesos de aprendizaje y
memoria así como en la regulación de circuitos neuronales durante el desarrollo;
sin embargo, la participación de estos factores podrían continuar a lo largo de la
vida, así se ha reportado que el BDNF disminuye considerablemente durante el
proceso de envejecimiento (Shetty y cols.,2004), esto altera la actividad de otros
- 39 -
elementos como es la PKA, la expresión del neuropéptido Y y la p-CREB
(Hattiangady y cols., 2005). Cuando se administra BDNF en cortes de hipocampo
se inhibe la AHP mediada por canales SK (Kramar y cols., 2004), sugiriéndose
que sea a través de la protein kinasa A (Gallo y cols., 2002), además ante la
inducción de LTP los canales SK2 son interiorizados siendo un proceso
dependiente de PKA esto en espinas de neuronas de hipocampo de la región CA1
(Lin y cols., 2008). Con lo anterior se sugiere que el BDNF podría facilitar la
inducción de LTP inhibiendo indirectamente a los SK. Así, podría esperarse que
en el proceso de envejecimiento donde la cantidad de BDNF disminuye al igual
que los efectos que ejerce sobre las neuronas se podría esperar una mayor
actividad de los canales SK principalmente alterando la posthiperpolarización la
cual esta aumentada en mamíferos viejos (Moyer 1992) ver en articulo de Foster
1998, siendo estos un buen modelo para estudiar el efecto del bloqueo de estos
canales.
Se ha descrito que la neurogénesis en el giro dentado de rata disminuye al
iniciar la segunda etapa de la vida de este organismo “middle-aged” (Kuhn y cols.
1996), lo cual podría al menos en parte ser por el temprano declive en la
concentración de BDNF en hipocampo, además, se ha demostrado que este
estimula la neurogénesis en el dentado (Lee y cols., 2002), el aprendizaje y la
memoria (Falkenberg y cols., 1992). Un dato interesante dado por Kuhn y cols.
(1996) es que existe una marcada disminución de la neurogénesis en el giro
dentado en animales de “middle age” con respecto a animales jóvenes, sin
embargo este comportamiento no es continuo ya que no hay cambios entre
animales viejos con respecto a los “middle-aged” sugiriendo que las alteraciones
en el cerebro podrían darse desde una “edad temprana” y que las alteraciones que
se llegan a observar en cerebros viejos podrían estar dadas por alteraciones
previas. De ahí la importancia de evaluar la morfología en animales de 12 meses,
en donde después de 2 meses de administración de apamina el uso de la toxina
en estos animales de “middle aged” provocó una mayor expresión de espinas en
neuronas espinosas medianas del NAcc y en las neuronas piramidales de la
- 40 -
región CA1 del hipocampo ventral, así como incrementó la longitud dendrítica de
estas últimas, sugiriendo que se favoreció la comunicación neuronal, no así en
animales de 20 meses de edad, donde a pesar de la administración de la toxina no
se alteró algún parámetro morfológico proponiéndose que el efecto de la apamina
no se observa si el cerebro sobre el que actúa es de mayor edad.
- 41 -
12. PERSPECTIVAS
A pesar de que el uso de la apamina no alteró morfológicamente todas las
regiones estudiadas en el presente trabajo, no se descarta que pueda modificar
otras regiones cerebrales, debido a que la mayoría de los antecedentes plantean
un efecto sobre memoria, uno de los pasos a seguir podría ser un mayor estudio
sobre otras regiones del hipocampo como es el giro dentado.
Además debido a que en este proyecto es novedoso en el uso subrcrónico
de la apamina, no se descarta que si se administra en animales menos viejos o
por un periodo más largo pueda modificar la morfología neuronal de otras áreas
como es la CPF y el NAcc.
El objetivo fue determinar las alteraciones morfológicas, pero usando este
protocolo se pueden realizar estudios electrofisiológicos para determinar la
funcionalidad de las neuronas hipocampales como evaluar si el uso subcrónico de
la apamina acorta el periodo de posthiperpolarización, así como si aumenta la
excitabilidad neuronal ya que como se determinó, fueron las células más sensibles
a la apamina. Por otro lado se pueden realizar pruebas de aprendizaje y memoria
como las prueba de la caja de Skinner o la prueba de aprendizaje espacial en el
laberinto acuático de Morris para verificar si los cambios aquí observados son
acompañados de una optimización de funciones cognitivas.
- 42 -
13. CONCLUSIONES
El uso de la apamina (2 ó 4 µg/kg de peso) durante dos meses de edad en
animales de 14 y 20 meses de edad no altera la actividad motora.
La administración subcrónica de apamina modifica la morfología neuronal de las
neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo ventral aumentando la
longitud dendrítica neuronal y la densidad de espinas dendríticas.
El uso de la apamina durante dos meses en ratas de 14 y 20 meses no modifica ni
la morfología neuronal ni la expresión de espinas dendríticas de las neuronas
piramidales de la tercera capa de la CPF.
La administración de apamina incrementa la expresión de espinas dendríticas de
las neuronas espinosas medianas del NAcc.
- 43 -
14. BIBLIOGRAFÍA
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